WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«А.И. ИЛЛАРИОНОВ, Е.А. ИЛЛАРИОНОВА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Иркутск 2011 УДК 543.42.062 ББК 24.23 И 44 Рецензенты Е.Ф. Мартынович, доктор ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ЖЕЛЕЗНОДОРОЖНОГО ТРАНСПОРТА

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ

А.И. ИЛЛАРИОНОВ, Е.А. ИЛЛАРИОНОВА

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ОРГАНИЧЕСКИХ

СОЕДИНЕНИЙ

Иркутск 2011

УДК 543.42.062

ББК 24.23

И 44

Рецензенты Е.Ф. Мартынович, доктор физико-математических наук, профессор, заместитель председателя Иркутского научного центра СО РАН;

В.К. Воронов, доктор химических наук, профессор Иркутского государственного технического университета Илларионов А.И., Илларионова Е.А.

Хроматографическая диагностика азотсодержащих органичеЛ ских соединений / А.И. Илларионов, Е.А. Илларионова. – Иркутск :

ИрГУПС, 2011. – 100 с.

ISBN 978-5-98710-171- Монография посвящена разработке новых вариантов хроматографического метода анализа органических соединений. Представлен материал по исследованию физико-химических характеристик органических веществ и возможных примесей. С помощью метода математического планирования эксперимента – плана «латинского квадрата» – и экспериментальных данных изучено влияние различных факторов на хроматографическое поведение органических веществ и возможных примесей. Предложена методология выбора оптимальных условий хроматографического анализа органических сред.

В монографии представлен материал по тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Книга рассчитана на научных сотрудников, аспирантов и студентов, занимающихся изучением хроматографических методов анализа.

УДК 543.42. ББК 24. © Илларионов А.И., Илларионова Е.А., © Иркутский государственный университет путей сообщения, ISBN 978-5-98710-171-

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ

ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕД МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ

ХРОМАТОГРАФИИ

1.1. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического контроля чистоты пентамина

1.2. Оптимизация условий и разработка методик хроматографического контроля чистоты аденозина и фосфадена...... 1.2.1. Выбор условий хроматографического анализа аденозина и фосфадена

1.2.2. Оптимизация условий хроматографического анализа аденозина и фосфадена методом математического планирования эксперимента

1.2.3. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического анализа фосфадена с использованием в качестве основного компонента подвижной фазы воды очищенной

1.2.4. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического анализа аденозина с использованием в качестве основного компонента подвижной фазы воды очищенной

1.3. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического контроля чистоты ксантинола никотината...... 1.4. Оптимизация условий и разработка методик хроматографического контроля чистоты фтивазида и метазида

ГЛАВА 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

ПРОИЗВОДНЫХ АРОМАТИЧЕСКОГО РЯДА

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕД,

СОДЕРЖАЩИХ ИБУПРОФЕН, МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

3. 1. Выбор оптимальных условий хроматографического анализа определяемых соединений

3.2. Количественное определение исследуемых двухкомпонентных органических соединений

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ВВЕДЕНИЕ

Важной характеристикой органических соединений (находящих свое применение в различных отраслях промышленности, в том числе и в медицинской практике) является их чистота. Для обнаружения примесей в органических веществах чаще всего находит применение плоскостная хроматография, позволяющая разделить и идентифицировать вещества, не только различающиеся по химической природе, но и обладающие близкими физико-химическими свойствами.

Метод хроматографии на бумаге используется для разделения и обнаружения примесей в аденозине и фосфадене [88, 92]. Предлагаемая методика является длительной, требует на один анализ 18-20 часов.

Для разделения нуклеозидов и суммы пуриновых соединений на любой стадии технологического процесса получения рибоксина предложен метод бумажной хроматографии [33]. Необходимо отметить, что методика требует для выполнения более 20 часов.

Примесь гипоксантина в 2 % растворе для инъекций рибоксина и таблетках рибоксина, покрытых оболочкой, предложено определять методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) [68].

Для определения специфической примеси гидразина в изониазиде нормативная документация (НД) [24] рекомендует метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол УФ-254», «Сорбфил УФили «Кизельгель 60 F 254» фирмы «Merck». В качестве системы растворителей используют смесь ацетон – вода (98:2), обнаружение зон веществ на хроматограмме ведут путем опрыскивания 1 % раствором n-диметиламинобензальдегида в спирте 95 %. Методика определения гидразина в препаратах изониазида методом ТСХ описана в работе [155].





Обнаружение специфических примесей гидразида изоникотиновой кислоты и формальдегида в метазиде, гидразида изоникотиновой кислоты и ванилина во фтивазиде рекомендуется проводить химическим методом [44, 94]. Определение примеси гидразида изоникотиновой кислоты проводят на основе иодкрахмальной пробы. Для обнаружения примеси формальдегида в метазиде используют пробу с фуксинсернистой кислотой, а для определения примеси ванилина во фтивазиде предлагается проба с фенолфталеином и щелочью.

В работе А.Х. Лайпанова и В.И. Лобанова предложена методика определения примесей в метазиде и фтивазиде методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол УФ-254» [36]. Установлено, что оптимальной для метазида является система растворителей бензол – этанол – диметилформамид (20:30:50), для фтивазида – хлороформ – этанол (90:10). Проявление хроматограмм предлагается проводить 0,5 % водным раствором пентацианоаминоферроата натрия и 0,1 % раствором 2,4-динитрофенилгидразина в растворе 2М соляной кислоты. Для количественной оценки примеси гидразида изоникотиновой кислоты авторы предложили экстракционно-фотометрическое определение [36]. В основу предложенной методики положена реакция с нитротетразолием синим, в результате которой образуется окрашенное соединение типа формазона, легко экстрагируемое органическими растворителями.

Метод ТСХ предложен для определения стабильности глазных капель с салюзидом [120]. Л.П. Овчаренко и Е.В. Компанцева разработали методики контроля качества салюзида и метазида методом ТСХ [52, 53].

Для контроля специфических примесей в левомицетине и синтомицине НД [37, 73] предлагает метод ТСХ на пластинках «Силуфол УФ-254».

Хроматографирование проводят в системе растворителей хлороформ:

спирт метиловый – вода (90:10:1), обнаружение зон веществ на хроматограммах осуществляют в ультрафиолетовом (УФ) свете на длине волны 254 нм. В Международной фармакопее III издания [42] приведена методика определения посторонних примесей в левомицетине методом ТСХ. Методика основана на использовании в качестве адсорбента силикагеля, а в качестве подвижной фазы – смеси хлороформа и метанола (9:1). Результат хроматографирования оценивают путем облучения хроматограммы в УФсвете (254 нм) после удаления растворителей и нагревания при 105 °С в течение 5 мин.

При оценке качества сульфаниламидных препаратов для испытаний на наличие специфических примесей все шире вводится метод ТСХ [2, 76, 78, 51, 93].

Определение примеси норсульфазола во фталазоле проводят на пластинках «Силуфол УФ-254», используя систему растворителей хлороформ – спирт метиловый в соотношении 45:5 [93]. Посторонние примеси в стрептоциде определяют на пластинках «Силуфол УФ-254» в системе растворителей аммиак раствор концентрированный – спирт метиловый – хлороформ (3:9:16) [76]. Для определения специфических органических примесей в сульфадиметоксине НД [78] рекомендует метод ТСХ на пластинках «Силуфол УФ-254», используя систему растворителей хлороформ – этилацетат – уксусная кислота в соотношении 8:2:1.

Одним из требований НД для оценки подлинности и чистоты ксантинола никотината является обнаружение кислоты никотиновой и специфической примеси теофиллина методом ТСХ [34, 87]. Рекомендованная НД методика [34, 87] не позволяет определять наличие еще одной специфической примеси: 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина, которая может присутствовать в препарате.

Для определения подлинности и чистоты пиразидола НД [63] рекомендует метод ТСХ на пластинках «Силуфол УФ-254». В качестве системы растворителей используют бензол: спирт этиловый: раствор аммиака в соотношении 45:15:1. Аналогичная система растворителей использована О.С. Анисимовой с соавторами [25] для изучения метаболизма пиразидола методом ТСХ в опытах in vivo на крысах.

Благодаря своим преимуществам TСX применяется для анализа многокомпонентных лекарственных форм, включающих аденозин и рибоксин.

Так, для разделения аденозина, рибоксина и его производного в смеси предложен метод хроматографии в тонком слое сорбента [61]. Метод ТСХ применяется для разделения рибоксина и других компонентов в гемоконсервантах (натрия хлорида, натрия пирувата, натрия фосфата двузамещенного) [55].

Рядом авторов [3, 43] разработаны методики контроля качества левомицетина в субстанции и в лекарственных формах с новокаином методом восходящей ТСХ в закрепленном слое сорбента (силикагель марки КСК). В качестве систем растворителей предложены смеси: ацетон – бензол (1:1), метанол – 25 % аммиак в разных соотношениях. В работах [9, 18] предложены методики, позволяющие идентифицировать левомицетин и продукты его деструкции в субстанции и моче методами хроматографии в тонких слоях насыпного оксида алюминия и закрепленного силикагеля. В качестве систем растворителей используют системы: бутанол – вода – уксусная кислота (67:30:3); бензол – этанол (5:1); хлороформ – метанол (12:1); н-бутанол, насыщенный водой – 2,5 % раствор фенола – 2 % раствор пиридина и другие. Детектирование пятен на хроматограммах осуществляют путем опрыскивания их хлоридом титана или дихлоридом олова, а затем бутилнитритом и N-(1-нафтил)-этиленамином.

В НД [40] описана методика обнаружения левомицетина и метилурацила в мази «Левомеколь» методом ТСХ на пластинках «Силуфол УФв системе хлороформ – ацетон – этанол (60:5:10) с последующей индикацией лекарственных веществ по положению и окраске пятен в сравнении с соответствующими свидетелями.

Для разделения фосфорных эфиров тиамина и аденозина авторы работы [98] предложили метод ионно-обменной хроматографии.

Г.У. Тиллаева [89] для идентификации суппозиториев с парацетамолом и норсульфазолом использовала метод ТСХ, применяя систему растворителей диэтиловый эфир – диметилформамид – бензол в соотношении 4:1:2.

Метод ТСХ, наряду с методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), применяется для разделения нуклеотидов и нуклеозидов в биологических объектах. Применение данного метода для биохимических исследований описано в монографиях Э. Шталя и М. Шаршуновой [99, 159]. В работах [69, 20, 156] приведены результаты хроматографирования нуклеотидов и нуклеозидов на сорбентах различного типа (на слоях полиэтиленимин-целлюлозы, силикагеля). Авторы статей [21, 65] предложили стандартные пластинки «Силуфол УФ-254» для разделения нуклеозид-5'-моно, ди- и трифосфатов.

Новый метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках силикагель 60F254 предложен для определения теофиллина в плазме крови [127].

Для получения высококачественных органических веществ важное значение имеет постадийный контроль производства. Исследуя постадийный контроль синтеза фосфадена, А.М. Шлянкевич с соавторами усовершенствовали методику анализа компонентов реакционной смеси на стадии фосфорилирования [101–104]. Для разделения фосфадена и ряда примесей ( аденозина, аденина, аденозин моно-, ди-, трифосфатов и других) авторы предложили высокочувствительный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий разделить и количественно оценить компоненты этой сложной смеси.

Примеси гипоксантина и гуанозина в субстанции рибоксина и рибоксине-стандарте определяют методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Waters» (США) [70].

Метод обращенно-фазовой ВЭЖХ применяется для обнаружения примесей в рибоксине-стандарте [71]. Работа [30] посвящена использованию нормально-фазовой ВЭЖХ для определения чистоты рибоксина.

Метод ВЭЖХ более широкое применение находит при биохимических исследованиях нуклеотидов и нуклеозидов производных пурина.

Адениновые нуклеотиды явились объектом исследования уже в ранних работах по применению ВЭЖХ [99, 110]. В последнее время разработано множество методик, позволяющих разделить смеси нуклеотидов и нуклеозидов и количественно определить их [10, 128, 129, 152, 116].

Проблеме обращенно-фазовой ВЭЖХ компонентов нуклеиновых кислот посвящены обзоры [69, 20, 106, 114, 11]. В целом ряде работ [125, 132, 153] приведены условия разделения сложных смесей пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов на сорбенте типа силикагель-ОДС.

В значительном количестве работ описан ион-парный вариант ВЭЖХ. Теоретические и практические аспекты ион-парной хроматографии нуклеотидов, в том числе и адениновых, исследованы в работах [124, 130, 142, 143, 154].

