WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«А.С. Сироткин, В.Б. Жукова ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Учебно-методическое пособие Казань КГТУ 2010 УДК 577.15:663/664(075.8) Теоретические основы биотехнологии:Учебно-методическое ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное агентство по образованию

Казанский государственный технологический

университет

А.С. Сироткин, В.Б. Жукова

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

БИОТЕХНОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Казань

КГТУ

2010

УДК 577.15:663/664(075.8)

Теоретические основы биотехнологии:Учебно-методическое

пособие /А.С. Сироткин, В.Б. Жукова; Казан. гос. технол. ун-т, Казань, 2010. 87 с.

ISBN 978-5-7882-0906-7 Учебно-методическое пособие по дисциплине «Теоретические основы биотехнологии» предназначено для студентов, обучающихся по специальности 24090165 – Биотехнология, а также по направлению подготовки бакалавров и магистров 550800 – Химическая технология и биотехнология.

Пособие содержит теоретические сведения из соответствующего лекционного курса, читаемого на кафедре промышленной биотехнологии по очной и очно-заочной формам обучения. Лекционный материал поддерживает осознанное выполнение заданий к лабораторным работам, а также помогает студентам успешно подготовиться к сдаче коллоквиумов по тематическим разделам учебной дисциплины, итоговых зачета и экзамена.

В части лабораторного практикума изучаются кинетические закономерности гибели микроорганизмов в процессе термического воздействия на микробные суспензии; роста микробных популяций на различных субстратах и рассматриваются аналитические методы определения параметров процесса культивирования клеток; исследуется влияние ингибиторов на рост микроорганизмов при различных способах культивирования.

Отдельными разделами приведены расчетные задания к семинарским занятиям, а также темы для самостоятельной работы.

В оформлении пособия принимала участие ведущий программист И.П.

Мужиковская.

Подготовлено на кафедре промышленной биотехнологии.

Табл. 8, Ил. 10. Библиогр. 24 ист.

Печатается по решению редакционно-издательского совета Казанского государственного технологического университета.

Рецензенты: заведующий кафедрой физиологии и биотехнологии растений Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина, д.б.н., профессор Т.В.

Багаева руководитель Центра аналитических исследований Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства РАСХН, к.б.н. Р.А. Шурхно © Казанский государственный технологический университет, 2010 г.

Оглавление Введение Тема 1. Асептика в биотехнологических процессах Стерилизация оборудования, питательных сред и воздуха Лабораторная работа 1. Изучение кинетики гибели микроорганизмов Контрольные вопросы Литература Тема 2. Метаболизм углеродсодержащего субстрата. Способы культивирования дрожжей на различных углеродных субстратах Лабораторная работа 2. Кинетика и стехиометрия роста микроорганизмов в процессе их периодического культивирования Контрольные вопросы Литература Тема 3. Ингибирование роста микроорганизмов в условиях периодического культивирования Лабораторная работа 3. Изучение влияния ингибиторов на рост микробной культуры методом острых опытов Контрольные вопросы Литература Расчетные задания к практическим занятиям Примерные темы самостоятельных работ к семинарским занятиям Введение В настоящий момент вряд ли у кого-нибудь может возникнуть сомнение в том, что современная биология представляет собой связанные между собой разделы научных знаний: микробиологию, анатомию растений и животных, биохимию, иммунологию, математику и много других областей естествознания.

исследованиях в области биохимии, молекулярной генетики и молекулярной биологии, достигнутые во второй половине текущего столетия, создали реальные предпосылки управления различными жизнедеятельности клетки. Сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического приложения результатов фундаментальных наук.

Можно с уверенностью утверждать, что биотехнология является наиболее разительным примером того, как результаты, казалось бы "чистой науки", находят применение в практической деятельности человека.

Основой, обеспечивающей благоприятную ситуацию для бурного развития биотехнологии, явились революционизирующие открытия и разработки:

• доказательства роли нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации в биологических системах (имеются в виду индивидуальные клетки и отдельные организмы, а не их популяции);

• расшифровка универсального для всех живых организмов генетического кода;

• раскрытие механизмов регуляции функционирования генов в процессе жизни одного поколения организмов;

• совершенствование существовавших и разработка новых технологий культивирования микроорганизмов, клеток растений и животных;

• как логическое следствие из вышесказанного, явилось создание (возникновение) и бурное развитие методов генетической и клеточной инженерии, с помощью которых искусственно создаются новые высокопродуктивные формы организмов, пригодные для использования в промышленных масштабах.

Все эти достижения вывели биотехнологию на новый уровень ее развития, позволяющий сознательно и целенаправленно управлять сложными клеточными процессами. Данная новая область биологических знаний и ее последние достижения стали крайне важными для здоровья и благополучия человека.

Тема 1. Асептика в биотехнологических процессах Стерилизация оборудования, питательных сред и воздуха Асептика (от греческого a – не, нет, sepsis – гниение) – это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение включая болезнетворные (патогенные). Следовательно, асептика в биотехнологии и в медицине, например, в хирургической практике – это не одно и то же понятие. В биотехнологических процессах предполагается использование какого-либо биообъекта (в том числе материальных потоков в биотехнологических процессах потенциальный источник микробов-контаминантов (от латинского contamination – загрязнение). В медицине стремятся исключить любую возможность попадания патогенных микробов и микробовконтаминантов на операционное поле или рану.

Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботёр (от фрацузского barbotage – перемешивание) и пр.

Следовательно, комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов включает: механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его механической защите относятся: удаление механических примесей (например, из воздуха) герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической – обработка воздуха и поверхностей приборов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической – обработка поверхностей химическими антисептиками.

Стерилизация – обеспложивание, т.е. полное уничтожение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах. Стерилизацию проводят физическими и химическими методами.

К физическим методам относятся:

1) воздействие высокой температуры;

2) ультрафиолетовое облучение;

3) стерилизующая фильтрация.

I. Физические методы стерилизации 1. Прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелки.

стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, пинцетов и других сопутствующих материалов.

2. Стерилизация кипячением. Этим методом стерилизуют мелкий инструментарий, предметные и покровные стекла и некоторые другие предметы. Их помещают в стерилизаторы, в которые наливают воду. Для устранения жесткости и повышения температуры кипения к воде добавляют 1-2 % раствор бикарбоната натрия. Кипячение производят не менее 30 минут. Однако данный метод не обеспечивает полной стерилизации, так как некоторые вирусы (например, вирус гепатита) и споры бактерий могут остаться жизнеспособными.

стерилизация в сушильном шкафу (в печи Пастера). Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165-180 оС воздуха. При более высокой температуре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре требуется большее время стерилизации. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду: чашки Петри, пробирки, пипетки и др.

4. Стерилизация паром под давлением в автоклаве. Один из наиболее эффективных методов стерилизации, который широко применяется в микробиологической практике. Работа с автоклавом требует точного выполнения специальной инструкции и соблюдения правил безопасности. Многие питательные среды и материалы стерилизуют при давлении 1 атм в течение 10-20 минут, питательные среды с углеводами – при 0,5 атм в течение 15 минут, а обеззараживание инфицированного материала производят при 1,5-2 атм в течение 20-25 минут (табл. 1.1).

Таблица 1.1 – Соотношение между давлением, температурой и продолжительностью стерилизации в автоклаве 5. Стерилизация текучим паром в аппарате Коха или в автоклаве. Данный вид стерилизации (с незавинченной крышкой автоклава и с открытым выпускным краном) основан на антибактериальном действии пара в отношении вегетативных клеток. Он применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал не выдерживает высокой температуры, например, питательные среды с витаминами, углеводами.

6. Дробная стерилизация. Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови, витамины и др.). Обеспечивает полное обеспложивание питательных сред и других материалов при 100 оС (или 80-90 оС) в течение 20-30 минут 3 дня подряд. При этом вегетативные клетки погибают, а споры сохраняются и за сутки прорастают. Последующее двукратное прогревание обеспечивает достаточно надежную стерильность материала. К процессам дробной стерилизации относится тиндализация, предполагающая термическую обработку материалов при 56-58 оС в течение 1 часа 5-6 дней подряд.

вегетативных клеток, но не бактериальных спор. Нагревание материала производится при температуре 50-65 оС в течение 15- минут или 70-80 оС в течение 5-10 минут с последующим быстрым охлаждением. Обычно пастеризуют напитки и пищевые продукты (вино, пиво, соки, молоко и др.).

8. Стерилизация ультрафиолетовыми лучами. Для полной или рентгеновские и -лучи. В спектре ультрафиолетовых ламп преобладает излучение в области 260 нм, поглощаемое, главным образом, нуклеиновыми кислотами и при достаточно долгом воздействии вызывающее гибель всех бактерий. В спектре ртутной сильная полоса испускания 254 нм (рис. 1.1).

Относительные единицы Рис. 1.1 – Воздействие УФ лучей на микроорганизмы Ультрафиолетовые лучи используются для частичной стерилизации помещений, при этом бактерии погибают быстро, а споры грибов, менее чувствительные к ультрафиолетовому воздействию, значительно медленнее.

Ионизирующее излучение применяют для стерилизации пищевых продуктов.

9. Стерилизующая фильтрация.

Этот метод обеспечивает полное или частичное задержание микроорганизмов. Он широко применяется для очистки газов (аэрирующего воздуха) и жидкостей (главным образом, на конечных стадиях производства фармацевтических препаратов).

Возможны два механизма задержания частиц при фильтрации.

Первый из них – прямой перехват, то есть задержание частиц, размер которых больше максимального размера пор фильтра.

Очевидно, эффективность фильтра по задержанию таких частиц составит 100 %. Однако прямым перехватом задерживается значительная часть частиц меньшего размера в результате их улавливания в более мелких порах, так как в большинстве фильтрующих материалов имеются поры разных размеров, а также путем одновременного попадания двух мелких частиц в одно отверстие и т. п.

