«МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ ПО БИОХИМИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВЫСШЕГО СЕСТРИНСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ Нижний Новгород 2008 2 Составители: зав. кафедрой, профессор Е. И. Ерлыкина, доценты ...»
-- [ Страница 1 ] --
Нижегородская государственная медицинская академия
Кафедра биохимии имени профессора
Г. Я. Городисской
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКИХ
ЗАНЯТИЙ ПО БИОХИМИИ
ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВЫСШЕГО СЕСТРИНСКОГО
ОБРАЗОВАНИЯ
Нижний Новгород
2008
2 Составители:
зав. кафедрой, профессор Е. И. Ерлыкина, доценты С. П. Калашников, П. П.
Загоскин, В. М. Фокин, Т.И. Шлапакова, ст. преподаватели Т. С. Семенова, Л. И.
Якобсон, ассистенты О. В. Баринова, О. И. Александрова Методическое пособие для практических занятий по биохимии для студентов высшего сестринского образования. – Нижний Новгород, 2008.
Данное учебное пособие составлено в соответствии с рабочей программой по биохимии для студентов высшего сестринского образования. Оно предназначено для экономии времени студента при подготовке к практическим занятиям и оптимизации работы при выполнении практических заданий.
-при загорании жидкостей, смешивающихся с водой, любыми огнетушителями:
струей воды, песком, асбестом, кошмой, суконным одеялом;
-горящие провода и электроприборы, находящиеся под напряжением, обесточить и тушить углекислым огнетушителем;
-горящие деревянные части – всеми огнегасящими средствами: сухой песок, кошма.
Лица, виновные в нарушении инструкции пожарной безопасности, несут административную и материальную ответственность.
МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
ПРИ РАБОТЕ С АГРЕССИВНЫМИ СРЕДАМИ
1. Проводить опыты, только предусмотренные преподавателем, соблюдая правила безопасности.
2. В химической лаборатории не ешьте, не пробуйте вещества на вкус, не наклоняйтесь над склянкой с реактивами.
3. Определяя вещество по запаху, осторожно направляйте к себе газ или пар и не делайте глубокого вдоха.
4. Будьте особенно осторожны в обращении с концентрированными кислотами и щелочами, ядовитыми веществами, участки кожи, одежды, на которые попал реактив, сначала тщательно смойте водой, затем протрите нейтрализующим реактивом.
5. Для приготовления растворов серной кислоты необходимо приливать в воду тонкой струей при непрерывном помешивании. Приливать воду в серную кислоту запрещается.
6. Жидкости, могущие причинить ожоги или отравления, запрещается брать ртом через пипетки.
МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С
ЭЛЕКТРООБОРУДОВАНИЕМ И ЭЛЕКТРОПРИБОРАМИ
При работе с электрооборудованием и электроприборами запрещено:
-работа с неисправным электрооборудованием;
-прикасаться руками или металлическими предметами к корпусам электроприборов и оголенным проводам;
-нарушать правила пользования электроприборами; уходя из помещения, оставлять включенными электрические установки без надзора;
В случае загорания электропроводов или электроприборов под током, немедленно отключить ток. Загоревшиеся провода тушить углекислым огнетушителем.
Основными поражающими факторами являются: поражение электрическим током, электрической дугой, ослепление электрической дугой.
Быстрая и правильная помощь при поражении электрическим током – главное условие спасения пострадавшего. Необходимо:
-как можно быстрее освободить его от действия электрического тока, перед этим выключив ток;
-если поблизости нет рубильника, силой отделить пострадавшего от проводника, не касаясь его тела, встав при этом на резиновый коврик, сухую фанеру или брезент;
-если на пострадавшего упал оголенный проводник под напряжением, то этот провод нужно сбросить сухой палкой или защищенной (рукавом, шарфом) рукой;
-оказать первую помощь, обеспечить пострадавшему приток свежего воздуха, дать понюхать нашатырный спирт, согреть тело растиранием, при отсутствии признаков жизни сделать искусственное дыхание;
-вызвать врача.
СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.
Белки являются обязательным компонентом всех живых организмов. Им принадлежит ведущая роль в многообразных физиологических функциях организма, а также в катализе и регуляции метаболических процессов.
Белки представляют собой макромолекулы с молекулярным весом от 4-5 тыс.
до нескольких миллионов, состоящие из аминокислот. В составе белков встречается около 20 аминокислот. Они связаны между собой ковалентными пептидными связями, образуя полипептидные цепи.
Известны 4 уровня организации или структуры белковой молекулы.
Первичная структура - это определённая последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептиде.
Вторичная структура обусловлена свёртыванием в пространстве полипептидной цепи в виде -спирали и -складчатости.
Третичная структура - трёхмерная структура полипептидной спирализованной цепочки, возникающая при взаимодействии радикалов аминокислот, принадлежащих одной и той же цепи, но удалённых друг от друга. В стабилизации третичной структуры участвуют дисульфидные, водородные, гидрофобные силы взаимодействия неполярных аминокислот, электрическое взаимодействие заряженных групп.
Многие белки состоят из нескольких полипептидных цепей. Взаимное пространственное расположение таких частиц (субъединиц) в единой белковой молекуле называют четвертичной структурой белка. В создании её принимают участие слабые связи.
Белки способны вступать в различные химические реакции: окисления, восстановления, солеобразования и т.д. Обладая значительным количеством основных (-NH2) и кислых (-СООН) групп, белки проявляют амфотерные свойства, обладают электорофоретической активностью. Для белков характерны оптические свойства.
Одним из характерных свойств белка является их способность к денатурации утере ряда характерных физических и биологических свойств под влиянием агентов, не нарушающих пептидных связей и состава белка и влияющих, главным образом, на третичную структуру белковой молекулы.
