WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 |

«ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНТРАЦИСТЕРНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ЭНРОФЛОКСАЦИНА И КЕТОПРОФЕНА ...»

-- [ Страница 1 ] --

1

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И

СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ»

На правах рукописи

Гуляева Анастасия Юрьевна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ

ИНТРАЦИСТЕРНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ НА ОСНОВЕ

ЭНРОФЛОКСАЦИНА И КЕТОПРОФЕНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология c токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук, доцент Виолин Б.В.

Москва -

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………… ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………… 1. 1.1. Мастит у коров…………………………………………………………… Резистентность и механизмы ее развития………………………..........

1.2. Фторхинолоны……………………………………………………...........

1.3. Кетопрофен……………………………………………………………….

1.4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………… 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………….. 2.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………………………….. 2.2.

Результаты изучения антибактериальной активности 2.3.

энрофлоксацина………………………………………………………….. Результаты изучения острой токсичности противомаститного препарата 2.4.

в опытах на лабораторных животных……………………… Результаты изучения субхронической токсичности противомаститного 2.5.

препарата в опытах на лабораторных животных……………………………… Результаты изучения раздражающего действия на паренхиму вымени 2.6.

после однократного и многократного интрацистернального введения противомаститного препарата………………………………. Результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина, 2.7.

ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке и плазме крови коров...... Результаты определения остаточных количеств энрофлоксацина, 2.8.

ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке коров после многократного введения противомаститного препарата…………….. Результаты определения оптимальной дозы противомаститного 2.9.




препарата…………………………………………………………………. 2.10. Результаты изучения терапевтической эффективности противомаститного препарата в условиях производства…………….. 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ…………………………………………... ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ…………………………………………. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………… ПРИЛОЖЕНИЕ А………………………………………………………………. ПРИЛОЖЕНИЕ Б……………………………………………………………….

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Анализ структуры заболеваний крупного рогатого скота в молочном скотоводстве показывает, что развитию отрасли существенно препятствуют различные инфекционные и незаразные болезни лактирующих коров, среди которых наиболее серьзный ущерб наносит мастит (35, 64, 75, 248).

Экономический ущерб, связанный с маститом, складывается из снижения удоев и качества молока, потери молочной продуктивности и преждевременной выбраковки коров до завершения генетически заложенного лактационного периода. Помимо экономического ущерба, мастит представляет серьезную опасность для здоровья людей, в связи с возможным попаданием в молоко патогенных для человека микроорганизмов и их токсинов (44, 280).

нарушение условий содержания, кормления и доения, а также различные гинекологические заболевания и изменение обмена веществ, что в комплексе снижает общую резистентность организма и способствует ослаблению барьерной функции тканей вымени. На этом фоне создаются благоприятные условия для внедрения и распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в паренхиме вымени, что вызывает воспаление молочной железы - мастит (44).

Наиболее часто при маститах выделяют монокультуры или в различных сочетаниях такие микроорганизмы, как стрептококки – Str.

agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberis; стафилококки — S.

pyogenes aureus, S. citreus, S. Albus, а также Escherichia coli и Pseudomonas aerugenosa (163, 273).

Несмотря на большое количество, используемых в настоящее время противомаститных препаратов, вследствие широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, их эффективность постоянно снижается. Поэтому разработка новых противомаститных препаратов активных в отношении устойчивых к антибиотикам патогенов продолжает оставаться актуальной (55).

микроорганизмы является применение новых соединений, к которым у бактерий еще не сформировались механизмы резистентности. К таким соединениям относятся фторхинолоны, механизмом действия которых заключается в ингибировании активности ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, приводящей к нарушению синтеза ДНК бактериальной клетки, что обеспечивает отсутствие перекрестной резистентности с другими антибиотиками, сульфаниламидами и нитрофуранами (91, 94).

Поэтому на основании собственных исследований и литературных данных в качестве антибактериального компонента в состав нового противомаститного препарата был включен фторхинолон энрофлоксацин, интрацистернального введения. Энрофлосацин в низких концентрациях обладает широким спектром действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, хорошей биодоступностью из места введения, а также малотоксичен для теплокровных животных, ввиду отсутствия у них фермента ДНК-гиразы, мишени для фторхинолонов в клетках микроорганизмов (87, 168).





Хотя основным этиотропным фактором в развитии мастита являются инфекционные агенты, патогенез болезни во многом основан на развитии воспалительных процессов в паренхиме вымени, приводящим к появлению боли и отеков, что осложняет течение болезни и увеличивает сроки выздоровления (95).

Поэтому важной составляющей успешной терапии мастита, помимо этиотропного компонента, воздействующего на причину болезни – микроорганизмы, является применение соединений, обладающих противовоспалительным действием и снижающих болевую реакцию, то есть, воздействующих на патогенез и симптомы заболевания (95). Такими интрацистернального введения, являются глюкокортикоиды (преднизолон, дексаметазон). Несмотря на выраженный противовоспалительный эффект эти препараты обладают рядом нежелательных побочных реакций, например, таких как снижение местного иммунитета. Учитывая побочное действие глюкокортикоидов в последнее время широкое применение в медицине и ветеринарии нашли нестероидные противовоспалительные соединения (НПВС), которые обладают выраженным противовоспалительным, анальгезирующим и жаропонижающим действием, при этом практически не оказывают побочного действия на макроорганизм. Среди НПВС одним из наиболее сильных обезболивающих соединений является кетопрофен, широко применяемый у нас в стране и за рубежом в различных угнетением активности циклооксигеназы (ЦОГ) - основного фермента метаболизма арахидоновой кислоты, являющейся предшественницей простагландинов, которые играют главную роль в патогенезе воспаления, боли и лихорадки (27, 83).

Поэтому в качестве противовоспалительного компонента в состав кетопрофен.

Учитывая, что до настоящего времени в зарубежной и отечественной ветеринарной практике лекарственный препарат для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина с кетопрофеном не использовался, представлялось актуальным изучить его фармако-токсикологические бактериальной этиологии у лактирующих коров.

противомаститного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике и доказательства его безопасности и эффективности при лечения мастита у коров в период лактации были проведены исследования по изучению антибактериальной активности; острой и субхронической токсичности в опытах на лабораторных животных;

раздражающего действия на ткани молочной железы коров;

фармакокинетики энрофлоксацина и кетопрофена и определению сроков выведения остаточных количеств действующих веществ препарата из организма коров, а также по изучению его терапевтической эффективности.

Цели и задачи исследований.

Изучить фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность нового лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита у лактирующих коров.

В задачи исследований входило:

- определить антибактериальную активность энрофлоксацина в опытах in vitro на изолятах микроорганизмов, выделенных из молока коров больных маститом, в сравнении с другими группами антибактериальных средств, широко используемыми при лечении мастита у коров;

изучить фармако-токсикологические свойства лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена на лабораторных животных;

лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена;

- изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена с молоком лактирующих коров после интрацистернального введения лекарственного препарата;

- установить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для лечения мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации;

- оценить терапевтическую эффективность и безопасность применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при мастите дойных коров в условиях производства.

Впервые изучены фармако-токсикологические свойства нового лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для интрацистернального введения. Установлены особенности распределения, накопления в тканях паренхимы вымени и сроки выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина с молоком. В условиях животноводческих хозяйств обоснована эффективность применения противомаститного препарата в ветеринарной практике.

Практическая значимость работы.

На основании результатов исследований доказана возможность безопасного и эффективного использования лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике. Экспериментально обоснованы оптимальная терапевтическая доза (300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе 7,5 мл), схема применения (трехкратно с интервалом 12 ч) и сроки возможного использования молока (1 сутки) в пищевых целях после интрацистернального введения препарата дойным коровам.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:

- IV съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» Москва, 2013 г.;

- Заседании ученого совета ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» в 2012, 2013 гг.

Личный вклад соискателя.

Диссертационная работа является результатом научной работы в период с 2009 по 2013 гг. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно и выполнен при научно-методической и консультационной помощи кандидата вет. наук, доцента Б.В. Виолина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина;

- характеристика фармако-токсикологических свойств лекарственного препарата для интрацистернального введения по результатам доклинических исследований;

- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и ципрофлоксацина с молоком коров после интрацистернального введения нового противомаститного препарата;

- результаты клинических исследований лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита коров в условиях производства;

- практические предложения по применению лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Мастит крупного рогатого скота С момента, когда человек одомашнил животных с целью получения молока, возникла проблема заболевания вымени – маститы. За тысячелетия развития молочного скотоводства ситуация существенно не изменилась в лучшую сторону, маститы, даже на фоне сбалансированного кормления, остаются основным ограничивающим фактором в полной реализации генетического потенциала коров по молочной продуктивности и качеству молока. Сегодня в зависимости от региона и страны мира клинической и скрытой формами мастита болеют в среднем от 17 до 20 % коров, а в отдельных регионах – 50% (15, 16, 75, 76, 80, 121, 208, 256 ).

В России скорее всего из-за неорганизованного сбора информации по животным, заболевшим маститом, ситуация выглядит несколько иначе. По данным Иноземцева В.П., (1999 г.) в 1995 году в России переболело маститом около миллиона коров, т.е. более 10% маточного поголовья (24, 25). В шести областях различных регионов России, в 1995 - 1997 годах мастит был диагностирован у 10,4 - 36,3% животных. Наибольший процент поражения коров маститом отмечен в хозяйствах Вологодской (27,3 - 36,3%) и Кировской (23,9 - 30,0%) областей, несколько реже заболевание встречается в Свердловской (18,9 - 25,6%) и Ульяновской (16,2 - 17,5%) областях и самый низкий уровень зарегистрирован в Воронежской области (10,3 - 13,8%) и Приморском крае (10,4 - 13,8%). (21,22). За три года заболеваемость в среднем по всем указанным областям составила от 11,9 до 31,7%, а в среднем по России 8,3 - 9,8%. (31, 76).

Экономический ущерб, наносимый маститами, складывается из снижения удоев и качества молока, потери молочной продуктивности и выбраковки коров.

представляют серьезную опасность для здоровья человека в связи с возможным попаданием в молоко патогенных для людей микроорганизмов и их токсинов. Так стафилококковые энтеротоксины, не разрушающиеся даже при кипячении и пастеризации молока, вызывают тяжелые пищевые отравления, часто с летальным исходом. Стрептококковый мастит у крупного рогатого скота, как правило, протекает скрыто, при этом патогенные стрептококки в молоке могут приводить к эндокардитам, менингитам новорожденных, ангинам и пищевым расстройства. Молоко, содержащее токсины кишечной палочки, может вызывать тяжело протекающие энтериты (280).

Мастит - заболевание молочной железы, возникающее в результате воздействия факторов внешней и внутренней среды и характеризующееся типичными признаками воспалительного процесса: покраснение, болезненность, отек, повышение местной температуры и нарушение секреторной деятельности молочной железы.

