WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

«ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ ...»

-- [ Страница 1 ] --

1

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»

(ФГБОУ ВПО КемТИПП)

На правах рукописи

Бабич Ольга Олеговна

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ

РЕАЛИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ

МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ

05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора технических наук

Научный консультант:

Лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники, доктор технических наук, профессор Просеков Александр Юрьевич Кемерово

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР..………………………………...…. 1.1 Особенности строения и свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы……… 1.2 Научные и практические аспекты получения L-фенилаланин-аммонийлиазы………………………………………………………………………………. 1.3 Прикладное использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы……………... 1.4 Обоснование основных направлений исследований, их цель и задачи…… ГЛАВА 2 МЕТОДОЛОГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ..……. 2.1 Организация выполнения работы

2.2 Объекты исследований

2.3 Используемое оборудование………………………………………………. 2.4 Методы проведения исследований

ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ

НАПРАВЛЕННЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ…...

3.1 Выбор ферментов для проведения направленного гидролиза белков молочной сыворотки……………………………………………………. 3.2 Изучение технологических режимов и условий проведения направленного ферментативного гидролиза белков молочной сыворотки….. 3.3 Изучение функциональных свойств направленных гидролизатов белков молочной сыворотки……………………………………………………... 3.4 Заключение по третьей главе…………………………………………………

ГЛАВА 4 СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИГМЕНТНЫХ




ДРОЖЖЕЙ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙЛИАЗУ И ИХ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ………………………………………………………… 4.1 Разработка ПЦР-системы для идентификации гена pal пигментных дрожжей.…………………………………………………………………………. 4.2 Анализ нуклеотидного состава гена pal у выбранных штаммов дрожжей 4.3 Изучение фенотипических особенностей и биохимических свойств выбранных культур для выбора дальнейших объектов исследований……….. 4.4 Выбор штамма суперпродуцента L-фенилаланин-аммоний-лиазы........... 4.5 Заключение по четвертой главе

ГЛАВА 5 МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГОПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ PAL …..………… 5.1 Подбор компонентов и оптимизация питательной среды для культивирования Aureobasidium pullulans 863…………………………………………….. 5.2 Исследование влияния параметров культивирования пигментных дрожжей на качественные показатели продукта биосинтеза……………...………… 5.3 Разработка технологии выделения и очистки PAL………

5.4 Заключение по пятой главе

ГЛАВА 6 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ

PAL НА НАНОЧАСТИЦЫ………………………………………………….. 6.1 Сравнительная характеристика химического состава и физических свойств частиц оксида железа Fe2O3 и Fe3O4…………………………………………………… 6.2 Оптимизация концентраций конденсирующих агентов, используемых при иммобилизации PAL на частицы Fe2O3, функционализированные тиофеновыми и сложноэфирными группами ……………………………………. 6.3 Изучение физико-химических свойств нативной и иммобилизованной PAL……………………………………………………………………………… Технологическая схема получения иммобилизованной PAL на наночастицы Fe3O4……………………………………………………………………………… 6.4 Заключение по шестой главе……………………………………..………..

ГЛАВА 7 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛИОФИЛИЗАЦИИ PAL……

7.1 Изучение теплофизических характеристик PAL…………………….…. 7.2 Исследование влияния процесса замораживания на активность PAL …… 7.3 Определение криоскопических температур PAL ….……………………… 7.4 Моделирование процессов кристаллизации влаги при замораживании ферментного препарата PAL…………………………..………………….……… 7.5 Изучение влияния режимных параметров лиофилизации на ее продолжи- тельность..………………………………………………………………..……… 7.6 Изучение кинетики процесса лиофильной сушки PAL…………..………. 7.7. Заключение по седьмой главе

ГЛАВА ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ

РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………………………… 8.1. Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией (патент РФ №2376893)………..……. 8.2 Способ выделения и очистки фермента…………………………………….. 8.3. Способ получения иммобилизованного фермента………………………. 8.4. Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах (патент РФ №2460790)…………………………………………... 8.5. Способ лиофилизации фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы 8.6. Ферментный препарат L-фенилаланин-аммоний лиаза (ТУ 9291-144Заключение по восьмой главе...............………………………………… ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ





СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение Б. Копии государственных контактов и соглашений на выполнение научно-исследовательских работ ……………………………………… Приложение В. Документы на ферментный препарат «Фенилаланин аммоний лиаза»…………………………………………………………………………. Приложение Г. Патенты на изобретения………………….…………………….. Приложение Д. Нормативная документация (ТУ, ТИ)………………………… Приложение Е. Экспертное заключение на технические условия «Ферментный препарат L-Фенилаланин-аммоний лиаза»……………………………….. Приложение Ж. Методики проведения исследовательских работ……………. Приложение К. Акт результатов испытаний оксида железа – носителя для иммобилизации ферментов………………………………………………………. Приложение Л. Акт апробации иммобилизованного препарата PAL……….. Приложение М. Акт внедрения результатов научно-исследовательской работы в производственный процесс…………………………………………… Приложение Н. Акт внедрения НИР в образовательный процесс……………. Приложение П. Акт внедрения результатов НИР в образовательный процесс Приложение Р. Свидетельство об аттестации методики измерений………….. Приложение С. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ…………………………………………………………………………. Приложение Т. Лицензионный договор………………………………………..

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Промышленное производство продуктов специализированного питания жизненно необходимо больным в критических и хронических состояниях, в т.ч. при нарушении функции пищеварения. Основу таких продуктов, как правило, составляют гидролизаты белков с различной глубиной гидролиза, зачастую являясь единственно возможным средством при терапевтическом воздействии, обеспечивающим полноценное развитие детей и жизнедеятельность взрослых с различной патологией.

К таким заболеваниям относится фенилкетонурия – наследственное нарушение аминокислотного обмена, вызванное нарушением перехода фенилаланина (незаменимой аминокислоты) в тирозин, и приводящее к задержке психического развития и тяжелым поражениям центральной нервной системы.

Количество фенилаланина в питании таких больных должно быть строго нормировано с учетом возраста больного, выполнения которого, как правило, добиваются потреблением специализированных продуктов. Одним из направлений получения таких продуктов является использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы (PAL) (КФ 4.3.1.5), которая катализирует реакцию обратимого дезаминирования Lфенилаланина до безопасных элементов: транс-коричной кислоты и аммиака.

PAL является ключевым продуктом метаболизма фенилпропаноидов в растениях и грибах, где вовлечена в биосинтез вторичных метаболитов (флавоноидов, фуранокумаринов, компонентов клеточный стенки) и существует в виде множественных изоформ, обнаружена в активной форме в водорослях, актиномицетах, 12 видах базидиомицетов, разрушающих древесину. Среди микроорганизмов, обладающих PAL-активностью, известны некоторые штаммы красных дрожжей Rhodotorula, Rhodosporidium и Sporobolomyces и два представителя актиномицетов – продуцентов митомицина.

Данный фермент находит применение как продукт самостоятельный в терапии и/или диагностике больных фенилкетонурии, так и вспомогательный в производстве продуктов питания специального назначения, а также в биотехнологическом производстве L-фенилаланина из транс-коричной кислоты, для подавления роста злокачественных клеток, стимулирования роста растений и т.д.

Все вышесказанное подтверждает актуальность работы.

Степень разработанности. Существенный вклад в создание и освоение технологии получения специализированных продуктов питания внесли Г.Б. Гаврилов, Н.Б. Гаврилова, В.И. Ганина, Н.И. Дунченко, И.А. Евдокимов, В.Д.