Авторы работы [22] предложили сочетание ионно-обменной хроматографии и хроматографии с обращенными фазами для определения нуклеотидов АДФ, АТФ, олигонуклеотидов и полинуклеотидов.

Клинические образцы, а также гидролизаты РНК, могут содержать до 20 нуклеозидов, поэтому анализ таких сложных образцов требует использования градиентной элюции [138, 148]. Для определения аденозина, инозина и гипоксантина использовали ВЭЖХ на колонках с сорбентом RP-18 [145]. Авторы работы [116] предложили методику определения аденина, аденозина и адениновых нуклеотидов непосредственной инъекцией проб крови в анализатор для ВЭЖХ.

Описанию условий проведения исследований компонентов нуклеиновых кислот с использованием метода ВЭЖХ посвящены работы [20, 69, 127, 109, 143].

В работе [107] предложен метод ВЭЖХ для определения изониазида в колонке с силикагелем с УФ-детектированием. Метод ВЭЖХ предложен для контроля качества лекарственных форм, содержащих изониазид, пиразинамид и рифампицин [121, 136].

Обращенно-фазный вариант ВЭЖХ разработан для определения рифампицина и изониазида в лекарственных формах [118].

Авторы работы [134] разработали способ анализа смеси изониазида с хлоргидратом пиридоксина методом жидкостной хроматографии с образованием ионных пар с УФ-детектированием.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовой детекцией применен в количественном анализе теобромина, теофиллина в субстанциях и лекарственных формах, содержащих дибазол, фенобарбитал, папаверина гидрохлорид [16], какао-продукты [108, 111].

Исследования проводят на жидкостном хроматографе «Хьюлетт-ПаккардВ качестве подвижной фазы служит смесь 96 % этанола и 1 % раствора уксусной кислоты (70:30). Скорость элиминирования составляет 1 мл/мин при 20 °С.

Теофиллин в лекарственных формах анализируют ВЭЖХ на колонках с обращено-фазным сорбентом, используя подвижную фазу – 0,02М раствор тетрабутиламмония фосфата в смеси с водным раствором гидроксида натрия (80:10), которая перемещается со скоростью 0,5 мл/мин.

Внутренний стандарт – никотинамид. Ошибка определения с 99 % вероятностью не превышает 1,3 % [146].

Для определения содержания пентоксифиллина в сыворотке крови применен метод ВЭЖХ [48]. Относительная ошибка определения составила 8,9 % при концентрации пентоксифиллина 75,0 нг/мл.

Способ определения левомицетина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ с использованием систем растворителей ацетонитрил – вода – дециламин 40:60:(0,08 - 0,12) описан авторами в работе [1].

М.И. Громова с соавторами провела хроматографическое изучение различных производных изоникотиновой кислоты, в частности, изониазида [97]. Авторами предложена методика разделения ряда производных изоникотиновой кислоты методом обращенно-фазовой хроматографии.

Для количественной оценки никотиновой кислоты и ее производных, а также для определения в препаратах примесей и изомерных соединений был предложен метод ВЭЖХ [14]. При этом для разделения различных изомерных производных никотиновой кислоты использовали нормально-фазовый и обращенно-фазовый методы жидкостной хроматографии.

Для анализа изониазида M. Sarwar и др. предложили метод газовой хроматографии [152].

Т.А. Завражная предложила метод газо-жидкостной хроматографии для определения никотиновой кислоты в 1 % растворе для инъекций [19].

В качестве внутреннего стандарта автором предложен 1 % спиртовый раствор миндальной кислоты. Относительная ошибка определения не превышает 1 %.

Для определения посторонних примесей в растворе диклофенака натрия для инъекций [67] предложен метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол УФ 254». В качестве системы растворителей используют смесь бензол – кислота уксусная ледяная – этилацетат (18:1:1), обнаружение зон веществ на хроматограмме ведут путем облучения УФ-светом. Содержание примесей допускается не более 1 %.

Обнаружение специфических примесей в таблетках диклофенака натрия рекомендуется проводить методом тонкослойной хроматографии [85].

Хроматографирование проводят в смеси растворителей хлороформ – кислота уксусная ледяная (50:1), обнаружение зон веществ осуществляют 0,5 % раствором бихромата калия в серной кислоте. Суммарное содержание примеси должно быть не более 1 %.

В фармакопейной статье предприятия ОАО «Щелковский витаминный завод» [79] на диклофенака натрия в таблетках определение примесей рекомендуется проводить методом ТСХ в системе растворителей спирт метиловый – кислота уксусная ледяная (9:1). Аналогичная методика рекомендована для определения чистоты ортофена в субстанции [56].

В нормативной документации [17] на субстанцию диклофенака натрия индийского производства метод ТСХ предложен для определения подлинности. Посторонние примеси определяют методом ВЭЖХ [17]. В качестве подвижной фазы используют смесь растворителей раствора фосфорной кислоты и раствора натрия дигидрофосфата, доведенных до рН 2,5, и метанол. Суммарное содержание примесей допускается не более 0,5 %.

Для определения посторонних примесей и исследования стабильности натрия диклофенака в мази используется метод ТСХ на силикагеле в среде растворителей хлороформ – ацетон – кислота муравьиная (80:10:3) [15, 47]. Обнаружение зон веществ на хроматограмме проводили путем обработки дихромата калия.

Для исследования диклофенака натрия используется хроматоденситометрическая методика [4]. Хроматографирование осуществляется на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей бутанол – спирт этиловый – раствор аммиака 25 % (5:1:1). Проявление хроматограммы проводят в УФ-свете на длине волны 254 нм.

Для обнаружения посторонних примесей в ибупрофене также используют метод ТСХ [86]. В качестве системы растворителей предложена смесь гексан – этилацетат – кислота уксусная ледяная (30:5:2), а проявителя – 10 % раствор фосфорномолибденовой кислоты. Содержание примесей, согласно требованиям нормативной документации, допускается не более 3 % для таблетированной лекарственной формы.

Для отделения вольтарена от его метаболитов предложили метод ТСХ в работе [75].

Определение специфической примеси 3-ацетилбензофенона в кетопрофене проводится методом ТСХ на пластинках «Силикагель 60 F254» в системе растворителей эфир этиловый – толуол – кислота муравьиная (30:10:0,4) [12]. Данной примеси допускается не более 0,5 %.

Разработан хроматоденситометрический метод идентификации и определения диклофенака и примесей в фармацевтических препаратах [133].

Хроматографирование проводили на пластинках силикагеля при использовании в качестве подвижной фазы смеси циклогексан – хлороформ – метанол (12:6:1). Хроматограммы денситометрировали в ультрафиолетовом свете на длине волны 248 нм.

Нормативный документ [23] рекомендует определение примеси 4-изобутил-ацетофена в ибупрофене проводить методом ВЭЖХ.

В нормативной документации на кетопрофен [31, 66] определение примеси рекомендовано проводить как методом ТСХ, так и более чувствительным методом ВЭЖХ. Метод ВЭЖХ предложен и для идентификации специфической примеси в нимесулиде [50, 84].

Согласно Фармакопеи США 24-го издания [157], наличие посторонних примесей в ибупрофене устанавливают методом газожидкостной хроматографии по соотношению суммы площадей пиков, обусловленных примесями, к площади пика ибупрофена.

Метод газожидкостной хроматографии применяется для определения примесей остаточных органических растворителей в диклофенаке натрия [39], кетопрофене [12, 66], ибупрофене [23], нимесулиде [50].

Для идентификации полупродуктов синтеза диклофенака натрия предложен метод газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе «Газохром 1109» отечественного производства с ионизационнорезонансным детектором с радиоактивным источником Ni-63 [45]. Методика может применяться для идентификации полупродуктов на стадиях синтеза диклофенака натрия, а также для контроля готового продукта.

В работах [122, 151] представлены методики газохроматографического определения ортофена в сыворотке крови. Предложенные методики требуют предварительной обработки с помощью экстракции и дериватизации соединений, что существенно усложняет проведение анализа. Аналогичная методика анализа ортофена методом ВЭЖХ описана в работах [115, 149].

Д.О. Румянцевым [72] разработана методика определения индометацина и ортофена в сыворотке крови и в лекарственных формах методом ВЭЖХ. Данная методика требует использования только общедоступных реактивов, но методика характеризуется низкой чувствительностью и выполняется на импортном оборудовании.

Методом ВЭЖХ устанавливают наличие специфических примесей в натрия диклофенаке [15].

Известен способ определения кетопрофена [38] с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «Стайер» фирмы «Аквилон» с УФ-детектером.

Согласно требованиям Фармакопеи США 23-го и 24-го издания [157, 158], количественное определение ибупрофена в субстанции и лекарственных формах проводится методом ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы предложена система растворителей: хлоруксусная кислота, доведенная до рН 3 с помощью раствора аммиака и ацетонитрила. Количественная оценка ведется методом внутреннего стандарта по ваперофенону.

Для определения субстанции ибупрофена производства Индии НД также рекомендует метод ВЭЖХ [23].

Метод газожидкостной хроматографии использовали для исследования содержания ибупрофена в мази, приготовленной на геле полиэтиленоксида – 1500 [59].

Известны методики определения вольтарена методами газожидкостной хроматографии (ГЖХ) [122] и ВЭЖХ [144].

Предложенные методики характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью, однако требуют дорогостоящего оборудования и дефицитных реактивов.

Для анализа кетопрофена в плазме крови предложен метод ВЭЖХ [162].

В работе [74] разработаны методики идентификации и количественного определения кетопрофена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0,02 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного и метанола в соотношении 1:1.

В работе [164] применена ахиральная хроматографическая система в ахиральной ВЭЖХ-колонке. В данной методике оценено влияние ряда хроматографических параметров, таких как тип колонки, рН буфера и температура. В этой хиральной хроматографической системе реализовано хорошее разрешение энантиомеров кетопрофена.

Предложены методики определения диклофенака, ибупрофена, диазепама и других лекарственных веществ в природных и сточных водах методами газовой и жидкостной хроматографии [131].

Разработана простая и экспрессная методика количественного определения ибупрофена в плазме крови [119]. Из пробы плазмы ибупрофен выделяют при помощи твердофазной экстракции и затем количественно определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Относительное стандартное отклонение составляет 0,06.

Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии предложен для количественного определения нимесулида в субстанции и готовых лекарственных формах [141]. В качестве подвижной фазы использовали смесь циклогексан – этилацетат (60:40). Количественную оценку нимесулида и продуктов разложения проводили денситометрическим методом.

Для анализа ингредиентов многокомпонентных лекарственных препаратов актуальным направлением является использование ВЭЖХ. Данный метод позволяет совместить стадии разделения и определения, что существенно сокращает время проведения анализа, а также увеличивает его точность [77].

Методом ВЭЖХ разработана методика, позволяющая разделять смесь лекарственных веществ (индопрофен, кетопрофен, супрофен, напроксен, флурбипрофен, фенопрофен и ибупрофен) [139].

В работе [49] представлена методика количественного определения некоторых противовоспалительных лекарственных препаратов в комбинированных лекарственных формах на гелевой основе с использованием методов спектрофотометрии, высокоэффективной и газовой хроматографии.

Газовая хроматография предложена для анализа пяти кислых НПВП (ибупрофен, напроксен, кетопрофен, толфенамовая кислота и диклофенак) в сточных водах [113]. Методика включает концентрирование пробы с использованием твердофазной экстракции с полимерным сорбентом, функционализированным N-винилпирролидоном.

Метод жидкостной хроматографии разработан для определения девяти лекарственных веществ (бензафиврат, клофибровая кислота, диклофенак, фенопрофен, гемфиброцил, ибупрофен, индометацин, кетопрофен и напроксен) в сточных водах [137].

Описана методика определения энантиомеров ибупрофена в моче методом жидкостной хроматографии с УФ-фотометрическим детектированием на длине волны 250 нм [161]. Относительное стандартное отклонение соответствует 7,3 и 3,6 %.

Проведено исследование распада ибупрофена методом обращенофазной ВЭЖХ [112].

Разработана экспрессная методика одновременного определения лекарственных веществ ацетаминофена, ибупрофена и хлорзоксазона в фармацевтических препаратах при помощи ВЭЖХ с обращенными фазами [147].