Маститы развиваются во все циклы развития молочной железы:

запуска, сухостоя, сразу после отела, но наиболее часто возникают в лактационный период (80).

По данным разных авторов, во время лактации маститы встречаются в 36,3% случаев, при запуске — в 22,6%, в сухостойный период в 15,8% и в первые дни после отела — 25,3% (23, 28,35, 43, 53, 58, 75, 80, 184, 264).

Ведущая роль в этиопатогенезе маститов принадлежит бактериям, грибам и вирусам, причем доля бактериальных маститов превышает 80% (9, 26, 28, 35, 68).

Микроорганизмы могут быть непосредственной причиной мастита или осложнять воспалительный процесс, вызванный другими факторами, как например, травмированием тканей вымени, при неудачном выбранном режиме доения (50). Маститы возникают, как под влиянием микрофлоры, проникающей в вымя из внешней среды (через сосковый канал или при повреждении кожи вымени), так и вследствие развития условно-патогенной микрофлоры в результате снижения резистентности организма.

Анализируя спектр микроорганизмов, выделяемых при маститах, установлено, что основную роль играют стрептококки — Streptococcus agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberis; стафилококки — Staphylococcus pyogenes aureus, Staph. citreus, Staph, albus; кишечная палочка — Escherichia coli; синегнойная палочка — Pseudomonas aerugenosa (273). В исследовании, проведенном Jones G.M., Bailey, T.L, Roberson JR (1998) было показано, что кишечная палочка выделена в 28,2% случаев, стафилококки - в 26,9%, стрептококки — в 25% случаев (163).

коагулазонегатиных стафилококков составило 40,7%, грамотрицательных (кроме Escherichia coli)- 19,5%, Staphylococcus aureus – 12,2%, Streptococcus uberis – 5, 3%, Enterococcus spp -4,8%, Escherichia coli- 4, 5% (131, 195) В последнее время появляется все больше сообщений о возросшей роли микоплазм и микроскопических грибов в развитии мастита. Из воспаленных четвертей вымени были выделены грибы рода Aspergillus, Mucor, Penicillum, Trihoderma, а также Candida pseudotropikalus (115, 199, 210).. Причем частота индикации маститов микозного происхождения имеет бесконтрольным применением антибиотиков.

Патогенез развития маститов При маститах, как и при других типичных воспалительных процессах, раздражающее действие этиологического фактора в молочной железе происходит повреждение тканей, что ведет к расстройству функций, связанных с выведением альвеолярного молока в молочные ходы и цистерну вымени, что в свою очередь приводит к застою молока, повышению внутритканевого давления, нарушению циркуляции крови и лимфы и расстройству питания тканей. В результате нарушения кровообращения, происходят процессы экссудации и эмиграции и пролиферации, что впоследствии сопровождается накоплением в поврежденных тканях вымени воспалительного экссудата и клеточного инфильтрата, которые и определяют характер воспалительного процесса (19). В ходе последовательной цепочки развития патологического процесса вокруг очага воспаления образуется демаркационная линия; в тканях концентрируются недоокисленные продукты воспаления, повышается осмотическое и онкотическое давление, приводящее к усилению болевой реакции воспаленной молочной железы (75). Поврежденные эпителиальные клетки отторгаются и выделяются вместе с секретом молочной железы, за счет чего увеличивается количество соматических клеток в молоке, что является одним из диагностических признаков мастита у лактирующих коров (19, 23, 74,75,203, 250).

воспалительного процесса в тканях вымени, наблюдаются и физикохимические изменения в секрете, пораженных долей вымени, а именно в результате повреждающих действий микроорганизмов начинается распад белков молока, выпотевание хлорида и бикарбоната натрия, что приводит к повышению щелочности секрета, в нем появляются хлопья и сгустки.

Лечение маститов Первостепенное значение для сохранения молочной продуктивности коров имеет своевременное и эффективное лечение воспаления молочной железы (65).

Многие авторы считают более рациональной комплексную терапию, так как она направлена на восстановление нормального физиологического состояния, как молочной железы, так и всего организма в целом (23, 28).

Учитывая полиэтиологический характер мастита, следует отдавать предпочтение антимикробным средствам широкого спектра действия. Для повышения резистентности организма животного, уменьшения сроков лечения и устранения побочных эффектов следует выявить наиболее распространенных в данном хозяйстве условно-патогенных микроорганизмов, а также проверить его на устойчивость к различным группам антибиотиков.

Также при лечении необходимо обращать свое внимание на такой немаловажный фактор, как безопасность препаратов для всего организма.

Применение антимикробных препаратов может приводить к «загрязнению»

установлении сроков убоя животных на мясо и использования молока после окончания курса лечение (43).

противомаститных препаратов, можно сделать вывод, что наиболее часто ампициллин, клоксациллин), в том числе цефалоспорины (цефалексин, цефалониум); аминогликозидов (стрептомицин, фрамицетин, гентамицин, неомицин); линкозамидов (клиндамицин, линкомицин); макролидов (эритромицин), и тетрациклинов (окситетрациклин, тетрациклин) (9, 11, 51, 53, 56, 57, 198, 201).

этиологического фактора заболевания, однако применения только антибактериальных средств обычно недостаточно.

В процессе лечения необходимо уделять внимание не только адекватно выбранной этиотропной терапии, но и снижению воспалительной реакции, физиологического состояния молочной железы. Поэтому некоторые противовоспалительный компонент - кортикостероиды преднизолон и дексаметазон, позволяющие снять воспаление, которое зачастую осложняет течение болезни и препятствует выздоровлению.

Для лечения мастита, как правило, используют лекарственные формы для интрацистернального введения, за счет чего лечебное действие оказывается непосредственно в очаге воспаления: цефроксим, дифурол А, Б, мастисан А,Б, Е, мастивален, эндофарм, эримаст и другие. При этом лекарственные формы для интрацистернального введения должны отвечать следующим требованиям: оказывать максимальное антибактериальное действие на возбудителей и минимальное негативное влияние на паренхиму вымени и ее функциональное состояние, обладать противовоспалительным действием и быстро выводиться с молоком (53). Все эти свойства определяют вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственной формы.

Оптимальной основой для лекарственных форм являются соединения, которые фармакологически и химически неактивны, но хорошо растворяющие и/или эмульгирующие и/или суспендирующие действующие вещества. Одновременно основа не должна влиять на фармакологическую активность действующих веществ, не связывать их и способствовать проникновению в очаг воспаления. Например, в качестве вспомогательных полиэтиленгликоли, диметилсульфоксид или различные комбинации этих веществ (23).

В последнее время снизилась эффективность противомаститных препаратов в результате развития резистентности у основных возбудителей маститов к антибактериальным препаратам. Так, например, по данным B. San Martn et al резистентность к комбинации амоксициллин-клавулановая кислота у штаммов Staphylococcus aureus, выделенных у коров, больных маститом, была выявлена в 38,1% случаев, к ампициллину - 26-40%, к цефкиному - 24,7%, к пенициллину - 28,8-47%, к линкомицину - 38,9%.

Уровень резистентности у выделенных при мастите E. coli к цефтиофуру, гентамицину, стрептомицину и канамицину был в пределах 11-21%. К другим антибактериальным препаратам количество резистентностных штаммов варьировало от 1 до 7%. Похожие данные были получены и другими авторами (227).

Lehtolainen et al. отмечали в своих исследованиях, что 27% выделенных в 2003 году штаммов E. Coli из молока больных коров были резистентны к одному или нескольким антибактериальным веществам. Так, 15% изолятов из Израиля и 14% из Финляндии были резистентны к тетрациклину, к дегидрострептомицину - 13 и 9%, к цефалексину - 3 и 16%, к ампициллину и 7% и к триметоприму-сульфадиазинину 4 и 2% соответственно. При этом ни у одного изолята не отмечалось развитие резистентности к гентамицину, цефтазидиму или ципрофлоксацину (178). Lanz 2002 г. (Швейцарии), Makovec и Ruegg, 2001 г. (США) также отмечали развитие резистентности среди E. Coli, выделенных из молока больных коров, к стрептомицину (22%), ампициллину (21%), тетрациклину (20%-37%) и канамицину (16%) (174, 184). По данным многих авторов (2003 г.) от 5 до 100% выделенных изолятов S. aureus были резистентны к пенициллину: Аргентина – 40%, Бразилия – 87%, Англия –36%, Дания – 23%, Италия – 40%, Латвия – 100%, Испания – 40%, Япония – 27%, Голландия – 24%, Германия – 23%. К стрептомицину в среднем было устойчиво 5% изолятов S. aureus, причем наибольший процент резистентных штаммов отмечался в Японии (10%, 1997-1998 г), Италии (7%), Испании (6%). К тетрациклину были устойчивы 2-58% изолятов, к гентамицину – 2-30% (96, 110, 145,258, 271). Высокий уровень развития резистентности отмечался также среди изолятов стрептококков, часто выделяемых из молока больных маститом коров. Так, по данным многих авторов (Англия, Франция, Голландия, США) на 2003 год 41-77% от всех тетрациклина, 5-24% - макролидных антибиотиков (96, 222). В свою очередь S. uberis в 20-40% случаев проявил устойчивость к действию макролидов, в 39-70% чувствительным к действию пенициллинов, процент устойчивости к которому превышал 3 (96, 215, 222). По данным авторов из Аргентины, Дании, Финляндии, Германии и США все чаще антибиотикоустойчивость выявляется у коагулазонегативных стафилококков. Так, на 2000-2003 г от до 39% изолятов были устойчивы к действию пенициллина, 7% - к действию стрептомицина, 8-9% - к действию тетрациклина, 5-13%- к действию макролидов (85, 144, 215, 220, 258).

В связи с этим актуальным остается вопрос по изысканию новых высокоэффективных, дешевых и технологичных в производстве и применении лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики данного заболевания.

1.2. Резистентность и механизмы ее развития В настоящее время применение антибактериальных средств в животноводстве достигло высокого уровня. Все чаще такие препараты используются не для лечения, а для профилактики заболеваний. В связи с чем огромное количество здоровых животных систематически подвергаются обработке антибактериальными веществами, что в свою очередь создает благоприятную обстановку для появления, развития, распространения и сохранения резистентных бактерий, которые могут вызывать инфекционные заболевания у животных и человека (6).

Под резистентностью (устойчивостью) понимают способность микроорганизма переносить значительно большие концентрации препарата, чем остальные микроорганизмы данного штамма (вида), или развиваться при таких концентрациях, которые превышают достигаемые в макроорганизме при введении антибактериальных препаратов в терапевтических дозах (30).

Механизм действия антибактериальных соединений (АБС) направлен на угнетение более или менее специфичного для микроорганизмов (прокариот) метаболического процесса, что происходит в результате связывания АБС с определенной мишенью, в качестве которой может выступать либо фермент, либо структурная молекула микроорганизма. В связи с этим АБС подавляют жизнедеятельность микроорганизмов в концентрациях, не наносящих или наносящих минимальный вред эукариотическим клеткам макроорганизма (274, 287).