Все белковые вещества делят на простые и сложные. Простыми называются белки, которые при гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты;
сложными - которые включают как аминокислоты, так и небелковые компоненты кофакторы.
Ферменты или энзимы - специфические белки, которые находятся во всех клетках и тканях организмов и играют роль биологических катализаторов.
Важнейшие химические реакции, протекающие в живой клетке, катализируются ферментами, обеспечивающими большую скорость реакции при относительно невысокой температуре и низкой концентрации реагирующих веществ.
Вещества, подвергающиеся под действием ферментов разнообразным химическим превращениям, носят название субстратов. Действие каждого фермента строго ограничено одним или несколькими родственными по структуре субстратами. Часть фермента-белка, активно взаимодействующая с субстратом, носит название активного центра фермента. В построении активного центра принимает участие ряд аминокислот, объединённых определённым образом при формировании третичной ступени организации фермента.
Ферменты могут иметь природу простых белков и относится к сложным белкам. Белковая часть фермента называется апоферментом. Небелковая часть может слабо связываться с апоферментом и легко разъединяться - кофермент, или связь между ними может быть прочная - простетическая группа.
Все ферменты подразделяются на 6 классов в зависимости от характера их действия: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.
Работа 1. Биуретовая реакция на пептидную связь (реакция Пиотровского).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Реакция обусловлена присутствием в белке пептидных связей, образующих с ионами меди в щелочной среде солеобразные комплексы. В зависимости от длины полипептидной цепи раствор окрашивается в сине-фиолетовый или розовый цвет.
К 10 каплям раствора белка прибавить 5 капель 10% едкого натра и 1 каплю 1% сернокислой меди и перемешать. Содержимое пробирки приобретает синефиолетовый цвет. То же самое проделать с растворами полипептидов и аминокислот. Затем решить задачу, определив содержимое раствора (белок, полипептид, смесь аминокислот), проделав биуретовую реакцию.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Работа 2. Необратимые способы осаждения белка из раствора.
ОБОРУДОВАНИЕ: водяная баня (100 °С).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Осаждение белков из растворов и биологических жидкостей может быть достигнуто с помощью физических и химических агентов, вызывающих необратимую денатурацию белка с нарушением обоих факторов устойчивости молекул белка (гидратной оболочки и заряда) и выпадением белка в осадок.
Работа выполняется в соответствии с условиями, указанными в таблице:
(качественная реакция на Работа 3. Открытие апофермента и кофермента в аспартат-аминотрансферазе.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
В сложных белках-ферментах белковый компонент (апофермент) может быть обнаружен с помощью биуретовой реакции. Небелковый компонент, содержащий производное какого-либо витамина, может быть открыт с помощью качественных реакций на соответствующий витамин. В состав аспартатаминотрансферазы входит в качестве кофермента пиридоксальфосфат - производное витамина В6. Витамин В (пиридоксол) и его производные бесцветны, но приобретают красную окраску в присутствии хлорного железа. Реакция обусловлена образованием комплексной соли типа фенолята железа.
1. Открыть белковую часть фермента с помощью биуретовой реакции. (См.
протокол занятия №1).
2. Открыть кофермент с помощью качественной реакции на витамин В6. В пробирке смешать 5 капель раствора аспартатаминотрансферазы и 1 каплю 5% раствора хлорного железа. Встряхнуть. Появляется вишневое окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
соблюдайте технику безопасности при работе с сильно действующими и ядовитыми веществами.
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Белки - важнейшие макромолекулы организма. Разнообразие белков и их функций.
2. Аминокислоты – структурные мономерные молекулы белка, их строение, классификация, номенклатура. Заменимые и незаменимые аминокислоты.
3. Первичная структура, строение полипептидной цепи, пептидная связь, наименование пептидов.
4. Вторичная структура белка, связи ее стабилизирующие. Характеристика спирали и -складчатой структуры.
5. Третичная структура, связи ее стабилизирующие. Мономерные белки.
6. Четвертичная структура, связи ее стабилизирующие. Олигомерные белки.
7. Физико – химические свойства белков. Молекулярная масса. Изоэлектрическая точка белков. Влияние рН на заряд белков. Денатурация белков.
8. Ферменты. Структурная организация. Классификация.
9. Специфичность действия ферментов, её значение.
10. Витамины как кофакторы ферментов.
11. Пути регуляции активности ферментов – ингибирование, активация, аллостерическая регуляция, химическая иструктурная модификация.
БИОХИМИЯ ГОРМОНОВ. РЕГУЛЯЦИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА.
Углеводы являются постоянными компонентами всех органов и тканей. У животных содержание углеводов в печени может достигать 5 % и более от её веса, в мышцах - до 1%, в сердце - до 0,5%, в головном мозгу- до 0,2%.
Углеводы играют исключительно важную роль как в растительных, так и в животных организмах. Роль углеводов сводится к следующему:
1. Энергетическая роль. Углеводы легче всего окисляются в организме. За счёт их окисления образуется около 60% всей вырабатываемой энергии. При сгорании 1г углеводов вырабатывается 4,1 ккал.
2. Пластическая роль. Углеводы являются строительным материалом для синтеза различных биологически активных веществ. Рибоза и дезоксирибоза входят в состав нуклеиновых кислот, в состав нуклеозидтрифосфатов, например, НАД, ФАД, АТФ и т.д. Простые сахара входят в состав гликопротеинов и протеогликанов, в состав некоторых липидов. Таким образом, углеводы используются дляпостроения различных органических веществ в организме.
3. Опорная и защитная роль. Этоа функция связана в основном с включением углеводов в гликозамингликаны, входящие в состав хрящей, костной ткани и образуют основное вещество соединительной ткани.
Углеводы занимают очень важное место в питании человека, составляя около 60-70% его рациона. Из углеводов наибольшее значение в питании имеют крахмал и тростниковый сахар, которые хорошо усваиваются организмом. Обычно за сутки человек потребляет 450-600г углеводов.