Следует отметить, что для удаления из газов столь мелких частиц как бактерии (минимальный размер 0,3-0,4 мкм), фильтры, работающие на принципе простого перехвата, используются сравнительно редко, поскольку имеют очень высокое гидравлическое сопротивление из-за малого размера пор. При стерилизующей фильтрации жидкостей прямой перехват является основным механизмом задержания частиц.

Второй механизм – задержание при соударении частиц с волокнами фильтра. Наряду с частицами, размер которых больше размера пор, фильтры для очистки газов способны удерживать частицы значительно меньшего размера. Это обусловлено тем, что при соударении твердой частицы с волокном фильтрующего материала она «прилипает» к ней и удерживается ван-дерваальсовыми силами. Поскольку эти силы быстро уменьшаются с увеличением радиуса частицы, они удерживают лишь мелкие частицы, размер которых не превышает 2-10 мкм.

Соударение твердых частиц с волокнами может происходить по двум причинам. При огибании волокна потоком газа твердые частицы сравнительно большого размера продолжают двигаться по инерции прямолинейно вследствие значительной разницы в плотностях частицы и окружающего ее газа и наталкиваются на волокно. Более мелкие частицы увлекаются воздушным потоком и гораздо реже наталкиваются на волокна. А для самых мелких частиц твердой фазы (менее 0,1-0,2 мкм) существенную роль играет броуновское движение, благодаря которому вероятность соударения частицы с волокном увеличивается.

Таким образом, наиболее трудно улавливаются частицы размером от 0,2 до 0,5 мкм.

Для повышения эффективности фильтра, работающего по принципу задержания частиц при соударениях, увеличивают толщину слоя фильтрующего материала. Например, если степень улавливания фильтром частиц определенного размера составляет 90 %, то увеличение толщины слоя фильтра вдвое приведет к повышению этой цифры до 99 % и т. д. Так можно добиться почти 100 % -ного улавливания твердых частиц определенного размера, используя фильтр с порами гораздо большего размера, но достаточной толщины. Напомним еще раз, что это относится только к фильтрующей стерилизации газов; при фильтрации жидкостей основной механизм улавливания – прямой перехват.

Любой фильтр можно охарактеризовать максимальным размером пор (улавливание частиц большего размера в нем абсолютное), а также зависимостью удерживающей способности фильтра от размера частиц меньше диаметра пор при определенном режиме фильтрации.

подразделяют на поверхностные и глубинные. К поверхностным относятся плетеные сетчатые фильтры, а также мембраны, имеющие прямые сквозные отверстия. В фильтрах этого типа частицы удерживаются в основном на поверхности фильтра, что приводит к быстрому забиванию пор и прекращению фильтрации.

Такие фильтры можно использовать для обработки предварительно очищенных от большей части загрязнений жидкостей и газов.

Фильтры глубинного типа, в которых задержание частиц происходит по всему объему материала, имеют хаотически расположенные поры. Их в свою очередь можно разделить на фильтры, поры которых не увеличиваются при возрастании давления (мембранные фильтры), и у которых поры увеличиваются при увеличении давления (например, фильтры с набивкой из хлопчатобумажных нитей). Фильтры с увеличением пор имеют низкие эксплуатационные характеристики и плохо удерживают частицы в условиях пульсации давления.

биотехнологических производствах состоит в том, что здесь требуется полное задержание бактерий, представляющих собой очень мелкие частицы (самые мелкие бактерии имеют размер 0,3 мкм). Это обусловливает необходимость использования многостадийных систем очистки с применением разных типов фильтров на различных стадиях.

При разделении биологических суспензий, т.е. при отделении мелкодисперсных и коллоидных примесей, макромолекул (белков, ферментов, нуклеиновых кислот) от культуральной жидкости используются следующие методы фильтрации:

1) собственно фильтрация через тканевые фильтры – для отделения частиц размером от 10 мкм до 1 мм (мелкодисперсных примесей, развитого мицелия грибов). Мицелиальные грибы имеют размеры микроколоний до 1 мм, что упрощает их отделение от жидкости. Кроме того, в жидкой фазе могут присутствовать нерастворимые компоненты питательной среды, как, например, мука, дробина, применяемые в спиртовом производстве. Тонкие взвеси этих компонентов имеют размеры от 10 до 100 мкм, а грубые взвеси – от 100 мкм до 1 мм;

2) микрофильтрация – для отделения частиц размеров от 200 нм до 10 мкм (мицелия грибов, крупных клеток дрожжей, эритроцитов). Наиболее крупные клетки дрожжей имеют размеры до 15-20 мкм;

3) ультрафильтрация – для отделения частиц размером от 10 нм до 5 мкм (клеток дрожжей, бактерий, некоторых вирусов, макромолекул). Этим методом могут успешно отделяться клетки бактериальные клетки, имеющие размеры от 0,3 до 1 мкм, вирусы с размером больше 10 нм, а также ферменты, нуклеинов кислоты и другие макромолекулы размером от 10 до 120 нм.

II. Химическая стерилизация – основана на применении -пропиолактона, растворов хлорамина, карболовой кислоты, фенола, 70 % раствора этанола и др. Этот метод чаще всего питательных сред.

Химические средства:

материалы содержат некоторое количество воды (5-15 %). Окись этилена применяют в виде газовой смеси (с N2 или СО2), в которой ее доля составляет от 2 до 50 %.

активнее окиси этилена, необратимо инактивирует клетки и споры. Далее -пропиолактон произвольно гидролизуется до карбоновых кислот, являющихся дополнительным субстратом.

3. Диэтилпирокарбонат (0,003-0,02 %) – применяют для 4. Растворы хлорамина (0,5-10 %) – используются чаще всего для стерилизации посуды, инструментов и поверхностей.

Основные методы стерилизации представлены в таблице 1.2.

Таблица 1.2 – Методы стерилизации оборудования, питательных сред и воздуха Термообработка: Нагревание объекта Основной метод острым паром Подача струи пара под Стерилизация аппаратов и Продолжение таблицы 1. глухим паром Пар изолирован от Стерилизация некоторых генерируемым в электронагреватели, и сред, если последние не самом сосуде, вводимые в стерилизуемый пригорают к нагревателю подлежащем объект стерилизации в автоклаве Стерилизуемые материалы Стерилизация некоторых Дезинфекция Применяют химические Стерилизация питательных (химическое дезинфицирующие агенты сред, в основном для Фильтрационный Пропускание газов Стерилизация Ультразвуковое Обработка ультразвуком Экспериментальный метод, воздействие жидких сред с определенным рекомендован для микроорганизмов Цель и задачи работы: определить основные показатели, которые характеризуют эффективность термической стерилизации среды для обеспечения её асептики (100 % - ной гибели микроорганизмов).

Гибель части клеток в процессе роста популяции учитывается большинством моделей как процесс, протекающий параллельно и независимо от размножения жизнеспособных особей той же культуры.

В ряде случаев, а именно при стерилизации жидких и твердых сред, оборудования, вспомогательных материалов, гибель части или всех клеток становится целью процесса.

Такая постановка задачи требует таких методов решения, которые способны гарантировать асептику среды и воспроизводить результаты в промышленных условиях при длительной эксплуатации установок.

Основным методом стерилизации жидкостей и аппаратуры в лабораторных условиях является термический, связанный с достаточно длительным прогревом до заданной температуры.

Гибель микроорганизмов при повышенной температуре происходит, как правило, со скоростью, пропорциональной числу клеток или спор, еще сохранивших жизнеспособность к данному (анализируемому) моменту времени:

жизнеспособных особей микроорганизмов составляла [хо], то ко времени она достигает величины:

где k – удельная скорость гибели, мин- (процесса). Так, уменьшение числа клеток в 10 раз вследствие их гибели соответствует значению ln [xo ] критерия стерилизации, равному 2,303.

На практике важной характеристикой оказывается время, за которое концентрация выживших клеток уменьшается в 10 раз.

Из уравнения (*): 10=2,303/k.

Величина критерия стерилизации обычно задается при стерилизации жидких сред для обеспечения требуемой степени их асептики. Поэтому, зная значение удельной скорости гибели k клеток при определенной постоянной температуре, по уравнению (*) находят необходимую продолжительность термообработки среды.

Гибель клеток и спор резко ускоряется с ростом температуры.

В интервале 100-140 С удельная скорость гибели клеток k возрастает в 104-105 раз, при повышении температуры на 10 оС удельная скорость гибели клеток и спор возрастает в 10 раз и более.

Зависимость удельной скорости гибели клеток от температуры описывается уравнением Аррениуса:

Постоянную E в этом уравнении по аналогии с химической кинетикой называют энергией активации процесса гибели микроорганизмов.

Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

- суспензия дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в объеме 500 мл на каждое занятие;

- микроскопы – 5 шт.;

- камера Горяева-Тома – 5 шт.;

- водяная баня (термостат) – 1-2 шт.;

- краситель (метиленовый синий);

- лабораторные стаканчики объемом 20-50 мл (по 1 шт. на бригаду) - пробирки (5 шт. на бригаду);

- мерные цилиндры объемом 10 мл (5 шт.);

- пипетки объемом 1 или 2 мл (5 шт.);

- фильтровальная бумага;

- марлевые салфетки микроорганизмов, разлить её в лабораторные стаканчики, откуда отобрать по 3-5 мл в 4 пробирки.

использовать одну из пробирок (нулевая проба (х0)).

2. Каждой бригаде поместить 3 пробирки в 3 водяные термостатируемые бани с заданными температурами эксперимента (Т = 65 оC, 85 оС и 100 оС).

3. Через определенные промежутки времени (15 минут) отбирать из пробирок пробы микробных суспензий для подсчета числа клеток.

4. Произвести подсчет общего числа клеток в отобранных пробах с использованием счетных камер Горяева-Тома, а также числа живых клеток с предварительным окрашиванием проб микробных суспензий.

крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева-Тома (рис. 1.2), хотя можно применять и другие.

Эта камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда указывается на предметном стекле.

а – вид сверху; б – вид сбоку;

в – вид сетки камеры при малом увеличении микроскопа Рис. 1.2 – Камера Горяева-Тома При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящихся в камере, соответствует расчетному. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.

Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 минут микроскопировании были видны в водной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5 % -ном водном растворе формалина. Число клеток подсчитывают с объективом 8 или 40. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую сторону квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой суспензией микроорганизмов.

Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

где х – число клеток в 1 мл суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

S – площадь квадрата сетки в мм2;

103 – коэффициент перевода см3 в мм3;

n – разведение исследуемой суспензии.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов, 100 – на прямоугольники и 100 остаются чистыми.

Каждая их 15 вертикальных и горизонтальных полос сетки Горяева имеет ширину, равную 1/5 мм, причем каждая третья полоса разделена в свою очередь на 4 узкие полоски шириной 1/20 мм, при пересечении которых образуются маленькие квадратики площадью 1/400 мм2. Они составляют 25 групп из квадратиков. Для подсчета используются большие квадраты, разделенные на 16 маленьких.

Оценить эффективность обеспечения асептики жидкой среды вследствие её термообработки при различных температурах. Для этого:

1. Вычислить х – общее число клеток, а также число живых клеток в 1 мл суспензии и построить графическую зависимость х = f(); проанализировать кинетику гибели микробных клеток во временных интервалах от 0 до 30 минут и от 30 до 60 минут.

продолжительности термообработки на эффективность стерилизации среды.

2. Вычислить значение критерия стерилизации ln 3. Определить удельную скорость гибели k микроорганизмов при заданной температуре (Т = 65 оС, 85 оС, 100 оС) по уравнению (1.1).

представить в виде таблицы 1.3.

термической стерилизации пробы 4. Рассчитать время, за которое концентрация выживших клеток снижается в 10 раз.

5. Построить графическую зависимость в координатах lnk = f(1/T) (Т приводится в градусах Кельвина). Для построения зависимости использовать значения удельной скорости гибели k живых (неокрашенных) клеток в анализируемых пробах.

Рис. 1.3 – Графическая зависимость k от 1/Т Из графика (рис. 3.1) найти tg и точку пересечения с осью ординат. В линеаризованном виде уравнение Аррениуса может быть записано как Здесь lnA определяется из графика как величина, численно равная величине отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат, а Таким образом, значение удельной скорости гибели определяется из уравнения Аррениуса с найденными константами:

А и Е/R.

Эффективность термообработки для обеспечения асептики жидких сред может быть оценена для любой температуры: так как А, Е, R – постоянные величины, подставив в уравнение Аррениуса (1.3) любое значение Т, рассчитывается k.

1. Асептика, асептические условия, стерильность.

2. Какое влияние оказывает посторонняя микрофлора на эффективность микробиологических производств? Приведите примеры.

3. Каким образом обеспечивается достижение и поддержание асептических условий на стадии ферментации?

4. Термическая стерилизация.

5. Химическая стерилизация.

6. Стерилизация ионизирующим излучением.

7. Фильтрующая стерилизация.

8. Проанализируйте существующие способы и режимы стерилизации. Какие пути повышения эффективности режимов стерилизации жидкостей вы знаете?

9. Методы и режимы получения стерильного воздуха.

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.: КолосС, 2004. – 296 с.

2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С-Пб.: Наука, 1995.

– 600 с.

микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.

4. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы Агропромиздат, 1990. – с. 210-213.

5. Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии. – М.: Агропромиздат, 1985. – 224 с.

6. Матвеев В.Е. Основы асептики в технологии чистых микробиологических препаратов. – М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. – 312 с.

7. Биотехнология: уч. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред.

Н.С. Егорова; В.Д. Самуилова. Кн. 1. – М.: Высшая школа, 1987. – 159 с.

Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 334 с.

9. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. – М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.

Тема 2. Метаболизм углеродсодержащего субстрата.

Способы культивирования дрожжей на различных Живая клетка – сложный биохимический реактор для проведения более 1000 независимых одновременно протекающих биокаталитических процессов превращения веществ, совокупность которых называется метаболизмом клетки.

Процессы метаболических превращений сложных веществ (полисахаридов, липидов, белков и др.) в простые (например, СО2 и Н2О) с целью получения энергии (для энергетического обмена) называются катаболическими, а их совокупность – катаболизмом клетки.

Процессы метаболических превращений с целью построения клетки с биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и др. сложных, богатых энергией веществ из энергопотребляющими и называются анаболическими, а их совокупность – анаболизмом клетки.

Процессы биосинтеза низкомолекулярных веществ аминокислот, нуклеотидов, моносахаридов – компонентов для биосинтеза биополимеров - белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов называются амфиболическими, а их совокупность – амфиболизмом клетки. Амфиболические процессы обеспечивают клетку энергией и исходными для анаболизма веществами.

Метаболические процессы и реакции в клетке объединяются в определенные последовательности, называемые путями метаболизма.

В результате анаболизма и амфиболизма синтезируются первичные и вторичные метаболиты.

Первичные метаболиты – это продукты метаболизма, необходимые для роста микроорганизмов и выступающие в качестве строительных блоков макромолекул и коферментов. К ним относятся аминокислоты, витамины, ферменты, органические кислоты и др.

Вторичные метаболиты – это продукты метаболизма, в которых микроорганизмы не нуждаются для собственного роста. К ним относятся антибиотики, токсины, алкалоиды и др.

Биохимические особенности роста микроорганизмов В биотехнологии под субстратом понимается органическое или неорганическое вещество, взаимодействующее с ферментом с образованием фермент-субстратного комплекса, в результативном случае приводящего к получению продуктов ферментативной реакции.

При этом следует заметить, что для описания природных процессов понятие «субстрат» (substrate) используется двояко:

под ним понимается не только питательное вещество для организмов, но и среда, обусловливающая условия для их роста и развития (например, буковая стружка для иммобилизованных клеток уксусно-кислых бактерий).

Подавляющее большинство микроорганизмов в качестве углеродного субстрата предпочитают использовать углеводы – моно- и дисахариды, прежде всего гексозы (глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, сахарозу и др.).

Природа микроорганизма обусловливает выбор одного из путей катаболизма глюкозы в качестве доминирующего пути:

Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, пентозофосфатный, ЭнтнераДудорова, дыхание и др.

Метаболический путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (ЭМП) биокаталитических стадий (рис. 2.1).

Рис. 2.1 – Схема метаболического пути Эмбдена-МейергофаПарнаса продуктом – пировиноградная кислота (ПВК, пируват). Катаболизм фосфорилировании промежуточных соединений с накоплением максимума энергии субстрата внутри клетки, поскольку сильно ионизированные органические вещества не диффундируют через клеточную мембрану из клетки и являются источником энергии для внутриклеточной энергии вследствие присоединения фосфатной группы HPO42- к молекулам органического субстрата называют субстратным фосфорилированием.

энергозатратные реакции, когда изменение свободной энергии G0; энергодающей реакцией для их протекания является сопряженная реакция гидролиза АТФ (рис. 2.1). Спонтанные 3-фосфоглицеринового альдегида через ряд промежуточных продуктов в две молекулы пирувата (рис. 2.1). Таким образом, катаболизм 1 молекулы глюкозы с образованием 2 молекул пирувата сопровождается первоначальным гидролизом 2 молекул АТФ и последующим образованием 4 молекул АТФ.

Общая стехиометрия пути ЭМП выглядит следующим образом:

В результате катаболизма глюкозы по пути ЭМП клетка получает следующие преимущества:

- запасается химическая энергия (АТФ) - образуются восстанавливающие эквиваленты (НАДН+Н+) - синтезируются биосинтетические предшественники (ПВК).

Поэтому этот путь метаболизма является амфиболическим.

В клетках мышечных тканей и молочно-кислых бактериях путь ЭМП не завершается образованием пирувата; пируват восстанавливается до молочной кислоты (лактата):

Вся последовательность биохимических реакций, начинающая с глюкозы и завершающаяся молочной кислотой называется гликолизом.

биосинтетических предшественниках метаболизма ацетилкофермента А, органических кислотах), в энергии (АТФ и других макроэргических соединениях), в восстановительных эквивалентах (НАДН и НАДФН) микробные клетки могут пентозофосфатный, Энтнера-Дудорова, дыхание.

При этом общий принцип метаболизма субстратов состоит в несколькими путями катаболизма одновременно для обеспечения биополимеров.

Метаболизм этанола алкогольдегидрогеназой и НАД-зависимой дегидрогеназой. Первый фермент локализован в митохондриях и ответственен за проведение реакций окисления этанола в ацетальдегид:

НАД НАДН

В цитоплазме обнаружен еще один тип дегидрогеназы, которая катализирует протекание обратной реакции превращения ацетальдегида в этанол. Этот процесс обычно отмечается для анаэробных условий, в которых протекает спиртовое брожение, в то время как реакция (2.3) доминирует при аэробном росте дрожжей на этаноле.

Ацетальдегид, в свою очередь, под действием НАД-зависимой дегидрогеназы превращается в ацетилкофермент А (СН3СОКоА, ацетил-КоА):

НАД НАДН

В результате двухступенчатого окисления этанола образуется 2 моля НАДН из 1 моля этанола. При недостатке кислорода клетка может выделять в окружающую среду уксусную кислоту. Она образуется за счет конверсии ацетилкофермента А с участием неорганического фосфата под действием фосфатацетилтрансферазы до фосфоацетилфосфата (СН3СООФ) и дальнейшего превращения последнего в уксусную кислоту под действием ацетаткиназы:

При аэробном дыхании на окисление 1 моля этанола затрачивается 1 моль кислорода и синтезируется 5 молей АТФ.

Ацетилкофермент А, синтезированный в клетке в нормальных условиях, включается в ЦТК при конденсации с оксокислотами.

Часть ацетил-КоА вовлекается в так называемый глиоксилатный шунт. Глиоксилатный шунт представляет собой обходной путь реакций превращения изолимонной кислоты в яблочную (рис. 2.2).

Если в цикле Кребса изолимонная кислота путем двух стадий декарбоксилирования последовательно превращается через -кетоглютаровую кислоту в янтарную кислоту, а затем в яблочную, то при окислении этанола с «включением глиоксилатного шунта» эти две стадии декарбоксилирования отсутствуют.