Резистентность микроорганизмов к АБС может быть природной и приобретенной. Актуальной проблемой является приобретенная резистентность, характеризующаяся устойчивостью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, подавляющих основную часть микробной популяции (73, 275).

Развитие резистетности у микроорганизмов происходит, как правило, в результате спонтанных хромосомных мутаций генома бактериальной клетки.

Последние не связаны с направленным действием на ДНК бактерии антибактериальных препаратов, которые играют роль лишь селективных агентов. В результате воздействия антимикробных препаратов на популяцию основная масса бактериальных клеток гибнет (если антибиотик обладает бактерицидным действием) или прекращает развитие (если антибиотик обладает бактериостатическим действием), при этом микроорганизмы, оказавшиеся устойчивыми сохраняются, приобретают конкурентное преимущество в борьбе за питательные вещества, размножаются и распространяются в окружающей среде. В дальнейшем приобретенная резистентность закрепляется и передается по наследству последующим генерациям бактерий. Таким образом, происходит селекция устойчивых микроорганизмов под воздействием антибиотиков. Поэтому устойчивость наиболее часто встречается к антибактериальным средствам, которые применяются длительное время, например, к пенициллинам, тетрациклинам, хлорамфениколу (239, 276).

Также развитие резистентности может происходить вследствие процесса адаптации (приспособления) микроорганизма к «вредному»

воздействию антибиотического вещества. При этом, в некоторых случаях наблюдается замена одних звеньев обмена веществ, другими, не подверженными действию препарата, или микроорганизмы начинают усиленно вырабатывать соединения, разрушающие молекулу антибиотика, тем самым нейтрализуя его действие. Например, ряд штаммов стафилококков и спороносных бактерий образуют фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин с образованием продуктов, не обладающих антибиотической активностью. Это явление называется энзиматической инактивацией антибиотиков (58, 239, 276).

Другим путем распространения генов резистентности являются внехромосомные факторы устойчивости, к которым относятся плазмиды и транспозонные элементы (276).

внехромосомные элементы в виде ковалентнозамкнутых колец ДНК, способных самостоятельно реплицироваться в бактериальной клетке. При этом в одной бактериальной клетке одновременно могут находиться плазмиды, отвечающие за разные свойства микроорганизма, например, за токсичность и резистентность (276).

Конъюгирующие плазмиды, такие как плазмиды резистентности R, в своем составе содержат два компонента — r-фактор, отвечающий за резистентность к антибиотикам и фактор переноса устойчивости RTF, основной фукцией которого является обеспечение передачи генетической информации. Иногда r-факторы (неконъюгирующие плазмиды) могут самостоятельно существовать в бактериальных клетках. При этом межбактериальное перемещение таких r-факторов происходит в результате их коинтеграции с конъюгирующими плазмидами. Такая плазмида может антибактериальным веществам (276).

Плазмидам присущ «плейотропный эффект», заключающийся в способности плазмид оказывать влияние на многие свойства бактерий, в частности, на чувствительность к различным фагам, скорость размножения, чувствительность к лизису детергентами и так далее. В основе этого эффекта лежат изменения поверхностных слоев клеточной стенки под влиянием плазмид (7, 58).

Способность плазмид циркулировать от животных к животным, от животных к человеку и от человека к животным способствует быстрому распространению резистентности микроорганизмов к антибактериальным соединениям и обуславливает их важную роль в эволюции этих организмов.

Транспозонные элементы – это фрагменты ДНК, которые свободно перемещаются от одного репликона к другому. Транспозоны определяют разные фенотипические признаки бактериальной клетки, в том числе и устойчивость к антибактериальным соединениям, и содействуют тем самым переносу детерминант резистентности к антибиотикам между хромосомой, плазмидами и фагами. Наряду с этим они не подчиняются rec-системам клетки, тем самым передача хромосомных маркеров между неродственными видами ничем не ограничивается. Ввиду того, что в состав транспозонов входят детерминанты устойчивости и при постоянно действующем в условиях производства селективном давлении антибактериальных препаратов на бактериальные популяции, возможно образование гибридных химиотерапевтическим веществам (58). Транспозоны способны перемещаться не только в пределах одного вида, но также попадать в новые виды и роды микробов. Было установлено, что транспозоны Т1699 и Т1700, первоначально проникают в конъюгативную плазмиду этого вида, вместе с которой перемещаются в другие роды семейства Enterobacteriaceae (276, 290).

Для распространения резистентности среди микроорганизмов к антибактериальным соединеньям решающее значение имеет локализация кодирующих генов (плазмидная или хромосомная). При плазмидной распространение резистентности, при хромосомной наблюдают Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам в случае как плазмидной, так и хромосомной локализации детерминант резистентности может быть обусловлена несколькими механизмами:

1.Модификация чувствительной мишени. В ходе эволюционного процесса в результате естественных мутаций в кодирующих генах, возможно снижение или утрата способности специфических рецепторов к связыванию с антибактериальными препаратами. В результате чего антибиотик, проникший в клетку, не может блокировать биохимические процессы.

2. Инактивация АБП. Микроорганизмы в ходе активного воздействия инактивируют антибиотики при их поступлении внутрь клетки.

3. Активное выведение. У микроорганизмов существуют специальные транспортные системы, которые связываясь с антибиотиком, выводят его наружу быстрее, чем он смог бы оказать свое действие.

4. Нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки.

Антибиотикам для воздействия на чувствительные мишени необходимо липополисахаридный слой грамотрицательных микроорганизмов. При этом молекулы антибиотиков транспортируются внутрь клетки через пориновые каналы белковой природы, которые являются естественным путем для поступления питательных веществ внутрь микроорганизма и выведения продуктов метаболизма. В результате мутаций возможна полная или частичная утрата поринов, приводящая к выраженному в различной степени снижению чувствительности.

микроорганизмов связан с синтезом защитных белков, которые успевают соединиться с чувствительными мишенями до воздействия антибиотика на них (72).

Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам может быть специфичной для каждой группы антибиотиков и зависит от способов воздействия препаратов на микробную клетку и от свойств самих микробов (279).

бактерицидного действия бета-лактамов связан с их специфической способностью ингибировать биосинтез клеточной стенки микроорганизмов (10).

Наиболее часто встречающейся причиной развития резистентности микроорганизмов к -лактамам является их ферментативная инактивация в результате гидролиза одной из связей -лактамного кольца ферментами лактамазами, вырабатываемые устойчивыми штаммами микроорганизмов.

Среди других причин появления резистентности к -лактамам отмечены:

- снижение проницаемости внешних структур грамотрицательных бактерий в результате мутаций, при которых происходит полная или частичная утрата поринов в клеточной стенке, в результате чего антибиотик теряет способность проникать внутрь микроорганизма;

- активное выведение -лактамов из микробной клетки. До недавнего времени считалось, что -лактамы не выводятся из микробной клетки, однако в последние годы появились данные о наличии у P.aeruginosa транспортных систем, осуществляющих активное выведение некоторых из них и, прежде всего, карбапенемов;

пенициллиносвязывающие белки, участвующие в синтезе клеточной стенки бактерий, теряют способность связываться с -лактамами, что проявляется в повышении МПК этих препаратов и снижении клинической эффективности (72,73).

Макролиды – относятся к классу поликетидов, в основе химической структуры которых является макроциклическое 14- или 16-членное лактонное кольцо, к которому присоединены один или несколько углеводных остатков.

Механизм действия макролидов заключается во взаимодействии с 23S РНК компонентом каталитического центра пептидтрансферазы 50S (или 30S для некоторых микроорганизмов) субъединицы мембраноассоциированных рибосом бактериальных клеток (61).

Развитие резистентности к макролидам обусловлено тремя факторами:

- модификация мишени действия макролидов, а именно структурные изменения в рибосомальных 50S-субъединицах, а именно, метилирование аденина в 23S-рибосомальной РНК под действием фермента метилазы эритромицинрезистентности (177). Все это в свою очередь способствует нарушению связывания антибиотика с рибосомами и блокированию их антибактериального действия.

- активное выведение антибиотика из микробной клеток.

посредством ферментативного расщепления лактонного кольца эстеразами (например, эритромицинэстеразой) или фосфотрансферазами (макролид 2’фосфотрансферазой), которые выделяют некоторые грамположителные и грамотрицательные микроорганизмы.

Хлорамфеникол - синтетический антибиотик, идентичный природному — продукту жизнедеятельности микроорганизма Streptomyces venezuelae.

Механизм действия связан с блокировкой переноса аминокислот в ингибированием синтеза белка.

Основным механизмом развития резистентности к левомицентину является ферментативная инактивация (ацетилирование). Среди механизмов развития устойчивости отмечают также понижение проницаемости и активное выведение из клетки (177).

Аминогликозиды - группа антибиотиков, общим в химическом строении бактерицидного действия аминогликозидов связан с нарушением синтеза аминогликозидов теряют способность связываться с рибосомами и подавлять синтез белка. Описаны три группы аминогликозидомодифицирующих ферментов (АМФ), осуществляющих инактивацию аминогликозидов, путм их связывания с различными молекулами: ААС - присоединяющие молекулу уксусной кислоты, АРН - присоединяющие молекулу фосфорной кислоты, ANT - присоединяющие молекулу нуклеотида аденина (72).

Среди других механизмов развития резистентности к представителям аминогликозидов можно выделить: снижение проницаемости внешних структур, модификация мишени (30S субъединица бактериальной рибосомы) и нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки (например, B.cepacia) (72,191. 192).

Тетрациклины – бактериостатические антибиотики, относящиеся к классу поликетидов, активные в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий (как аэробных, так и анаэробных).

Механизм действия тетрациклинов связан с угнетением синтеза белка, за счет связывания с 30S -субъединицей бактериальных рибосом.

Выделяют три основных механизма развития резистентности у тетрациклинов:

- активное выведение антибиотика из клетки;

снижение сродства антибиотиков к рибосомам, что обусловлено синтезом защитных белков синтезировать белок, несмотря на связывание с рибосомой молекулы тетрациклина;

- инактивация тетрациклинов бактериальными ферментами (241).

В отличие от -лактамных антибиотиков, макролидов, тетрациклинов, хлорамфеникола и аминогликозидов, фторхинолоны отличаются особым механизмом действия, ввиду которого развитее резистентности происходит намного медленнее (72).

Хинолоны/фторхинолоны – антибактериальные препараты широкого спектра действия, оказывающие бактерицидный эффект. Механизм действия фторхинолонов заключается в ингибировании ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, что в свою очередь приводит к нарушению синтеза ДНК и процесса репликации бактериальной клетки.