Контроль за качеством парацетамолсодержащих лекарственных смесей за рубежом проводят в основном с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, но эти методики неприменимы в наших условиях ввиду различных причин: малодоступные сорбенты, приборы, детекторы [46, 117, 160]. По нормативной документации [82] при анализе таблеток «Ибумол» для определения ибупрофена предлагается алкалиметрический метод после отделения его хлороформом, а для определения парацетамола используется фотоэлектроколориметрический метод на длине волны нм после цветной реакции образования азосоединения. Метод является трудоемким, длительным. Для определения парацетамола в порошке «Колдрекс» используется метод ВЭЖХ, определение проводят, используя подвижную фазу – раствор метанола 30 % [64].

Т.С. Малолеткина [41] предлагает использовать для определения парацетамола в порошке «Колдрекс» методику ВЭЖХ. Элюирование проводят в градиентном режиме. Растворы подвижной фазы готовят в фосфатном буфере с рН 4,0. Время удерживания для парацетамола составляет 9,67 мин.

Количественное определение компонентов таблеток «Ибуклин», содержащих ибупрофен и парацетамол, по НД 42-10296-05 [80] проводят методом ВЭЖХ. Несмотря на ряд преимуществ данного метода анализа, его существенным недостатком является применение приборов и колонок импортного изготовления, не всегда имеющихся в арсенале отечественных химических лабораторий.

Анализ научной литературы и нормативных документов показывает, что хроматографические методы широко применяются для определения специфических примесей в лекарственных средствах производных пурина, индола, изоникотиновой кислоты, антибиотиков группы хлорамфеникола, сульфаниламидных препаратов, ибупрофена, диклофенака натрия, кетопрофена, нимесулида.

Метод тонкослойной хроматографии позволяет достаточно надежно идентифицировать специфические примеси в изониазиде, левомицетине, синтомицине, пиразидоле, никотиновой кислоте, пентоксифиллине, ацикловире, ибупрофене, диклофенаке натрия, кетопрофене, сульфаниламидных препаратах и других, находит применение в анализе многокомпонентных лекарственных форм, а также для определения препаратов исследуемой группы в биологических объектах. Однако испытание на чистоту метазида и фтивазида рекомендуется НД проводить химическим методом.

Предложенные авторами рассмотренных выше работ методики определения чистоты метазида и фтивазида методом хроматографии в тонком слое сорбента недостаточно совершенны, основаны на использовании сложных и высокотоксичных систем растворителей. Обнаружение и разделение примесей в аденозине и фосфадене ведется с использованием хроматографии на бумаге. Этот метод является длительным, что создает трудности при использовании его в условиях серийного производства. Несовершенна и методика хроматографического контроля чистоты ксантинола никотината, так как не позволяет определять наличие примеси 7-(2-окси-3хлорпропил)-теофиллина, которая может присутствовать в препарате. НД не предусмотрен контроль специфических примесей в пентамине. В связи с вышеотмеченным целесообразна разработка методик контроля чистоты метазида, фтивазида, аденозина, фосфадена, ксантинола никотината, пентамина.

Из представленных литературных данных следует, что метод ВЭЖХ применяется для анализа сложных по составу объектов, когда необходимо разделить большое количество соединений, что объясняется высокой разделяющей способностью метода. ВЭЖХ находит применение для анализа нимесулида, ибупрофена, диклофенака натрия, кетопрофена в лекарственных формах, в сыворотке крови и для изучения стабильности. Предложенные авторами рассмотренных работ методики разработаны на импортных хроматографах, малодоступных для отечественных лабораторий, и требуют различных условий хроматографирования.

АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ

ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕД МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ

ХРОМАТОГРАФИИ

Одной из главных проблем современной медицины является профилактика и лечение сердечно-сосудистых заболеваний, которые во всех развитых странах мира занимают первое место среди причин смертности лиц старшего и среднего возраста. Ухудшение эпидемиологической ситуации в стране стало одной из причин роста бактериальных и вирусных инфекций.

С каждым годом привлекает все большее внимание проблема туберкулеза.

Так, за 1991–2003 годы заболеваемость туберкулезом в Российской Федерации увеличилась более чем в 2 раза. Выросла заболеваемость туберкулезом и среди детей. Сложное финансово-экономическое состояние многих групп населения вызывает различные нервно-психические расстройства.

Данные заболевания часто являются причиной инвалидизации. Для лечения названных заболеваний широкое применение находят азотсодержащие лекарственные средства, обладающие сердечно-сосудистым, антибактериальным, противовирусным, психотропным и другими действиями. Эффективность и безопасность лечения данными препаратами во многом зависит от уровня их качества.

На основании критического анализа данных литературы и сравнительной оценки уровня требований и методик анализа, включенных в нормативные документы и зарубежные фармакопеи на лекарственные средства данной группы, установлено, что уровень требований и методы анализа указанной группы препаратов несовершенны и не позволяют объективно оценить их качество. Так, для контроля чистоты ряда препаратов используется химический метод, который является необъективным, так как на результаты реакции могут влиять окислители, восстановители либо вещества, обладающие кислотно-основными свойствами. В некоторых случаях для определения специфических примесей нормативная документация требует применения метода хроматографии на бумаге, который характеризуется длительностью и низкой чувствительностью. Перспективными для контроля чистоты лекарственных средств являются методы жидкостной и тонкослойной хроматографии, которые характеризуются высокой чувствительностью и объективностью. Вопросы хроматографического разделения лекарственных веществ и возможных примесей являются одной из основных и до сих пор еще недостаточно решенных проблем жидкостной и тонкослойной хроматографии. Поэтому исследования в этом направлении в настоящее время являются актуальными.

Объектами настоящего исследования выбраны пентамин, аденозин, фосфаден, ксантинола никотинат, метазид и фтивазид, широко применяемые в медицинской практике в качестве спазмолитических, сердечнососудистых и противотуберкулезных лекарственных средств. Большое значение для повышения качества лекарственных средств имеет контроль специфических примесей, которыми, как правило, являются исходные продукты и полупродукты синтеза. Специфические примеси могут присутствовать в основном препарате и оказывать токсическое действие, если их количество превышает норму.

Пентамин в качестве таких примесей может содержать диэтилентриамин (исходный продукт синтеза) и пентаметилдиэтилентриамин (промежуточный продукт синтеза), а ксантинола никотинат – теофиллин (исходный продукт синтеза) и 7-(2-окси-3 хлорпропил)-теофиллина (промежуточный продукт синтеза). Диэтилентриамин и пентаметилдиэтилентриамин являются токсичными соединениями, поэтому этих примесей в пентамине не должно быть. В действующей НД [62] не предусмотрен контроль специфических примесей в данном препарате. Предложенный НД [34] хроматографический способ контроля чистоты ксантинола никотината требует определения одной примеси теофиллина.

Одним из требований НД для оценки чистоты фосфадена и аденозина является отсутствие специфических примесей. Аденозин и фосфаден в качестве возможных специфических примесей могут содержать производные пурина, близкие к действующим веществам по химической структуре и физико-химическим свойствам, такие как аденин и аденозин в фосфадене и инозин и ацетилинозин в аденозине [88, 92].

Как было отмечено во введении, нормативная документация (НД), регламентирующая качество аденозина и фосфадена, рекомендует определение специфических примесей, являющихся производными пурина, проводить методом хроматографии на бумаге. Способ, предлагаемый НД, обладает рядом преимуществ [99, 104]. Однако существенным недостатком этого метода является длительность: для его выполнения требуется более 18 часов.

Исходя из способа получения метазида установлено, что в качестве специфических примесей он может содержать гидразид изоникотиновой кислоты (ГИНК) и формальдегид. Исходными продуктами синтеза фтивазида является ГИНК и ванилин, наличие которых контролируется в данном препарате. Нормативная документация предлагает определять данные специфические примеси в метазиде и фтивазиде химическим методом [44, 94]. Для обнаружения примеси ГИНК применяют иодкрахмальную пробу, а ванилина – пробу с фенолфталеином и щелочью. Предложенный НД способ контроля чистоты метазида и фтивазида характеризуется низкой селективностью, так как на результаты реакции могут влиять окислители, восстановители и вещества, обладающие кислотно-основными свойствами.

В связи с вышеотмеченным нами были проведены исследования по выбору селективного, объективного и экспрессного метода для разработки методик обнаружения и разделения всех возможных примесей пентамина, аденозина, фосфадена, ксантинола никотината, метазида и фтивазида.

1.1. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического контроля чистоты пентамина Пентамин (3-метил-1,5-бис-(N-диметил-N-этиламмоний)-3-азапентана дибромид) представляет собой соль четвертичного аммониевого основания. Данное соединение хорошо растворимо в воде и практически не растворимо в органических растворителях. Диэтилентриамин, пентаметилдиэтилен-триамин являются органическими основаниями с выраженными основными свойствами, хорошо растворяются в воде, органических растворителях, растворах кислот.

Учитывая сходство химических свойств возможных примесей и анализируемого вещества, для их разделения можно предложить методы хроматографии: высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и тонкослойную хроматографию (ТСХ). Метод ВЭЖХ является более чувствительным по сравнению с ТСХ [105, 100], с его помощью можно определить количественное содержание анализируемого соединения, но данный метод требует дорогостоящей аппаратуры. Поэтому более удобным для многих заводских лабораторий является метод ТСХ [32, 35, 99, 104]. В связи с вышесказанным для разработки методики анализа специфических примесей пентамина был выбран метод ТСХ [29].

На основании изучения особенностей строения пентамина и возможных примесей было установлено, что оптимальное разделение исследуемых веществ может быть достигнуто при использовании в качестве сорбента силикагеля. За счет гидроксилированной поверхности силикагель является кислым сорбентом и позволяет разделять вещества, различающиеся кислотно-основными свойствами.

Обнаружение исследуемых объектов на хроматограммах проводили в парах йода. Было проведено определение чувствительности обнаружения зон исследуемых веществ указанным методом. Для этого наносили на хроматографическую пластинку уменьшающиеся количества (от 1,0 мкг до 0, мкг) спиртовых растворов пентамина, диэтилентриамина, пентаметилдиэтилентриамина. Чувствительность обнаружения веществ в парах йода составила 0,5 мкг.

Для оценки подвижности анализируемых веществ в различных растворителях на линию старта хроматографической пластинки с помощью микрошприца наносили 0,015 мл 5 % спиртового раствора пентамина и по 0,001 мл 1 % спиртовых растворов диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина. Пластинки подсушивали на воздухе до испарения спирта, хроматографировали восходящим способом до подъема фронта растворителя на 10 см выше линии старта. Подвижность исследуемых соединений оценивали по величине Rf.

Выбор оптимальной системы растворителей проводили с помощью математического планирования эксперимента по методу «латинского квадрата» [8]. При составлении плана «латинского квадрата» считали все использованные факторы независимыми, хотя на практике они могут в определенной степени взаимодействовать. План «латинского квадрата» включал по одному варианту хроматографирования в каждом столбце и в каждой строке. Путем математического планирования эксперимента методом «латинского квадрата» изучили влияние двух факторов на хроматографическое поведение пентамина, диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина [29]. В качестве фактора А использовали различные органические растворители (ацетон, метанол, этанол, бутанол и изопропиловый спирт (ИПС)), а в качестве фактора В – ледяную уксусную кислоту (ЛУК) и 25 % раствор аммиака, которые в зависимости от их количества влияют на величину рН системы растворителей. Выбор данных факторов основывался на физико-химических свойствах пентамина, диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина. Пентамин, представляющий собой четвертичную аммониевую соль, уступает по силе основности диэтилентриамину и пентаметилдиэтилентриамину, которые, являясь алифатическими аминами, также различаются между собой основными свойствами.

Схема планирования опытов по методу «латинского квадрата» представлена в табл. 1.1, а результаты хроматографирования пентамина, диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина представлены в табл. 1.2.

План «латинского квадрата» для пентамина и его примесей Ацетон Метанол Этанол Бутанол ИПС Результаты хроматографирования пентамина и возможных примесей -[NH3 25%] (9:1) -[NH3 25%] (6:4) 25% (1:1)] (5:5) -[NH3 25%] (6:4) -[NH3 25%] (5:5) 25% (1:1)] (6:4) -[NH3 25%] (5:5) -[NH3 25%] (7:3) 25% (1:1)] (8:2) -[NH3 25%] (8:2) -[NH3 25%] (9:1) 25% (1:1)] (6:4) 25% (1:1)] (9:1) Для разделения веществ важное значение имеет Rf между зонами. Поэтому в дальнейшем план «латинского квадрата» упростили, заменив значения Rf пятен на Rf. Эти данные были использованы для установления влияния определенных выше факторов А и В на хроматографическое поведение пентамина и его примесей методом дисперсионного анализа по известной методике [8]. По результатам дисперсионного анализа установили, что оба фактора являются значимыми, но меньшее влияние на хроматографическое разделение исследуемых веществ оказывает органический растворитель (фактор А). Более значимым для хроматографического разделения пентамина, диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина является фактор В, влияющий на рН системы растворителей. В связи с этим в дальнейших экспериментах варьировали этим фактором.