В желудочно-кишечном тракте под действием ферментов происходит распад сложных углеводов до моносахаридов, которые всасываются в тонком кишечнике. В процессе всасывания большая часть моносахаридов превращается в глюкозу, которая с током крови попадает в печень. В печени глюкоза превращается в основном в гликоген, а часть её без изменения поступает в большой круг кровообращения. В крови концентрация глюкозы поддерживается на постоянном уровне - 3,3 - 5,5 миллимоль на литр. Регуляция уровня глюкозы в крови осуществляется центральной нервной системой и эндокринными железами, т.е.
происходит нейрогуморальным путём - гормонами.
Гормоны - это органические вещества различной химической природы, синтезируемые в эндокринных железах или железах внутренней секреции и поступающие непосредственно в кровь. Своё название гормоны получили от греческого слова «hormao» - возбуждаю. Гормоны - биологически активные вещества, проявляющие регуляторное действие в обмене веществ ничтожно малых количествах, усиливающие или замедляющие физиологическую деятельность органов и тканей. Недостаток или избыток тех или иных гормонов связан с нарушением функции внутренней секреции той или иной железы (гипофиза, щитовидной, надпочечников, панкреатической и др.) и приводит к ряду заболеваний. Например, сахарный диабет развивается при нарушении функции поджелудочной железы. Необходимо отметить гормональное корригирующее действие гипофиза на деятельность всех желёз. Кроме того, работа эндокринных желёз контролируется центральной нервной системой.
Гормоны имеют различную химическую природу. Они либо являются белками (инсулин, глюкагон и др.), или образуются из аминокислот (тироксин, адреналин и др.), или же в их основе лежит стериновое ядро (половые гормоны, кортикостероиды).
В зависимости от своей химической природы гормоны имеют разный механизм действия. Гормоны аминокислотной и белковой природы, то есть растворимые в воде, не могут проникнуть через липидный слой мембран и реализуют своё действие через посредников - мессенджеров, которые передают и усиливают гормональный эффект. Наиболее изученным посредноком в осуществлении гормонального действия является цАМФ. Гормоны стероидной природы растворимы в жирах, свободно проходят сквозь липиды мембран и оказывают своё действие непосредственно в цитозоле. Поэтому различают гормоны с мембранным и цитозольным механизмом действия.
Органические кислоты легко вызывают денатурацию белка, в результате чего выпадает осадок.
Осаждение белка сульфосалициловой кислотой высокоспецифичная и чувствительная реакция.
В пробирку налить 1 мл исследуемого раствора инсулина и добавить 3- капель сульфосалициловой кислоты. При наличии в растворе инсулина выпадает осадок.
2. Биуретовая реакция на гормоны белковой и полипептидной природы
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Белки и пептиды взаимодействуют с CuSO4 в щелочной среде, образуя комплексное соединение.Реакция обусловлена наличием в структуре пептидной связи. Образовавшееся комплексное соединение меди (биуретовый комплекс) дает фиолетовую окраску.
В пробирку вносят 1-5 капель исследуемого раствора АКТГ,5 капель 10% раствора NаОН, 1 каплю 1% раствора CuSО4. Наблюдается появление фиолетовой окраски.
3. Обнаружение адреналина хлоридом железа.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Адреналин дает реакции, характерные для пирокатехинов. С ионами железа он образует соединение изумрудно-зеленого цвета типа фенолята. Адреналин легко окисляется, что также характерно для пирокатехинов. Если к раствору адреналина или его соединению с железом добавить щелочь, образуется адренохром красного цвета.
В пробирку вносят 10 капель раствора 0,1% адреналина и добавляют 1 каплю 1% раствора FeCl3. Появляется изумрудно-зеленая окраска. К полученному раствору добавить 1 каплю 5% щелочи. Окраска становится вишнево-красной.
4. Обнаружение иода в тироксине.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Гормоны щитовидной железы (тироксин, трииодтиронин) содержат в своем составе йод. Если их подвергнуть щелочному гидролизу (кипячению с КНСО3), то выделится йодит калия, из которого при добавлении йодата калия выделяется йод.
Свободный йод обнаруживаются с помощью крахмала.
К 1 мл щелочного гидролизата гормонов щитовидной железы добавляют серную кислоту до кислой реакции (4-5 капель), 2 капли 1% раствора крахмала и капель 20% раствора йодата калия. Появляется синяя окраска.
Работа 2. Изучение влияния инсулина, адреналина и кортизола на содержание глюкозы в крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
К числу специфических регуляторов обмена углеводов относятся гормоны надпочечников: мозгового вещества - адреналин, коркового слоя глюкокортикоиды (кортизол и др.) и два гормона поджелудочной железы - инсулин и глюкагон.
Для оценки влияния гормонов на уровень глюкозы в крови берут кровь у животных до введения гормона и через 30,60,90,120 мин. после введения гормона (инсулин, адреналин) или через 6,12,18,24 час. после введения кортизола.
Определение глюкозы проводится глюкозооксидазным методом.
Схема постановки эксперимента:
1. У кролика из ушной вены взять 0,1 мл крови с помощью микропипетки, осадить белки и определить в надосадочной жидкости содержание глюкозы.
2. Медленно подкожно ввести необходимое количество инсулина (из расчета клиническая единица на 1 кг веса), продезинфицировать место укола.
3. Через 30,60,90,120 мин. вновь взять 0,1 мл крови и повторно определить содержание глюкозы.
4. Аналогично провести опыт с введением адреналина (0,5 мг подкожно), а затем через 30,60,90,120 мин. определить содержание глюкозы в крови.
5. Эксперимент повторить с введением кортизола (через 6,12,18,24 часа).
глюкозооксидазным методом.