Круглик, К.С. Ладодо, Л.А. Остроумов, А.Н. Петров, В.О. Попов, Г.Ю. Сажинов, В.А. Тутельян, В.Д. Харитонов, И.С. Хамагаева, А.Г. Храмцов; ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы - В.И. Муштаев, M. Jason Мас Donald, H.

Orum, O.F. Rasmussen и др.

Разработка новых и усовершенствование существующих технологий получения ферментного препарата требует нахождения новых, более интенсивных источников его сверхсинтеза, что невозможно без изучения генетических особенностей уже известных продуцентов. В базах данных генетических последовательностей (EMBL и GeneBank) расшифровано только 27 последовательностей генома микроорганизмов, обладающих PAL-активностью. Поэтому поиск микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью, на основе анализа генетических последовательностей их генома, разработка технологий получения и использования L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве молочных продуктов специального назначения является актуальным.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках:

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме: «Молекулярное клонирование и экспрессия гена pal, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетонурией», государственный контракт №П1701;

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка технологии получения продуктов питания для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена», государственный контракт №16.740.11.0239;

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка альтернативных подходов получения продуктов для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена с использованием методов биоинформатики и математического моделирования», соглашение №14.В37.21.0565;

и при финансовой поддержки - гранта Президента Российской Федерации МД-48.2009.4, договор №02.120.11.48-МД по теме «Биохимический и геномный анализ экспрессии гена pal с целью получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы в связи созданием продуктов питания для больных фенилкетонурией»;

- аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 года)», задание №2.1.2/3566 по теме «Разработка биотехнологии получения специфических ферментов, продуцируемых микроорганизмами» и при финансовой поддержке Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (г. Москва, договор №154/1 от 23.03.2012 г).

Цель и задачи исследования. Целью работы является развитие существующих и создание новых биотехнологий специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

Для ее выполнения решались следующие задачи:

разработать технологию получения направленных гидролизатов молочной сыворотки, предназначенных для использования при получении продуктов питания для больных фенилкетонурией;

сформировать стратегию скрининга пигментных дрожжей, отличающихся способностью к синтезу L-фенилаланин-аммоний-лиазы и изучить фенотипические особенности и биохимические свойства штаммов продуцентов Lфенилаланин-аммоний-лиазы;

разработать технологию получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществить выбор штамма ее суперпродуцента, подобрать компоненты и оптимизировать состав питательной среды для его культивирования, изучить влияние параметров процесса периодического культивирования выбранного штамма на выход L-фенилаланин-аммоний-лиазы и ее активность, разработать технологию выделения и очистки полученного фермента;

разработать технологию иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы и исследовать основные физико-химические, биохимические и каталитические свойства нативной и иммобилизованной L-фенилаланинаммоний-лиазы;

разработать технологию лиофилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы, обеспечивающую максимальное сохранение ее активности в процессе хранения;

использовать установленные закономерности для разработки технических документов и широкомасштабного внедрения результатов исследования в промышленности, в т. ч. путем трансферта технологий.

Научная новизна работы. Разработана технология получения целенаправленных гидролизатов молочной сыворотки, обеспечивающая максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи.

Проведен молекулярно-функциональный скрининг группы пигментных дрожжей, из которых выделено 19 новых продуцентов L-фенилаланин-аммонийлиазы (Aureobasidium pullulans, Bullera piricola, Candida glabrata, C.maltosa, Cystofilobasidium capitatum, Debaryomyces castellii, D.robertsiae, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula diobovatum, Rh. infirmominiatum, Rh. glutinis, Rh. lactosa, Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, S. kluyveri, Tilletiopsis washingtonensis, Torulopsis apicola, Tremella foliacea, Tr. mesenterica).

Установлена корреляция между генетической организацией штаммов микроорганизмов и их биосинтезом L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

На основе методов случайных процессов, дисперсионного анализа и полного факторного эксперимента исследованы закономерности периодического глубинного культивирования пигментных дрожжей и биосинтеза PAL, выделен высокоактивный продуцент PAL - штамм Aureobasidium pullulans, для него определен компонентный состав субстрата, теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены режимы ферментации PAL.

Разработаны методики организации биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносителях и лиофилизации PAL, позволяющие не только получить фермент, превосходящий по качеству существующие аналоги, но и гарантировать его сохранность на протяжении более чем 8 мес.

Разработана технология получения специализированных молочных продуктов с использованием PAL, предназначенных для питания больных фенилкетонурией.

Практическая значимость работы. На основе теоретических и экспериментальных исследований сформулированы требования к технологическим процессам, связанным с получением продуктов питания для больных фенилкетонурией: параметры и условия периодического культивирования Aureobasidium pullulans, биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносители, лиофилизации PAL, направленного гидролиза молочного сырья. Техническая новизна разработанных технологических решений подтверждена патентами РФ № 2376893 «Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией» № 2415943 «Биологически активный пептид, полученный из молочного белка», № 2425879 «Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ», № 2437935 «Способ производства мультиферментного препарата», № 2460790 «Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах».

Разработаны и утверждены технические условия и технологическая инструкция на производство L-фенилаланин-аммоний-лиазы (ТУ 9291-144-02068315и ТИ 9291-144-02068315-2011). Разработана и аттестована методика определения коричной кислоты и ее солей методом капиллярного электрофореза в алкогольных и газированных безалкогольных напитках, гидролизатах молочных белков (свидетельство №01.00225/205-21-11). Результаты моделирования реализованы в алгоритме (свидетельство №2014611451 на регистрацию программы для ЭВМ, 03.02.2014).

Составлена техническая документация на производство белковых продуктов для больных фенилкетонурией фенилаланин-фри (ТУ 9745-145-04545745рецептуры питательных сред для культивирования пигментных дрожжей (№ 01.01264/212-21-11) и глубинного культивирования пигментных дрожжей (№ 01.00104/005-21-11); выделения и очистки PAL (№ 01.00106/006-21-11); иммобилизации PAL на наночастицы оксида железа (№ 01.00107/007-21-11); лиофилизации PAL (№ 01.00108/008-21-11); утверждены методики идентификации микроорганизмов, обладающих активностью (№01.00114/104-21-12).

Наработана партия фермента L-фенилаланин-аммиак-лиазы и проведены опытно-производственные испытания фермента in vivo. Установлена антипролиферативная активность L-фенилаланин-аммиак-лиазы, синтезированной штаммом Aureobasidium pullulans в экспериментах in vivo, что определяет ее как противоопухолевого агента.

Результаты исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» подготовки студентов и магистрантов, обучающихся по направлениям 240700 «Биотехнология» и 141200 «Холодильная, криогенная техника и системы жизнеобеспечения», а так же при организации научно-исследовательской и практической работы аспирантов.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы представлены на симпозиумах, конгрессах, конференциях, семинарах и совещаниях различного уровня за рубежом (Армения, Германия, Канада, США) и в России (Барнаул, Бийск, Волгоград, Звенигород, Москва, Новосибирск, Омск, Санкт-Петербург, Ставрополь, Тамбов и др.).

Результаты диссертационной работы прошли апробацию на предприятиях биотехнологической и пищевой промышленности: ООО «Биотек», в Институт молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (НАН РА), ЗАО «Хладотехника», ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», VTA Austria LTD (Австрия) и внедрены в производство на ClusterNanoTech LTD (Англия) путем трансферта технологий в рамках лицензионного договора №4/13 от 20.12.2013 г.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в более печатных работах, в том числе двух монографиях, 27 статьях в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных материалов диссертационных исследований: «Journal of Analytical Chemistry», «Biotechnology and Applied Biochemistry», «Биомедицинская химия», «Нанотехнологии и наноматериалы», «Известия высших учебных заведений: Серия Химия и химические технологии», «Биотехнология», «Фундаментальные исследования», «Журнал аналитической химии», «Технология живых систем», «Известия Самарского научного центра Российской академии наук», «Вестник ВСГТУ», «Техника и технология пищевых производств», «Достижения науки и техники АПК», «Молочная промышленность», «Хранение и переработка сельхозсырья», а также пяти патентах РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения направленных гидролизатов молочной сыворотки.