нефторированным, так и фторированным) являются хромосомные мутации (155). Их можно разделить на две группы:

- мутации в топоизомеразных генах gyrА, gyrB, parC и parE (72,155);

- мутации, приводящие к уменьшению проницаемости внешней структуры бактерий или к усилению выведения антибактериального вещества из клетки (5, 148).

Наиболее глубоко механизм мутации в топоизомеразах изучен у двух микроорганизмов: E.coli и P. Aeruginosa. Основой данного механизма устойчивости является снижение аффиности препаратов к комплексу ДНКфермент (119, 254, 267). Снижение аффинности происходит в результате спонтанных мутаций, приводящих к аминокислотным заменам в полипептидных цепях ДНК–гиразы или топоизомеразы IV. Для снижения аффинности к хинолонам значение имеют лишь мутации, возникающие на участках полипептидных цепей, входящих в состав хинолонового кармана.

Эти участки получили название «область, детерминирующая устойчивость к хинолонам» (119, 120, 267). В зависимости от того, в какой точке «хинолонового кармана» произошла аминокислотная замена, наблюдают выраженное в той или иной степени повышение минимальной подавляющей концентрации. У устойчивых лабораторных тест-культур и полевых изолятов были выявлены мутации в Gly-81, Ser-83, Ala-84 и Asp-87, в то время как замены Ala-67, Asp-82 и Gln-106 были найдены только у лабораторных резистентных мутирующих микроорганизмов (255). Так, у кишечной палочки замена серина в 83-м положении и Asp в 87 положении являются наиболее частыми мутациями, приводящими к формированию устойчивости к хинолонам (119, 120, 267).

Важное практическое значение имеют мутации в генах gyrА и parC.

При мутациях в области гена parC, определяющей устойчивость к хинолонам, плюс происходит замещения серина в 80-м положении на аминокислоту аргинин (Аrg) или изолейцин (Ile) и глутаминовой кислоты в положении 84 на Валин (Val) или лизин (Lys). Мутации в генах gyrB и parE не оказывают существенного влияния на развитие резистентности к фторхинолонам у кишечной палочки. Принципиально важнейшим моментом как для теории, так и для практики является то, что у одного и того же микроорганизма мутации в одном или двух генах могут накапливаться, сопровождаясь ступенчатым снижением аффинности ферментов к хинолонам и повышением МПК (270). Также уровень резистентности микроорганизмов зависит от того, в каком гене и в каком количестве происходят замены. Так, у кишечной палочки при единичных мутациях в гене gyrА, идет снижение чувствительности, например, к ципрофлоксацину (МПК 0,25 мкг/мл), однако такой уровень резистентности не имеет клинического значения (микроорганизм будет оставаться в категории чувствительных). При двух замещениях, одном в gyrА и втором в parC, кишечная палочка умеренно чувствительна к действию ципрофлоксацина (МПК 0,5 и 1 мкг/мг).

Замещение трех аминокислот (двух в gyrА и одной в parC или одной в gyrА и двух в parC) приводит к повышению уровня резистентности до МПК мкг/мг, а при 4-х замещениях (двух в gyrА и двух в parC) микроорганизм становится устойчив (МПК 16-32 мкг/мл) к действию антибиотика.

Из других механизмов резистентности к хинолонам значение имеют снижение проницаемости внешних структур и активное выведение, но об их частоте и соответственно клиническом значении судить трудно (5,148).

При одинаковом механизме действия всех хинолонов, разная способность к проникновению через внешнюю мембрану клетки или к выведению из нее обуславливает различную чувствительность микроорганизмов к антибактериальному средству.

Считается, что проникновение фторхинолонов через внешнюю мембрану происходит двумя способами: через порины и независимо от них.

Более гидрофильные фторхинолоны пересекают внешнюю мембрану главным образом через порины (162), в то время как более гидрофобные фторхинолоны проникают как через порины, так и без них (112).

Устойчивость, связанная с активным выведением, наиболее широко распространена среди грамотрицательных бактерий. Активное выведение антибактериальных препаратов (в том числе фторхинолонов) из внутренней среды бактерий осуществляют сложные белковые структуры (транспортные системы или эффлюксные насосы – efflux pumps), локализованные в цитоплазматической и внешней мембранах микробной клетки.

Полевые изоляты E. coli показывают высокий уровень резистентности к фторхинолонам при наличии мутаций в генах gyrА и pacC и высоком уровне фермента AcrАВ, отвечающего за выведения вещества из клетки (153,211). Ингибирование AcrАВ может снизить МПК хинолонов даже при наличии мутации в гене gyrА, в результате чего микроорганизм станет более чувствительным (164, 181).

У грамположительных микроорганизмов такой механизм развития резистентности встречается реже и, как правило, не достигает высокого уровня. Активному выведению из микробной клетки в наибольшей степени подвержен норфлоксацин, в меньшей степени – ципрофлоксацин и офлоксацин. Левофлоксацин, спарфлоксацин и другие новые фторхинолоны практически не выводятся (72).

Исследования Martinez-Martinez, L., A. Pascual, and G.A. Jacoby (1998) (155, 188) показали развитие резистентности к фторхинолонам за счет плазмид. Так был описан полевой изолят Klebsiella pneumoniae, носящий плазмиды с высоким уровнем резистентности к фторхинолонам (160, 249, 260).

Таким образом, основными механизмами развития устойчивости для фторхинолонов являются модификация мишеней действия и активное выведение препарата из бактериальной клетки. При этом, важным моментом является то, что они, как правило, имеют стационарную хромосомную локализацию, редко мобилизуясь в плазмидах и других переносчиках генетической информации между бактериям, вследствие чего быстрого распространения устойчивости между различными бактериальными клетками не происходит.

Также медленному развитию резистентности способствует наличие двух мишеней действия, в результате чего у хинолонов устойчивость формируется ступенеобразно. Так, после возникновения и селекции мутаций в генах фермента, являющегося первичной мишенью, антибактериальный эффект проявляется за счет подавления активности второго фермента, являющегося вторичной мишенью. При дальнейшем воздействии хинолонов на микроорганизм возможно возникновение и селекция мутаций во вторичной мишени, что ведет к повышению МПК. Например, если единичные мутации сопровождает незначительное повышение МПК (в 2 – раза), то такой уровень резистентности может не иметь клинического значения (микроорганизм будет оставаться в категории чувствительных).

Так, МПК ципрофлоксацина в отношении E. coli при аминокислотной замене в 81 позиции ДНК-гиразы возрастает в 8 раз (от 0,03 – 0,06 до 0,24 – 0, мкг/мл) (270). Поскольку принятая пограничная концентрация между чувствительными и умеренно устойчивыми штаммами равна 1,0 мкг/мл, то несмотря на наличие механизма устойчивости данный изолят можно рассматривать как чувствительный.

При этом вероятность развития резистентности к фторхинолонам, имеющим приблизительно одинаковое сродство к обеим топоизомеразам, значительно ниже, так как для этого должны произойти мутации одновременно в генах обоих ферментов.

При этом частота мутаций, по данным Сидоренко С.В.и др (72), скорее всего, не зависит от воздействия фторхинолонов и составляет 10 -6-10-10.

На сегодняшний момент существует несколько путей преодоления резистентности микроорганизмов к антибиотикам. Основной путь – это изыскание и внедрение в практику новых антибиотиков, а также получение новых производных известных антибиотиков, к которым у микроорганизмов еще не сформировалось механизмов устойчивости. Однако через определенный промежуток времени любая молекула антибиотика начинает инактивироваться в микробной клетке за счет развивающихся изменений в геноме микробной клетки. Поэтому спустя некоторое время после начала использования нового препарата, отмечают распространение детерминант резистентности к этому соединению в плазмидах и транспозонах. В этой связи эффективность каждого антибиотика начинает уменьшаться, что обусловливает необходимость синтеза новых антимикробных препаратов (2, 38, 42).

Развитие резистентности микроорганизмов неизбежно даже при назначении антибиотика в терапевтической дозе. Этому способствует множество факторов, среди них — неадекватный доступ к лекарствам, неправильная диагностика, дефицит объективной информации и прочие (283).

резистентности у фторхинолонов, а также то, что ранее они не применялись для лечения маститов, нам представлялось целесообразным изучить эффективность энрофлоксацина для лечения маститов и разработать препарат для интрацистернального введения на основе этого соединения.

Класс хинолонов включает две основные группы препаратов, принципиально различающихся по структуре, активности, фармакокинетике и широте спектра антибактериальной активности: нефторированные хинолоны и фторхинолоны. В настоящее время все известные фторхинолоны имеют одинаковую структуру:

Общими структурными признаками всех фторхинолонов является оксогруппа в позиции 4, кислотная функциональная группа в позиции 3, атом фтора в позиции 6, а также по одному заместителю в 1-м и 7-м положениях.

Фтор в позиции 6 отличает фторхинолоны от хинолонов и обуславливает более широкий спектр активности и эффективность. Некоторые из фторхинолонов имеют также замещения в 5-й и 8-й позициях основной структуры хинолона. При этом замещение в N-1 обязательно для антибактериальной активности молекулы. Оптимальным является циклопропиловый остаток, который (за исключением левофлоксацина) имеется во всех новых фторхинолонах. Замещение в С-5 основной структуры хинолона в значительной степени определяет активность молекулы в отношении грамотрицательных бактерий и хламидий Хинолоны классифицируют по времени введения в практику новых препаратов с улучшенными антимикробными свойствами. Различные химические замещения и боковые группы обуславливают разнообразные свойства представителей разных групп, такие как липофильность, объем распределения, биодоступность и скорость выведения, при этом антибактериальная активность разных фторхинолонов принципиально не отличается.

Согласно рабочей классификации, предложенной R. Quintiliani (1999), хинолоны разделяют на четыре поколения.

Хинолоны I поколения преимущественно активны в отношении грамотрицательных микроорганизмов, и при этом не создают высоких концентраций в крови и тканях. Одним из первых представителей этого поколения является налидиксовая кислота (группа нафталидин-карбоновых кислот), полученная еще в 1962 г. и до сих пор применяемая в урологической практике. Синтезированные в 70-е годы оксолиновая кислота и циноксацин, так же применяются в урологии. Из-за невозможности создания эффективных и безопасных концентраций во внутренних органах, использование хинолонов первого поколения ограниченно. В основном их применяют при лечении неосложненных инфекций мочевыводящих путей.

Недостатком представителей этого поколения фторхинолонов является быстрое развитие к ним резистентности у микроорганизмов (39, 54, 164, 201, 269).

Фторхинолоны II поколения разрешены для клинического применения с начала 80-х годов и отличаются широким спектром антимикробного фармакокинетикой, что позволяет применять их для лечения инфекций различной этиологии и локализации, в том числе осложненных инфекций мочевых путей и пиелонефритов, респираторных, желудочно-кишечных и кожных инфекций (240, 243). Фторхинолоны II поколения, характеризуются более высокой активностью в отношении грамположительных бактерий (прежде всего пневмококков и анаэробов), а также внутриклеточных патогенов, в том числе микоплазм.