К 1 мл надосадочной жидкости добавить 3 мл рабочего реактива (содержащего глюкозооксидазу, пероксидазу и о-толидин), через 15 минут колориметрировать на ФЭКе против H2O (красный светофильтр).
Стандартная проба.
Готовится точно так же, как и опытная проба, но вместо крови необходимо взять 0,1 мл стандартного раствора глюкозы с концентрацией 5,5 мМ/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Полученные результаты о влиянии адреналина, инсулина и кортизола занести в таблицу и построить графики.
ИНСУЛИН АДРЕНАЛИН КОРТИЗОЛ
введ. мин мин мин мин введ. мин мин мин мин введ. час час час час
ТЕХНИКА РАБОТЫ НА ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРЕ МАРКИ КФК-2-МП.
При открытой крышке прогреть ФЭК 15 минут. Установить светофильтр (для данного анализа –зеленый; длина волны 540 нм). Поставить кюветы (дальняя кювета - контроль, содержащий дистиллированную воду (растворитель), ближняя кювета анализируемый раствор).
Установить рычаг влево. Нажать кнопку "ПУСК". Нажать кнопку "Ш0".
Закрыть крышку. Нажать кнопку "К1". Перевести рычаг в правое положение.
Нажать кнопку "D5". Считать результат со шкалы прибора. Перевести рычаг в левое положение. Открыть крышку. Вынуть "опытную" кювету. Протереть кюветное отделение ФЭК. Прибор готов к дальнейшим измерениям.
Работа 3. Качественное определение глюкозы в моче /проба Троммера/.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Реакция Троммера: основана на способности углеводов, окисляясь, восстанавливать металлы, в данном случае двухвалентную медь При нагревании в кипящей водяной бане Cu(OH)2 (осадок голубого цвета) восстанавливается в CuOH (осадок желтого цвета), а затем в Cu2O (осадок красного цвета). Для проведения реакции Троммера к исследуемому раствору прибавить 5 капель 10% NaOH и капли 1% CuSO4. Нельзя добавлять избыток CuSO4 и передерживать пробирки в водяной бане, т.к. в этом случае может образоваться оксид меди CuO (черный осадок), маскирующий положительную реакцию.
ХОД РАБОТЫ
К 5 каплям исследуемой мочи прибавить 5 капель 10% раствора едкого натра, 5 капель 1% раствора сернокислой меди и нагреть на кипящей водяной бане. В присутствии углеводов развивается желтая или красная окраска осадка. Работу выполнить с нормальной мочой и с мочой, содержащей сахар.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Работа 4. Количественное определение глюкозы в моче (метод Альтгаузена).
Метод основан на том, что при действии на альдегиды небольшим количеством разбавленной щелочи происходит полимеризация альдегидов.
Продукты этой реакции называют альдолями, а рассматриваемую реакцию альдольной конденсацией.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
При нагревании альдегидов с концентрированной щелочью они превращаются в смолистые вещества бурого цвета.
Работу выполнить с нормальной мочой и с мочой, содержащей сахар. 4 мл мочи смешать с 1 мл 10% раствора едкого натра и кипятить в течение 1 минуты.
Через 10 минут развившуюся окраску сравнить со стандартной цветной шкалой. На шкале указано содержание сахара в процентах, соответствующее определенному окрашиванию жидкости в пробирке. Если полученный цвет жидкости интенсивнее цвета одной полоски таблицы, но слабее следующей, то содержание сахара будет средней величиной между обозначенными на этих полосках. Мочу, содержащую сахар более 4%, необходимо разбавить водой в 2 или 3 раза и с уже разведенной провести определение. Полученный процент сахара в этом случае надо умножить на степень разведения.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Общее понятие о гормонах.
2. Классификация гормонов по химической природе.
3. Иерархия действия гормонов.
4. Транспорт гормонов, синтез гормонов.
5. Внутриклеточный механизм действия гормонов.
6. Мембранный механизм действия гормонов.
7. Глюкоза крови, её происхождение, содержание в норме.
8. Гормональная регуляция уровня глюкозы в крови.
9. Гипо- и гипергликемия, факторы, способствующие их развитию. Глюкозурия, причины её возникновения.
10. Влияние инсулина, глюкагона, адреналина на процессы синтеза и распада гликогена.
ВНУТРИТКАНЕВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ВЕЩЕСТВ. БИОХИМИЯ
ЛИПИДНОГО ОБМЕНА.
Липидами называются неоднородные по химическому строению вещества, обладающие общими физико-химическими свойстами и биологическими функциями. Липиды нераствормы в воде, но хорошо растворимы в органических растворителях.
Липиды широко распространены в животном организме. Нейтральные жиры выполняют резервную функцию, депонируются в подкожной жировой клетчатке и сальниках. Запасные жиры представляют в организме энергетический резерв, при полном окислении 1г жира даёт 9,3 ккал энергии. Кроме того, они участвуют в процессах теплорегуляции, несут защитную функцию. Жиры служат источниками гормонов, а так же посредников передачи гормонального сигнала (диацилглицеролы, инозитол-3-фосфаты).
В организме липиды соединяются с некоторыми белками, образуют надмолекулярные комплексы, называемые липопротеидами..Различают липопротеиды плазмы крови и липопротеиды мембран.
Плазменные липопротеины - это транспортная форма липидов, содержит нейтральные липиды, холестерин и его эфиры. В крови разделяют несколько классов липопротеинов: хиломикроны - переносчики экзогенного жира;
липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) - переносчики эндогенного жира и холестерина; липопротеины низкой плотности (ЛПНП) - переносчики холестерина в ткани; липопротеины высокой плотности (ЛПВП) - переносчики холестерина из тканей в печень. ЛПОНП и ЛПНП являются атерогенными фракциями, т.к.
способствуют развитию атеросклероза. ЛПВП называется антиатерогенной фракцией, “уборщиком” холестерина.
Мембранные липопротеины - фосфолипиды - входят в состав мембран клеток и клеточных органелл.