превращается в янтарную и глиоксиловую кислоты. Эту реакцию катализирует изоцитратлиаза. Глиоксиловая кислота путем конденсации с ацетил-КоА образует яблочную кислоту под действием малатсинтазы. Таким образом, при каждом обороте синтезируются дополнительные молекулы яблочной кислоты утилизации источников углерода.

ПОЛИСАХАРИДЫ

ЛИПИДЫ АДФ

ГЕКСОЗЫ

ЖИРНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

ПЕНТОЗЫ

КИСЛОТЫ

ФОСФОЕНОЛПИРУВАТ

ПИРУВАТ

ЯБЛОЧНАЯ

КИСЛОТА

ЛИМОННАЯ

ЩАВЕЛЕВОУКСУСНАЯ

КИСЛОТА

КИСЛОТА

ИЗОЛИМОННАЯ

ЯБЛОЧНАЯ КИСЛОТА

КИСЛОТА

-КЕТОГЛЮТАРОВАЯ

ФУМАРОВАЯ КИСЛОТА

КИСЛОТА

ГЛИОКСИЛОВАЯ

КИСЛОТА

АДФ АТФ

АДФ АТФ

Рис. 2.2 – Биохимическая схема ассимиляции На рис. 2.2 отмечена передача четырех пар протонов (2Н), высвобождающихся в цикле ЦТК при катаболизме углеводов, в электронтранспортную цепь (ЭТЦ) дыхания с их окислением до Н2О.

При ассимиляции этанола в ЭТЦ дополнительно передается пары протонов (2Н).

Сопряженно с транспортом электронов в дыхательной цепи накапливается внутриклеточная энергия. Этот процесс называется окислительным фосфорилированием.

Стехиометрия процессов культивирования микроорганизмов Если в результате химического взаимодействия реагентов А и В образуются продукты С и D и выделяются тепло Н, то можно с учетом стехиометрических коэффициентов А, В, C, D и Н можно записать стехиометрическое уравнение реакции:

Определенные значения стехиометрических коэффициентов отражают закон сохранения материи: количество атомов элементов, составляющих вещества А, В, С и D, не должно изменяться в процессе превращения веществ.

Действие закона сохранения энергии в биологии приводит к перегруппировке макро- и микроэлементов. Такая перегруппировка предполагает, что общее количество углерода, азота, фосфора, водорода, кислорода, металлов и др. элементов, включенное в митохондрии, др.), внутри- и внеклеточные вещества (АТФ, белки, антибиотики), равно количеству этих элементов, потребленных из питательной среды.

Схематическое представление процесса культивирования микроорганизмов представлено на рис. 2.3.

Рис. 2.3 – Схема процесса культивирования микроорганизмов Стехиометрическое уравнение для ферментативной реакции превращения субстратов (S) в продукты (Р) и биомассу (Х) в процессе культивирования можно записать следующим образом (квадратные скобки традиционно обозначают концентрации веществ, в данном случае различных субстратов):

С [углеродный субстрат] + N [азотный субстрат] + Ф [фосфорный Х [биомасса] + Р [продукт метаболизма] + …+ СО [СО2] + Н О [Н2О] В процессах культивирования биомасса (Х) накапливается как продукт реакции; она же в качестве инокулята является важнейшим исходным реагентом, от ферментативной правильнее было бы показать биомассу в качестве субстрата с коэффициентом Х, а в качестве продукта с коэффициентом (Х+1).

Однако количество инокулята принимается пренебрежимо малым в сравнении с количеством биомассы, накопленной в процессе культивирования.

Реакции, в которых продукт является катализатором реакции, называются автокаталитическими.

Молекулярный вес биомассы (биомоль) определить формулу биомассы. Элементный состав биомассы микроорганизмов приведен в табл. 2.1.

микроорганизмов Дрожжи Бактерии Если принять сухой вес биомассы равным 100 г, масса соответствующего элемента (С, H, O, N, P, S) в граммах (грамматомах) равна отношению его процентного содержания к его атомной массе (табл. 2.2). При этом зольными компонентами биомассы пренебрегают.

Таблица 2.2 – Удельно-весовой элементный состав биомассы различных микроорганизмов Дрожжи Бактерии Таким образом, формула биомассы записывается так:

для дрожжей – C3,92H6,5O1,88N0,54P0,05S0,03, для бактерий – C4,42H7,0O1,25N0,86P0,1S0,03, для микроорганизмов «усредненного» состава – C4,17H8,0O1,25N1,0P0,1S0,03.

Молекулярный вес биомассы (биомоль) составляет около (с учетом зольности биомассы).

Для простоты расчетов по стехиометрическим уравнениям из формулы биомассы можно исключить некоторые элементы, чаще всего фосфор и серу.

Далее, для расчетов удобнее принять формулу биомассы из расчета на 1 атом углерода. Для этого нужно разделить индексы при всех атомах на индекс при углероде:

для дрожжей – CH1,66O0,48N0, для бактерий – CH1,58O0,28N0, для биомассы «усредненного» состава – CH1,92O0,3N0, Для практических расчетов биомоля «усредненного» состава часто используют формулу Стоутхамера:

CH1,8O0,5N0,2 с молекулярной массой 24,6.

Лабораторная работа 2. Кинетика и стехиометрия роста культивирования Цели и задачи работы: получить экспериментальные данные, характеризующие периодический процесс роста дрожжей на конкретном углеродном субстрате (глюкоза, этанол, глюкозоспиртовая смесь (1:1)) и провести их анализ.

представляет с точки зрения техники наиболее простой метод культивирования. В этом случае в качалочную колбу или ферментатор помещается питательная среда, в которую вносится активная культура микроорганизмов – инокулят (от лат. inoculatio – прививка). Инокулят иначе называют посевным материалом, а инокуляцию называют посевом. В дальнейшем наблюдают за ростом и накоплением микроорганизмов в питательной среде.

Рост микроорганизмов наблюдается до тех пор, пока концентрация продуктов метаболизма не достигнет критического Культуральная жидкость представляет собой жидкую фазу по окончании культивирования микроорганизмов, содержащую неиспользованный субстрат и другие компоненты питательной среды.

выращивание в наиболее благоприятных (оптимальных) условиях (от этого ключевого понятия возникают определение культуры микроорганизмов, культуральной жидкости и т.п.).

Экспериментальное исследование процесса культивирования обозначаемых специальной терминологией:

• In vitro (лат. «в стекле») – это технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся в пробирке либо, в более общем смысле, вне живого организма. В определённой степени этот термин противопоставляется термину in vivo.

Многие эксперименты, имеющие отношение к молекулярно биологии, биохимии, фармакологии, медицине, генетике и др., проводятся вне организма и живых клеток, где условия, а организмов.

• In vivo (лат. – буквально «в (на) живом»), то есть «внутри живого организма» или «внутри клетки». В науке in vivo использование термина in vivo исключает использование части живого организма (так, как это делается при тестах in vitro) или использование мёртвого организма. Тестирование на животных и клинические испытания являются формами исследования in vivo.

• Ex vivo (лат. «из жизни») означает "то, что происходит вне организма", т.е. проведение экспериментов в живой ткани, перенесённой из организма в искусственную внешнюю среду.

Наиболее распространенная техника ex vivo использует живые клетки или ткани, извлечённые из живого организма и выращенные (сохранённые) в стерильных лабораторных условиях в течение нескольких дней или недель. Такие клетки служат образцами поведения организма в целом, как следствие - сокращается потребность в экспериментах над животными и человеком. Эксперименты ex vivo, как правило, проводятся in vitro, однако два эти термина не являются синонимами.

• In silico – термин, обозначающий компьютерное биологического. Термин по написанию близок к латинскому выражению in silicio – «в кремнии», поскольку кремний как полупроводниковый материал играет важную роль в производстве компьютерного оборудования.

Для феноменологического описания роста микроорганизмов в периодическом режиме обычно используют кривую роста (рис. 2.4). Она имеет S-образный характер. Различают несколько стадий роста.

I II III IV V VI

Рис. 2.4 – Кривая роста периодической культуры микроорганизмов Сразу после посева (инокуляции) наблюдается лаг-фаза (I). В этой фазе число клеток не возрастает, однако идут интенсивные приспособительные процессы. После окончания лаг-фазы скорость роста возрастает. Эта фаза носит название фазы ускорения роста (II) и занимает весьма небольшое время. Экспоненциальная максимальной скоростью деления клеток. Логарифмическая фаза роста сменяется фазой замедления роста (IV), когда наблюдается еще относительно интенсивный рост клеток, однако скорость роста замедляется. Затем у многих микроорганизмов наступает стационарная фаза (V), когда концентрация биомассы не меняется во времени. Далее следует фаза отмирания и выживания (VI), в ходе которой число жизнеспособных клеток снижается.

осуществляется c помощью удельной скорости роста µ, значение которой в каждый момент времени определяется по уравнению:

где µ – удельная скорость роста, ч -1;

х – концентрация биомассы в момент времени, ч.

определить удельную скорость роста за определенные промежутки времени где х1 и х2 – концентрация биомассы в начальный и конечный хср – средняя концентрация биомассы в интервале времени коэффициента q, дает возможность судить о кинетике потребления субстрата где S1 и S2 – концентрация субстрата в момент времени 1 и 2.

используемого для роста определенного количества биомассы за метаболический коэффициент может быть рассчитан для любого субстрата: органического (этанол и др.), минерального (азот, фосфор, и т.д.).

Рассмотренные показатели µ и q представляют собой кинетические характеристики роста культуры. Однако при целостном рассмотрении процесса, важное значение имеют стехиометрические показатели – выходы по массе и энергии.

Под выходом по массе (или экономическим коэффициентом) понимается весовое отношение прироста абсолютно сухой биомассы (АСБ) к количеству потребленного субстрата (г АСБ/г субстрата) Однако этот показатель имеет существенный недостаток:

массовый выход не характеризует эффективность процесса роста с точки зрения энергии. Так, при росте микроорганизмов на глюкозе и уксусной кислоте могут быть получены одинаковые значения Y, хотя энергия, содержащаяся в этих соединениях, различна.