Соединения, относящиеся к III поколению, содержат в положении хинолонового ядра незамещенный или замещенный пиперазиновый цикл, а в положении 6 –атом фтора (41, 154, 201). По широте спектра действия и антибактериальной активности их можно сравнить только с бета-лактамами третьего и четвертого поколения (94, 182, 196, 240).

Тровафлоксацин, в настоящее время является единственным представителем 4 поколения фторхинолонов и обладает более выраженной антимикробной активностью в отношении анаэробов, но в отношении грамположительных и грамотрицательных не отличается от фторхинолонов третьего поколения. Его активность в отношении Pseudomonas spp., сопоставима с ципрофлоксацином (8, 63, 101, 117, 133, 149, 193, 253, 183, 292).

Все фторхинолоны хорошо всасываются при приеме внутрь, достигая максимальной концентрации через 1-3 ч; прием пищи несколько удлиняет процесс всасывания (154). Фторхинолоны хорошо проникают во многие органы и ткани, причем концентрации в них равны или превышают сывороточные. Все фторхинолоны, за исключением пефлоксацина и офлоксацина, достаточно медленно выводятся из организма.

В России на сегодняшний день в ветеринарии зарегистрированы энрофлоксацин, флюмеквин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, марбофлоксацин. Среди фторхинолонов наиболее широкое применение нашел энрофлоксацин, благодаря антибактериальному спектру действия, фармакокинетическим параметрам и безопасности для организма животных (86, 168).

Энрофлоксацин - это производное хинолокарбоксильной кислоты, относится к группе фторхинолонов второго поколения и состоит из одного радикала фтора в позиции 6, одного радикала пиперазинила в позиции 7 и радикала циклопропила в позиции 1 (138, 225). Энрофлоксацин был синтезирован в 1983 году и представляет собой слегка желтоватый, мелкий кристаллический порошок, без запаха, с горьковатым вкусом. Молекулярный вес энрофлоксацина: 359,4. Эмпирическая формула: C19H22FN3O3 (рисунок 1).

Рисунок 1. Структурная формула энрофлоксацина:

С химической точки зрения это кислота: 1-циклопропил-6-фтор-1,4дигидро-4-оксо-7-(4-этил-1-пиперазинил)-3-карбоксильный хинолон.

Энрофлоксацин трудно растворим в воде, мало растворим в этаноле, хорошо растворим в хлороформе, кислых и щелочных растворах. Наличие атома фтора и карбоцикла определяют степень антимикробной активности и широту спектра действия энрофлоксацина. Этилпиперазильный заместитель обеспечивает оптимизацию фармакокинетических свойств, способствует повышению активности в отношении стафилококков, анаэробов, микобактерий.

Механизм действия фторхинолонов, в том числе и энрофлоксацина, отличающийся от других антибактериальных веществ, обеспечил для энрофлоксацина отсутствие перекрестной резистентности с другими антибиотиками, сульфаниламидами и нитрофуранами.

Наиболее распространенной является версия о том, что мишенью их действия являются бактериальные топоизомеразы – топоизомераза IV и ДНК–гираза, осуществляющие изменение пространственной конфигурации молекулы ДНК на различных этапах ее репликации. Каждый из ферментов состоит из четырех субъединиц. Так, ДНК–гираза, тетрамерный фермент, состоит из двух субъединиц gyrА и двух субъединиц gyrB, которые кодируются генами gyrА и gyrB. Топоизомераза IV, имеющая также (соответствующие гены parC и parE). Гены обоих ферментов локализованы на бактериальной хромосоме. Топоизомераза IV осуществляет разрезание на отдельные полипептидные цепочки формирующуюся в ходе репликации линейную молекулу ДНК. Одна из основных функций ДНК–гиразы заключается в снятии напряжения, возникающего впереди репликационной вилки в результате расплетения двойной спирали ДНК в ходе репликации (98, 150, 207, 252).

направлениях кольца хромосомы, создавая две репликационные вилки.

Раскручивание спирали ДНК в обоих направлениях вызывает скручивание хромосомы в направлении спирали и сделать хромосому плотной. ДНКгираза предотвращает положительное суперскручивание, закручивая ДНК в противоположном направлении (289). Таким образом, в молекулу ДНК топологическое напряжение, возникающее впереди движущейся репликационной вилки.

Принято считать, что фторхинолоны имеют две связывающие области, одна взаимодействует с ДНК, другая- с ДНК-гиразой. Ингибирование репликации ДНК обусловлено формированием комплекса ДНК-гиразафторхинолон-ДНК, который блокирует движение вдоль репликационной вилки, что приводит к гибели микробной клетки. Этот феномен был назван «poison hypothesis». Полагается, что фторхинолоны связываются с ДНКгиразой в присутствии ДНК и ионов Mg2+, которые, возможно, необходимы для формирования комплекса. Однако, они не связываются с каждым элементом независимо.

формирование комплекса между ДНК, ДНК-гиразой и фторхинолонами.

Согласно модели, предложенной Shen, у молекулы фторхинолона есть три функциональные области (рисунок 2):

фторхинолоны связываются с молекулой ДНК посредством за счет связывания радикала в позиции С-7 с субъединицей В Рисунок 2. Модель формирования комплекса между ДНК, ДНКгиразой и фторхинолонами по Shen Palumbo предложил другую модель, в соответствии с которой связывание молекулы фторхинолона и ДНК происходит в результате формирования комплекса между радикалами в 3 и 4 позициях, ионами Mg2+ и фосфатными группами ДНК (рисунок 3). Кроме того, так как молекула фторхинолонов имеет плоскую структуру двойного кольца, она может связываться с такой же плоской структурой основания ДНК. Фторхинолоны также могут связываться с ДНК–гиразой в позициях 1 и 7 (216).

Рисунок 3. Модель формирования комплекса между ДНК, ДНКгиразой и фторхинолонами по Palumbo Foerster D. (1987) изучал механизм действия энрофлоксацина в концентрациях 0,025-2,0 мг/мл на бактериальный фермент ДНК-гиразу с помощью непрерывной микрофотосъемки двух обработанных препаратом культур Staph. аureus и E.coli. В ходе исследований было установлено, что энрофлоксацин ингибирует деление клетки, а не нарушает формирование клеточной стенки, в результате клетка увеличивается в размерах и подвергается лизису. Применение энрофлосацина в низких концентрациях граммотрицательных микроорганизмов, при их увеличении – лизис и разрыв мембраны клеточной стенки (137, 232).

В механизме действия хинолонов в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов имеются некоторые особенности. Этот факт позволяет для всех хинолонов выделить первичную, к которой данный хинолон проявляет наибольшее сродство, и вторичную мишени действия. У грамотрицательных микроорганизмов наибольшее сродство хинолоны проявляют к ДНК-гиразе (топоизомераза IV имеет меньшее значение), благодаря чему именно этот фермент является первичной мишенью их действия, у грамположительных – наоборот (72,119). При этом большинство нефторированных и фторированных хинолонов обладают большим сродством к ДНК-гиразе, с чем и связана их преимущественная активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов. В то время как некоторые новые фторхинолоны, такие как спарфлоксацин, грепафлоксацин, тровафлоксацин, моксифлоксацин, обладают высокой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов, что вероятно, объясняется их повышенным сродством к топоизомеразе IV (119, 270).

По данным Manjunatha, U.H., M. Dalal, et all, у некоторых микроорганизмов, такие как Mycobacterium tuberculosis, Campylobacter spp., Corynebacterium spp., и Helicobacter pylori, отсутствует топоизомераза IV, а по данным исследований, проведенных на Mycobacterium smegmatis, была выявлена повышенная активность у них ДНК-гиразы, возможно, берущая на себя роль топоизомеразы IV (187).

Таким образом, основной мишенью для действия фторхинолонов являются ДНК-гираза и топоизомераза IV, поэтому и основные причины развития резистентности у бактерий связаны с изменениями в этих ферментах.

Большое значение в механизме действия энрофлоксацина имеет длительный постантибиотический эффект, который определяется как прямым действием препарата на микробную клетку, так и особенностями фармакокинетики (высокие тканевые и внутриклеточные концентрации). Все эти факторы особенно существенны, когда речь идет об инфекционных процессах, вызванных возбудителями с внутриклеточной локализацией или о заболеваниях, сопровождающихся резким снижением иммунитета.

Необходимо отметить, что антибактериальная активность большинства фторхинолонов, в том числе и энрофлоксацина, зависит от концентрации.

Активность повышается до концентрации 90 мкг/мл, и затем снижается. Этот эффект, возможно, вызван ингибированием синтеза РНК в больших концентрациях, что дает начало к снижению производства ДНК (197).

Чувствительность микроорганизмов к энрофлоксацину Энрофлоксацин обладает широким спектром действия в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, в том числе Staphylococcus spp., E.Coli, Salmonella spp, Pasteurella spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Haemophilus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp.

Минимальная ингибирующая концентрация энрофлоксацина для E.Coli, Salmonella, Klebsiella, Yersinia, Haemophilus, Pasteurella, Actinobacillus колеблется в пределах 0,01-0,06 мкг/мл, а для Serratia, Proteus, Campylobacter, Bordetella, Staphylococcus, Mycoplasma – 0,125-0,5 мкг/мл (104, 151, 180, 234).

По результатам мониторинга, проведенного в Германии в 2002- годы, МПК энрофлоксацина в отношении E.coli составила – 0,03 мкг/кг, S.

aureus – 0,12 мкг/мг, коагулазонегативных Staphylococcus spp. – 0,12 мкг/мг, Streptococcus spp. – 0,5 мкг/мг. При этом уровень резистентности у этих же микроорганизмов составил 1,9; 0; 0,6; и 0,2% соответственно (257), что говорит о медленном развитии резистентности к энрофлоксацину.

По данным многочисленных исследований, энрофлоксацин показал высокую активность и в отношении микоплазм; его минимально подавляющая концентрация (МПК) (0,03-0,5 мкг/мл) сходна, а в некоторых случаях превосходит МПК антибактериальных веществ, которые традиционно используются для лечения микоплазмоза: тилозин (0,03-0, мкг/мл), доксициклин (0,3-2 мкг/мл), тиамулин (0,05-1 мкг/мл), линкомицин (0,13-2 мкг/мл) (118, 123, 140, 221 ).

По данным Romagnoli et al. (1992) и Scheer M, энрофлоксацин действует на мультирезистентные микроорганизмы (138, 231).

Низкая частота спонтанных мутаций и уникальность механизма действия определяют относительно редкое выделение штаммов, устойчивых к энрофлоксацину, несмотря на его интенсивное применение в течение последних десятилетий (211).

Токсичность энрофлоксацина Энрофлоксацин характеризуются низкой токсичностью для млекопитающих, ввиду отсутствия в клетках млекопитающих ДНК-гиразы, мишени для энрофлоксацина, что делает препарат практически не токсичным для макроорганизма (91, 136, 190).