Жиры из жировых депо поступают по мере надобности в кровь и используются тканями в качестве энергетического или пластического материала. В результате распада жирных кислот образуется ацетил-КоА, который может окисляться в цикле Кребса с высвобождением большого количества энергии. В печени ацетил-КоА служит основой для образования ацетоуксусной кислоты, количество которой возрастает при нарушениях липидного обмена. В печени протекают синтетические процессы, основой для которых является ацетил-КоА:
синтез жирных кислот, триглицеридов, фосфатидов и холестерина.
Работа 1. Определение ацетоновых тел в моче.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
К ацетоновым или кетоновым телам относятся ацетон, -оксимасляная и ацетоуксусная кислоты.
Обнаружение в моче ацетона основано на взаимодействии его с нитропруссидом натрия и образовании окрашенного соединения. Качественное выявление ацетоуксусной кислоты основано на образовании комплексного соединения железа с енольной формой ацетоуксусной кислоты.
1. Экспресс-метод определения ацетона в моче( по Лестраде).* На предметное стекло, помещенное на лист белой бумаги, нанести небольшое количество порошка, состоящего из смеси натрия нитропруссидного, аммония сернокислого, натрия углекислого и добавить 2-3 капли исследуемой мочи. При наличии ацетона максимальное вишневое окрашивание наступает обычно через 1- минуты. Пробу считать отрицательной, если изменения цвета мочи не наступает, положительной - при отчетливо фиолетовой окраске, появляющейся через 1- минуты.
2. Реакция Легаля на ацетон с нитропруссидом натрия.* К небольшому количеству исследуемой мочи прибавить несколько капель раствора нитропруссида натрия и затем 3-4 капли 10% едкого натрия. Образуется красное окрашивание. Затем жидкость подкислить 10% уксусной кислотой. При этом в присутствии ацетона красная окраска приобретает вишневый оттенок, а если ацетона нет, то при добавлении уксусной кислоты красное окрашивание исчезает.
3. Реакция Герхарда на ацетоуксусную кислоту.* В пробирку налить 1-2 мл исследуемой мочи и прибавить 4-5 капель хлорного железа. Наблюдается вишнево-красное окрашивание, если присутствует ацетоуксусная кислота.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
* реакции проделать с нормальной мочой и мочой, содержащей кетоновые тела.
Работа 2. Определение - и пре--липопротеинов в сыворотке крови.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Метод основан на способности гепарина образовывать с - и пре- липопротеинами сыворотки крови комплекс, который под действием хлористого кальция выпадает в осадок. Концентрацию - и пре- -липопротеинов сыворотки крови определяют по степени мутности, которая пропорциональна концентрации липопротеинов.
В пробирку, содержащую 0,2 мл сыворотки крови, прилить 2 мл 0,05М хлористого кальция. Определить исходную величину оптической плотности /Д1/ на ФЭКе /красный светофильтр, 630-690 нм, кювета 0,5 см/. Перенести содержимое кюветы обратно в пробирку. К содержимому пробирки добавить микропипеткой точно! 0,04 мл гепарина, несколько раз промыв пипетку содержимым пробирки.
Ровно через 5 минут измерить величину оптической плотности /Д2./ на ФЭКе.
Содержание - и пре--липопротеинов в сыворотке крови рассчитывают по формуле:
где 12-эмпирический коэффициент для выражения -липопротеинов в г/л.
По полученным данным рассчитать содержание - и пре--липопротеинов в исследуемой сыворотке крови.
В норме содержание - и пре--липопротеинов в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,2 г/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Синтез кетоновых тел в печени. Пути образования ацетоуксусной кислоты.
2. Пути активации ацетоуксусной кислоты.
3. Нарушения, приводящие к накоплению ацетоновых тел в тканях. Ацетонемия, ацетонурия.
4. Липопротеины сыворотки крови, классификация, строение, роль в обмене веществ- хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП.
5. Гиперхолестеролемия, гиперлипопротеинемия как факторы риска развития атеросклероза.
БИОХИМИЯ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА.
Все физиологические функции и лежащие в их основе биохимические процессы осуществляются в организме при активном участии белков.
Первый этап преобразования белковых веществ после их поступления в организм начинается в желудочно-кишечном тракте, где белкиподвергаются действию ряда протеолитических ферментов. Под действием этих ферментов происходит расщепление сложных белков до протеинов и простетических групп и окончательный распад простых белков до свободных аминокислот.
Часть аминокислот, Всосавшись в кровь, используется в органах и тканях для построения тканевых белков, ферментов, гормонов, пуриновых и пиримидиновых оснований и др. Аминокислоты, не использованные для этих процессов, подвергаются в тканях различным превращениям.
Конечными продуктами распада аминокислот в тканях являются углекислый газ, вода и аммиак.
Переваривание белков начинается в желудке. Чистый желудочный сок имеет сильную кислую реакцию (рН около 1), а кислотность желудочного содержимого несколько меньше (рН=1,5 - 2,5). Благодаря соляной кислоте обеспечивается оптимальный рН желудочного сока. Соляная кислота активирует пепсиноген путем ограниченного протеолиза (отщепления участка полипептида), превращая его в активный пепсин. При расщеплении белковой молекулы пепсином в гидролизате образуются довольно близкие по величине полипептиды, которые подвергаются дальнейшему гидролизу в двенадцатиперстной кишке. Сюда в составе поджелудочного сока выделяются в неактивном виде трипсиноген и химотрипсиноген, которые активируются в щелочной среде путём ограниченного протеолиза. Трипсин и химотрипсин расщепляют белки, не изменившиеся в желудке под влиянием пепсина, а также полипептиды. Образовавшиеся полипептиды подвергаются дальнейшему расщеплению в кишечнике под влиянием пептидаз - карбоксипептидазы, аминопептидазы, дипептидазы.