Анализ значений R f между зонами показал, что наибольшее значение Rf имеет для системы растворителей с ИПС, причем вторым компонентом хроматографической системы является 25 % раствор аммиака. Была поставлена серия экспериментов с системами растворителей состава ИПС – 25 % раствор аммиака, в которых варьировалось количество аммиака. Результаты хроматографирования представлены на рис. 1.1.

На основании анализа экспериментальных данных, представленных на рис. 1.1, определено, что хроматографическое разделение исследуемых веществ наблюдается во всех системах растворителей с ИПС. Однако в системах 3, 5 и 6 зоны веществ имеют вытянутую форму. Наибольшее значение Rf между зонами пентамина, диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина наблюдается в системе 1, которая является оптимальной для контроля чистоты пентамина.

Методика определения чистоты пентамина 0,1 г препарата растворяют в 10 мл 95 % спирта и перемешивают. На линию старта пластинки «Армсорб» или «Сорбфил» размером 7,515 см микропипеткой наносят 0,015 мл (150 мкг) раствора пентамина. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 минут, а затем помещают в камеру со смесью растворителей: изопропиловый спирт – 25 % раствор аммиака (5:2,5) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителя пройдет 3/4 пластинки, её вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение минут и проявляют в парах йода. На хроматограмме анализируемого образца наблюдается пятно, соответствующее пентамину с Rf 0,65–0,68. Допускается пятно от нанесенной пробы на линии старта. Не должно быть дополнительных пятен выше и ниже пятна пентамина.

Результаты хроматографирования считаются достоверными, если соблюдаются условия пригодности хроматографической системы. Для проверки пригодности хроматографической системы была проведена апробация выбранных условий хроматографического анализа пентамина на модельной смеси, состоящей из одинаковых количеств препарата и возможных примесей.

На рис. 1.2 представлена модельная хроматограмма, показывающая, что выбранные условия хроматографирования являются оптимальными и позволяют разделять пентамин, диэтилентриамин и пентаметилдиэтилентриамин.

По данной методике было проанализировано 10 серий пентамина.

Ряд промышленных серий пентамина имел дополнительные пятна, соответствующие стандартным образцам вещества свидетеля (СОВС) примесей диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина.

1 – раствор пентамина (Rf 0,65–0,68) 2 – раствор модельной смеси пентамина, диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина 3 – раствор диэтилентриамина (Rf 0,21–0,23) 4 – раствор пентаметилдиэтилентриамина (Rf 0,83–0,85) Рис. 1.2. Хроматограмма модельной смеси пентамина и возможных примесей в оптимальной системе растворителей Зоны, соответствующие специфическим примесям в образце пентамина, элюировали этиловым спиртом. Образцы примесей, полученные с хроматограммы, идентифицировали с помощью ИК-спектроскопии и элементного анализа. Сравнительная оценка полученных результатов проводилась с СОВС диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина. Результаты элементного анализа представлены в табл. 3.

Результаты элементного анализа примесей диэтилентриамина Наименование примесей Диэтилентриамина Пентаметилдиэтилентриамина данные ИК-спектры образцов примесей, полученных с хроматограммы, и СОВС примесей представлены на рисунках 1.3–1.6.

Рис. 1.3. ИК-спектр примеси диэтилентриамина, полученной с хроматограммы Рис. 1.4. ИК-спектр СОВС примеси диэтилентриамина Рис. 1.5. ИК-спектр примеси пентаметилдиэтилентриамина, полученной Рис. 1.6. ИК-спектр СОВС примеси пентаметилдиэтилентриамина Сравнительная оценка результатов элементного анализа и ИК-спектроскопии образцов примесей, полученных с хроматограммы промышленного образца пентамина, и СОВС примесей показала, что они идентичны.

Это позволяет сделать заключение, что примеси диэтилентриамина и пентаметилдиэтилентриамина действительно могут присутствовать в пентамине. В связи с тем, что рассмотренные примеси являются недопустимыми, предприятие-изготовитель усовершенствовало систему очистки данного препарата. Во всех образцах пентамина после дополнительной производственной очистки примесей обнаружено не было. На хроматограмме испытуемого препарата пентамина обнаруживается только зона пентамина с Rf 0,65–0,68.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана методика хроматографического контроля чистоты пентамина.

Предлагаемая методика контроля специфических примесей в пентамине была апробирована в ОТК ОАО «Усолье-Сибирский химфармкомбинат» и «Дальхимфарм» (г. Хабаровск) и включена в фармакопейные статьи предприятий на препараты «Пентамин» и «5 % раствор для инъекций пентамина».

1.2. Оптимизация условий и разработка методик хроматографического контроля чистоты аденозина и фосфадена 1.2.1. Выбор условий хроматографического анализа аденозина Аденозин и фосфаден – производные пурина N-гликозидной структуры. Общими фрагментами их молекул являются пуриновое основание (аденин) и углевод (рибоза), соединенные гликозидной связью по азоту в 9-м положении. Отличительный фрагмент структуры фосфадена – остаток фосфорной кислоты.

Фосфаден и аденозин обладают большой полярностью за счет наличия в структуре гидроксильных групп сахарного компонента. Остаток фосфорной кислоты в молекуле фосфадена придает ему более выраженные кислотные свойства, чем у остальных исследуемых веществ. Значения рН ОН-групп остатка фосфорной кислоты соответственно равны 1,0 и 6,2 [96].

Аденин, представляющий собой азотистое основание, характеризуется амфотерными свойствами. Аминогруппа аденина придает ему слабые основные свойства, а водород имидазольного цикла – слабые кислотные свойства.

В молекулах фосфадена и аденозина также присутствует аминогруппа, которая обусловливает их слабые основные свойства.

Инозин и ацетилинозин, имеющие в основе структуры гипоксантин, обладают кислотными свойствами за счет имидо-имидольной таутомерии (рис. 1.7).

Учитывая сходство химического строения возможных примесей с анализируемыми веществами, оптимальным методом их обнаружения следует считать метод ТСХ. Кроме того, наличие различных функциональных групп в структуре основных веществ и примесей создает для этого реальные предпосылки.

На основании изучения особенностей строения аденозина, фосфадена и их возможных примесей было установлено, что оптимальное разделение исследуемых веществ может быть достигнуто при использовании в качестве сорбента силикагеля. Он является кислым сорбентом и позволяет разделить вещества, учитывая различия в их кислотно-основных свойствах.

Для обнаружения исследуемых объектов на хроматограммах использовали раствор о-толидина [99] и облучение ультрафиолетовым (УФ) светом (длина волны 254 нм). Провели сравнение чувствительности обнаружения зон исследуемых веществ этими способами. Для этого наносили на хроматографическую пластинку уменьшающиеся количества 1%-ных водных растворов аденозина, фосфадена и возможных примесей (от 100 до 0,1 мкг). Чувствительность обнаружения веществ УФ-светом и о-толидиновым реактивом составила соответственно 0,5 и 2 мкг. Поэтому в дальнейшем детектирование их на хроматограммах осуществляли с помощью ультрафиолетового осветителя типа «ВИО-1» (светофильтры УФС-1, УФС-2, длина волны 254 нм).

Для оценки подвижности анализируемых веществ в различных растворителях на линию старта пластинки с помощью микрошприца наносили по 0,005 мл 1 % водных растворов фосфадена, аденина, аденозина, инозина, ацетилинозина, пластинки подсушивали на воздухе в течение 5 минут. Хроматографирование проводили восходящим способом до подъема фронта растворителя на 10 см выше линии старта. Подвижность исследуемых соединений оценивали по величине Rf.

Для выбора оптимальной подвижной фазы использовали математическое планирование эксперимента по плану «латинского квадрата» [6, 7].

1.2.2. Оптимизация условий хроматографического анализа аденозина и фосфадена методом математического планирования эксперимента Литературные данные [20, 54] и анализ физико-химических свойств аденозина, фосфадена и возможных примесей показали, что на их хроматографическое поведение наибольшее влияние оказывает создание определенной рН среды, что немаловажно в случае хроматографирования препаратов, обладающих кислотно-основными свойствами.

В связи с этим для выявления оптимальной подвижной фазы, позволяющей добиться разделения аденозина и фосфадена от возможных примесей, нами изучены двухкомпонентные системы растворителей, состоящие из органического растворителя и буферных растворов, создающих различные значения рН.

В качестве органических растворителей использовали бутанол, метанол, пропанол-2, этанол, ацетон. Другие органические растворители исключены на предварительной стадии испытаний как не отвечающие требованиям, предъявляемым к ним. В состав подвижной фазы, кроме органического растворителя, включали буферные растворы: аммиачный, фосфатный, боратный, фталатный, ацетатный.

Поиск оптимальной подвижной фазы проводили с помощью метода «латинского квадрата» [8]. При составлении плана «латинского квадрата»

для удобства считали все использованные факторы независимыми, хотя на практике они могут в определенной степени взаимодействовать. План «латинского квадрата» включал по одному варианту хроматографирования в каждой строке и в каждом столбце.

План «латинского квадрата» и результаты хроматографирования аденозина, инозина, ацетилинозина, фосфадена и аденина представлены в таблицах 1.4–1.6. На основании полученных данных рассчитали средние значения Rf пятен по каждому фактору для всех исследуемых веществ. Эти данные были использованы для определения влияния отдельных факторов методом дисперсионного анализа по известной методике [8]. По результатам дисперсионного анализа установили, что все факторы являются значимыми, но меньшее влияние оказывает состав буферного раствора.

План «латинского квадрата» для фосфадена, аденозина и их примесей бутанол метанол пропанол- этанол ацетон Результаты хроматографирования фосфадена и возможных примесей Система растворителей Результаты хроматографирования аденозина и возможных примесей Система растворителей Бутанол – аммиачный буфер (9:1) 0,00±0,01 0,08±0,01 0,00±0, Бутанол – фосфатный буфер (8:2) 0,40±0,01 0,07±0,01 0,10±0, Бутанол – боратный буфер (7:3) 0,43±0,01 0,00±0,01 0,00±0, Бутанол – фталатный буфер (6:4) 0,64±0,01 0,00±0,01 0,00±0, Бутанол – цетатный буфер (5:5) 0,78±0,01 0,52±0,01 0,83±0, Метанол – аммиачный буфер (7:3) 0,90±0,01 0,15±0,01 0,12±0, Метанол – фосфатный буфер (6:4) 0,31±0,01 0,25±0,01 0,23±0, Метанол – боратный буфер (5:5) 0,65±0,01 0,22±0,01 0,59±0, Метанол – фталатный буфер (9:1) 0,00±0,01 0,63±0,01 0,12±0, Метанол – ацетатный буфер (8:2) 0,00±0,01 0,19±0,01 0,18±0, Пропанол – аммиачный буфер (5:5) 0,60±0,01 0,10±0,01 0,10±0, Пропанол – фосфатный буфер (7:3) 0,39±0,01 0,20±0,01 0,30±0, Пропанол – боратный буфер (9:1) 0,43±0,01 0,13±0,01 0,25±0, Пропанол – фталатный буфер (8:2) 0,46±0,01 0,15±0,01 0,10±0, Пропанол – ацетатный буфер (6:4) 0,43±0,01 0,10±0,01 0,10±0, Этанол – аммиачный буфер (8:2) 0,25±0,01 0,32±0,01 0,64±0, Этанол – фосфатный буфер (9:1) 0,49±0,01 0,48±0,01 0,14±0, Этанол – боратный буфер (6:4) 0,63±0,01 0,57±0,01 0,68±0, Этанол – фталатный буфер (5:5) 0,74±0,01 0,88±0,01 0,85±0, Этанол – ацетатный буфер (7:3) 0,67±0,01 0,81±0,01 0,75±0, Ацетон – аммиачный буфер (6:4) 0,54±0,01 0,40±0,01 0,88±0, Ацетон – фосфатный буфер (5:5) 0,80±0,01 0,80±0,01 0,83±0, Ацетон – боратный буфер (8:2) 0,65±0,01 0,80±0,01 0,87±0, Ацетон – фталатный буфер (7:3) 0,72±0,01 0,88±0,01 0,87±0, Ацетон – ацетатный буфер (9:1) 0,41±0,01 0,81±0,01 0,65±0, Данные, полученные в результате хроматографирования фосфадена, аденозина, аденина, инозина, ацетилинозина, представили в виде графиков зависимости значения Rf от состава подвижной фазы (пример на рис. 1.8– 1.9) [6, 7].