Энергетический выход характеризует долю энергии субстрата, восстановленности является редоксон. Количество редоксонов в расчете на 1 грамм-атом углерода определяет восстановленность вещества. Для субстрата с химическим составом CHpOnNq она рассчитывается по формуле Энергетический выход обычно определяют из следующего соотношения:

где x, s – весовая доля углерода в биомассе и субстрате x, s – степень восстановленности биомассы и субстрата.

меняется в зависимости от вида микроорганизма и равна x = 4,2.

Средняя весовая доля углерода в биомассе x = 0,46.

Приведем уравнение количественной связи энергетического выхода и выхода по кислороду Y О2 :

В условиях аэробного культивирования дрожжей на этаноле в качестве целевого продукта получают микробную биомассу – продуцент белка. В практическом отношении представляет интерес значение выхода белка из потребленного субстрата:

где: Б – содержание белка, % вес.;

Sо, S – начальная и конечная концентрация субстрата, г/л, Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

- музейная культура дрожжей – 2-3 пробирки;

- суспензия дрожжей (р. Candida или р. Saccharomyces) – 20-50 мл;

- микроскопы – 5 шт.;

- газовый хроматограф;

- спектрофотометр;

- фотоэлектроколориметр – 2 шт. и кюветы на 5 мл;

- центрифуга (8000 мин-1);

- водяная баня – 2 шт.;

- электроплитка – 2 шт.;

- перемешивающее устройство (качалка) – 2 шт.;

- качалочные колбы (9 шт. на одну качалку) объемом 100 мл;

- NH4H2PO4 – 50-100 г;

- (NH4)2SO4 – 5-10 г;

- Na2HPO4·12H2O – 7-10 г;

- этанол как субстрат – 20-50 мл;

- глюкоза как субстрат 20-50 г - дрожжевой автолизат – 20-50 мл;

- раствор соли Мора FeSO4(NH4)2SO4 – 92 г и H2SO4 в 1 л Н2О;

- раствор феррицианида K3Fe(CN)6 – 0,2 г/л;

- физиологический раствор (0,85 г NaCl на 10 мл Н2О);

- медный купорос, оксид меди СuSO4 5H2O – 35 г;

- сегнетова соль COOK-CHOH-CHOH-COONa 4H2O – 175 г;

- 0,1 н раствор гипосульфита натрия Na2S2O3;

- 0,5% раствор крахмала;

- пипетки мерные объемом 1 мл – 5-10 шт.;

- пипетки мерные объемом 2 мл – 5-10 шт.;

- конические колбы объемом 250 мл – 5 шт.;

- пробирки со штативом (на 1 опыт, на 1 бригаду) – 8-10 шт.;

- мерные колбы объемом 50 или 100 мл (на бригаду) – 4-5 шт.;

- мерные колбы объемом 500 мл (1000 мл) – 2 шт.;

- бюретки объемом на 50 мл (100 мл) – 2 шт.;

- круглодонная колба с резиновой пробкой и газоотводной трубкой объемом 50-75 мл – 1-2 шт.;

- трехшариковая колба (приемная) – 1-2 шт.;

- предметные стекла – 10 шт.;

- покровные стекла – 10 шт.;

- марлевые салфетки;

- фильтровальная бумага.

1. Подготовить посевной материал.

источниками углерода.

3. Осуществить процесс культивирования дрожжей.

Предварительно построить калибровочный график зависимости оптической плотности D от концентрации биомассы дрожжей X (г/л).

4. Выполнить аналитические исследования: определить содержание биомассы в культуральной жидкости, количества белка в биомассе, содержание остаточного субстрата. С целью выявления запасного вещества – гликогена приготовить препарат дрожжевой суспензии «раздавленная капля» и микроскопировать его с объективом 40.

Дрожжи стерильно пересевают с музейного косяка на свежий косяк сусло-агара. Затем пересеянные косяки помещают в термостат при температуре 36 оС и выдерживают их там в течение 24 часов. Выращенную культуру дрожжей смывают с косяка в стерильных условиях стерильным физиологическим раствором из расчета 5 мл физраствора на 1 косяк. Полученную суспензию дрожжей объемом 2 мл стерильно переносят в колбы со стерильной питательной средой в объеме 100 мл.

Saccharomyces в данной работе используются синтетические питательные среды, различающиеся источником углерода. Для приготовления трех питательных сред готовятся растворы:

- глюкозы (раствор 20 г/л). Раствор глюкозы стерилизуют в автоклаве 0,5 часа под давлением 0,5 атм;

- этанола (1 % об.);

- глюкозо-спиртовой смеси (готовится из индивидуальных растворов в соотношении 1:1).

Кроме источника углерода для приготовления питательных сред используются следующие источники минерального питания:

1) для культивирования дрожжей р. Candida:

NH4H2PO4 – 10 г/л, MgSO4 – 0,7 г/л, Na2HPO412Н2О – 0,7 г/л, КН2РО4 – 6,8 г/л;

2) для культивирования дрожжей р. Saccharomyces:

(NH4)2SO4 – 5-10 г, СаCl24 H2O – 1 г, MgSO47 H2O – 7-10 г, NaCl – 5-10 г, KH2PO4 – 30-40 г, K2HPO4 – 1 г.

Приготовленную минеральную среду объемом 250 мл стерилизуют в автоклаве 1 час под давлением 1 атм 10-20 мин.

Раствор микроэлементов готовят и стерилизуют отдельно. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,25 г FeSO4, 1,25 г MnSO4, 1,25 г ZnSO4, 0,63 г NaCl и добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Приготовленный раствор стерилизуют при 1 атм 10-20 мин и стерильно вносят в колбу с ранее приготовленной минеральной средой из расчета 1 мл на 1 л минеральной среды.

Далее раствор стерильно разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 100 мл и закрывают ватно-марлевыми пробками.

дрожжевого автолизата в качестве фактора роста (источника витаминов, аминокислот, ферментов и т.п.), а также приготовленные ранее растворы, содержащие источники углерода (внимание: этанол вносится в колбы вдали от пламени !).

Затем в качалочные колбы с питательной средой вносят инокулят из расчета 1 мл приготовленной суспензии дрожжевых клеток на 20 мл питательной среды.

Построение калибровочного графика Построить калибровочный график зависимости оптической плотности дрожжевой суспензии D от концентрации биомассы суспензии Х.

Для этого следует приготовить модельные суспензии с концентрациями биомассы, указанными в первой строке таблицы, провести измерения их оптической плотности и заполнить вторую калибровочный график D=f(X).

Х, г АСБ/л фотоэлектроколориметр с установкой длины волны проходящего света =490 нм для кюветы с толщиной рабочего слоя образца 5 мм.

Культивирование ведут на перемешивающем устройстве (качалке). В процессе ферментации поддерживают следующие условия: температура 36 оС, число оборотов качалки 200-220 мин-1.

Длительность ферментации составляет 24 часа. Отбор проб в первые 6-8 часов производят через каждые 1,5-2 часа, причем питательную среду. Последняя проба отбирается по истечении часов культивирования.

В каждой пробе определяют оптическую плотность и, пользуясь калибровочным графиком, определяют концентрацию биомассы дрожжей. Далее рассчитывают содержание белка в биомассе, а также определяют концентрацию этанола и глюкозы по методикам, указанным ниже.

Пользуясь препаратом дрожжевой суспензии «раздавленная капля», в рабочих тетрадях изображают морфологическую картину для каждой отобранной пробы и анализируют наличие гликогена в клетках дрожжей.

Определение оптической плотности культуральной жидкости Оптическая плотность служит качественным показателем содержания биомассы в культуральной жидкости. Для определения оптической плотности применяют фотоэлектроколориметр. При приготовлении суспензии клеток учитывают, что наиболее точные результаты получают при работе с суспензиями, имеющими показатели на среднем участке измерительной шкалы. Для разбавления суспензий используют водопроводную воду.

Измеряют светорассеяние суспензий с помощью кюветы с длинной светового пути 0,5 см при длине волн 490 нм (зеленый светофильтр).

Подсчет числа клеток в культуральной жидкости производят с помощью счетной камеры Горяева-Тома, при микроскопировании проб с 40-кратным объективом.

Определение содержания этанола.

1. Для качественного определения этанола в культуральной жидкости (КЖ) проводится смешение её проб с серной кислотой и раствором бихромата калия по следующей схеме:

1 мл Н2SО4 (конц.) + 0,2 мл К2Cr2О7 (2%-ный раствор) + 1 мл КЖ (отфильтрованная проба) Цвет раствора характеризует степень присутствия этанола в пробе:

голубой цвет – много этанола зеленый цвет – достаточное количество этанола желтый цвет – отсутствие этанола.

2. Для количественного определения содержания этанола могут быть применены 2 метода.

2.1. Метод газохроматографический.

Определение производят с помощью газового хроматографа снабженного пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента используют PORAPAC-QS, в процессе определения поддерживают температуру колонок 180 С. В качестве газаносителя применяют инертные газы (гелий или азот). Температура испарителя – 220 оС. При расходе газа-носителя 4,2 л/мин этанол регистрируется на 5-6 минуте после ввода пробы. Для контроля вводят определенное количество этанола и по соотношению высоты пиков контроля и пробы судят о концентрации этанола в среде.

2.2. Оксидиметрический метод основан на окислении этанола до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной кислотой.

3СН3СН2ОН + 2К2Cr2О7 + 8Н2SО4 3СН3СООН + 2Cr(SO4)2 + + K2SO4 + 11H2O Избыток бихромата оттитровывают раствором соли Мора.

К2Cr2О7 + 6FeSO4(NH4)2SO4 + 7Н2SО4 Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)2 + + 6(NH4)2SO4 + 7H2O + K2SO По количеству бихромата, израсходованного на окисление, вычисляют концентрацию этанола.