2. Стратегия молекулярно-функционального поиска микроорганизмов продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы; последовательности генов, ответственных за синтез L-фенилаланин-аммоний-лиазы, фенотипические особенности и биохимические свойства изучаемых культур.

3. Факторы, повышающие PAL-активность биотехнологических процессов.

4. Технология получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

5. Технология применения L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве продуктов питания для больных фенилкетонурией.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав, результатов и выводов, списка использованных литературных источников (524 наименований) и приложений. Основной текст изложен на 309 страницах, содержит 83 таблицы, 98 рисунков.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

В аналитическом обзоре рассмотрены особенности строения и свойств Lфенилаланин-аммоний-лиазы, проанализированы научные и практические аспекты ее получения, изучено прикладное использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

1.1. Особенности строения и свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы L-фенилаланин-аммоний-лиаза (PAL, КФ 4.3.1.5) относится к семейству лиаз, катализирующих реакции неокислительного деаминирования L-фенилаланина с образованием транс-коричной кислоты и свободного иона аммония:

Неокислительное дезаменирование L-фенилаланина было открыто Кукол и Конном в 1961 году [171].

L-фенилаланин-аммоний-лиаза широко распространена у высших растений, где она участвует в синтезе фенолов и лигнина. Схема метаболизма фенилаланина в растениях представлена на рисунке 1.1.1. В результате из Lфенилаланина образуется транс-коричная кислота, которая на следующей стадии подвергается пара-гидроксилированию с образованием из нее nгидроксикоричной (n-кумаровой) кислоты.

Пара-кумаровая кислота является первым и с биогенетической точки зрения простейшим фенольным соединением растений, которое служит родоначальником большинства других растительных фенолов. Она активизируется в КоАлигазной реакции, а затем в виде активного КоА-эфира может вступать в реакции с различными другими метаболитами клетки или же подвергаться иным формам преобразований.

Рисунок 1.1.1 – Схема метаболизма фенилаланина в растениях В результате таких превращений в растениях в виде уже конечных продуктов образуются представители разных классов полифенольных соединений. При окислительном укорачивании боковой цепи n-кумаровой кислоты образуются ацетофеноны, фенилуксусные, фенолкарбоновые кислоты. Восстановление ее боковой цепи вместе с последующей димеризацией или полимеризацией восстановленного продукта ведет к образованию лигнинов и полимерных фенолов типа лигнина. После введения дополнительной гидроксигруппы в орто-положении к боковой цепи происходит спонтанная циклизации последней с образованием кумаринов. Когда же n-кумаровая кислота подвергается этерификации или связывается с разными полимерными веществами клетки, то из нее образуются различные конъюгированные формы гидроксикоричных кислот и их производных.

PAL-активность найдена в водорослях [460], в актиномицетах [463] и в видах базидиомицетов, разрушающих древесину [386]. Среди микроорганизмов, обладающих PAL-активностью находятся некоторые штаммы красных дрожжей Rhodotorula, Rhodosporidium и Sporobolomyces [321, 324, 336, 359361, 385, 424, 446, 449, 458, 468, 519] и у двух представителей актиномицетов – продуцентов митомицина [305, 441].

У бактерий PAL не обнаружена. PAL широко распространена в природных источниках (бобы, петрушка и сладкий картофель) [310, 343, 358, 366, 383, 386, 414, 462, 463]. У растений наиболее высокий уровень PAL обнаружен у папоротника Pteridium aguilinum. В большинстве растений PAL кодируется участком из 35 генов. Исключение составляет последовательность PAL картофеля, состоящая из 4050 генов [267]. В большинстве случаев размер генов находится в диапазоне от 2,1 до 2,4 кДа. Присутствие интронов характерно для растений и дрожжей. Геном PAL растений содержит обычно только один интрон, в то время как геном PAL дрожжей – пять или шесть интронов [283].

В большинстве случаев молекула PAL имеет молекулярную массу в диапазоне от 300 до 340 кДа [303]. По данным разных исследователей, имеются исключения из этого правила: молекулы с молекулярной массой 152 кДа, 226 кДа, кДа, 226 кДа, 560 кДа.

Конформации PAL, выделенной из различных источников, более или менее асферичны [315, 338]. Обычно L-фенилаланин-аммоний-лиаза – это гомотетраметрический белок, состоящий из четырех одинаковых субъединиц. Гетеротетраметрический PAL – это комплекс, состоящий из двух разных димеров. Большинство молекул PAL представляют собой гидрофобные белки. Это свойство позволяет использовать гидрофобные хроматографические колонки для очистки фермента [126, 303].

Первая трехмерная структура L-фенилаланин-аммоний-лиазы была определена с разрешением 2.1 А для PAL, полученной от Rhodosporidium toruloides. На рисунке 1.1.2 представлена пространственная структура L-фенилаланин-аммонийлиазы, выделенной из дрожжей рода Rhodosporidium toruloides [149, 322].

Рисунок 1.1.2 – Пространственная структура L-фенилаланин-аммоний-лиазы L-фенилаланин-аммоний-лиаза состоит из 716 аминокислотных остатков.

Аминокислотная последовательность L-фенилаланин-аммоний-лиазы, выделенной из дрожжей рода Rhodosporidium toruloides, представлена на рисунке 1.1.3 [402].

PAL-препараты из большинства источников имеют только одну константу Михаэлиса-Ментен, но в этом случае фермент имеет низкое сродство по отношению к субстрату.

Действие препаратов фермента, полученных из различных источников, значительно отличается по кинетике реакции. Константа Михаэлиса-Ментен для PAL, выделенной из стебля ячменя, равна 1,7±0,3 10-3 М [5, 49, 50, 392]. Значение этого показателя для высокоочищенной PAL из клубней картофеля возрастает от 3,8 10-5 до 2,6 10-4 моль по мере возрастания концентрации L-фенилаланина. В присутствии Dфенилаланина – конкурентного ингибитора PAL отклонений от классической кинетики Михаэлиса-Ментен не наблюдается.

Рисунок 1.1.3 – Аминокислотная последовательность L-фенилаланин-аммонийлиазы, выделенной из дрожжей рода Rhodosporidium toruloides В большинстве случаев PAL не требует ионов металлов, хотя имеются данные о слабом влиянии ионов Mg2+ и Ba2+ на активность PAL. Подавление активности PAL может быть вызвано широким кругом соединений, таких как карбонильные, сульфгидрильные или тиоловые реагенты, феноловые кислоты или ионы тяжелых металлов. В большинстве случаев PAL чувствительна к синтетическим ингибиторам, таким как (S)-2-аминоокси-3-фенилапропановая кислота, (R)-(1-аминофенилэтил) фосфоновая кислота и 2-аминоиндан-2-фосфоновая кислота; такие ингибиторы часто используются для блокирования биосинтеза фенолпропаноидных компонентов в растительных клетках и тканях [28, 51, 236, 261, 357].

Оптимум рН для PAL обычно находится в диапазоне от 8,2 до 9,0. Температурный оптимум составляет 35С для табака, 55С для подсолнечника и 44-46С для Rhizoctonia. PAL, выделенные из растений, обычно чувствительны к повторному замораживанию и размораживанию и теряют активность при температуре выше 60С. Напротив, грибковые PAL более термически устойчивы. PAL из Rhodotorula устойчива в течение шести месяцев при температуре -60С [39, 63, 119, 427].