Работа 1. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты, общей кислотности желудочного сока раздельно и в общей пробе.
ОБОРУДОВАНИЕ: бюретки для титрования.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Для определения общей кислотности и свободной соляной кислоты используется метод титрования 0,1н раствором NаОН в присутствии соответствующих индикаторов (фенолфталеина и диметиламиноазобензола).
Кислотность желудочного сока оценивается в единицах кислотности по количеству миллилитров 0,1н раствора NAOH, необходимого для нейтрализации 100 мл желудочного сока.
1.Количественное определение общей кислотности желудочного сока В тщательно вымытую водой и ополоснутую соляной кислотой колбу прилить 10 мл профильтрованного желудочного содержимого, добавить 1-2 капли 0,5% раствора фенолфталеина* (зона перехода окраски индикатора при рН=8,2Провести титрование 0,1н раствором едкого натра до появления слаборозового окрашивания, неисчезающего в течение 1 минуты. При титровании колбочка ставится на лист белой бумаги.
РЕЗУЛЬТАТЫ: (выразить в условных единицах кислотности, сравнить с нормой) 2. Количественное определение свободной соляной кислоты К 10 мл желудочного сока добавить 1-2 капли спиртового раствора диметиламиноазобензола (зона перехода окраски в пределах рН=2,9-4,2).
Титрование вести 0,1н раствором NаОН до появления оранжевой окраски.
Свободная соляная кислота почти вся оттитровывается при рН=3.
РЕЗУЛЬТАТЫ: (выразить в единицах кислотности, сравнить с нормой) 3. Количественное определение общей кислотности, общей соляной кислоты, свободной соляной кислоты и связанной соляной кислоты желудочного сока в одной пробе.
Определение перечисленных видов кислотности в одной пробе желудочного сока титрованием 0,1н раствором NаОН с одновременным присутствием двух индикаторов; диметиламиноазобензола и фенолфталеина.
В колбочку отмерить 10 мл фильтрата желудочного сока, добавить 1-2 капли диметиламиноазобензола и 2 капли фенолфталеина. Титрование ведется 0,1н раствором едкого натра до появления желтовато-красной (оранжевой) окраски.
Далее продолжается титрование до лимонно-желтого цвета (вторая отметка) и, наконец, до появления розовой окраски (третья отметка), не исчезающей в течение минуты. В каждом случае регистрировать количество мл 0,1н раствора едкого натра, потраченного на титрование.
Первый результат титрования находится в соответствии с количеством перед каждым титрованием колбочку тщательно вымыть водой, ополоснуть соляной кислотой и вновь ополоснуть дистиллированной водой.
свободной кислоты, второй используется для вычисления связанной соляной кислоты, по последнему - рассчитывается общая кислотность.
Среднее арифметическое между вторым и третьим титрованием используется для расчета содержания общей соляной кислоты.
Пример: до первой метки (оранжевый цвет) на титрование пошло 3,2 мл 0,1н раствора едкого натра, до второй - 4,5 мл (лимонно-желтый цвет), до кислота третьей - 5,5 мл (розовый цвет). Среднее арифметическое между второй и третьей отметкой:
Свободная соляная кислота 3.2. 10 = 32 ед.
Общая соляная 5.0. 10 = 50 ед.
Связанная соляная кислота 50 -32 =18 ед.
Общая кислотность 5.5. 10 = 55 ед.
Показатели кислотности желудочного сока в норме:
Общая кислотность – 40 – 60 ед.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
а) До первой отметки б) До второй отметки в) До третьей отметки Результаты расчета кислотности желудочного сока (ед) 1. Свободная HCL 2.Общая HCL 3. Связанная HCL 4. Общая кислотность Работа 2. Определение общего белка плазмы крови биуретовым методом.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Белки, реагируя в щелочной среде с сульфатом меди, образуют соединение, имеющее розово-фиолетовую окраску. Интенсивность получаемой окраски. прямо пропорциональной концентрации белка в растворе. измеряется с помощью фотоэлектроколориметра.
1. В опытную пробирку, содержащую 0.1 мл плазмы крови, налить 5 мл биуретового реактива, перемешать и оставить при комнатной температуре на минут.
2. В контрольную пробирку налить 0,1 мл 0.9 % раствора хлорида натрия и добавить 5 мл биуретового реактива, перемешать и оставить при комнатной температуре на 30 минут.
3. Колориметрировать против контроля в кюветах толщиной 10 мм при зеленом светофильтре (540-560 нм).
4. По калибровочному графику рассчитать содержание белка в пробе.
НОРМА - 65-85 г/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Работа 3. Обнаружение фенилпирувата в моче (проба Фелинга).
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Фенилпировиноградная кислота образует с ионами трехвалентного железа комплексное соединение, окрашенное в сине-зеленый цвет.
К 2 мл мочи прилить 4-5 капель 10% раствора хлорного железа. При наличии в моче фенилпировиноградной кислоты появляется сине-зеленое окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (объяснить причину появления фенилпирувата в моче).
2. Переваривание белков в желудке, ферменты, механизм активации, специфичность действия. Роль соляной кислоты.
3. Переваривание белков в кишечнике, ферменты, механизм активации, специфичность действия.
4. Наследственные энзимопатии.
ТКАНЕВАЯ БИОХИМИЯ.
Кровь - основная жидкость организма. Через ннеё клетки тела получают всё необходимое питание, в неё они отдают многочисленные продукты обмена. Состав крови отражает нормальные и патологические процессы, происходящие в организме.
Кровь выполняет разнообразные функции: дыхательную - доставка кислорода к тканям и удаление из них углекислоты; питательную - транспорт к органам и тканям продуктов, поступающих из пищеварительного тракта; выделительную перенос продуктов обмена веществ к выделительным органам - лёгким, почкам, кишечнику; регуляторную - доставка к органам и тканям гормонов и витаминов, регуляция осмотического давления, поддержание постоянства концентрации ионов водорода, регуляция тепла в организме; защитную - транспортировка защитных веществ, например, антител; механическую - создание необходимого давления в полостях и органах.