ЛД50 при оральном введении у мышей и крыс 5000 мг/кг массы тела, у кроликов - в диапазоне 500-800 мг/кг массы тела, у цыплят колеблется в пределах 2000-2500 мг/кг массы тела, что в сотни раз превышает терапевтическую дозу. При парентеральном введении ЛД 50 для мышей - мг/кг массы тела.

В субхронических и хронических экспериментах было установлено, что основными органами-мишенями для фторхинолонов являются печень и почки. Доза, не оказывающая токсического действия в хроническом опыте, составила 10 мг/кг/день. В более высоких дозах отмечаются изменения в биохимии крови, а также уменьшение массы семенников и патологический сперматогенез (132).

У энрофлоксацина не было выявлено эмбриотоксическое действие даже при введении десятикратных терапевтических доз – до 50 мг/кг (132).

По данным исследований Brown S. A. энрофлоксацин вызывает дегенеративные изменения в суставном хряще у молодняка, выражающееся в возникновении везикул и эрозий на хрящевой поверхности сустава. Этот эффект был выявлен у щенков при длительном (13-недельном) введении энрофлоксацина в дозах 3 мг/кг/день. При назначении терапевтического курса (10 дней) артропатии у щенков не наблюдалось. Похожая ситуация отмечалась у коров и свиней при введении энрофлоксацина в течении дней в дозах выше 30 мг/кг (93, 108, 122, 126).

Фармакокинетика Фармакокинетика энрофлоксацина, как и большинства фторхинолонов, распределения, низкой степенью связывания с белками плазмы, большим периодом полураспада в сыворотке крови и способностью проникать внутрь клетки. В основном эти свойства обусловлены липофильностью фторхинолонов. Биодоступность всех фторхинолонов превосходит 70%.

Проведенная оценка фармакокинетики Altreuther Р., еt al на крысах при однократном внутривенном введении энрофлоксацина в дозе 5 мг/ кг, показали, что он быстро абсорбируется и проникает во все ткани, при этом биодоступность составила 75% (92, 132). Изучение фармакокинетики энрофлоксацина, проведенные на крупном рогатом скоте, свиньях, птицах, также показали быструю его абсорбцию и проникновение во всех органы и ткани после орального и парентерального введения (92, 132). По данным Европейского агентства биодоступность энрофлоксацина у кроликов была соответственно 61, 92 и 72% после орального, внутримышечного и подкожного введения в дозе 5 мг/кг массы тела (129).

концентрации в сыворотке крови через 0,5-2 часа, что зависит от вида животного и способа введения (орального или парентерального). Так по данным EMEA при оральном, внутримышечном и подкожном путях введения энрофлоксацина в дозе 5 мг/кг массы тела максимальная концентрация энрофлоксацина составила 0,45, 3,04 и 2,07 мкг/мл соответственно через 1-2 часа после введения (129). Схожие результаты о быстром достижении максимальных концентрации энрофлоксацина в сыворотке крови отмечали и Kung K., et al. (171).

хорошем проникновении препарата во внеклеточные пространства и внутрь клеток. Концентрация энрофлоксацина внутри клеток, как правило, в несколько раз выше, чем в плазме крови и межклеточном пространстве, что имеет важное значение при терапии инфекций с внутриклеточной локализацией возбудителя (71).

По данным FDA и M. Scheer, концентрация энрофлоксацина во внутренних органах и лимфатических узлах в течение 12 часов в несколько раз превышает сывороточные. У птиц энрофлоксацин преимущественно накапливается в коже (92, 132,231).

альвеолярных макрофагах концентрации соединений фторхинолонов в 2- раз превышает концентрации в плазме, что способствует быстрому попаданию энрофлоксацина в очаг воспаления.

Метаболизм Энрофлоксацин в значительной степени метаболизируется в печени.

Pirro (1996) в своих исследования определил 9 метаболитов энрофлоксацина:

ципрофлоксацин, оксоэнрофлоксацин, оксоципрофлоксацин,N-формил fluoroquinolonic acid и 7-aminofluoroquinilonic acid (214).

У сельскохозяйственных животных метаболизм происходит в печени и почках и основным метаболитом является ципрофлоксацин, который обладает таким же спектром антибактериальной активности как и исходный энрофлоксацин. Ципрофлоксацин появляется в крови через 3-6 часов после введения энрофлоксацина, к 9-12 часам его концентрации постепенно нарастает, а затем плавно снижается (92, 132).

Энрофлоксацин не аккумулируется в тканях и достаточно быстро выводится из организма через почки и печень: большая его часть в течение 24 часов после введения, при этом около 40% с желчью в неизмененном виде (4, 5, 67, 92,115, 132, 272).

концентрациями в сыворотке крови и еще более высокими в тканях и органах, низкими минимальными бактерицидными концентрациями для большинства грамотрицательных, грамположительных микроорганизмов, включая микоплазм, а также отсутствием перекрестной резистентности к традиционным химиотерапевтическим препаратам, используемым в ветеринарии, что позволило нам включить энрофлоксацин в качестве действующего вещества в состав противомаститного препарата для интрацистернального введения.

Мастит – это воспаление молочной железы, характеризующееся сопровождается болевой реакцией.

Арахидоновая кислота и ее метаболиты, играют важную роль в развитии воспалительных процессов в вымени, которые осложняют течение болезни и увеличивают сроки выздоровления. Так при повреждении клеток макроорганизма под действием различных раздражающих факторов эндо или экзогенного происхождения, например бактериями и их токсинами, из фосфослипидов клеточных мембран под влиянием фосфолипазы А немедленно выделяется арахидоновоя кислота, которая в дальнейшем под действием ферментов циклооксигеназы (ЦОГ) и липооксигеназы (ЛОГ) метаболизируется по двум основным путям с образованием нескольких групп эйкозаноидов-медиаторов: простогландинов и простациклина, лейкотриенов (ЛТ) и липоксинов А и В (114), большинство которых возбуждает ноцицепторы свободных неинкапсулированных нервных окончаний в пораженных тканях. Это приводит не только к первичной болевой реакции, но и к повышению чувствительности болевых окончаний к последующим раздражениям (209, 227).

Накапливаясь в очаге воспаления простагландины ПГЕ2 и ПГI вызывают локальное расширение сосудов, отек, экссудацию и миграцию лейкоцитов; сенсибилизируют рецепторы к медиаторам боли (гистамину и брадикинину) и механическим воздействиям, понижая порог болевой чувствительности; повышают чувствительность гипоталамических центров терморегуляции к действию эндогенных пирогенов (интерлейкина-1 и др.) ( 289).

Таким образом, целесообразно в противомаститную терапии помимо этиотропного компонента, воздействующего на причину болезни, в частности на микроорганизмы (возбудителя заболевания), включать компонент, который обладал бы и противовоспалительным действием и снимал бы болевую реакцию, то есть, воздействовал бы на патогенез заболевания и проявлял бы симптоматическую терапию; таким свойством обладают нестероидные противовоспалительные соединения. Среди них наиболее сильное анальгетическое действие оказывает кетопрофен, и поэтому мы решили дополнительно включить его в лекарственную форму к энрофлоксацину (95).

противовоспалительных средств (НПВС), который обладает выраженным обезболивающим, жаропонижающим и противовоспалительным действием и нашел широкое применение за рубежом в виде различных лекарственных форм.

арилпропионовой кислоты, относящееся к «профенам» (рисунок 4).

«Профены» - это слабые кислоты (pKa=3-5), имеющие общую химическую структуру, выражаемую формулой: Ar-CH (CH3)-COOH (24, 83, 292).

Кетопрофен синтезирован в 1967 году, а в 1971 году был признан «молекулой года», с 1973 года широко используется в клинической практике во всех странах мира (80, 178), в том числе в России.

С химической точки зрения это кислота: 2-(3-бензоил-фенил)пропионовая кислота.

Рисунок 4. Химическая формула кетопрофена В молекуле кетопрофена бензольная и карбоксильная группы находятся в антиположении по отношению к бензольному кольцу (60). За счет группы -СН3 в альфа положение, повышена его ЦОГ- ингибирующая активность и снижена токсичность.

кристаллический порошок, без запаха, практически нерастворимый в воде, легко растворимый в органических растворителях, а также в спиртовом растворе натрия гидроксида. Является сильной органической кислотой (рКа=3-5) и характеризуется высокой липофильностью, при физиологических значениях рН среды, в основном находится в ионизированном состоянии (3).

Температура плавления кетопрофена 92-970С. Молекулярная масса 254, (22,233).

Как и другие НПВС, кетопрофен оказывает анальгезирующее, противовоспалительное и жаропонижающее действие, но при этом анальгетический эффект кетопрофена проявляется быстрее и независимо от его противовоспалительного действия, и даже наблюдается при отсутствии воспалительных реакций.

Механизм действия кетопрофена связан с угнетением активности циклооксигеназы (ЦОГ)-основного фермента метаболизма арахидоновой кислоты, являющейся предшественником простагландинов, которые играют главную роль в патогенезе воспаления, боли и лихорадки (82). По данным W.

Cromlish и B. Kennedy (1989), кетопрофен примерно в одинаковой степени подавляет ЦОГ-1 и ЦОГ-2 и сходен в этом отношении с другими НПВС (ибупрофен, пироксикам, напроксен) (69, 88, 239).

противовоспалительный эффекты НПВС определяются подавлением циклооксигеназы ЦОГ2, а развитие побочных реакций подавлением – «противовоспалительных» и «цитопротективных» простогландинов, было противовоспалительных препаратов, так называемых "селективных ингибиторов ЦОГ2" (целекоксиб, рофекоксиб, мелоксикам, нимесулид, этодолак) (135, 48). Согласно многочисленным клиническим исследованиям было показано, что селективные ингибиторы ЦОГ2 столь же эффективны, как и "неселективные" НПВС, но также потенциально не лишены недостатков. Поэтому "неселективные" НПВС продолжают оставаться лекарственными средствами, которые еще длительное время будут занимать очень важное место в клинической практике (47, 48, 49, 135, 238, 244).

Выраженное анальгизирующее действие кетопрофена обусловлено двумя механизмами: периферическим и центральным. Периферическое действие кетопрофена опосредовано через подавление выработки все тех же медиаторов воспаления простогландинов (ПГ) и лейкотриенов (ЛТ), а центральное - обусловлено способностью:

благодаря высокой липофильностью;

- оказывать центральное воздействие на уровне задних рогов спинного мозга путем ингибирования деполяризации нейронов задних столбов (46, 109, 139, 291).

Кроме того, кетопрофен обладает антибрадикининовой активностью, стабилизирует лизосомальные мембраны, вызывает значительное торможение активности нейтрофилов у больных с ревматоидным артритом (РА), подавляет агрегацию тромбоцитов (48).