Для определения концентрации этанола в мерную колбу вносят 20 мл культуральной жидкости, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Затем отбирают 10 мл пробы в круглодонную колбу емкостью 50-75 мл, горлышко плотно газоотводной трубкой. В трехгорловую колбу вносят 25 мл раствора бихромата и 10 мл концентрированной серной кислоты.

Конец отводной трубки должен доходить почти до конца приемника. Отгонка длится 10-15 минут. За время отгонки приемная колба должна быть заполнена на 2/3 объема колбы.

Окраска раствора меняется от оранжевой до грязно-бурой.

Содержимое приемника переносят в мерную колбу на 100 мл, туда сливают промывные воды от приемника и отводной трубки, доводят до метким дистиллированной водой и перемешивают.

Отбирают 20 мл в коническую колбу на 250 мл, добавляют туда 20 мл дистиллированной воды и титруют раствором соли Мора.

Одновременно ведут контрольное титрование следующим образом. В коническую колбу на 250 мл помещают 5 мл раствора бихромата, 2 мл концентрированной серной кислоты, 30-40 мл дистиллированной воды и титруют раствором соли Мора. Конец титрования устанавливают капельной пробой с раствором феррицианида. Ее проводят на белой фарфоровой пластинке с помощью стеклянной палочки. Капают по капле раствор феррацианида и титруемую жидкость. Интенсивное синее окрашивание свидетельствует о конце титрования. Количество этилового спирта в г/л культуральной жидкости рассчитывают по формуле где а, в – количество раствора соли Мора, пошедшего на 5 – разведение культуральной жидкости;

0,01 г этанола соответствует 1 мл К2Cr2О7.

Необходимые растворы: Н2SO4 (уд. вес 1,84), раствор К2Cr2О – 42,6 г/л, раствор соли Мора FeSO4(NH4)2SO4 – 92 г и Н2SO4 – 20 г в 1 л воды, раствор феррицианида – 0,2 г/л.

Определение содержания глюкозы в питательной среде и культуральной жидкости (по реакции Фелинга) Метод основан на восстановлении меди моносахаридами из окиси меди (II) в окись меди (I). Моносахариды в этой реакции выступают в качестве восстановителей меди и поэтому называются редуцирующими веществами (англ. reduction – восстановление).

сегнетовой соли (калий натрий виннокислый) в щелочной среде.

При смешивании сульфата меди со щелочью происходит реакция:

В присутствии сегнетовой соли выделившийся гидрооксид меди (II) не выпадает в осадок, так как образует комплексное соединение. Медь восстанавливается в присутствии моносахаридов с образованием окиси меди (I). Количество выпадшего осадка Сu2O (красно-бурого цвета) зависит от природы и количества редуцирующих веществ в пробе, состава жидкости Фелинга, ее щелочности, общего объема нагреваемой жидкости, температуры и длительности нагревания.

В результате этой реакции альдегидная или кетонная группа моносахарида окисляется до карбоксильной группы:

В зависимости от содержания углеводов в исследуемой жидкости, для анализа надо брать следующее количество пробы:

а) до 30 часов роста культуры – 0,5 мл б) до 48 часов роста культуры – 1 мл Для анализа отобрать 0,5 мл культуральной жидкости в колбу объемом 100 мл (250 мл), добавить 9,5 мл H2O и по 10 мл растворов Ф1 (CuSO4 5H2O) и Ф2 (COOK CHOH CHOH COONa 4H2O), и смесь нагревают на электроплитке в течение 3 минут с момента появления первого пузырька. Затем смесь охлаждают и в колбу вносят 15 мл 20 % раствора H2SO4 и 5 мл 40 % раствора KJ.

Выделившийся J2, оттитровывают 0,1 н раствором Na2S2O3. В конце титрования вносят в колбу несколько капель 0,5 % раствора крахмала. Крахмал нужно добавлять в конце титрования, т.к. если добавлять его сразу, то образуется комплекс меди с крахмалом, который медленно реагирует с гипосульфитом натрия (Na2S2O3).

Раствор в колбе должен приобрести сначала грязно-синий цвет, а по окончании титрования молочную окраску.

Аналогично готовят контрольную пробу, в которой вместо культуральной жидкости для анализа используется 10 мл H2O.

Далее реакцию проводят согласно вышеописанной методике.

Используя данные титрования и учитывая разность объемов титранта (Na2S2O3) между контрольной и опытной пробами (V), по калибровочному графику V = f (С) определяем концентрацию редуцирующих сахаров (С). Этим методом определяют содержание в культуральной жидкости гексоз – основного источника углерода для большинства микроорганизмов.

Выявление запасного энергетически важного запасного вещества дрожжевой клетки – гликогена На предметном стекле приготовить препарат «раздавленная капля». Добавить каплю раствора Люголя. Микроскопировать под окрашивается в красновато-бурый цвет.

Определение количества белка в биомассе Метод основан на том факте, что спектрофотометрически максимум поглощения белков наблюдается при 280 нм. Он обусловлен присутствием в белках ароматических аминокислот – тирозина и триптофана. Диапазон колебаний отношений их содержания к содержанию других аминокислот довольно узок.

При определении содержания белка в дрожжевых клетках сначала проводят гидролиз дрожжей с экстракцией белков. Для этого надо внести 1 мл культуральной жидкости в мерные колбы на 50 мл, добавить 20 мл 0,5 н NаОН и поставить на кипящую водяную баню и нагревать. Время закипания засекают с момента закипания. Затем пробы охлаждают и доводят объем до 50 мл 0,5 н раствором NаОН. Остатки клеток удаляют центрифугированием.

Одновременно обрабатывают контрольную пробу. Для этого нужно внести 20 мл 0,5 н NаОН, прокипятить на водяной бане 20 минут, довести объем до 50 мл 0,5 н NаОН.

оптическую плотность при = 280 нм и 260 нм. При каждой длине волны измерения проводят относительно контрольной пробы.

Если отношение определяют по формуле: Б = 1,45 А280 - 0,74 А260. Здесь А280 и А260 – оптическая плотность при 280 и 260 нм соответственно; Б– содержание белка в биомассе, % вес.

Зная концентрацию биомассы в культуральной жидкости, можно определить концентрацию белка в биомассе.

1. Используя экспериментальные данные, построить кривую роста дрожжей в периодических условиях культивирования и определить длительность основных фаз (лаг-фазы, log-фазы, фазы стационарного роста).

2. Построить и проанализировать график зависимости концентрации углеродного субстрата в среде в зависимости от времени.

3. Вычислить значения удельной скорости роста µ по фазам роста.

4. Рассчитать значения экономического коэффициента и метаболического коэффициента по фазам роста.

5. Вычислить значения выхода по энергии, кислороду и белку для процесса культивирования дрожжей, формула биомассы которых принять по Стоутхамеру СН1,8O0,5N0,2.

Результаты экспериментальных исследований и расчетов свести в табл. 2.3 и 2.4.

Таблица 2.3 – Экспериментальные данные, полученные при культивировании дрожжей Таблица 2.4 – Расчетные показатели культивирования дрожжей по фазам роста лаг-фаза фаза ускорения логарифмическая фаза замедления стационарная фаза отмирания 1. Проведите сравнительный анализ роста дрожжей на глюкозе и этаноле. Объясните биохимические особенности утилизации того или иного субстрата, используя рис. 2.2.

2. Почему клетке, способной ассимилировать С2-соединения, необходим глиоксилатный шунт?

3. В каких условиях клетки дрожжей образуют уксусную кислоту?

4. Объясните роль источников минерального питания и факторов роста, которые вносятся в питательную среду для культивирования дрожжей.

5. Перечислите основные контролируемые и регулируемые параметры процесса культивирования дрожжей.

6. Каков критерий окончания процесса культивирования?

7. Каковы характерные признаки различных фаз роста?

жизнедеятельности дрожжей в стационарной фазе роста?

9. На какой фазе роста содержание белка в клетках максимально?

10. Существует ли прямая корреляция между удельной скоростью роста и содержанием белка в биомассе?

характеристикам роста культуры?

микроорганизмов?

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.:

Высшая шк., 2004. – 356 с.

2. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы Агропромиздат, 1990. – с. 97-99, 173-205.

3. Еникеев Ш.Г., Белялова З.М., Валеев Р.И. и др. Получение микробной биомассы на основе этилового спирта. – Казань: КХТИ, 1988. – 32 с.

микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.

5. Решетник О.А. Общая микробиология. – Казань: КХТИ, 1984. – с. 59-66.

6. Егоров Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Академия, 2003. – 208 с.

7. Микробная биотехнология / Лещинская И.Б. Куриненко Б.М., Вершинина В.И. и др. – Казань: Унипресс: ДАС, 2000. – 368 с.

8. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С-Пб.: Наука, 1995.

– 600 с.

Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 334 с.

10. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова.

– М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.

Тема 3. Ингибирование роста микроорганизмов в условиях периодического культивирования разнообразные биокаталитические реакции, которые протекают с участием множества ферментов.

Описание кинетики ферментативных реакций При взаимодействии фермента (E) с субстратом (S) образуется фермент-субстратный комплекс (ЕS) за счет сил физической природы. Различают 2 стадии ферментативной реакции, из которых собственно только вторая является биохимическим каталитическим превращением:

Скорость образования продукта (Р) равна:

Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (ES) определяется как Общая концентрация фермента (E0) определяется суммарной концентрацией индивидуального фермента и фермента, связанного в комплексе с субстратом:

Из уравнения (3.3) следует Подставляя (3.4) в (3.5), получаем [ES] Ks + [ES] [S] = [E0] [S] или [ES] (Ks + [S]) = [E0] [S] Подставляя (3.6) в (3.2), получим k+2 [E0] – максимальная скорость ферментативной реакции Vmax, когда [ES]=[ E0], т.е. весь фермент связан в фермент-субстратном комплексе, т.е.:

Константу диссоциации Ks называют константой Михаэлиса и обозначают Km в уравнении (3.8):

Уравнение (3.9) представляет собой уравнение МихаэлисаМентен, которое учитывает лимитирование скорости реакции концентрацией субстрата. Этим уравнением Л. Михаэлис и М.Л.