Изучение специфичности PAL показало, что препараты фермента, приготовленные из различных организмов, дезаминируют не только L-фенилаланин, но и его производные. Мета-замещенные соединения L-фенилаланина вступают в реакции, они дезаминируются лучше, чем пара-замещенные. Орто-замещенные соединения L-фенилаланина не являются субстратом для PAL [64, 123, 180, 251].

D-фенилаланин не дезаминируется препаратами PAL, выделенными из большинства исследуемых организмов: побеги пшеницы, Rhizoctonia solani, Streptomyceg verticillatus, Rhodotorula glutinis [161]. Однако препараты фермента из клубней картофеля используют D-фенилаланин при высокой концентрации субстрата. При этом Vmax реакции будет значительно ниже скорости дезаминирования L-изомера [340].

Ферментные препараты из многих источников, кроме папоротника Pteridium aguilinum, Streptomyces verticillatus, Uatilago hordei, могут дезаминировать L-тирозин. Дезаминирование D-тирозина препаратами PAL не осуществляется [387]. Свежеполученные препараты фермента из стеблей ячменя катализировали дезаминирование D-тирозина и DL-м-тирозина [161]. При хранении препарата эти активности полностью исчезали, хотя активность PAL сохранялась на 75%, Следует отметить, что до сих пор попытки получить препарат, активный для Lтирозина, но не дезаминирующий L-фенилаланин, были безуспешны.

PAL не дезаминирует L- и DL-аспарагиновую кислоту, L-аланин, Lгистидин, L-глицин, L-цистеин, L-триптофан, DL-лейцин, 3-нитро-L-тирозин, памино- DL-фенилаланин, п-нитро-DL-фенилаланин, производные фенилсерина [161, 340, 387].

Устойчивость препаратов PAL из стебля ячменя зависит от возраста растительного материала, используемого для их приготовления. Ацетоновые порошки, приготовленные из стеблей ячменя до колошения, при хранении в течение трех месяцев при 6°С обнаруживали 100% PAL-активности. Ацетоновые порошки из стебля, несущего колос, теряли полностью PAL-активность при хранении менее трех месяцев [161].

Устойчивость PAL зависит от значений рН буфера, в котором хранится препарат. При хранении PAL из картофеля в буферах со значениями рН от 5,5 до 7, при 0°С в течение нескольких дней теряется 20% активности фермента. Если значение рН буфера ниже 5,5, за несколько часов теряется 50% PAL-активности [340].

Нагревание фермента, выделенного из Streptomyces verticillatus в течение 15 минут при 70°С и значении рН 7,6, не влияет на PAL-активность. Полная инактивация фермента обнаружена при 80°С [161]. У PAL из Rhodotorula glutinis полная потеря активности фермента наблюдалась при 70°С в течение 5 минут (рН 8,5). PAL из Rhodotorula glutinis более термолабильна, чем фермент из Rhodotorula texensis [387]. При тепловой обработке PAL из картофеля при 55°С и значении рН 8,7 в течение 5 минут сохраняется 90% активности фермента. Понижение значения рН до 5,5 приводит к потере 50% PAL-активности [340].

Способность препаратов к дезаминированию L-тирозина теряется при нагревании быстрее, чем способность к дезаминированию L-фенилаланина. При тепловом воздействии, которое полностью ликвидирует активность относительно L-тирозина, препараты сохраняют способность дезаминировать L-фенилаланин и его производные. Присутствие L-фенилаланина при нагревании защищает PAL от разрушения. L-тирозин гораздо слабее защищает L-тирозин-аммоний-лиазу (TAL) [161]. Авторы предполагают, что это может служить подтверждением существования двух ферментов: PAL и TAL. Причем, TAL более термолабильна, чем PAL.

Сульфгидрильные реагенты оказывают разное влияние на PAL, выделенную из различных источников. Пара-хлормеркурибензоат не влияет на PAL из картофеля и Ustilago hordei [337-340], слабо ингибирует фермент из Streptomyces verticillatus и Rhizoctonia solani. Даже при высоких концентрациях сульфгидрильных реагентов наблюдается незначительное ингибирование для PAL из этих организмов. Это позволило сделать заключение о том, что сульфгидрильная группа не входит в активный центр PAL, но важна в поддержании нужной конформации фермента [340].

Однако PAL из ячменя и Rhodotorula glutinis полностью ингибируется сульфгидрильными реагентами и восстанавливает свою активность при добавлении сульфгидрильных соединений. Это доказывает, что PAL этих организмов для проявления своей активности нуждается в сульфгидрильной группе [387].

Сильное подавление PAL-активности осуществляют карбонильные реагенты. Ингибирование фермента из разных организмов цианидом, боргидридом, семикарбазидом, гидрохлоридом доказывает, что карбонильная группа присутствует в активном центре PAL. Действие перечисленных ферментных ингибиторов, кроме боргидрида, устраняется при пропускании препаратов PAL через хроматографическую колонку. Торможение фермента боргцдридом натрия снималось Lфенилаланином и транс-коричной кислотой.

Защита от инактивации фермента с помощью этих двух соединений определяется их способностью связываться с ферментом. Однако D-фенилаланин является хорошим конкурентным ингибитором и способен соединяться с ферментом, но он не защищает PAL от инактивации боргидридом натрия. L-тирозин, который не является ни конкурентным ингибитором, ни субстратом для PAL, выделенной из картофельных клубней, не защищает фермент от инактивирующего действия боргидрида натрия [340].

Соли тяжелых металлов оказывают ингибирующее действие на PAL. Активность PAL из Streptomyces verticillatus подавляется катионами двухвалентных металлов, кроме Mg2+, на PAL из Rhodotorula glutinis и картофеля не действуют Mn2+ и Mg2+, очень сильные ингибиторы Cd2+ и Zn2+. Ни один из исследованных катионов тяжелых металлов не оказывает стимулирующего действия на PAL [387].

Для изучения механизма действия PAL ферментные препараты обрабатывали ингибиторами, несущими радиоактивную метку. Показано, что существует линейная зависимость между включением 3Н из NaB3H4 и 14С из Na14CN и инактивацией PAL этими веществами [407]. Это доказывает, что у фермента дрожжей и клубней картофеля в активном центре содержится электрофильный участок, который может включаться в образование промежуточных веществ.

Кислотный гидролиз вещества, полученного при обработке PALНаВ3Н4, приводит к образованию DL-аланина, в котором большая часть радиоактивного водорода находится в -положении, и способного к обмену трития. Это позволило предположить, что в активном центре PAL из картофельных клубней, дрожжей рода Rhodotorula и Sporobolomyces находится дегидроаланин [161]. Это предположение подтверждается опытами с Na14CN [343, 407]. Продуктами кислотного гцдролиза фермента, меченого -14С является D, L-аспартат. Метка локализована в четвертом углеродном атоме аспарагиновой кислоты. Это соединение могло образоваться при кислотном гидролизе -цианоаланина. PAL может быть защищена от действия цианида и боргидрида натрия коричной кислотой, DL-2оксифенилаланином, L--фенилуксусной кислотой [370].

Для PAL из Sporobolomyces pararoseus изучалась защита от инактивации цианидом с помощью двух конкурентных ингибиторов глицина и фенола [407].

Глицин, который напоминает алифатическую часть молекулы субстрата, защищает фермент от инактивации при действии цианида. В то время как фенол, имитирующий ароматическую часть субстратной молекулы, не обеспечивает защиты. Это указывает на то, что каталитически существенная часть дегидроаланиновой половины может физически маскироваться глицином и, следовательно, локализуется в алифатической части субстратной молекулы.