Кровь состоит из плазмы и взвешенных в ней форменных элементов. В норме рН крови человека составляет около 7,4.
Эритроциты млекопитающих живут до 90 - 110 дней и затем разрушаются в клетках ретикулоэндотелиальной системы. Освободившийся гемоглобин расщепляется на белок и гем, который теряет железо и подвергается дальнейшим превращениям. При этом образуется ряд веществ, которые переходят в билирубин.
Это нерастворимое в воде соединение, обладающее токсичностью, поэтому, попадая в кровь, он образует комплекс с альбуминами и называется свободным, непрямым, т.к. не даёт прямой цветной реакции с диазореактивом.
В таком виде билирубин транспортируется для обезвреживания в печень, где теряет связь с белком и вступает во взаимодействие с уридиндифосфоглюкуроновой кислотой (УДФГГ). Этот обезвреженный билирубин называется связанным, прямым, т.к. даёт прямую цветную реакцию с диазореактивом.
Билирубин вместе с желчью изливается в желчный пузырь, затем в кмшечник, где под влиянием микроорганизмов восстанавливается в стеркобилиноген и в дальнейшем в стеркобилин и выводится из кишечника. Часть билирубина из кишечника всасывается в кровь, выделяется с мочой, обуславливая её специфическую окраску.
В норме в крови содержится общий билирубин 0,3 -17 микромоль на литр, состоящий из непрямого и прямого в соотношении 3:1, в моче содержится около мг стеркобилиногена, с калом выводится 200 - 300 мг стеркобилина.
Работа 1. Бензидиновая проба на гемовую группировку гемоглобина.
К 5 каплям разбавленной крови добавить 5 капель 0.2% спиртового раствора бензидина и несколько капель перекиси водорода. Жидкость окрашивается в синий или зеленый цвет.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Работа 2. Количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашика.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние. Такой билирубин со смесью диазореактивов дает розово-фиолетовое окрашивание, которое под действием реактива Фелинга переходит в зеленое.
По интенсивности последнего фотоколориметрически определяют концентрацию фракций билирубина.
Работу проводят по следующей схеме, используя 3 пробирки с сывороткой крови.
Колориметрировать на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 670 нм) против воды в кюветах толщиной 5 мм. Из показателей, полученных при колориметрии общего и прямого билирубина, вычесть показатель контроля. Расчет провести по калибровочному графику. Найти содержание общего и прямого билирубина в микромолях на литр. Для определения уровня непрямого билирубина из общего его содержания вычесть показатель прямого билирубина.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Функция крови. Белки плазмы крови. Физиологическая роль белков плазмы крови.
2. Белки плазмы крови:
а) альбумины, их роль в организме.
б) 1, 2,, -глобулины, характеристика отдельных представителей.
Привести примеры индивидуальных белков, роль их в организме.
3. Синтез белков крови.
4. Гемоглобин - основной белок эритроцитов, его структурная организация.
5. Ферменты крови. Диагностическое значение исследования ферментативного состава крови.
6. Роль печени в обмене веществ.
7. Распад гемоглобина в клетках ретикулоэндотелиальной системы.
8. Прямой билирубин как продукт превращения непрямого билирубина в гепатоцитах.
9. Превращение билирубина в желудочно-кишечном тракте.
ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ: КОЛЛОКВИУМ.
ЛИТЕРАТУРА.
1. Николаев А. Я. Биологическая химия. - М.: Высшая школа, 1998.
2. Северин Е. С., Алейникова Т. Л., Осипов Е. В. Биохимия. - М.: Медицина, 2000.
3. Общая и биологическая химия (учебное пособие). - М.: Перспектива, 2002.
4. Равич – Щербо М. И., Новиков В. В. Физическая и коллоидная химия. - М.:
Медицина, 1975.
ТКАНЕВАЯ БИОХИМИЯ
Вариант 1.
1). Непрямой билирубин образуется при распаде … 2). Нормальные показатели пигментного обмена:
1. в крови содержится 75% непрямого и 25% прямого билирубина;
2. в моче содержится билирубин;
3. в моче содержится стеркобилиноген;
4. в кале отсутствуют желчные пигменты.
3). Определите участок полипептидной цепи принадлежащий нормальному гемоглобину и гемоглобину S:
А – нормальный гемоглобин; 1. вал-гис-лей-тре-про-глу-глу-лиз-… Б – гемоглобин S. 2. вал-гис-лей-тре-про-вал-глу-лиз-… 4). Гемоглобин транспортирует по крови:
1. азот;
2. углекислый газ;
3. кислород;
4. аммиак.
5). Индикаторными ферментами называют:
1. ферменты, синтезируемые преимущественно в печени, в норме выделяющиеся в кровь и выполняющие определенную функцию;
2. ферменты, синтезируемые в печени и выделяемые с желчью;
3. ферменты, синтезируемые в клетках и попадающие в кровь при повреждении тканей;
6). Поддержание осмотического давления внутри сосуда обеспечивается:
1. альбуминами;
2. катионами натрия;
3. действием цАМФ;
4. катионами кальция;
5. содержанием глюкозы.
Вариант 2.
1). Прямой билирубин образуется в печени за счет связывания … 2). При паренхиматозной желтухе:
1. нарушена экскреция прямого билирубина в желчные капилляры;
усилен гемолиз эритроцитов;
в моче появляется билирубин;
в кале увеличивается количество стеркобилиногена;
нарушена активность УДФ-глюкуронил-трансферазы.
3). Снижение концентрации общего белка в плазме крови называется ……………… и может наблюдаться при …………………………….