противовоспалительной и жаропонижающей активности кетопрофен (200мг/сут) не уступает, а по анальгетической- превосходит большинство НПВС (89, 176, 230). Так, по силе противовоспалительного действия НПВС могут быть расположены в следующей последовательности (от большего к меньшему): индометацинфлурбипрофен диклофенак натрия пироксикам кетопрофен напроксен ибупрофен амидопирин аспирин (82). По последовательности: кетопрофен диклофенак натрия индометацин флурбипрофен амидопирин пироксикам пирпрофен напроксен ибупрофен аспирин. (82). Его обезболивающий эффект сравним с опиоидами; в 65 раз превосходит фенилбутазон и в 150 раз - аспирин. По жаропонижающей активности кетопрофен примерно в 3-4 раза активней индометацина.

Кетопрофен относится к среднетоксичным соединениям. При изучении острой токсичности кетопрофена было установлено, что у мышей, кроликов и собак ЛД50 при оральном, подкожном и внутрибрюшинном путях введения была около 500 мг/кг. Смертельная доза кетопрофена в форме 10% инъекционного раствора при многократном подкожном введении составляет 2467 (2236-2698) мг/кг (18). Кетопрофен относится к веществам со слабой кумуляцией - коэффициент кумуляции равен 5,27 (26).

При изучении хронической токсичности кетопрофена в опытах на крысах в течение одного месяца не вызывающая токсического эффекта доза (недействующая доза NOEL (no observed effective dose)) составила при пероральном введении 2 мг/кг массы тела в день, а при применении в смеси с кормом – 6 мг/кг массы тела в день. В исследованиях на обезьянах в течение 6 мес. NOEL при пероральном введении составила 4,5 мг/кг массы тела в день.

кетопрофена было установлено, что отрицательное воздействие на формирование эмбриона проявляется при введении препарата в дозе 9 мг/кг, которая токсична также и для организма матери. При оральном введении кетопрофена в дозе 2 мг/кг массы тела в день эмбриональное и тератогенное действие не наблюдалось.

Исследование канцерогенности на крысах (3; 4,5 и 7 мг кетопрофена в течение 91 недели) и мышах (4, 8, 16 и 32 мг кетопрофена в течение недель) показали отсутствие связи между применением кетопрофена и Исследование кетопрофена и его метаболита RP 69400 не выявило мутагенной активности этих веществ (128).

особенностями. Он очень быстро абсорбирует из ЖКТ после перорального введения и в течение 0,5-2 ч достигает максимальной концентрации в плазме крови. Биодоступность кетопрофена после внутримышечного введения варьирует у разных видов животных: так у кролика она составляет 38%, коров – 85-100%, а у верблюдов -100% (206).

Кетопрофен обладает коротким периодом полувыведения (1-2 ч. – у людей; 0,88 ч - у лошадей; 0,42 ч - у телят; 0,26 ч - у кошек) и низким объемом распределения, что характерно для производных кислот, которые интенсивно связывают с белками плазмы крови (49, 98, 99, 178, 205, 226, 230, 287). Несмотря на то, что кетопрофен до 97% связывается с белками плазмы крови, он легко проникает в полость суставов и длительно задерживается в синовиальной жидкости (49, 287). Результаты исследований проведенных на лошадях с синовитами показали, что концентрация кетопрофена в синовиальной жидкости была в 6,5 раз выше, чем у здоровых лошадей и определялась уже через 1 ч после инъекции препарата, тогда как у здоровых – только через 3 часа. Важной особенностью кетопрофена, является отсутствие существенного влияния на синтез протеогликана хондроцитами кролика и человека (113, 157). Период полувыведения кетопрофена существенно ниже, чем у аспирина (3 ч), индометацина (5 ч) и кеторолака трометамина (5-6 ч), что позволяет отнести кетопрофен к лекарственным препаратам с коротким периодом полувыведения, которые представляют меньший риск для пациентов, благодаря их быстрой элиминации в случае возникновения осложнений (3).

подвергается глюкуронизации с образованием сложных эфиров с глюкуроновой кислотой, выводимых главным образом почками (128).

Populaire et al (1973) выявили два пути метаболизма кетопрофена, первый заключается в окислении ароматического кольца и продукции 3-гидрокси- и 4-гидроксикетопрофена, а другой – в соединении с группой карбоновых кислот (106).

После однократного внутримышечного введения кетопрофена в дозе мг/кг массы тела коровам, 90% вещества определялось в моче в течение часов, из них 90-93% составлял метаболит RP 69400, который в 10-100 раз менее активен, чем исходный кетопрофен. После дальнейшего применения кетопрофена раз в день в дозе 3 мг/кг массы тела в течение 3 дней кетопрофен и его метаболит обнаруживались только в почках и их концентрация через 24 часа после третьей инъекции составила 0,19±0, мкг/г и 0,24±0,17 мкг/г соответственно. В других тканях эти вещества не выявляются или их уровень был ниже предела детектирования метода (0, мкг/г для кетопрофена, 0,1 мкг/г для RP 69400). В месте инъекции обычно находится только неметаболизированный кетопрофен. Имеются данные, что кетопрофен и его метаболит RP 69400 не детектируются (0,025 мкг/мл) в молоке, полученном во время или сразу после лечения в рекомендуемых дозах (128).

Изучение стереоселективности кетопрофена на крысах, собаках, кошках, лошадях, обезьянах и кроликах подтвердило преобладание концентрации в плазме крови S(+)-формы кетопрофена (86).

С другой стороны у лошадей и телят концентрации двух энантиомеров находятся на одном уровне, а у коз и овец преобладает R(-)-форма (98, 141, 142, 167, 172, 173, 224) Метаболизированный кетопрофен главным образом выводится почками-60–80% – в виде глюкуронида. Выведение с каловыми массами составляет менее 1%.

Анализ литературы показал, что кетопрофен характеризуется быстрым и мощным анальгетическим эффектом, сравнимым с опиоидным, по противовоспалительной и жаропонижающей активности кетопрофен не уступает, а по анальгетической – превосходит большинство НПВС;

отличается коротким периодом полувыведения (1,5-2 ч), что имеет существенное значение при использовании у коров в лактационный период.

(3, 194, 268, 291). Кроме того, применение кетопрофена в комплексной терапии мастита повышает эффективность лечения на 5-14% (3, 103, 194, 237, 282, 285).

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований Изучение антибактериальной активность энрофлоксацина Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) энрофлоксацина в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, выделенных от коров, больных маститом, проводили методом серийных разведений в плотной питательной среде (45). В качестве тест-культур использовали полевые штаммы микроорганизмов, выделенные из молока коров, больных маститом и типированные по морфологическим, тинкториальным, культуральным и фементативным свойствам.

Морфологические и тинкториальные свойства изучали путем окрашивания бактериологических препаратов по Граму с последующей микроскопией под иммерсией (х90). Ферментативные свойства энтеробактерий изучали с помощью СИБов (системы индикаторные бумажные). Ферментативные свойства выделенные грамположительных микроорганизмов изучали с помощью Streptotest 16, Staphylotest 16, Ps.aeroginosa - оксидного теста (положительный). Идентифицировали штаммы микроорганизмов в соответствии с «определителем бактерий Берджи» (1997). Исследования проводили в сравнении с другими препаратами группы фторхинолонов (энрофлоксацин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, флюмеквин), а также с антибактериальными средствами других групп: тетрациклины (доксициклин), аминогликозиды (гентамицин), полусинтетические пенициллины (амоксициллин), линкозамиды (клиндамицин), хлорамфениколы (левомицетин), цефалоспорины (цефтиофур, цефалексин).

В качестве питательной среды использовали мясопептонный агар, расплавленный на водяной бане и охлажденный до 55-60 С. Разведения антибиотиков готовили на стерильном физиологическом растворе из основного раствора, содержащего 1000 мкг/мл антибактериального вещества, таким образом, чтобы концентрация в растворе была в десять раз выше той, которую нужно получить в питательной среде. Далее 1,5 мл раствора антибиотика смешивали в стерильном флаконе с 13,5 мл расплавленной питательной среды, выливали в чашку Петри и охлаждали до полного застывания агара. Для контроля вместо раствора антибиотика в питательную среду добавляли 1,5 мл физиологического раствора. Чашки Петри подсушивали в течение 1 часа, чтобы избежать образования конденсата на поверхности агара. Затем каждую чашку засевали при помощи бактериологической петли суточной культурой одного из исследуемых изолятов микроорганизмов в концентрации 10 млн. микробных тел в 1 мл.

Чашки Петри помещали в термостат для инкубации при 37 С на 18-20 часов.

За МПК для данного изолята принимали ту концентрацию, при которой отсутствовали признаки роста микроорганизма на поверхности агара.

препарата на лабораторных животных Изучение острой токсичности проводили в виварии Всероссийского института гельминтологии имени К.И.Скрябина (ВИГИС) в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического государственного комитета (65).

Острую токсичность изучали на 40 беспородных белых мышах массой 18-20 г и 24 белых крысах массой 180-200 г из питомника «Филиал Андреевка ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН». Животных содержали в виварии согласно санитарным правилам и на стандартном рационе с использованием сухого брикетированного корма (ООО «Лабораторснаб», г.

Москва) в соответствии с приказом МЗ СССР № 104 5-7 3 от 06.04.73 г. и № 1179 от 10.10.1983 г. (52, 66). Подготовку к опыту крыс и мышей проводили в соответствии с указаниями ОФС «испытание на токсичность» ГФ XI (13).

Перед опытом у животных отбирали корм и воду. Через два часа животных взвешивали и распределяли по группам.

Противомаститный препарат в 1% растворе крахмала вводили однократно в утренние часы на голодный желудок перорально через зонд в дозах: 2500; 5000; 8000 и 10000 мг/кг, а кормление осуществляли спустя два часа. Каждую дозу препарата испытывали на 10 белых мышах и 6 крысах.

Наблюдение за клиническим состоянием животных проводили в течение суток после введения препарата. В процессе опыта учитывали клиническое состояние животных, двигательную активность, отмечали особенности поведения; оценивали прием корма и воды, а также состояние шерстного покрова.

Для определения ульцерогенного действия было сформировано три группы по 3 крысы в каждой (массой 180-230 г), которым препарат вводили в желудок в дозах 5000; 8000 и 10000 мг/кг однократно. На следующие сутки всех животных подвергали эвтаназии и визуально исследовали состояние желудочно-кишечного тракта.

Оценку ульцерогенного эффекта проводили по 4-балльной шкале: 0 – отсутствие повреждений; 0,5 – гиперемия, 1 – единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных кровоизлияния); 2 – множественные повреждения (эрозия, точечные кровоизлияния); 3 – значительные и множественные повреждения слизистой оболочки (эрозии, кровоизлияния); – грубые повреждения, охватывающие всю поверхность слизистой оболочки (массивные кровоизлияния, эрозии, перфорации) (65).