Изучено влияние некоторых аминокислот на активность фермента, выделенного из разных организмов [161]. Дезаминирование L-фенилаланина ингибируется аминокислотами более сильно, чем дезаминирование L-тирозина. Наиболее эффективными ингибиторами PAL-активности были D-фенилаланин, L и D-тирозин, 3оксифенилаланин и производные фенилсерина.

Оба изомера тирозина эффективны как ингибиторы PAL, в то время как ни один из изомеров фенилаланина не ингибирует дезаминирование тирозина. Степень ингибирования не коррелирует со способностью аминокислот выступать в роли субстрата для PAL.

Например, производные фенилсерина являются очень сильными ингибиторами, но не функционируют как субстраты. Наоборот, 4-фторфенилаланин дезаминируется препаратами PAL, но не является ингибитором ее активности.

Недавно обнаружено ингибиторное действие L--аминоокси-фенилпропионовой кислоты на активность PAL, выделенной из растений и Rhodotorula glutinis [475]. Данное соединение является аналогом L-фенилаланина и vivo показали, что это соединение является очень специфическим конкурентным ингибитором PAL, не действуя ни на рост растений, ни на содержание растворимого белка [400]. Клетки, обработанные L--аминоокси--фенилпропионовой кислотой, обнаруживают специфическую аккумуляцию L-фенилаланина, PAL, выделенная из всех исследуемых объектов, конкурентно ингибируется конечным продуктом реакции транс-коричной кислотой [407]. Авторы предполагают, что действие PAL регулируется по принципу обратной связи конечным продуктом реакции. Однако опыты по изучению действия транс-коричной кислоты на PAL в суспензиях культуры моркови Daucus carota L. in vivo и in vitro показали неспецифическое влияние этого соединения на PAL-активность [475]. Помимо ингибиторного действия, оказываемого на PAL, транс-коричная кислота влияет и на белковый метаболизм in vivo и in vitro. При использовании транс-коричной кислоты in vivo содержание свободных аминокислот увеличивается в два раза. Кроме того, при концентрации транс-коричной кислоты 10-3М обнаружено необратимое повреждение ФМ и гибель клеток. Эти данные подтверждают предположение о том, что влияние транс-коричной кислоты на PAL in vivo и in vitro не обусловлено основным конкурентным ингибированием фермента (Durat, 1963). Оставалось неясным, играет ли транс-коричная кислота важную роль в регуляции активности PAL.

D-фенилаланин, D-тирозин и такие аминокислоты, как D, L-аланин, Lаспарагиновая и L-глутаминовая кислоты, L-гистидин, L-лизин, DL-треонин, DLтриптофан не используются дрожжами Rhodotorula glutinis и Sporobolomyces pararoseus в качестве субстрата для PAL [387, 407].

Ферментные препараты PAL, выделенной из Rhodotorula glutinis и Rhodotorula texensls, при нагревании в течение 5 минут при 70-75°С (рН = 8,5) полностью инактивируются [387].

Соли тяжелых металлов и карбонильные реагенты ингибируют PALактивность у дрожжей так же, как у растений. Сульфгидрильные ингибиторы полностью подавляют активность PAL, выделенную из дрожжей [387, 407]. Это делает ее похожей на PAL ячменя и отличает от фермента из других организмов.

PAL-активность соединений. У Rhodotorula glutinis ингибирование PAL n-хлормеркурибензоатом полностью снимается при добавлении сульфгидрильных соединений, например, -меркаптоэтанол обращает ингибирование на 96%, глютатион на 90%. Это доказывает, что PAL дрожжей так же, как и ячменя, для проявления своей активности нуждается в сульфгидрильной группе [387]. Предполагают, что у Rhodotorula glutinis эта группа помогает осуществить извлечение протонов из молекулы субстрата [407].

Sporobolomyces, ингибируется транс-коричной кислотой конкурентным образом [343, 407]. Конкурентными ингибиторами дрожжевой PAL являются также L-фенилацетат, глицин, аланин и L--аминоокси-Д-пропионовая кислота [407].

У PAL-дрожжей в активном центре находится дегидроаланин, как и у PAL из картофельных клубней [326, 343, 407]. Однако исследования с меченым нитрометаном СН3NO2 указывают на то, что существуют важные структурные различия в строении активного центра PAL у Rhodotorula glutinis и PAL растений [340]. Но их химическая природа до сих пор не выяснена.

Изучение действия протеиназ-трипсина и химотрипсина на PAL из Rhodotorula glutinis показывает, что фермент более чувствителен к химотрипсину [326]. Это предполагает наличие гидрофобного участка на поверхности PAL.

Авторы считают, что в этом месте образуется связь между ферментом и ароматическим кольцом L-фенилаланина.

Реакция, катализируемая PAL у Rhodotorula glutinis, может быть обращена в сторону образования L-фенилаланина. 70% транс-коричной кислоты было превращено в L-фенилаланин за 24 часа в реакционной смеси с высоким содержанием ионов аммония (7,0 М) и щелочным значением рН = 10,0.

Ряд работ посвящен изучению условий образования PAL у дрожжей. В интактных клетках дрожжей PAL-активность не обнаруживается. Только разрушение клеток или применение некоторых поверхностно-активных веществ позволяет выявить активность фермента [387].

PAL-активность найдена у дрожжей при культивировании их на натуральных и синтетических средах. Максимальное образование PAL у дрожжей разных родов и видов обнаружено в присутствии L-фенилаланина, L-тирозина, Lи DL-изолейцина [387, 445].

Активность PAL у Rhodotorula glutinis, вызванная добавлением Lфенилаланина, в десять раз превышает начальную активность фермента. У Rhodotorula texensis L-фенилаланин оказывает более слабое влияние на активность PAL. Авторы предполагают, что PAL Rhodotorula glutinis фермент адаптивный, образующийся при добавлении L-фенилаланина, а PAL Rhodotorula texensis конститутивный фермент, который проявляет свою активность в клетках, выращенных на среде без L-фенилаланина.

Некоторые штаммы Rhodotorula способны использовать L-фенилаланин в качестве единственного источника углерода и азота и при этом накапливают в среде транс-коричную кислоту [387]. Однако наблюдается несоответствие между ассимиляцией L-фенилаланина и проявлением PAL-активности. Некоторые штаммы Rhodotorula glutinie и Rhodotorula rubra хорошо используют Lфенилаланин для роста, но при этом не обнаруживают PAL-активности. А штаммы Rhodotorula texensis, высокоэффективные по PAL, не способны расти на среде, содержащей L-фенилаланин в качестве источника углерода и азота.

Максимальная PAL-активность проявляется в конце логарифмической фазы роста дрожжей [387, 407]. У культур, находящихся в стационарной фазе роста, PAL-активность заметно падает. Для дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенных на среде, содержащей 1,0% дрожжевого экстракта, 1,0% пептона, 0,05% L-фенилаланина, 0,5% NaCl (рН = 6,0), удалось увеличить время проявления максимальной PAL-активности добавлением L- или pL-изолейцина к среде культивирования [416].

Ряд работ посвящен изучению механизмов регуляции PAL-активности у дрожжей. При работе с Rhodotorula glutinis установлено, что L-фенилаланин индуцирует PAL-активность только тогда, когда он является единственным источником или углерода, или азота [380]. Добавление к среде фруктозы или сернокислого аммония предотвращает индукцию PAL. Авторы предполагают, что существует два вида PAL, один из которых индуцируется в ответ на дефицит азота, другой на дефицит углерода. Однако при работе с другими штаммами индукция PAL с помощью L-фенилаланина не снимается при Rh.glutinis добавлении глюкозы (как источника углерода) и глутаминовой кислоты (как источника азота). Эти разногласия авторы объясняют или существованием штаммовых различий, или разнообразием метаболических путей утилизации таких разных источников углерода, как фруктоза и глюкоза, и таких источников азота, как сернокислый аммоний и глутаминовая кислота.