Ментен в 1913 году описали кинетику простых ферментативных превращений субстрата в различные продукты, а также не связанных с ингибированием фермента.

В уравнении (3.9) константа Михаэлиса Km является мерой сродства фермента к субстрату и численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине от максимальной (V=Vmax/2).

Чем меньше значение Km, тем выше сродство фермента к данному субстрату, субстрат быстрее претерпевает превращение, т.е.

быстрее протекает ферментативная реакция.

Графическим образом уравнения Михаэлиса-Ментен является гипербола (рис. 3.1). Как любая нелинейная функция, она неудобна для нахождения параметров уравнения – Km и Vmax.

Рис. 3.1 – Гипербола – графический образ уравнения МихаэлисаМентен Для нахождения численных значений Km и Vmax уравнение приводят к линейной зависимости (y=a+bx) различными способами.

Наиболее традиционным является зависимость Лайнуивера-Берка, представляющая собой уравнение Михаэлиса-Ментен в обратных координатах (1/V = f(1/S)):

Km/(Vmax [S]) + [S]/(Vmax [S]) = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]) (3.10) Таким образом, параметры уравнения Михаэлиса-Ментен легко найти из линеаризованного уравнения y=a+bx (рис. 3.2):

а = 1/Vmax (отрезок на пересечении прямой с осью у (1/V));

b = Km/Vmax (тангенс угла наклона прямой к оси x (1/S));

или -1/Km (отрезок на пересечении прямой с осью x (1/S)).

Рис. 3.2 – Зависимость Лайнуивера-Берка – линеаризованное В 40-х годах 20-го века Ж. Моно (Monod) показал, что достаточно удачным и универсальным для описания роста большинства микробных культур является уравнение, вид которого аналогичен уравнению Михаэлиса-Ментен, которое использовалось для фундаментального описания кинетики ферментативных реакций, в том числе внутри микробных клеток.

Таким образом, рост микроорганизмов зависит от питания (субстрата) и для большинства микроорганизмов описывается уравнением (моделью) Моно. Графическим образом уравнения Моно также является гипербола (рис. 3.3), а уравнение записывается с микроорганизмов:

где µmax– максимальная удельная скорость роста; при избытке субстрата µ = µmax (рис. 3.3);

KS – константа полунасыщения (Моно); она является мерой усвояемости субстрата в процессе роста микроорганизмов. На рис. 3.3 наименьшее значение KS отличает наиболее усвояемый соответствовать менее усвояемому субстрату (например, галактозе), самое большое значение KS’’ может характеризовать наименее усвояемый субстрат (например, янтарную кислоту).

Рис. 3.3 – Гипербола – графический образ уравнения Моно Лимитирование микробного роста концентрацией субстрата наблюдается в следующем:

чем выше концентрация субстрата, тем больше удельная скорость роста (но не больше максимально возможной для данной микробной культуры и для данных условий культивирования).

Следует также отметить, что существует диапазон минимальных концентраций субстрата S, для которых не наблюдается микробный рост (рис. 3.3): энергии небольших количеств субстрата недостаточно для обеспечения конструктивного обмена и построения клеточной биомассы.

ферментативных реакций с ингибированием фермента относятся к специфике ингибирования микробного роста.

Кинетика ферментативных реакций с ингибированием фермента микроорганизмов и, соответственно, на их рост может оказывать субстрат в высоких концентрациях. С учетом ингибирующего действия субстрата на фермент уравнение Михаэлиса-Ментен записывается следующим образом:

где Ki – константа ингибирования субстратом.

Далее, кроме субстрата, не оказывающего ингибирующего действия, во взаимодействие с ферментом может вступать веществоингибитор, снижающее активность фермента и конкурирующее или неконкурирующее с субстратом за активные центры фермента.

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же (!) активным центром фермента:

фермента к субстрату (т.е. повышается значение Кm). Величина Vmax не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом. В этом случае ингибирование имеет обратимый характер.

Михаэлиса-Ментен выглядит следующим образом:

где Ki = [E][I]/[EI] – константа ингибирования.

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными (!) активными центрами фермента.

При этом величина Кm не изменяется, а величина Vmax снижается.

Уравнение Михаэлиса-Ментен с учетом неконкурентного ингибирования:

Аналогично, фермент может подвергаться конкурентному или неконкурентному ингибированию продуктом реакции (Р):

При рассмотрении ингибирования ферментов следует отметить, что оно может быть обратимым или необратимым, когда активность восстанавливается после удаления ингибитора из среды.

Ингибирование микробного роста, развития и размножения клеток На уровне клеточного роста различают специфическое или компонентов окружающей среды.

Специфические ингибиторы, в первую очередь, антибиотики, приводят к гибели клеток вследствие избирательного ингибирования синтеза клеточных полимеров, а ингибиторы множественного неспецифического действия оказывают прямое губительное действие на микробные клетки.

многостороннее действие на обмен веществ. К ним, прежде всего, относятся тяжелые металлы. Их ингибирующее действие проявляется в инактивации ферментов. Они могут связываться с активным центром фермента, изменять конформацию молекулы фермента, вытеснять другие металлы, входящие в состав ферментов.

способностью их образовывать комплексы с функциональными группами веществ клетки и прочностью образуемых комплексов.

Тяжелые металлы ингибируют процесс дыхания, влияют на проницаемость и транспортный аппарат клетки.

Физиологическое состояние культуры дрожжей р. Candida Ионы меди поступают в клетки р. Candida путем активного обнаруживается в них с помощью электронного микроскопа в виде гранул, переходящих с периферии клетки в вакуоль. Вероятно, что гранулы, содержащие медь, имеют липидную природу. Клетки, ингибированные медью, могут длительное время существовать в хемостате.

Под действием ионов меди содержание основных полимеров в клетках р. Candida меняется: снижается содержание белка на 15 %, возрастает содержание липидов на 30 %. Видимо, медь ингибирует синтез белка и не затрагивает, а даже усиливает синтез резервных веществ.

Два типа реакции культур Candida utilis (Yarrowia lypolitica) на Данные, полученные с ионами меди и серебра, приводят к выводу о том, что действие этих металлов на микроорганизмы принципиально различается как в условиях непродолжительного периодического культивирования (в острых опытах), так и при непрерывном культивировании (в хемостате).

Известно, что поглощение клетками ионов металлов может быть результатом следующих процессов:

клеточной поверхностью; 2) активного транспорта в клетку;

3) сложного процесса, когда первая фаза быстрой адсорбции сменяется активным транспортом. Поглощение ионов металлов путем адсорбции протекает очень быстро, не зависит от температуры и физиологического состояния клеток. Активный транспорт является длительным процессом и зависит от многих параметров, таких как температура.

Были исследованы процессы поглощения меди и серебра суспензиями С. utilis, отмытыми 0,l н раствором HCl. Клетки помещались в растворы CuSO45H2O или AgNO3, и определялась во времени убыль ионов из раствора и содержание металлов в клетках.

Медь определялась полярографически, а серебро – на атомноадсорбционном спектрофотометре (см. рис. 3.4).

Серебро практически мгновенно поглощалось как живыми, так и мертвыми клетками (гибель клеток вызывалась нагреванием при 80 оС в течение 10 минут). При этом серебро легко вымывалось 0,l н раствором HCl. Процесс поглощения его не зависел от температуры в пределах от 4 до 37 оС. Следовательно, в этом случае наблюдалась адсорбция ионов серебра.

Медь связывалась клетками постепенно, в течение двух часов.

При этом все клетки оставались живыми. Процесс транспорта меди зависел от температуры, требовал энергетического субстрата и подавлялся ингибиторами энергетического метаболизма KCN и 1,4-ДНФ. Мертвые клетки связывали такое же количество меди мгновенно (рис. 3.4).

1 – живые клетки; 2 – мертвые Рис. 3.4 – Сравнительное поглощение ионов серебра (а) и меди (б) клетками Candida utilis (Yarrowia lypolitica) Лабораторная работа 3. Изучения влияния ингибиторов на рост микробной культуры методом острых опытов Цель и задачи работы: получить комплекс экспериментальных ингибирования, используя зависимость Лайнуивера-Берка (1/µ = f(1/S)).

Метод острых опытов изучает влияние ингибитора на поведение экспоненциально растущей культуры. Такого рода исследования позволяют выявить механизм ингибирования биосинтеза микробных полимеров и установить ингибирование синтеза конкретных нуклеиновые кислоты и др.).

Для этого к экспоненциально растущей культуре добавляются различные дозы ингибитора и в течение 1,5-6 часов ведутся наблюдения за кинетикой роста в опыте и контроле.

Важно найти ту дозу (концентрацию) ингибитора, которая действует на наиболее чувствительное звено метаболизма (большие дозировки специфических ингибиторов могут действовать на несколько функций).

Также очень важна длительность опыта: чем она короче, тем точнее информация, т.к. повреждение одного звена метаболизма быстро отражается на многих других. Культивирование должно быть достаточно коротким для того, чтобы другие факторы среды, кроме добавленного ингибитора, не успели оказать своего действия.

Кроме того, в процессе исследований следят за выживаемостью неразмножающихся клеток в присутствии ингибитора.

Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

- посевной материал – суспензия дрожжей (р.p. Saccharomyces или Candida) 200-300 мл на весь эксперимент;

- перемешивающее устройство (качалка) – 2, 4, 6 шт.;

- фотоэлектроколориметр (2 шт.) и кюветы (на 5 мл);

- качалочные колбы (9 шт. на одну качалку) объемом 100 мл;

- питательная среда с раствором микроэлементов и витаминов;

- этанол как субстрат (S = 0,1 %; 0,3 %; 0,5 %);

- ингибитор – 1 % раствор CuSO45H2O;

- пипетки мерные объемом 10 мл – 6-8 шт.;

- пипетки мерные объемом 1 мл – 6-8 шт.;

- конические колбы объемом 250 мл – 6-8 шт.;

- пробирки со штативом (на 1 опыт, на 1 бригаду) – 5-6 шт.;

- мерные колбы объемом 50 или 100 мл – 4 шт.;

- мерные колбы объемом 500 мл – 2 шт.;

1. Провести короткое (до 12 часов) культивирование дрожжей р.