Рис. 1.8. Зависимость Rf фосфадена и его примесей Примечание. Системы растворителей: 1 – бутанол-аммиачный буфер (9:1); 2 – метаноламмиачный буфер (7:3); 3 – пропанол-аммиачный буфер (5:5); 4 – этанол-аммиачный буфер (8:2); 5 – ацетон-аммиачный буфер (6:4).

Анализ полученных данных показал, что из всех систем растворителей пять позволяют отделить фосфаден, аденозин и аденин друг от друга. Такими подвижными фазами являются: аммиачный буфер – ацетон (4:6), фосфатный буфер – ацетон (5:5), боратный буфер – бутанол (3:7), фосфатный буфер – бутанол (2:8), фосфатный буфер – этанол (1:9). Однако при хроматографировании в трех системах растворителей зона фосфадена имеет растянутую форму. Поэтому оптимальными подвижными фазами являются системы: аммиачный буфер – ацетон (4:6) и фосфатный буфер – этанол (1:9).

Примечание. Системы растворителей: 1 – бутанол – аммиачный буфер (9:1); 2 – метанол – аммиачный буфер (7:3); 3 – пропанол – аммиачный буфер (5:5); 4 – этанол – аммиачный буфер (8:2); 5 – ацетон – аммиачный буфер (6:4).

Анализ результатов хроматографирования аденозина и возможных примесей показал, что четыре подвижные фазы являются оптимальными для разделения аденозина, инозина и ацетилинозина. Однако при хроматографировании в системах: фосфатный буфер – пропанол-2 (3:7) и боратный буфер – пропанол-2 (1:9) исследуемые вещества имеют зоны растянутой формы. Поэтому для определения чистоты аденозина в присутствии инозина и ацетилинозина можно рекомендовать системы: аммиачный буфер – ацетон (4:6) и ацетатный буфер – ацетон (l:9).

Таким образом, с помощью математического метода планирования эксперимента (план «латинского квадрата») найдено несколько систем растворителей, позволяющих разделить аденозин, фосфаден и возможные примеси.

Методика обнаружения примесей аденозина 0,1 г фосфадена растворяют в 5 мл воды, нагревая на водяной бане при температуре от 40 до 50 °С. 0,005 мл (100 мкг) испытуемого раствора фосфадена микрощприцем или калиброванным капилляром наносят на линию старта пластинки «Силуфол УФ-254», «Армсорб», «Сорбфил» или готовой пластинки Воскресенского силикагеля порциями, подсушивая каждую порцию. Пластинку высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут, затем помещают в систему растворителей аммиачный буфер – ацетон (4: 6) или фосфатный буфер – этанол (1:9) и хроматографируют восходящим методом.

Во избежание проявления краевого эффекта в камеру помещают полоску фильтровальной бумаги, погруженную в систему растворителей. Когда растворитель пройдет расстояние 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры и помещают в сушильный шкаф (температура 100– 105 °С) на 5–10 минут. Затем пластинку просматривают в УФ-свете (длина волны 254 нм). На хроматограмме должно быть одно темное пятно фосфадена с Rf 0,150±0,005.

Результаты хроматографирования фосфадена, аденозина, аденина приведены в табл. 1.7. Из представленных данных видно, что найденные оптимальные системы растворителей можно рекомендовать для хроматографического контроля чистоты фосфадена.

Методика обнаружения примесей инозина и ацетилинозина в аденозине 0,1 г аденозина растворяют в 5 мл воды, нагревая на водяной бане при температуре от 40 до 50 °С. 0,005 мл (100 мкг) испытуемого раствора аденозина микрошприцем или калиброванным капилляром наносят на линию старта пластинки «Силуфол УФ-254», «Армсорб», «Сорбфил» или готовой пластинки Воскресенского силикагеля порциями, подсушивая каждую порцию.

Пластинку высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут, затем помещают в систему растворителей: аммиачный буфер – ацетон (4:6) или ацетатный буфер – ацетон (1:9) и хроматографируют восходящим методом.

Во избежание проявления краевого эффекта в камеру помещают полоску фильтровальной бумаги, погруженную в систему растворителей. Когда растворитель пройдет расстояние 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры и помещают в сушильный шкаф (температура 100C) на 5–10 минут. Затем пластинку просматривают в УФ-свете (длина волны 254 нм). На хроматограмме должно быть одно темное пятно аденозина с Rf 0,51±0,04 (I система) и 0,45±0,05 (II система).

Результаты хроматографирования аденозина и возможных примесей представлены в табл. 1.7.

Хроматографическая подвижность аденозина, фосфадена Аммиачный буфер – ацетон (4:6) Фосфатный буфер – этанол (1: 9) Ацетатный буфер – ацетон (1:9) Таким образом, показана возможность выбора оптимальной подвижной фазы с помощью математического планирования эксперимента методом «латинского квадрата». Предлагаемый метод позволяет учесть одновременное влияние нескольких факторов на хроматографическое поведение аденозина, фосфадена и возможных примесей. Сравнительная оценка хроматографических систем показала, что их разделяющая способность увеличивается с возрастанием полярности растворителей.

Создание узкого интервала рН с помощью буферных растворов позволило установить состав оптимальной подвижной фазы для хроматографического контроля чистоты аденозина и фосфадена. Основными факторами, влияющими на хроматографическое поведение аденозина, фосфадена и возможных примесей, являются полярность растворителя и определенный интервал рН среды. Эти факторы были учтены при дальнейших исследованиях хроматографического поведения аденозина и фосфадена.

1.2.3. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического анализа фосфадена с использованием в качестве основного компонента подвижной фазы Фосфаден, аденозин и аденин различаются между собой кислотноосновными свойствами и гидрофильностью. Различие в гидрофильности исследуемых веществ было использовано при выборе подвижной фазы [27]. В качестве основного компонента подвижной фазы была выбрана вода очищенная как наиболее полярный и имеющий гидрофильную природу растворитель. Результаты хроматографирования представлены в таблице 1.8 и на рис. 1.10. Как следует из экспериментальных данных, расположение зон веществ на хроматограмме при использовании в качестве подвижной фазы воды дает основание полагать, что в данной хроматографической системе преобладающим фактором является взаимодействие веществ с подвижной фазой, так как вещества на хроматограмме располагаются в соответствии с их гидрофильностью. Фосфаден, аденозин, аденин имеет Rf соответственно 0,6; 0,58; 0,3.

Наибольшей подвижностью в воде характеризуется фосфаден (Rf 0,6), наименее подвижен аденин (Rf 0,3), не имеющий в структуре гидроксильных групп. Следовательно, хроматографическая подвижность исследуемых веществ в воде зависит от числа гидроксильных групп в молекуле.

Аденозин (Rf 0,58) мало отличается от фосфадена по хроматографической подвижности в этих условиях.

Для разделения аденозина и фосфадена было использовано их различие в химических свойствах. Поэтому в состав подвижной фазы вводили ледяную уксусную кислоту (табл. 1.8).

Как следует из табл. 1.8 и рис. 1.10, добавление уксусной кислоты к воде привело к увеличению подвижности фосфадена и аденина и практически не повлияло на хроматографическое поведение аденозина. В результате D Rf между фосфаденом и аденином составило 0,37. Однако значительно уменьшилось D Rf между аденином и аденозином (от 0, до 0,08).

Хроматографическая подвижность фосфадена, аденозина, аденина Система растворителей Примечание: Хроматографирование проводили параллельно на пластинках Воскресенского сикагеля, «Силуфол УФ-254», «Армсорб», «Сорбифил». На всех пластинках получены близкие значения величины Rf. * – форма пятна вытянутая.

Рис. 1.10. Зависимость Rf фосфадена, аденозина, аденина Примечание. Системы растворителей: 1. Вода; 2. Вода – СН3СООН (лед) (100:1);

3. Вода – СН3СООН (лед) (100:2,5); 4. Вода – СН3СООН (лед) (100:5); 5. Вода – 25 % NН3 (100:10); 6. Вода – 25 % NН3 (100:5); 7. Вода – 25 % NН3 (100:0,5); 8. Вода – 25 % NН3 (100:0,25); 9. Вода – 25 % NН3 (100:0,3).

Уменьшение количества ледяной уксусной кислоты в составе подвижной фазы (табл. 1.8., п.ф. №3) привело к снижению значения Rf аденина и разделению всех компонентов. Значение величины Rf фосфадена, аденозина и аденина при хроматографировании в системе растворителей вода – ледяная уксусная кислота (100:2,5) составило соответственно 0,81; 0,46; 0,23. Однако данную подвижную фазу нельзя считать оптимальной, так как зона фосфадена имеет вытянутую форму. Образование растянутой зоны фосфадена объясняется тем, что он диссоциирует в воде благодаря наличию выраженных кислотных свойств и, вероятно, скорость распределения диссоциированной и недиссоциированной форм между подвижной и неподвижной фазами различна. Для предотвращения элиптичности зон пользуются хроматографическими системами с различным интервалом значений рН [95].

Использование систем с добавлением уксусной кислоты не привело к получению правильно очерченной зоны фосфадена, что можно объяснить более высокой способностью к диссоциации фосфадена в сравнении с уксусной кислотой (рН фосфадена 6,2 [96]; рКа уксусной кислоты 4, [13]).

В дальнейшем хроматографирование проводили, добавляя к воде 25%-ный раствор аммиака. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 1.8 и на рис. 1.10. Введение аммиака в состав подвижной фазы увеличивает подвижность всех исследуемых веществ, нивелируя различие в их хроматографическом поведении. Обращает на себя внимание тот факт, что подвижность аденина резко возрастает. Если в воде он имеет Rf меньше аденозина, то в подвижной фазе вода – 25%-ный раствор аммиака (100:10) аденин имеет Rf выше аденозина и приближается по подвижности к фосфадену. Уменьшение в подвижной фазе аммиака до определенных количественных соотношений с водой восстанавливает дифференциацию в хроматографическом поведении исследуемых веществ и их взаимное расположение на хроматограмме аналогично системам, включающим уксусную кислоту.

Преимущество использования подвижных фаз, содержащих 25%-ный раствор аммиака, состоит в том, что при аналогичных значениях Rf зоны веществ, в том числе и фосфадена, имеют правильную форму. Оптимальной является подвижная фаза вода – 25%-ный раствор аммиака (100:0,5), в которой фосфаден, аденозин и аденин имеют Rf 0,8; 0,5; 0,3 соответственно.

Уменьшать количество аммиака в подвижной фазе не рекомендуется, так как это приводит к получению зоны фосфадена вытянутой формы.

Таким образом, в результате проведенных исследований подобрана оптимальная система растворителей для хроматографического разделения в тонком слое сорбента фосфадена, аденозина и аденина.

Методика обнаружения примесей аденозина и аденина в фосфадене 0,1 г фосфадена растворяют в 5 мл воды, нагревая на водяной бане при температуре от 40 до 50 °С. 0,005 мл (100 мкг) испытуемого раствора фосфадена микрошприцем или калиброванным капилляром наносят на линию старта пластинки «Силуфол УФ-254», «Армсорб», «Сорбфил» или готовой пластинки Воскресенского силикагеля порциями, подсушивая каждую порцию. Пластинку высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут, затем помещают в систему растворителей вода – 25%-ный раствор аммиака (100:0,5) и хроматографируют восходящим методом. Во избежание появления краевого эффекта в камеру помещают полоску фильтровальной бумаги, погруженную в систему растворителей.

Когда растворитель пройдет расстояние 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры и помещают в сушильный шкаф (температура 100– 105 °С) на 5-10 минут. Затем пластинку просматривают в УФ-свете (длина волны 254 нм).

На хроматограмме должно быть одно темное пятно, соответствующее фосфадену, Rf которого равно 0,85±0,05.

Таким образом, в результате изучения хроматографического поведения фосфадена, аденозина и аденина была разработана методика анализа, позволяющая с достаточной точностью судить о чистоте фосфадена.