Для дрожжей Rhodosporidium toruloides показано, что глюкоза и аммоний репрессируют их PAL-активность в присутствии 1 г фенилаланина [325].

Механизмы действия этих соединений различны. Глюкоза в отличие от аммония не действует ни на размеры пула L-фенилаланина, ни на скорость включения этой аминокислоты в белок, следовательно, она оказывает влияние непосредственно на синтез фермента. Аммоний вызывает уменьшение в количестве L-фенилаланина, и, таким образом, устраняет индуктор PAL, что приводит к снижению активности фермента [324, 325]. Для дрожжей Neurospora crassa установлено, что индукция PAL вызывается L-фенилаланином только в среде с ограниченным содержанием азота. Лимитирование среды по углероду в присутствии L-фенилаланина не приводит к индукции PAL. Были получены мутанты Neurospora crassa по nit- гену, не проявлящие PAL-активность в присутствии инцуктора при дефиците азота. Авторы предполагают, что nit-2 регуляторный ген играет основную роль в контроле PAL-активности.

В последнее время исследуется механизм, с помощью которого Lфенилаланин действует на PAL-активность у дрожжей. Изучение влияния ингибиторов белкового синтеза на индукцию PAL в дрожжах Rhodotorula glutinis и Neurospora crassa позволяет предположить, что PAL синтезируется de novo в ответ на L-фенилаланин. Добавление циклогексимида препятствует увеличению PAL-активности в присутствии L-фенилаланина, указывая, что для индукции фермента необходим синтез белка [449].

1.2. Научные и практические аспекты получения В отечественных и зарубежных литературных источниках имеются многочисленные данные о достижениях в области молекулярного клонирования и экспрессии гена pal [182, 174, 197]. Из многочисленных источников известно, что увеличение активности PAL, вызванное двумя факторами, может происходить в результате двух процессов: 1 увеличения скорости синтеза полипептидных цепей фермента; 2 – активации существующего, но каталитически неактивного фермента [161, 213, 214, 215].

Есть много примеров регулирования активности PAL на белковом уровне.

Такое регулирование может включать увеличение синтеза PAL, превращение неактивных форм в активные, сокращение деградации активной PAL, увеличение числа оборотов фермента. Активность PAL может регулироваться на генетическом уровне. Экспрессия гена pal обычно активируется в растениях, зараженных вирусом табачной мозаики, бактериями или грибами [82, 106, 246].

Экспрессия pal в клетках растений варьируется в зависимости от типа клеток/тканей и стадии развития, коррелируя с накоплением специфических фенилпропаноидных соединений. Например, Rubery и Northcote [176, 430] сравнили извлекаемую активность PAL в различных тканях платанов (Acerpseudoplatanus) и определили, что ксилема с быстрой лигнифицирующей дифференциацией содержит более высокие уровни активности PAL, чем камбиальные или костные ткани, которые не подвержены быстрой лигнификации. Jahnen и Hahlbrock локализовали PAL в поперечных сечениях надземных частей рассады люцерны с использованием PAL-специфичной антисыворотки и иммуногистохимического метода [208, 262, 384]. В молодой рассаде PAL была связана со всеми тестируемыми тканями, но была особенно активна в эпидермальных и жировых эпителиальных клетках, где накапливаются флавоноиды и фуранокумарины, соответственно.

По сравнению с молодой рассадой, зрелая рассада петрушки, изученная в этом же исследовании, имела повсюду значительно более низкие уровни активности PAL, поэтому можно предположить, что с возрастом могут происходить изменения в уровне экспрессии генов. Такие изменения способны вызывать различия в требованиях для различных фенилпропаноидных соединений, таких как дифференциация и созревание клеток. Другой пример изменений в экспрессии PAL во время развития включает созревание земляники. Given в 1988 наблюдал, что покраснение земляники (вследствие накопления антоцианов) сопровождается повышением извлекаемой активности PAL.

В добавление к примерам экспрессии, связанным с развитием и пространственным расположением, флуктуации в уровнях PAL и других ферментах фенилпропаноидного пути метаболизма обычно наблюдаются в растениях в ответ на факторы окружающей среды, такие как микробиологическая атака, ультрафиолетовое излучение, повреждение генов [196, 217, 282, 308, 309, 312, 347, 383, 415]. Обработка суспензии растительных клеточных культур патогенами или растительными экстрактами, называемыми «элиситорами», часто вызывает метаболические изменения, что является откликом неповрежденного растения. Индуцированные изменения активности PAL часто рассматриваются в контексте защиты растений, поскольку энергия направляется на синтез антимикробных и защитных соединений и/или укрепление клеточных стенок [245, 335]. В качестве иллюстрации – быстрое повышение активности PAL близко коррелирует:

а) с образованием фитоалексинов, фазеолина и медикарпина в бобах и люцерне, соответственно, следующим за образованием спор и элиситоров из патогенов грибов Colletotrichum lindemuthianum [154, 271, 437];

б) с накоплением флавоноидов, УФ-защитников в клеточных культурах петрушки в ответ на ультрафиолетовое излучение [257, 334];

в) со смещением суберина и лигнина при повреждениях или в Phytophthora инфицированных клубнях картофеля [279, 333, 430].

Недавние исследования восприимчивости трансгенных табачных растений (перенос гена PAL2 бобов), в которых уровни активности PAL снижались ниже уровня дикого типа, обеспечили доказательство связи между индуцированной экспрессией PAL и системной устойчивостью против вируса табачной мозаики TMV [461]. Флуктуации активности PAL также были зафиксированы в других многочисленных случаях, включающих различные комбинации стимулирующих и биологических систем [338].

Частые случаи «индукции» фермента наблюдаются в различных исследуемых системах взаимодействия растений с окружающей средой. Они характеризуются повышением активности PAL в результате стимулирования или давления, сопровождаемого или последующим спадом, или выходом на плато активности PAL [376].

В случае табачных растений инокуляция с вирулентными патогенами грибов Cercospora nicotianae не приводит к индукции транскриптов PAL, как происходит в том случае, если растение инокулируется с авирулентным штаммом TMV [286, 306]. Хотя индукция PAL не способствует защите при взаимодействии с грибами, связанная с развитием экспрессия PAL (и, по-видимому, результирующее накопление различных защитных фенилпропаноидных соединений) способствует снижению развития заболевания. Было обнаружено, что прогрессирование болезни, вызванное инокуляцией с C. nicotianae, было более быстрым в трансгенных табачных растениях, проявляя сниженные уровни активности PAL, чем в растениях дикого типа [306, 423].

Регуляция PAL, связанная с этими переходными повышениями активности в индуцированных тканях или с пространственной экспрессией, до сих пор плохо изучена. Другой аспект экспрессии, который добавляет сложности к пониманию регуляторных процессов, это существование различных изоформ PAL. Сообщалось об экспрессии мультиплетных форм PAL во многих растениях, включая картофель [338], горчицу [266, 331] и люцерну [278]; проведены детальные исследования мультиплетных форм PAL, подвергающихся экспрессии в клеточных культурах французских бобов. Четыре формы этого фермента, имеющие близкие молекулярные массы, но различные изоэлектрические точки, разделялись хроматографически. Нативная PAL – это тетраметрический фермент, и подготовка смешанных изоформ, подвергнутых двумерному (2D) гель-электрофорезу, приводила к существованию 1011 различно заряженных субъединиц, близких по молекулярной массе. Изоформы PAL бобов также различаются по их сродству к Lфенилаланину. Обработка культур грибковым препаратом повысила уровни всех изоформ, но, что наиболее поразительно, наблюдался сдвиг в сторону преобладания двух изоформ с минимальной Km по отношению к L-фенилаланину. Предпочтительная индукция изоформы PAL с максимальным сродством к субстрату также наблюдалась в суспензии клеточной культуры люцерны после обработки грибковым препаратом [164, 223, 294, 401].