Candida (Erwinia) на питательной среде (ПС) с различными начальными концентрациями углеродного субстрата (этанола): 0,1 %;

0,3 %; 0,5 %. Внесение остальных компонентов питательной среды проводить согласно указаниям в лабораторной работе 2.

Условия периодического культивирования с использованием перемешивающего устройства («качалки»): t = 36 oС, n = 220 об/мин.

По окончании лаг-фазы в начале экспоненциальной фазы роста (обычно через 1,5 часа для данных условий культивирования) добавить в среду ингибитор – 1 % раствор CuSO45Н2О. Провести часовые контрольные (без ингибитора) и опытные (с ингибитором) ферментации.

Схема ферментации представлена ниже:

а) без ингибитора (контроль):

ПС (V = 200 мл) + 0,2 мл + 0,2 мл + этанол + 20 мл внести в 9 качалочных колб по 20 мл в каждую колбу;

б) с ингибитором (опыт):аналогично а) + 0,5 мл 1% раствора CuSO45Н2О:



Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:

«Министерство образования и науки Российской Федерации СЫКТЫВКАРСКИЙ ЛЕСНОЙ ИНСТИТУТ (филиал) Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет им. С. М. Кирова Кафедра теплотехники и гидравлики ОСНОВЫ ОРГАНИЗАЦИИ ЭЛЕКТРОСНАБЖЕНИЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Учебно-методический комплекс по дисциплине для студентов специальности 110302 Электрификация и автоматизация сельского хозяйства...»

«УДК 544(075) ББК 24.5я73 Ф48 Электронный учебно-методический комплекс по дисциплине Физическая химия подготовлен в рамках реализации Программы развития федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский федеральный университет (СФУ) на 2007–2010 гг. Рецензенты: Красноярский краевой фонд науки; Экспертная комиссия СФУ по подготовке учебно-методических комплексов дисциплин Ф48 Физическая химия [Электронный ресурс] : учеб. программа дисциплины...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ СЫКТЫВКАРСКИЙ ЛЕСНОЙ ИНСТИТУТ – ФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ С. М. КИРОВА КАФЕДРА ХИМИИ ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ОСНОВЫ БИОХИМИИ Методические указания по выполнению контрольных работ по дисциплине Органическая химия и основы биохимии для студентов специальности 240406 Технология химической переработки древесины заочной формы обучения и...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С. М. Кирова Кафедра целлюлозно-бумажного производства, лесохимии и промышленной экологии ОБЩАЯ И НЕОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Учебно-методический комплекс по дисциплине для подготовки студентов направления бакалавриата 280200 Защита...»

«ГОУ ВПО ИГМУ Росздрава Кафедра технологии лекарственных форм Т.П. ЗЮБР, Г.И. АКСЕНОВА, И.Б. ВАСИЛЬЕВ Учебно-методическое пособие Детские лекарственные формы для студентов фармацевтического факультета Иркутск, 2009 Пособие подготовлено зав. кафедрой технологии лекарственных форм ИГМУ доцентом Зюбр Т.П., ассистентом, ст. преподавателем, кандидатом фарм. наук. Аксеновой Г.И., кандидатом фарм. наук Васильевым И.Б. Рецензенты: зав. кафедрой фармации ГИУВа, доктор фарм. наук. профессор Ковальская...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С. М. Кирова (СЛИ) Кафедра Машины и оборудование лесного комплекса УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ МАТЕРИАЛОВЕДЕНИЕ для специальности 220301 Автоматизация технологических процессов и производств (по отраслям) Сыктывкар...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С. М. Кирова (СЛИ) Кафедра общей и прикладной экологии КЛИМАТОЛОГИЯ РЕСПУБЛИКИ КОМИ Учебно-методический комплекс по дисциплине для студентов направления бакалавриата 280200 Защита окружающей среды и специальности 280201 Охрана...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ СЫКТЫВКАРСКИЙ ЛЕСНОЙ ИНСТИТУТ – ФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ С. М. КИРОВА КАФЕДРА ХИМИИ ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Методические указания по выполнению контрольной работы по дисциплине Химия для студентов специальности 250201 Лесное хозяйство заочной формы обучения и бакалавров направления 250100 Лесное дело Самостоятельное учебное...»

«МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДООЧИСТКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕМБРАННЫХ МЕТОДОВ Студент Еникеев К.Б. д.т.н., профессор Беззубцева М.М. Санкт-Петербургский государственный аграрный университет Санкт-Петербург, Росcия RESEARCH TECHNIQUE OF WATER TREATMENT WITH THE USE OF MEMBRANE TECHNIQUES Enikeev K.B. Bezzubceva M.M. St. Petersburg State Agrarian University St. Petersburg, Russia Учебно-методическое пособие для бакалавров, обучающихся по направлению Агроинженерия Цель работы: 1. Ознакомиться с процессом...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С. М. Кирова Кафедра теплотехники и гидравлики ЭЛЕКТРОТЕХНИКА И ЭЛЕКТРОНИКА Учебно-методический комплекс по дисциплине для студентов специальности 220700.65 Автоматизация технологических процессов и производств всех форм обучения...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ кафедра Мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф Доника.А.Д., Ильин В.Я. Основы токсикологии токсичных химических веществ учебное пособие по Токсикологии и медицинской защите Волгоград - 2009 ББК 68.69 Авторы: кандидат медицинских наук А.Д.Доника кандидат медицинских наук, доцент В.Я.Ильин Рецензенты: зав.кафедрой фармацевтической и токсикологической химии,...»

«ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО ИГМУ Росздрава) Илларионова Е.А., Сыроватский И.П., Тыжигирова В.В. Учебное пособие по фармацевтической химии для студентов 4 курса заочного отделения фармацевтического факультета ОБЩИЕ И ЧАСТНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ КОНТРОЛЬНЫЕ РАБОТЫ № 1, № 2 и № 3 Иркутск – 2008 Авторы учебного пособия для студентов 4 курса заочного отделения фармацевтического факультета...»

«Министерство образования Российской Федерации МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНОЙ ЭКОЛОГИИ ТЕРМОХИМИЯ И КИНЕТИКА Москва 2003 Министерство образования Российской Федерации _ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНОЙ ЭКОЛОГИИ Кафедра Общая и физическая химия ТЕРМОХИМИЯ И КИНЕТИКА Методические указания Под редакцией д-ра хим. наук В.С.Первова Москва 2003 2 Допущено редакционно-издательским советом. Составители: В.В.Горбунов, Е.А.Зеляева, Г.С.Исаева УДК 554,4; 544, Термохимия...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С. М. Кирова Кафедра целлюлозно-бумажного производства, лесохимии и промышленной экологии ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Учебно-методический комплекс по дисциплине для подготовки дипломированного специалиста по направлению 240000...»

«Федеральное агентство по образованию Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова Кафедра химии и технологии высокомолекулярных соединений им. С.С. Медведева Тверской В.А. МЕМБРАННЫЕ ПРОЦЕССЫ РАЗДЕЛЕНИЯ. ПОЛИМЕРНЫЕ МЕМБРАНЫ Учебное пособие 2008 www.mitht.ru/e-library УДК 539.217 ББК 24.7 Рецензент: д.т.н., проф. Таран А.Л. (МИТХТ, кафедра процессов и аппаратов химической технологии) Тверской В.А. Мембранные процессы разделения. Полимерные мембраны Учебное...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С. М. Кирова Кафедра целлюлозно-бумажного производства, лесохимии и промышленной экологии В. А. Дёмин ТЕХНОЛОГИЯ И ОБОРУДОВАНИЕ ЛЕСОХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ Учебное пособие Утверждено учебно-методическим советом Сыктывкарского...»

«Н.Л. ГЛИНКА ОБЩАЯ ХИМИЯ Учебное пособие Издание стереотипное УДК 54(075.8) ББК 24.1я73 Г54 Глинка Н.Л. Г54 Общая химия : учебное пособие / Н.Л. Глинка. — Изд. стер. — М. : КНОРУС, 2012. — 752 с. ISBN 978-5-406-02149-1 Учебное пособие предназначено для студентов нехимических специальностей высших учебных заведений. Оно может служить пособием для лиц, самостоятельно изучающих основы химии, для учащихся химических средних профессиональных образовательных...»

«ГОУ ВПО ИГМУ Росздрава Кафедра общей химии Физическая и коллоидная химия ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАБУХАНИЯ ЖЕЛАТИНЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ рН СРЕДЫ ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Методическое пособие Иркутск, 2008 Пособие подготовлено кафедрой общей химии ГОУ ВПО ИГМУ Рецензенты: Пособие Определение набухания желатины в зависимости от РН среды состоит из информационного материала и лабораторной работы по курсу коллоидной химии и предназначено для студентов 2 курса фармацевтического факультета очной формы обучения в...»

«ГОУ ВПО ИГМУ Росздрава Кафедра общей химии Физическая и коллоидная химия ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОРОГА КОАГУЛЯЦИИ ЗОЛЯ ГИДРАТА ОКИСИ ЖЕЛЕЗА ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Методическое пособие Иркутск, 2008 Пособие подготовлено кафедрой общей химии ГОУ ВПО ИГМУ Рецензенты: Пособие Определение порога коагуляции золя гидрата окиси железа состоит из информационного материала и лабораторной работы по курсу коллоидной химии и предназначено для студентов 2 курса фармацевтического факультета очной формы обучения в...»

«МИНИСТРЕСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА МЕДИЦИНЫ КАТАСТРОФ Методические указания для выполнения контрольной работы студентами заочного отделения 3 курса фармацевтического факультета по дисциплине Безопасность жизнедеятельности. Медицина катастроф Волгоград – 2013 г 1 Методические рекомендации Контрольная работа является индивидуальной обязательной формой контроля самостоятельной внеаудиторной работы студента заочного...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.