1.2.4. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического анализа аденозина с использованием в качестве основного компонента подвижной фазы Аденозин, инозин, ацетилинозин различаются между собой кислотно-основными свойствами и гидрофильностью. По аналогии с фосфаденом, различие в гидрофильности исследуемых веществ было использовано при выборе подвижной фазы. В качестве основного компонента подвижной фазы была выбрана вода, позволяющая разделить вещества, отличающиеся кислотно-основными свойствами.

Результаты хроматографирования аденозина представлены в таблице 1.9 и на рис. 1.11. Как следует из приведенных данных, аденозин, инозин и ацетилинозин при хроматографировании их в воде отделяются друг от друга. Значения величины Rf пятен аденозина, инозина и ацетилинозина составляют соответственно 0,57; 0,73; 0,3.

Для более четкого разделения пятен необходимо увеличить D Rf между зонами, что позволяют сделать различия в кислотных свойствах исследуемых веществ и их гидрофильности. Для решения данной задачи в хроматографическую систему вводили кислоту и основание. При добавлении ледяной уксусной кислоты в подвижную фазу значительно увеличивается Rf инозина и уменьшается Rf аденозина, как вещества, не обладающего кислотными свойствами. Увеличение количества кислоты в подвижной фазе вызвало подавление кислотных свойств инозина и снижение его подвижности. Rf инозина изменилось от 0,88 до 0,81. Значения Rf аденозина и ацетилинозина изменилось незначительно.

Хроматографирование в подвижной фазе вода – 25%-ный раствор аммиака (100:0,25) показало, что хроматографическое поведение исследуемых веществ изменилось значительно, особенно ацетилинозина. Это можно объяснить увеличением способности исследуемых веществ к имидо-имидольной таутомерии и, в связи с этим, увеличением гидрофильных свойств данных веществ. В подвижной фазе вода – 25%-ный раствор аммиака (100:0,5) Rf ацетилинозина составляет 0,75. Введение в систему аммиака увеличивает подвижность аденозина (Rf 0,69), так как уменьшается в этом случае взаимодействие вещества, обладающего основными свойствами, с сорбентом кислого типа. Это приводит к уменьшению D Rf между инозином и аденозином до 0,16 и между ацетилинозином и инозином до 0,1. Таким образом, введение аммиака в состав подвижной фазы приводит к нивелированию различия в хроматографическом поведении исследуемых веществ и сближению зон веществ на хроматограмме.

Хроматографическая подвижность аденозина, инозина и ацетилинозина 7. Вода – 25 % NH3 – СH3COOH (л.) (100:0,25:0,25) 0,57±0,01 0,77±0,01 0,29±0, 8. Вода – 25 % NH3 – СH3COOH (л.) (100:0,25:0,5) 0,61±0,01 0,82±0,01 0,25±0, 9. Вода – 25 % NH3 – СH3COOH (л.) (100:0,25:0,75) 0,54±0,01 0,73±0,01 0,22±0, 10. Вода – 25 % NH3 – СH3COOH (л.) (100:0,25:1) 0,57±0,01 0,77±0,01 0,23±0, Примечание. Хроматографирование проводили параллельно на пластинках Воскресенского силикагеля, «Силуфол УФ-254», «Армсорб», «Сорбфил». На всех пластинках получены близкие значения величины Rf.

В ходе дальнейшего эксперимента хроматографирование проводили в подвижных фазах 7-10 (см. таблицу 1.9 и рис. 1.11). Добавление в состав подвижной фазы кислоты, дифференцирующей различие между аденозином, инозином и ацетилинозином, позволяет значительно увеличить D Rf между аденозином и ацетилинозином.

Рис. 1.11. Зависимость Rf аденозина и его примесей от состава Примечание. Состав системы растворителей: 1. Вода; 2. Вода – СН3СООН (лед) (100:1); 3. Вода – СН3СООН (лед) (100:0,5); 4. Вода – СН3СООН (лед) (100:5,5); 5. Вода – 25 % NН3 (100:0,5); 6. Вода – 25 % NН3 (100:0,25); 7. Вода – 25 % NН3 – СН3СООН (лед) (100:0,25:0,25); 8. Вода – 25 % NН3 – СН3СООН (лед) (100:0,25:0,5); 9. Вода – 25 % NН3 – СН3СООН (лед) (100:0,25:0,75); 10. Вода – 25 % NН3 – СН3СООН (лед) (100:0,25:1).

Из представленных экспериментальных данных следует, что наиболее оптимальными системами растворителей для разделения аденозина, инозина и ацетилинозина являются вода – 25%-ный раствор аммиака – ледяная уксусная кислота (100:0,25:0,5) и вода – ледяная уксусная кислота (100:1,05).

Методика обнаружения примесей инозина и ацетилинозина в аденозине 0,1 г аденозина растворяют в 5 мл воды, нагревая на водяной бане при температуре от 40 до 50 °С. Для анализа используют две хроматографические пластинки «Силуфол УФ-254», «Армсорб», «Сорбфил» или Воскресенского силикагеля.

На линию старта пластинок наносят по 0,005 мл (100 мкг) раствора аденозина порциями, подсушивая каждую порцию. Пластинки высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 5-10 минут, затем помещают в системы растворителей: первую – вода – 25%-ный раствор аммиака – ледяная уксусная кислота (100:0,25:0,5); вторую – вода – ледяная уксусная кислота (100:1,05) и хроматографируют восходящим методом.

Во избежание проявления краевого эффекта в камеры помещают полоски фильтровальной бумаги, погруженные в системы растворителей. Когда растворитель пройдет расстояние 10 см от линии старта, пластинки вынимают из камер и помещают в сушильный шкаф (температура 100–105 °С) на 5–10 минут. Затем пластинки просматривают в УФ-свете (длина волны 254 нм). На хроматограммах должно быть одно темное пятно аденозина с Rf 0,55 ± 0,05.

Апробацию выбранных условий хроматографического анализа фосфадена и аденозина проводили на модельных смесях, состоящих из препаратов и возможных примесей. Результаты хроматографического контроля модельных смесей препаратов с добавками примесей представлены на рис. 1.12 (а, б, в).

Рис. 1.12. Хроматограммы модельных смесей фосфадена и аденозина Примечание: фосфаден (а-1), аденозин (а-2; б-1; в-1), аденин (а-3), инозин (б-2; в-2), ацетилинозин (б-3; в-3).

а-система – вода – 25 %-ный раствор аммиака (100:0,5); б-система – вода – 25 %-ный раствор аммиака – ледяная уксусная кислота (100:0,25:0,5); в-система – вода – ледяная уксусная кислота (100:1,05).

Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны методики хроматографического контроля чистоты фосфадена и аденозина. Эти методики были использованы для оценки стабильности лекарственных средств в процессе хранения. Использование метода хроматографии в тонком слое сорбента позволило сократить продолжительность испытания чистоты аденозина и фосфадена до одного часа.

Методики хроматографического контроля чистоты аденозина и фосфадена, содержащие экологически чистые и легко доступные растворители, защищены Патентом РФ на изобретение [236] и внедрены в практику работы ОТК Усолье-Сибирского химико-фармацевтического комбината.

1.3. Оптимизация условий и разработка методики хроматографического контроля чистоты Ксантинола никотинат представляет собой соль, образованную органическим основанием – ксантинолом и органической никотиновой кислотой. Основание ксантинола является производным теофиллина, который в 7-м положении имеет 2-окси-3-(N-метил-b-гидроксиэтиламино)пропильный радикал.

Исходя из способа получения ксантинола никотината, в качестве возможных примесей в нем могут быть: исходный продукт синтеза – теофиллин и промежуточный продукт синтеза – 7-(2-окси-3-хлорпропил)теофиллин. Рекомендованная НД [34] система растворителей для хроматографического контроля чистоты ксантинола никотината не позволяет обнаружить примеси 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллин. Поэтому были проведены исследования по выбору другой подвижной фазы.

Общим структурным фрагментом ксантинола никотината, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина является ядро пурина. Пурин представляет собой конденсированную гетероциклическую систему, состоящую из двух циклов пиримидина и имидазола. Наличие гетероциклических атомов азота придает производным пурина основные свойства. Наличие в молекуле ксантинола никотината в 7-м положении аминоалкильного радикала придает ему более выраженные основные свойства, чем у остальных исследуемых веществ. За счет подвижного атома водорода в 7-м положении теофиллин проявляет слабые кислотные свойства. Одним из основных структурных фрагментов ксантинола никотината является никотиновая кислота. За счет карбоксильной группы никотиновая кислота обладает кислотными свойствами, а наличие третичного атома азота придает ей слабые основные свойства. В связи с этим никотиновая кислота проявляет амфотерные свойства.

Таким образом, ксантинола никотинат, никотиновая кислота, теофиллин и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллин проявляют и кислотные, и основные свойства. Наличие различных функциональных групп в их молекулах либо усиливает, либо ослабляет эти свойства.

Учитывая сходство химического строения возможных примесей с анализируемым веществом, оптимальным методом их разделения следует считать метод ТСХ.

На основании изучения особенностей строения ксантинола никотината, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина было установлено, что оптимальное разделение исследуемых веществ может быть достигнуто при использовании в качестве сорбента силикагеля. Являясь кислым сорбентом, он позволяет разделить вещества, обладающие кислотноосновными свойствами. Обнаружение зон веществ на хроматограмме осуществляли путем просматривания в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Были определены чувствительности обнаружения зон исследуемых веществ указанным способом. Для этого наносили на хроматографическую пластинку уменьшающиеся количества (от 1,0 мг до 0,1 мг) спиртовых растворов ксантинола никотината, теофиллина, никотиновой кислоты и 7-(2-окси-3 хлорпропионил)-теофиллина. Чувствительность обнаружения составила 0,5мкг.

Для оценки хроматографической подвижности исследуемых веществ на линию старта хроматографической пластинки наносили по 0,02 мл 2 % водно-спиртового раствора ксантинола никотината, 0,6 % спиртового раствора никотиновой кислоты и 0,01 % спиртовых растворов теофиллина и 7-(2-окси-3 хлорпропил)-теофиллина. Затем подсушивали пластинки на воздухе до испарения спирта и хроматографировали восходящим способом до подъема фронта растворителя на 10 см выше линии старта. Подвижность исследуемых соединений оценивали по величине Rf.

Для выбора оптимальной подвижной фазы провели анализ физикохимических свойств ксантинола никотината, никотиновой кислоты и возможных примесей. Известно, что немаловажное значение для хроматографирования препаратов, обладающих кислотно-основными свойствами, имеет создание определенной рН среды. В связи с этим для выявления оптимальной подвижной фазы, позволяющей добиться разделения ксантинола, никотиновой кислоты и возможных примесей, были изучены двухкомпонентные системы растворителей, состоящие из органического растворителя и ледяной уксусной кислоты (либо 25 % раствора аммиака), создающие различные значения рН среды [28]. Хроматографическое поведение исследуемых веществ изучали в различных системах растворителей (табл.

1.10). Как следует из полученных экспериментальных данных (табл. 1.10), в сильнополярных растворителях зона ксантинола имеет вытянутую форму, а зоны всех других веществ не отличаются по хроматографической подвижности. В малополярных растворителях зоны всех исследуемых соединений остаются на линии старта. На основании анализа полученных результатов в качестве органической фазы выбрали ацетон как растворитель, обладающий средней полярностью и хорошо смешивающийся с водными растворами. Ксантинол, никотиновая кислота, теофиллин и 7-(2-окси-3хлорпропил)-теофиллин в ацетоне имеют Rf соответственно 0; 0; 0,61 и 0,72. Наибольшей подвижностью в ацетоне характеризуется 7-(2-окси-3хлорпропил)-теофиллин (Rf 0,72), наименее подвижны ксантинол и никотиновая кислота (Rf 0), отличающиеся более выраженными кислотноосновными свойствами.

Используя различия ксантинола и никотиновой кислоты в химических свойствах, для их разделения в состав системы растворителей вводили ледяную уксусную кислоту. На рис. 1.13 представлены состав систем растворителей (СР) и результаты хроматографирования ксантинола никотината и возможных примесей в виде хроматографической диаграммы.

Добавление ледяной уксусной кислоты к ацетону приводит к увеличению подвижности всех исследуемых веществ (рис. 1.13, СР № 2). Значение Rf ксантинола, никотиновой кислоты и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина составило соответственно 0,5; 0,55; 0,66; 0,77. Значение Rf между зонами ксантинола и никотиновой кислоты составило 0,05, а между зонами других соединений – 0,11.