Наличие мультиплетных форм PAL может обеспечить дополнительный контроль сверх потока через фенилпропаноидный путь метаболизма. Например, в случае патогенов или повреждений, которые способны навредить фенилпропаноидному биосинтезу, направление L-фенилаланина во вторичный метаболизм можно максимизировать не только повышением уровней PAL, но и преимущественным синтезом форм, которые обладают наибольшим сродством к Lфенилаланину. Jorrin and Dixon (1990) наблюдали [401, 294], что дифференциальная индукция изоформ PAL в обработанных препаратами культурах люцерны коррелирует с повышенными количествами ряда фенольных соединений по сравнению с их содержанием в контрольных культурах. Однако качественных изменений в профиле образованных соединений не наблюдалось.

Appert с сотрудниками (1994) отмечали, что четыре различных к-ДНК, кодирующие PAL петрушки, при клонировании и экспрессии в бактериальной системе образуют функциональные PAL-ферменты, которые значительно не различаются по своим кинетическим свойствам. Они сделали вывод о том, что у этого растения существование семейства PAL-генов необходимо для функционирования других, нежели для образования изоферментов с различными кинетическими способностями, как предполагалось для других видов.

Другое объяснение физиологического значения изоформ PAL связано с тем наблюдением, что активность PAL может быть подавлена in vitro множеством фенилропаноидных метаболитов [329, 435, 473]. Boudet с сотрудниками (1971) сообщали, что две формы PAL из Quercus pedunculata остаются различными по их чувствительности к гидроксикоричной и бензойной кислотам. Поскольку растения часто накапливают различные фенилпропаноидные соединения в разных тканях, данная изоформа PAL может быть оптимизирована для активности в специальной клеточной среде (например, в такой, где меньше всего чувствительности к продукту, накапливаемому до высокой концентрации [222, 280]). Другие возможные роли, предполагаемые для изоформ, в основном, включают специализацию для функционирования в особом клеточном расположении и ассоциацию изоформ с определенными участками [31, 32, 260]. Функционирование изоформ PAL может, очевидно, варьироваться от одного растения к другому. В противоположность изоформам PAL из 0. pedunculata, две изоформы из люцерны не проявляют больших различий в их чувствительности ко множеству фенилпропаноидных соединений. Существование изоформ PAL вызывает вопрос о том, как регулируются популяции изоформ и как могут различаться контролирующие механизмы в видах только с одной формой PAL, таких как P. banksiana и P. taeda.

Уровни ферментативной активности обычно определяют по скоростям двух противоположных процессов – синтез фермента и его инактивация и/или деградация. Каждый из них охватывает множество стадий, которые являются потенциальными точками регуляции. Синтез фермента зависит от скорости транскрипции, транскрипционного процессинга и оборота, трансляции, обработки и/или активации фермента, когда это необходимо. Скорость ферментативной деградации может зависеть от таких факторов, как исходная стабильность фермента и протекание общих или специфических для фермента протеолитических процессов. Присутствие ингибирующих соединений, таких как аллостерические обращенные регуляторы или соединения, которые связываются необратимо, вызывая инактивацию фермента, могут также играть роль в модуляции ферментативной активности.

Очевидно, стадии, включающие синтез и деградацию, которые лимитируют скорость, определяют уровни активного фермента в любой данный момент. Например, если транскрипционная активация генов pal была основной точкой контроля, доступность транскриптов будет функционировать, как лимитирующий фактор синтеза ферментов. Следует ожидать, что изменение уровня транскриптов приведет к соответствующим изменениям в трансляционной активности транскрипта и в уровне заново синтезированного фермента.

Таким образом, существует множество процессов, с помощью которых можно регулировать ферментативную активность и точно ее регулировать, как необходимо исследователю. Природа регуляторной активности pal исследовалась на разных уровнях, от экспрессии генов до ферментативной деградации и возможного значения клеточного метаболического контроля. Обзоры Dixon (1983) и Jones (1984) дают информацию по ранним исследованиям регуляции PAL [21, 22, 36, 70, 160].

Индукция активности PAL, вызываемая стимулированием или давлением со стороны окружающей среды, обычно приписывается скорее синтезу ферментов de novo, чем активации прекурсора белка [277, 346, 368, 436]. Различные доказательства показали, что увеличение заново синтезированных PAL в покрытосеменных растениях происходит при увеличении транскрипции генов pal, подтверждая модель, согласно которой изменения в экспрессии гена pal играют главную роль в регуляции уровней активности PAL.

У семян подсолнечника, которые инкубируют в растворе сахарозы при постоянном освещении, вызывают цикл повышений и снижений активности PAL [318, 458]. При добавлении в раствор сахарозы актиномицина D, ингибитора синтеза РНК, активность PAL в первом пике индукции уменьшалась до 60% [349, 465]. Актиномицин D не влияет на уровни активности PAL в контрольных семенах, которые инкубировались в водном растворе в темноте, предотвращая неспецифическое влияние актиномицина D на ферментативную активность. Разрезанные клубни картофеля и сладкого картофеля проявляют заметное переходное увеличение активности PAL [388, 474].

Непосредственное применение раствора актиномицина D (100 г/мл) к дискам сладкого картофеля сразу после разрезания значительно снижает активность PAL [456]. Более того, Hyodo (1976) наблюдал [343, 419] полное подавление индукции PAL, если диски картофеля инкубировались на фильтровальной бумаге, смоченной раствором актиномицином D ( мг/мл). Наблюдаемое влияние актиномицина D на индукцию PAL предполагает, что для максимальной индукции PAL требуется транскрипционный процесс. Однако результаты, представленные выше, сами по себе не дают окончательного доказательства того, что транскрипция гена pal является частью индукционного процесса. Нет правила, согласно которому pal требует посттрансляционных изменений для активности и транскрипция гена, кодирующего фактор изменения, необходима для индукции.

Использовалось множество экспериментальных методов, чтобы определить, является ли транскрипция гена PAL ключевым процессом в регуляции активности PAL. Непрямые средства исследования транскрипционной активности специфического гена – радиомечение образованных in vivo ферментов. Интересующий фермент, синтезированный немедленно после импульсного радиомечения аминокислоты (обычно L-[35S]-метионин), и связанная радиоактивность обеспечивает индикацию уровней соответствующих транскриптов в момент мечения (здесь принимают, что рибосомы образуют транскрипты со скоростью, пропорциональной содержанию транскриптов). Этот метод использовали Betz с сотрудниками (1978) и Shroeder с сотрудниками (1979) для определения трансляционной активности мРНК PAL в суспензии клеточной культуры петрушки в различные моменты времени после УФ-облучения [76, 97, 272]. Быстрое переходное увеличение синтеза PAL наблюдалось в клетках после обработки, следовательно, можно предположить, что облучение вызывает существенные изменения в уровнях транскриптов PAL. Период полураспада PAL в индуцированных культурах петрушки приблизительно оценивали, определяя уровни меченных PAL в разные моменты времени после того, как объединение свободных радиомеченных аминокислот в клетках исчерпывалось. Скорость синтеза фермента и величину его периода полураспада затем использовали для математического моделирования изменений ферментативной активности, ожидаемой после облучения клеток. Теоретические, рассчитанные величины соответствовали результатам экспериментальных определений, свидетельствуя о том, что вызванные УФ-облучением изменения активности PAL являются следствием изменения уровней м-РНК PAL [340, 398, 465].