Изучение субхронической токсичности противомаститного препарата в опытах на лабораторных животных Субхроническую токсичность препарата изучали в виварии Всероссийского института гельминтологии имени К.И.Скрябина (ВИГИС) на 40 белых крысах-самцах с начальной массой тела 170-179 г из питомника «Филиал Андреевка ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН», разделенных по принципу аналогов на 4 группы. Подготовку и содержание животных проводили аналогично как и в опыте по изучению острой токсичности препарата. Препарат в 1% растворе крахмала вводили в желудок в течение 21 суток с помощью желудочного зонда в следующих дозах: I группе препарат вводили в дозе 1000 мг/кг (1/5 от минимальной дозы, вызывающей ульцерогенное действие 5000 мг/кг), II группе - 500 мг/кг (1/10 от 5000 мг/кг), III группе - 250 мг/кг (1/20 от 5000 мг/кг). Крысам IV (контрольной) группы вводили 1% раствор крахмала.

В течение всего периода введения препарата наблюдали за общим состоянием, поведением животных и видимыми физиологическими функциями, учитывали количество приемом корма и воды. Изменение массы тела крыс регистрировали на 1, 3, 7, 10, 14 и 21 сутки.

Через сутки после последнего введения препарата всех крыс убивали декапитацией и отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей.

Основные показатели периферической крови крыс определяли на гематологическом анализаторе «АСТ-Diff» (США); лейкоцитарную формулу крови — общепринятым методом. Определение биохимических показателей проводили на биохимическом анализаторе «Сlima-15» (Испания).

Влияние препарата на состояние внутренних органов оценивали по результатам определения их массовых коэффициентов, ориентируясь на общепринятое мнение, что изменение массы органа, как правило, ведет к существенному изменению его функциональных способностей.

Также проводили макро- и микроскопическое исследование органов (печени, легких, почек, сердца, селезенки, желудка и тонкого кишечника).

Для этого отбирали пробы у 5 крыс из каждой группы, материал фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программы «Student 200».

Изучение раздражающего действия противомаститного препарата интрацистернального введения однократного и многократного интрацистернального введения проводили в ОНО «Московская селекционная станция» (Московская область, СеребряноПрудский район) и ИЛЦ «Фармбиомед» на лактирующих коровах голштинофризской породы массой 500-550 кг 3-4 лактации. Содержание коров было привязным; животные находились в отдельных загонах. Температура в помещении была на уровне 202С; влажность воздуха составляла 655%;

животных содержали при 9 часовом освещении. Рацион состоял из объемистых кормов (силос и сенаж) с добавлением концентратов (размолотый ячмень и пшеница). Потребление воды было не ограниченным. В хозяйстве доение коров проводят два раза в день.

Коровы не подвергались обработке антибактериальными препаратами.

Опытных животных метили индивидуальными ушными бирками.

Объектом исследования был противомаститный препарат на основе энрофлоксацина и кетопрофена (далее по тексту противомаститный препарат), расфасованный в шприцы-дозаторы по 7,5 мл, в которых содержалось 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена.

По содержанию в молоке соматических клеток судили о возможном раздражающем действии противомаститного препарата.

Исследование раздражающего действия после однократного введения противомаститного препарата проводили на 5 коровах. У животных до начала опыта из задней правой (опытной) и задней левой (контрольной) четвертей вымени отбирали пробы молока, в которых подсчитывали количество соматических клеток (фоновые показатели).

Всем 5 коровам в заднюю правую четверть вымени однократно вводили по одному шприцу-дозатору с противомаститным препаратом.

Через 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21 и 24 часа после введения препарата у всех животных отбирали пробы молока из задней правой (опытной) и задней левой (контрольной) четвертей вымени. Перед отбором проб первые порции молока сдаивали и отбрасывали.

В пробах молока определяли содержание соматических клеток на вискозиметрическом анализаторе «Соматос» (Россия).

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программы «Student 200».

Изучение местно-раздражающего действия препарата после многократного интрацистернального введения проводили на 8 дойных коровах, разделенных на две группы. Первой группе коров (5 голов) в заднюю правую (опытную) четверть вымени после доения вводили по одному шприц-дозатору с противомаститным препаратом (терапевтическая доза) пятикратно с интервалом 12 ч. Второй группе животных (3 головы) вводили одновременно по три шприца-дозатора с противомаститным препаратом в заднюю правую (опытную) четверть вымени пятикратно с интервалом 12 часов.

В течение 6 плановых доек после последнего введения препарата отбирали пробы молока из двух опытных четвертей вымени. В пробах молока определяли количество соматических клеток на анализаторе молока «Fossomatic» серия 400/2000/5000 (Дания).

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программы «Student 200».

Изучение фармакокинетики в молоке и плазме крови и остаточных количеств энрофлоксацина и кетопрофена в молоке после инрацистернального введения противомаститного препарата Фармакокинетику энрофлоксацина и кетопрофена после однократного введения препарата в молоке изучали на 5 клинически здоровых лактирующих коровах голштино-фризской породы. Лекарственное средство вводили интрацистернально по одному шприц-дозатору в заднюю правую (опытную) четверть вымени. Содержание коров было привязным; животные находились в отдельных загонах. Температура в помещении равнялась 202С; влажность воздуха составляла 655%; животных содержали при часовом освещении. Рацион состоял из объемистых кормов (силос и сенаж) с добавлением концентратов (размолотый ячмень и пшеница). Потребление воды было не ограниченным.

Образцы молока отбирали из задней правой четверти (опытной) и из задней левой (контрольной) четверти вымени до введения лекарственного средства и через 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 часа после введения препарата.

Пробы молока замораживали и хранили до начала анализа при -20°С.



Pages:   || 2 | 3 |
 
Похожие работы:

«ХИСАМОВ РАИЛЬ ЗАГИТОВИЧ ПРОЯВЛЕНИЕ МЯСНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ И МОРФОБИОХИМИЧЕСКИЙ СТАТУС ЖЕРЕБЯТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В РАЦИОНАХ АДАПТИРОВАННЫХ К УСЛОВИЯМ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН МИКРОМИНЕРАЛЬНЫХ ПРЕМИКСОВ 06.02.08 – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Якимов О.А....»

«Рахимова Юлия Мансуровна ВЛИЯНИЕ ПРИЁМОВ ОСНОВНОЙ ОБРАБОТКИ ПОЧВЫ И ГЕРБИЦИДОВ НА УРОЖАЙНОСТЬ И КАЧЕСТВО СОИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСОСТЕПИ ПОВОЛЖЬЯ Специальность 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени...»

«Тарасенко Петр Владимирович СИСТЕМА ВЛАГОСБЕРЕГАЮЩИХ ПОЧВОЗАЩИТНЫХ МЕЛИОРАЦИЙ В СРЕДНЕМ ПОВОЛЖЬЕ И ЦЕНТРАЛЬНОМ ЧЕРНОЗЕМЬЕ Специальность: 06.01.02 – мелиорация, рекультивация и охрана земель ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант : доктор...»

«Сёмина Наталья Ивановна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА ЮЖНЫХ ЧЕРНОЗЁМАХ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 06.01.01-Общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, Плескачёв...»

«МАКШАКОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА ПОСЛЕДЕЙСТВИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ И МИНЕРАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ НА УРОЖАЙНОСТЬ И КАЧЕСТВО ОЗИМОЙ РЖИ Специальность 06.01.04 – агрохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Мерзлая Генриэта...»

«Панфилова Ольга Витальевна ОЦЕНКА АДАПТИВНОСТИ КРАСНОЙ СМОРОДИНЫ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СЕВЕРО-ЗАПАДА ЦЕНТРАЛЬНО-ЧЕРНОЗЕМНОГО РЕГИОНА 06.01.05- селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель : кандидат с. - х. наук О.Д....»

«Матыченков Иван Владимирович ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОВЛИЯНИЯ КРЕМНИЕВЫХ, ФОСФОРНЫХ И АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ В СИСТЕМЕ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ Специальность: 06.01.04 -агрохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Е.П. Пахненко Москва Содержание стр. Введение Глава 1. Литературный обзор 1.1 Соединения кремния в природе 1.2...»

«Равашдех Шариф Халид Абдул-Азиз БИОЛОГИЯ, ВРЕДОНОСНОСТЬ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕР БОРЬБЫ ПРОТИВ ТОМАТНОЙ МОЛИ - Tuta absoluta (Meyrick) - В УСЛОВИЯХ ИОРДАНИИ 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : кандидат...»

«Макарова Елена Александровна НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМЫ ДИКИЕ ЖИВОТНЫЕ - БРАКОНЬЕРЫ Специальность: 06.02.09 – звероводство и охотоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, Проняев...»

«Николайченко Наталия Викторовна ФОРМИРОВАНИЕ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ АГРОФИТОЦЕНОЗОВ РАСТОРОПШИ ПЯТНИСТОЙ НА ЧЕРНОЗЕМНЫХ И КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ПОВОЛЖЬЯ 06.01.01 – Общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант : доктор с.-х. наук,...»

«АНИСТЕНОК СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ Продолжительность продуктивного использования коров айрширской породы и методы ее повышения Специальность 06.02.07 - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Ларионова Мария Сергеевна РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА В ЗОНЕ ЧЕРНОЗЁМНЫХ ПОЧВ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 06.01.01- Общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель : д.т.н., доцент Юдаев Игорь Викторович...»

«Вайс Андрей Андреевич НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ОЦЕНКИ ГОРИЗОНТАЛЬНОЙ СТРУКТУРЫ ДРЕВОСТОЕВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИХ УСТОЙЧИВОСТИ И ПРОДУКТИВНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ НАСАЖДЕНИЙ ЗАПАДНОЙ И ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ) 06.03.02 – лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Красноярск - Оглавление Введение.. 1...»

«АБДЕССЕМЕД ДАЛИЯ СУБКЛИНИЧЕСКИЙ МАСТИТ У КОРОВ В ПОСЛЕРОДОВЫЙ ПЕРИОД (ВЕРИФИКАЦИЯ ДИАГНОЗА И ТЕРАПИЯ) 06.02.06 – Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель – доктор...»

« Ткаченко Лия Викторовна Морфо – функциональная характеристика лимфатической системы легких и их регионарных лимфатических узлов кроликов в норме и эксперименте 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, онкология, патология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук...»

«Артюшина Ирина Юрьевна ЗНАЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНОГО РАСТВОРА В ФОРМИРОВАНИИ КОМПОЗИЦИИ АРОМАТА СРЕЗАННЫХ РОЗ Специальность: 06.01.04 – агрохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Надежда Владимировна Верховцева Москва – 20 Содержание Стр. Введение... Глава 1. Особенности формирования...»

«Колосовская Юлия Евгеньевна ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ ПЛАНТАЦИЙ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕМЕННОГО И ВЕГЕТАТИВНОГО ПОТОМСТВА (ЮГ КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ) 06.03.01 – Лесные культуры, селекция, семеноводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.