Хроматографическая подвижность ксантинола, никотиновой кислоты, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина Этилацетат 6,4 0,00±0,01 0,00±0,01 0,00±0,01 0,00±0, Ацетон – CH3COOH 0,50±0,02 0,55±0,02 0,66±0,02 0,77±0, Ацетон NH3(25 %) 0,41±0,02 0,03±0,01 0,24±0,02 0,77±0, Примечание: хроматографирование проводили параллельно на пластинках «Силуфол УФ-254», «Армсорб УФ-254», «Сорбфил УФ-254». На всех пластинках получены близкие значения величины Rf. * – форма пятна вытянутая.

Для более надежного разделения зон ксантинола и никотиновой кислоты увеличили количество ледяной уксусной кислоты в системе растворителей. Увеличение количества ледяной уксусной кислоты в составе подвижной фазы привело к снижению подвижности ксантинола и никотиновой кислоты и получению зоны никотиновой кислоты вытянутой формы (рис. 1.13, СР № 3;4). Следует отметить, что хроматографическая подвижность исследуемых веществ в системах с ледяной уксусной кислотой в большей степени зависит от проявления ими основных свойств. Никотиновая кислота, имеющая более выраженные кислотные свойства, в системах с ледяной уксусной кислотой диссоциирует. Зона никотиновой кислоты имеет вытянутую форму в связи с тем, что скорость распределения диссоциированной и недиссоциируемой форм между подвижной и неподвижной фазами различна.

Рис. 12. Зависимость значения Rf ксантинола (1), никотиновой кислоты (2), теофиллина (3), 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина (4) от состава систем Состав систем растворителей:

2 – ацетон – ледяная уксусная кислота (9:0,5), 3 – ацетон – ледяная уксусная кислота (9:1), 4 – ацетон – ледяная уксусная кислота (9:2), 5 – ацетон – 25 % раствор аммиака – ледяная уксусная кислота (9:1:1), 6 – ацетон – 25 % раствор аммиака – ледяная уксусная кислота (9:0,5:1), 7 – ацетон – 25 % раствор аммиака – ледяная уксусная кислота (9:0,5:0,5), 8 – ацетон – 25 % раствор аммиака (9:2), 9 – ацетон – 25 % раствор аммиака (9:1), 10 – ацетон – 25 % раствор аммиака (9:0,5) Для предотвращения эллиптичности зон, как правило, пользуются хроматографическими системами с различным интервалом значений рН [375]. В дальнейшем хроматографирование проводили, добавляя к ацетону с ледяной уксусной кислотой 25 % раствор аммиака. Добавление аммиака к системе с уксусной кислотой привело к увеличению подвижности ксантинола и никотиновой кислоты и сближению зон теофиллина и 7-(2-оксихлорпропил)-теофиллина (рис. 12, СР № 5). Уменьшение количества аммиака по отношению к ледяной уксусной кислоте восстанавливает дифференциацию в хроматографическом поведении исследуемых веществ (рис.

1.13, СР № 6). Значение Rf ксантинола, никотиновой кислоты, 7-(2-окси-3хлорпропил)-теофиллина составило соответсвенно 0,06; 0,53; 0,76 и 0,81. В данной подвижной фазе зоны ксантинола и никотиновой кислоты имеют вытянутые формы. Поэтому далее проводили хроматографирование в системах с добавлением 25 % раствора аммиака к ацетону (рис. 1.13, СР № 8;

9; 10). В системах основного характера наблюдалось разделение зон всех исследуемых веществ. Следует отметить, что зоны веществ имеют правильную форму, а в системе ацетон – 25 % раствор аммиака в соотношении 9:0,5 наблюдалось наибольшее значение Rf между зонами. Значение Rf ксантинола, кислоты никотиновой, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина в подвижной фазе ацетон – 25 % раствор аммиака (9:0,5) cоставило соответственно 0,41; 0,03; 0,24 и 0,77. Увеличение количества аммиака в данной системе растворителей не рекомендуется, так как это приводит к получению зоны ксантинола вытянутой формы.

Таким образом, подобрана оптимальная система растворителей для хроматографического разделения ксантинола, никотиновой кислоты, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина и разработана методика контроля чистоты ксантинола никотината методом хроматографии в тонком слое сорбента [28].

Методика определения чистоты ксантинола никотината 0,1 г препарата растворяют в 1 мл воды, прибавляют 4 мл спирта 95 % и перемешивают. На линию старта пластинки «Силуфол УФ-254», «Армсорб УФ-254», «Сорбфил УФ-254» или другой подходящей пластинки размером 7,515 см микропипеткой наносят 0,02 мл (400 мкг) раствора препарата в виде полосы длиной 1,0 см и шириной не более 0, см. Рядом наносят 0,02 мл 0,6 % раствора стандартного образца вещества свидетеля (СОВС) никотиновой кислоты в спирте 95% в виде полосы длиной 1,0 см и шириной не более 0,3 см, а также наносят 0,02 мл 0,01 % раствора СОВС теофиллина в спирте 95% и 0,02 мл 0,01 % раствора СОВС 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина в спирте 95 % и сушат на воздухе в течение 5 минут. Затем пластинку помещают в камеру со смесью растворителей ацетон – 25 % раствор аммиака (9:0,5) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителя пройдет 3/ длины пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 10 минут и просматривают в УФ свете при длине волны 254 нм. На хроматограмме анализируемого образца должно наблюдаться пятно основания препарата с Rf 0,40–0,42 и пятно никотиновой кислоты с Rf 0,03– 0,05, расположенные на уровне пятна СОВС. Пятна примесей теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина на хроматограмме испытуемого препарата не должны превышать по совокупности и интенсивности окраски пятна СОВС (не более 0,5 % в препарате).

Для проверки пригодности хроматографической системы было проведено хроматографирование модельной смеси, состоящей из одинаковых количеств ксантинола никотината, никотиновой кислоты, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина в выбранных оптимальных условиях.

Результаты хроматографического контроля модельной смеси препарата с добавками примесей представлены на рис. 1.14. Видно, что в разработанных условиях происходит четкое разделение зон соответственно ксантинола, никотиновой кислоты и возможных примесей.

По данной методике было проанализировано 10 производственных серий ксантинола никотината. В некоторых сериях ксантинола никотината кроме примеси теофиллина было обнаружено наличие примеси 7-(2-оксихлорпропил)-теофиллина, которые по совокупности величины и интенсивности окраски превышали 0,5 % в препарате. Пятна примесей теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина элюировали с хроматограммы этиловым спиртом и идентифицировали с помощью элементного анализа и ИК-спектроскопии. Результаты элементного анализа представлены в табл. 1.11.

1 – ксантинола никотинат; 2 – никотиновая кислота; 3 – теофиллин; 4 – 7-(2-окси-3хлорпропил)-теофиллин; 5 – модельная смесь ксантинола никотината, теофиллина и 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина. Система растворителей – ацетон – 25% раствор аммиака (9:0,5) Рис. 1.14. Хроматограмма модельной смеси ксантинола никотината в оптимальной системе растворителей ИК-спектры образцов примесей, полученные с хроматограммы ксантинола никотината и СОВС примесей, представлены на рис. 1.15–1.18.

Сравнительная оценка результатов элементного анализа и ИК-спектроскопии образцов примесей, полученных с хроматограммы промышленного образца ксантинола никотината и СОВС примесей, показала, что они идентичны. Это говорит о том, что в ксантиноле никотинате кроме примеси теофиллина может присутствовать примесь 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина.

Результаты элементного анализа примесей теофиллина Наименование Теофиллин хлорпропил)теоретические данные Рис. 1.15. ИК-спектр примеси теофиллина, полученный с хроматограммы Рис. 1.16. ИК-спектр СОВС примеси теофиллина Рис. 1.17. ИК-спектр примеси 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина, полученный Рис. 1.18. ИК-спектр СОВС примеси 7-(2-окси-3-хлорпропил)-теофиллина Разработанная методика хроматографического контроля чистоты ксантинола никотината позволила определить завышенное содержание примесей в промышленных сериях препарата. На основании данных исследований предприятие-изготовитель усовершенствовало систему очистки ксантинола никотината. При повторном анализе производственных серий ксантинола никотината установлено, что во всех образцах было обнаружено не более 0,5 % примесей. На хроматограмме испытуемого препарата обнаруживается зона ксантинола, имеющая Rf 0,40–0,42, никотиновой кислоты – 0,03–0,05, теофиллина – 0,24–0,26 и 7-(2-окси-3-хлорпропил)теофиллина – 0,77–0,79, не превышающие по совокупности величины и интенсивности окраски пятна СОВС теофиллина и СОВС 7-(2-окси-3хлорпропил)-теофиллина (не более 0,5 % в препарате).

Представленная методика хроматографического контроля чистоты ксантинола никотината включена в Фармакопейную статью предприятия ОАО «Усолье-Сибирский химфармкомбинат» на препарат «Ксантинола никотинат», внедрена в практику работы отдела технического контроля данного предприятия и защищена Патентом РФ на изобретение [57].

1.4. Оптимизация условий и разработка методик хроматографического контроля чистоты фтивазида Фтивазид, метазид и гидразид изоникотиновой кислоты (ГИНК) представляют собой производные пиридина. Общими фрагментами их молекул являются изоникотиновая кислота и гидразин, в результате взаимодействия которых между собой образуется альдиминная группа атомов.

Отличительной особенностью структуры фтивазида и метазида является наличие остатка альдегида-ванилина или формальдегида соответственно.

Фтивазид, метазид и ГИНК обладают окислительно-восстановительными свойствами за счет остатка гидразина. Данные соединения характеризуются амфотерными свойствами. Азот пиридинового цикла придает им слабые основные свойства, а альдиминная группа атомов – слабые кислотные свойства. В молекуле фтивазида присутствует остаток ванилина, который за счет наличия фенольного гидроксила усиливает его кислотные свойства.

Метазид, представляющий собой продукт конденсации двух молекул ГИНК и формальдегида, обладает более сильными основными свойствами.

Ванилин проявляет окислительно-восстановительные и кислотные свойства за счет альдегидной группы и фенольного гидроксила соответственно.

Учитывая сходство химического строения возможных примесей с анализируемыми веществами, оптимальным методом их обнаружения следует считать метод ТСХ. Наличие различных функциональных групп в структуре основных веществ и примесей создает для этого реальные предпосылки.

На основании изучения особенностей строения фтивазида, метазида и их возможных примесей было установлено, что оптимальное разделение исследуемых веществ может быть достигнуто при использовании в качестве сорбента силикагеля. Для обнаружения исследуемых объектов на хроматограммах использовали облучение УФ-светом (длина волны 254 нм).

Было проведено определение чувствительности обнаружения зон исследуемых веществ указанным способом. Для этого наносили на хроматографическую пластинку уменьшающиеся количества (от 1,0 мкг до 0,1 мкг) спиртовых растворов фтивазида, метазида, ГИНК и ванилина. Чувствительность обнаружения веществ УФ светом составила 0,5 мкг. В дальнейшем детектирование веществ на хроматограммах осуществлялось с помощью УФ-осветителя.

Для оценки подвижности анализируемых веществ в различных растворителях на линию старта готовых хроматографических пластинок («Силуфол УФ-254», «Сорбфил УФ-254», «Армсорб УФ-254») с помощью микрошприца наносили по 0,02 мл 5 % спиртовые растворы фтивазида и метазида, 0,01 мл 0,01 % раствора ГИНК и 0,02 мл 0,01 % раствора ванилина. Пластинки подсушивали на воздухе до испарения спирта, хроматографировали восходящим способом до подъема фронта растворителя на см выше линии старта. Подвижность исследуемых соединений оценивали по величине Rf.

Для выбора оптимальной подвижной фазы было изучено хроматографическое поведение фтивазида, метазида, ГИНК и ванилина в различных растворителях. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 1.12.

Хроматографическая подвижность фтивазида, метазида, ГИНК и ванилина в различных растворителях Растворитель Изопропанол 18,3 0,50±0,01 0,48±0,01 0,31±0,01 0,28±0, Этилацетат 6,40 0,00±0,01 0,44±0,01 0,00±0,01 0,00±0, Примечание: e - диэлектрическая проницаемость растворителей; хроматографирование проводили на готовых пластинках «Силуфол УФ-254», «Сорбфил УФ-254», «Армсорб УФ-254». Получены одинаковые результаты.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«Министерство образования Российской Федерации Государственное образовательное учреждение “ Красноярский государственный педагогический университет им. В.П. Астафьева” Г.Ф. Быконя Казачество и другое служебное население Восточной Сибири в XVIII - начале XIX в. (демографо-сословный аспект) Красноярск 2007 УДК 93 (18-19) (571.5); 351-755 БКК 63.3 Б 95 Ответственный редактор: Н. И. Дроздов, доктор исторических наук, профессор Рецензенты: Л. М. Дамешек, доктор исторических наук, профессор А. Р....»