4). Многие ферменты крови могут быть использованы для диагностики заболеваний и контроля эффективности лечения. При патологии каких органов в крови повышается активность перечисленных ниже ферментов?
В – Поджелудочная железа.
5). Гемоглобин относится к классу:
1. нуклеопротеинов;
2. фосфопротеинов;
3. хромопротеинов;
4. флавопротеинов.
6). Органоспецифичные ферменты печени:
1. ЛДГ;
2. аргиназа;
3. креатинфосфокиназа;
4. липаза;
7). Органоспецифичные ферменты печени:
1. ЛДГ;
2. аргиназа;
3. креатинфосфокиназа;
4. липаза;
5. орнитинкарбомоилтрансфераза.
8).Что является источником железа для синтеза гема:
1. цитохромы;
2. миоглобин;
3. ферритин;
4. каталаза;
5. метионин.
Вариант 3.
1). Перечислите свойства прямого и непрямого билирубина, а также их общие свойства.
А- прямой 1. Плохо растворим в воде.
билирубин; 2. Токсичен.
В- непрямой 3. Легко выводится из организма.
билирубин; 4. Концентрация увеличивается при гемолитической желтухе.
С- оба 5. Концентрация увеличивается при обтурационной желтухе.
билирубина. 6. Транспортируется кровью в комплексе с альбуминами.
2). Непрямой билирубин:
1. связан с глюкуроновой кислотой;
2. конъюгированный билирубин;
3. адсорбирован на белках сыворотки крови;
4. ковалентно связан с альбуминами сыворотки крови;
5. не обладает токсичностью.
3). Повышение концентрации общего белка плазмы крови называется ………………… и может наблюдаться вследствие…………………… 4). Укажите возможные причины:
А – Гиперпротеинемий. 2. обильные рвоты;
Б – Гипопротеинемии. 5. острые инфекции;
5). Какие функции гемоглобина нарушаются при серповидноклеточной анемии?
1. растворимость;
2. кооперативность;
3. снижается сродство гемоглобина к кислороду;
4. повышается сродство к кислороду;
5. деформируется эритроцит.
6). Кровь выполняет функции:
1. транспортную, осморегулирующую;
2. буферную, обезвреживающую;
3. синтетическую, экскреторную;
4. защитную, иммунологическую;
5. регуляторную, гомеостатическую.
7). К секреторным ферментам относятся:
1. глутаматдегидрогеназа;
2. кислая фосфатаза;
3. щелочная фосфатаза;
4. ацетилхолинэстераза;
5. лактатдегидрогеназа;
6. тромбокиназа;
7. протромбин.
Вариант 4.
1). Выберите ферменты, проявляющие наибольшую активность в печени:
1. креатинфосфокиназа ММ и МВ;
Узнайте, что такое Саентология...
Ваша жизнь поменяется...
2. ЛДГ-1 и ЛДГ-2;
3. аланинаминотрансфераза;
4. аспартатаминотрансфераза;
5. глюкозооксидаза.
2). Прямой билирубин:
1. транспортируется альбуминами крови;
2. конъюгированный билирубин;
3. связан с глюкуроновой кислотой;
4. связан в печени с желчными кислотами;
5. дает цветную реакцию с диазореактивом Эрлиха.
3). Перечислите основные буферные системы крови……………………………….
4). Подберите верные утверждения для следующих понятий:
5). По какому признаку разделяют белки крови методом электрофореза?
1. по молекулярной массе;
2. по растворимости в буферных растворах;
3. по заряду.
6). Обезвреживающие функции крови осуществляются в результате:
1. действия фосфатного и белкового буферов крови;
2. разведения токсичных веществ;
3. действия ферментов и плазмы и клеток крови;
4. связывания токсических веществ альбуминами.
7). К индикаторным ферментам относятся:
1. холинэстераза;
2. аспартатаминотрансфераза;
3. аланинаминотрансфераза;
4. щелочная фосфатаза;
5. креатинфосфокиназа;
6. лактатдегидрогеназа.
Вариант 5.
1). При обтурационной желтухе:
1. нарушен процесс желчевыделения;
2. нарушен процесс транспорта непрямого билирубина;
3. в крови увеличен прямой и непрямой билирубин;
4. нарушен процесс конъюгации с глюкуроновой кислотой;
5. в кале отсутствует стеркобилиноген.
2). При гемолитической желтухе:
1. происходит усиленный распад гемоглобина;
2. в крови увеличено содержание прямого билирубина;
3. в моче появляется билирубин;
4. в крови резко увеличен непрямой билирубин;
5. в моче отсутствует билирубин;
6. кал обесцвечен.
3).Транспорт и депонирование железа в организме происходит при участии…………. соответственно.
4). Подберите верные утверждения для следующих понятий:
А – ацидоз; 1. сдвиг рН крови в кислую сторону;
Б – алкалоз. 3. сдвиг рН крови в щелочную сторону;
В – порфирия;
Г- диспротеинемия;
Д – гемоглобинопатии.
5). Индикаторными ферментами называют:
1. ферменты, синтезируемые преимущественно в печени, в норме выделяющиеся в 2. кровь и выполняющие определенную функцию;
3. ферменты, синтезируемые в печени и выделяемые с желчью;
4. ферменты, синтезируемые в клетках и попадающие в кровь при повреждении тканей;
4). Значение пентозофосфатного пути заключается в том, что …………… 5). Конечным продуктом гликолитического распада глюкозы в анаэробных условиях является:
1. пировиноградная кислота;
2. ацетил-КоА;
3. молочная кислота;
4. СО2 и Н2О.
6). Какой фермент катализирует распад гликогена в ткани до глюкозо-1-фосфата:
1. фосфодиэстераза;
2. фосфатаза;
3. фосфорилаза;
4. фосфогексокиназа.
Вариант 2.
1). Найдите, в чем заключается воздействие гормонов на организм:
Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.