«Л. Л. МЕШКОВА И. И. БЕЛОУС Н. М. ФРОЛОВ ЛОГИСТИКА В СФЕРЕ МАТЕРИАЛЬНЫХ УСЛУГ НА ПРИМЕРЕ СНАБЖЕНЧЕСКОЗАГОТОВИТЕЛЬНЫХ И ТРАНСПОРТНЫХ УСЛУГ • ИЗДАТЕЛЬСТВО ТГТУ • Министерство образования Российской Федерации Тамбовский бизнес-колледж Л. Л. Мешкова, И. И. Белоус, Н. М. Фролов ЛОГИСТИКА В СФЕРЕ МАТЕРИАЛЬНЫХ УСЛУГ НА ПРИМЕРЕ СНАБЖЕНЧЕСКО-ЗАГОТОВИТЕЛЬНЫХ И ТРАНСПОРТНЫХ УСЛУГ Издание второе, исправленное и переработанное Тамбов...»

«Международная Академия Информатизации Цыганков В.Д., Соловьев С.В., Шарифов С.К., НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРИБОРОВ БИОМЕДИС   Отличительные особенности  научного подхода  БИОМЕДИС Москва 2013 1  УДК 615.844 С 14     Цыганков В.Д., Соловьев С.В., Шарифов С.К. Научные основы приборов БИОМЕДИС Отличительные особенности научного подхода. М. БИОМЕДИС. 2013. – 126 с. Коллективная монография посвящена теоретическим аспектам и прикладным вопросам разработки и применения гаммы медицинских приборов биорезонансной...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию РФ Владивостокский государственный университет экономики и сервиса _ ОБЕСПЕЧЕНИЕ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ (методологический аспект) Монография Владивосток Издательство ВГУЭС 2009 ББК 65.35 О 13 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ РЫБОХОО 13 ХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ (методологический аспект) / авт.-сост. А.П. Латкин, О.Ю. Ворожбит, Т.В. Терентьева, Л.Ф. Алексеева, М.Е. Василенко,...»

«МИНИСТЕРСТВО  ОБРАЗОВАНИЯ  И  НАУКИ  РОССИЙСКОЙ  ФЕДЕРАЦИИ  СИБИРСКИЙ  ФЕДЕРАЛЬНЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ  ИНСТИТУТ  ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОГО  МОДЕЛИРОВАНИЯ  СО  РАН  Е. Н. Заворуева, В. В. Заворуев, С. П. Крум  ЛАБИЛЬНОСТЬ ПЕРВОЙ ФОТОСИСТЕМЫ ФОТОТРОФОВ   В РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ  Монография  Красноярск  СФУ  2011  УДК  574.24  ББК  28.073  З-13        Рецензенты:   Р. А. Карначук, зав. кафедрой физиологии растений и биотехнологии,  доктор биологических наук, профессор Биологического института ТГУ; ...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования Международный государственный экологический университет имени А. Д. Сахарова Факультет мониторинга окружающей среды Кафедра энергоэффективных технологий О. И. Родькин ПРОИЗВОДСТВО ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО БИОТОПЛИВА В АГРАРНЫХ ЛАНДШАФТАХ: ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ Минск 2011 УДК 620.9:573:574 ББК 31.15:28.0:28.081 Р60 Рекомендовано к изданию НТС МГЭУ им. А.Д.Сахарова (протокол № 10 от 1 декабря 2010 г.) Автор: О. И....»

«Министерство образования и наук и Российской Федерации САНКТПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕЖДУНАРОДНЫЕ ОТНОШЕНИЯ И ДИАЛОГ КУЛЬТУР Под ред. И. Д. Осипова, С. Н. Погодина СанктПетербург Издательство Политехнического университета 2011 УДК 332 ББК Ф66 М43 Рецензенты: Доктор философских наук, профессор СПбГУ А. И. Бродский Доктор философских наук, профессор СПбГУ А. И. Стребков Редколлегия монографии: В. М. Никифоров, О. К. Павлова, И. Р. Тростинская...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЭКОНОМИКИ, СТАТИСТИКИ И ИНФОРМАТИКИ (МЭСИ) Худоренко Е.А., Назарова Е.А., Черевык К.А. РОЛЬ ИННОВАЦИОННЫХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ФОРМИРОВАНИИ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОГО ВЫПУСКНИКА ВУЗА С ОГРАНИЧЕННЫМИ ВОЗМОЖНОСТЯМИ ЗДОРОВЬЯ Монография Москва, 2011 1 УДК 378 ББК 74 X 981 Худоренко Е.А., Назарова Е.А., Черевык К.А. РОЛЬ ИННОВАЦИОННЫХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ФОРМИРОВАНИИ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОГО...»

«ISSN 2072-1692. Гуманітарний вісник ЗДІА. 2013. № 52 УДК 37.013.73 МАРЕК ГРАМЛЕВИЧ (доктор социологических наук, научный сотрудник) Университет имени Яна Кохановского в Кельцах, Польша E-mail: marekgmlewicz@wps.pl ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ СОЦИАЛЬНОЙ РАБОТЫ Дается анализ особенностей современной социальной работы, рассматривается динамика и структура безработицы, факторы и последствия ее распространения, роль государства в поддержке безработных и их семей. Автор ссылается на...»

«Сибирский государственный индустриальный университет Виктор Медиков К основам демографии Издание 2-е, переработанное и дополненное Новокузнецк 2010 2 Сибирский государственный индустриальный университет Виктор Медиков К основам демографии Научно-популярное издание Издание 2-е, переработанное и дополненное Новокузнецк 2010 3 ББК 65.050.2 М 42 Рецензенты: Профессор, доктор педагогических наук, директор Центра межотраслевых программ подготовки кадров МАГМУ Балбеко А.М. Профессор, доктор...»

«Российская Академия Наук Институт философии А.А. Михалев ПРОБЛЕМА КУЛЬТУРЫ В ЯПОНСКОЙ ФИЛОСОФИИ К. НИСИДА и Т. ВАЦУДЗИ Москва 2010 УДК 14 ББК 87.3 М 69 В авторской редакции Рецензенты доктор филос. наук В.Г. Буров доктор филос. наук С.В. Чугров Михалев, А.А. Проблема культуры в японской М 69 философии. К. Нисида и Т. Вацудзи [Текст] / А.А. Михалев ; Рос. акад. наук, Ин-т философии. – М.: ИФ РАН, 2010. – 77 с. ; 17 см. – Библиогр. в примеч.: с. 70–76. – 500 экз. – ISBN 978-5-9540Монография...»

«Социальное неравенство этнических групп: представления и реальность Электронный ресурс URL: http://www.civisbook.ru/files/File/neravenstvo.pdf Перепечатка с сайта Института социологии РАН http://www.isras.ru/ СОЦИАЛЬНОЕ НЕРАВЕНСТВО НЕРАВЕНСТВО ЭТНИЧЕСКИХ ГРУПП: ПРЕДСТАВЛЕНИЯ И РЕАЛЬНОСТЬ МОСКВА 2002 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭТНОЛОГИИ ИНСТИТУТ И АНТРОПОЛОГИИ СОЦИОЛОГИИ Международный научно исследовательский проект Социальное неравенство этнических групп и проблемы...»

«М.П. Карпенко ТЕЛЕОБУЧЕНИЕ Москва 2008 УДК 371.66:654.197 ББК 74.202 К26 Карпенко М.П. Телеобучение. М.: СГА, 2008. 800 с. ISBN 978-5-8323-0515-8 Монография посвящена описанию исследований, разработки, внедрения и опыта применения телеобучения – новой методологии обучения, базирующейся на использовании информационно-коммуникационных технологий, которая уверенно входит в практику деятельности разнообразных учебных заведений различных форм и уровней. При этом телеобучение охватывает не только...»

«Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации ГОУ ВПО “Ижевская государственная медицинская академия” ГОУ ВПО “Башкирский государственный медицинский университет” ГУЗ “Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы” МЗ СР ЧР Бабушкина Карина Аркадьевна Халиков Айрат Анварович Маркелова Надежда Михайловна ТЕРМОДИНАМИКА КРОВОПОДТЕКОВ В РАННЕМ ПОСТМОРТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ Монография Ижевск – Уфа – Чебоксары 2008 УДК 340.624.6:616-003.214 ББК 58+54.58 Б 129 Ре...»

«Российский государственный педагогический университет им. А.И.Герцена Н.А. ВЕРШИНИНА СТРУКТУРА ПЕДАГОГИКИ: МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Монография Санкт-Петербург 2008 УДК 37.013 Печатается по решению ББК 74.2 кафедры педагогики В 37 РГПУ им. А.И. Герцена Научный редактор: чл.-корр. РАО, д-р пед. наук, проф. А.П. Тряпицына Рецензенты: д-р пед.наук, проф. Н.Ф. Радионова д-р пед.наук, проф. С.А. Писарева Вершинина Н.А. Структура педагогики: Методология исследования. Монография. – СПб.: ООО Изд-во...»

«Российская Академия наук Институт всеобщей истории Л.П.МАРИНОВИЧ ГРЕКИ и Александр МАКЕДОНСКИЙ К ПРОБЛЕМЕ КРИЗИСА ПОЛИСА НАУКА Издательская фирма Восточная литература 1993 ББК 63.3(0)322 26 Ответственный редактор Е. С. ГОЛУБЦОВА Редактор издательства И. Г. ВИГАСИНА Маринович Л. П. М26 Греки и Александр Македонский (К проблеме кризиса полиса).— М.: Наука. Издательская фирма Восточная литература, 1993.— 287 с. ISBN 5-02- Монография посвящена тому трагическому для греков периоду, когда они вели...»

«К.В. Давыдов АДМИНИСТРАТИВНЫЕ РЕГЛАМЕНТЫ ФЕДЕРАЛЬНЫХ ОРГАНОВ ИСПОЛНИТЕЛЬНОЙ ВЛАСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ: ВОПРОСЫ ТЕОРИИ Монография nota bene ББК 67 Д 13 Научный редактор: Ю.Н. Старилов доктор юридических наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, заведующий кафедрой административного и муниципального права Воронежского государственного университета. Рецензенты: Б.В. Россинский доктор юридических наук, профессор, заслуженный юрист Российской Федерации, действительный член...»

«Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ Э.С.ЯРМУСИК КАТОЛИЧЕСКИЙ КОСТЕЛ В БЕЛАРУСИ В ГОДЫ ВТОРОЙ МИРОВОЙ ВОЙНЫ (1939–1945) Монография Гродно 2002 pawet.net УДК 282: 947.6 ББК 86.375+63.3(4Беи)721 Я75 Рецензенты: доктор исторических наук, профессор кафедры истории Беларуси нового и новейшего времени БГУ В.Ф.Ладысев; кандидат исторических наук Григорианского университета в Риме, докторант Варшавского...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Владивостокский государственный университет экономики и сервиса _ Л.А. НИКОЛАЕВА О.В. ЛАЙЧУК ФОРМИРОВАНИЕ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИНФОРМАЦИОННОГО СЕКТОРА ЭКОНОМИКИ И ПРОБЛЕМЫ ОЦЕНКИ ЕГО ПОТЕНЦИАЛА Монография Владивосток Издательство ВГУЭС 2007 ББК 65.01 Н 62 Рецензенты: А.И. Латкин, д-р экон. наук, профессор (ВГУЭС); В.А. Останин, д-р экон. наук, профессор (ДВГУ) Николаева Л.А., Лайчук О.В. Н 62 ФОРМИРОВАНИЕ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИНФОРМАЦИОННОГО СЕКТОРА...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тамбовский государственный технический университет С.П. СПИРИДОНОВ ТЕОРИЯ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ СИСТЕМНЫХ ИНДИКАТОРОВ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА ЖИЗНИ Рекомендовано экспертной комиссией по экономическим наукам при Научно-техническом совете университета в качестве монографии Тамбов Издательство ФГБОУ ВПО ТГТУ 2011 УДК...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.