Подобная корреляция между кинетикой индукции фермента и увеличением активности м-РНК PAL наблюдалось в суспензии клеточной культуры французских бобов (Phaseolus vulgaris) [34, 79, 157, 293, 316]. Изменения активности мРНК PAL в обработанных культурах исследовали с использованием иммуноосаждения субъединиц PAL из транслированных in vitro полисомальных и полных РНК.

Наблюдались переходные увеличения активности м-РНК PAL, которые предшествовали индукции ферментативной активности PAL. Cramer с сотрудниками (1985) отметили, что уровни активности м-РНК PAL полисомальной фракции увеличивались в постоянной пропорциональности с активностями полной фракции [219, 221, 307, 342]. Можно предположить, что транскрипты PAL, существующие до обработки, не были «селективно приняты» от полной РНК с повышенной скоростью, но действительное количество транскриптов PAL увеличилось.

Нозерн-блоттинг и метод прерванной транскрипции до сих пор развивались и использовались для контроля изменений уровней транскриптов PAL.

Minami с сотрудниками (1989) использовали фрагмент гена PAL риса для определения относительных уровней м-РНК PAL из этиолированного (лишенного хлорофилла) риса, выставленного на свет для варьирования продолжительности. Транскрипты PAL детектировались в этиолированных растениях, но после облучения уровни значительно возрастали. Создавая библиотеку к-ДНК из обработанных клеток бобов, Edwards с сотрудниками (1985) клонировали и секвенировали кДНК, которая кодирует частичный ген pal бобов и его 3'-нетранслированную основную последовательность. к-ДНК использовалась для исследования нозернблоттингом полной и полисомальной РНК из обработанных клеток бобов, отобранных в разные моменты времени после обработки. Увеличения транскриптов PAL наблюдались после 30-минутной обработки. Максимум достигался через часа после обработки, после чего уровень транскриптов PAL быстро снижался.

Напротив, в необработанных контрольных клетках не наблюдалось индукции мРНК PAL. При добавлении 4-тиоуридина к обработанным клеткам и отбора клеток спустя один час обнаруживались значительные количества этого нуклеотида в м-РНК PAL, подтверждая транскрипцию PAL de novo во время индукции [220, 247, 248, 296, 328, 432, 433].

Lawton с сотрудниками (1987) расширили эти наблюдения, изучая скорости транскрипции PAL, используя транскрипцию in vitro в ядре, изолированном от обработанных клеток бобов, отобранных в различные моменты времени после обработки. В течение пяти минут после обработки наблюдались двух-трехкратные увеличения скоростей транскрипции гена pal. Максимальные скорости достигались приблизительно после 80-минутной обработки, что совпадало с фазой максимальной активности транслируемой и гибридизованной м-РНК PAL, наблюдаемой Cramer с сотрудниками (1985) и Edwards с сотрудниками (1985), соответственно.

Параллельные эксперименты показали, что активация гена pal – это главный фактор в регуляции повышения активности PAL во время индукции, которая совершается во множестве других покрытосеменных растений и была описана Dixon and Harrison (1990). Примеры, в общих чертах подтверждающие эту точку зрения, относятся к транскрипционному контролю в относительно кратковременных случаях, включая отклики на внешние воздействия. Как описывалось ранее, изменения активности PAL происходят не только во время индукции, но и на всех стадиях развития, приводя к экспрессии pal, специфичной для тканей. Gowri с сотрудниками (1991) сравнили уровни транскриптов pal в различных органах клеток люцерны на протяжении одной – девяти недель после прорастания с использованием нозернблоттинга с метками к-ДНК pal люцерны. Максимальные уровни транскриптов PAL были обнаружены в корнях, стеблях и черешках листьев – во всех лигнифицирующих тканях, низкие уровни были обнаружены в листьях и растущих частях.

Уровень транскриптов pal в корнях увеличивался с момента прорастания до возраста трех недель, затем выравнивался и постепенно снижался. Однако в листьях и черешках листьев уровни м-РНК pal были относительно постоянны свыше девяти недель. Subramanium с сотрудниками (1993) наблюдали при нозерн-блоттинге полной РНК из клеток тополя, что транскриптов РНК было значительно больше в молодых стеблях, листьях и зародышах, чем в зрелых стеблях, листьях и тканях коры.

Это отражает отличия в уровнях ферментов в соответствующих тканях. Чтобы более детально исследовать экспрессию pal в этих органах, осуществляли гибридизацию in situ антисмысловой частичной к-ДНК PAL тополя в поперечных сечениях тканей тополя [454]. Сильная гибридизация наблюдалась в клетках, накапливающих фенилпропаноиды, таких как лигнифицирующие сосудистые ткани, стебли и черешки листьев. Близкая корреляция между уровнями транскриптов pal и накоплением фенилпропаноидов в этих тканях в зависимости от возраста, дает основание предполагать, что транскрипция гена pal может вовлекаться в контроль уровней активности PAL как в различных тканях, так и в разные моменты времени.

Анализ промоторов гена pal – это потеря света в определенных последовательностях ДНК, на которые влияет пространственная, связанная с развитием и индуцированная экспрессия. В особенности применение промотора-репортера при исследовании экспрессии PAL внесло вклад в понимание регуляции pal на транскрипционном уровне.

Последовательность гена pal, которую удалось определить, была из клеток французских бобов [409]. Основываясь на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и саузенр-блоттинге с использованием различных геномных клонов pal бобов, впоследствии были идентифицированы три класса генов pal в бобах. Чтобы исследовать свойства промоторов гена pal и их возможные функции в модулировании транскрипции, участок гена pal 2 бобов и его 5'-верхняя последовательность соединялись в кодирующую область гена-репортера глюкоронидазы (GUS) [305, 391]. Транслируемая область объединяла 1170 пар оснований промотора, 98 пар оснований нетранслированной последовательности и 60 первых пар оснований кодирующей области pal 2 бобов. Данная конструкция использовалась для трансформации листовых дисков табака, затем оценивалась активность GUS в различных тканях генерированных растений, как измерение активности промотора pal. В общем, относительные соотношения извлекаемой активности GUS в листьях, стеблях и корнях трансгенного табака были аналогичны уровням транскриптов pal 2 бобов, обычно наблюдаемым в соответствующих органах бобов – т. е. относительно низкая экспрессия в листьях и высокая – в стеблях и корнях. Гистохимическое окрашивание in situ для определения активности GUS в черешках листьев, стеблях и корнях трансгенных организмов выявило корреляцию между высокими уровнями GUS и клетками, накапливающими фенилпропаноидные метаболиты. Например, активность GUS была высока в окрашенных, запасающих флавоноиды участках черешков листьев. Клетки ксилемы сосудистой системы стебля так же показали высокие уровни GUS, но флоэма, кора и эпидермальные ткани – нет. Bevan с сотрудниками (1989) использовали конструкции, подобные промотору pal 2 бобов для трансформации картофеля и табака. И снова распределение активности GUS в трансформированных растениях способно коррелировать с накоплением фенилпропаноидных продуктов.

Таким образом, промотор pal 2 бобов может контролировать пространственное распределение GUS, локализованной в областях, с которыми связана высокая активность PAL. Табачные трансгенные растения для конструкции бобов pal 2-GUS вырабатывали GUS в корнях и апикальных мерисистемах [305], но такого явления не наблюдалось в соответствующих тканях Arabidopsis, несущих последовательность pal GUS Arabidopsis [319]. Также сильная экспрессия GUS наблюдается в черешках листьев цветов и значительно ниже в чашелистиках табачных растений с областью GUS бобов pal 2-промотор, в то время как обратное верно для трансформаций Arabidopsis. Ohl с сотрудниками (1990) предположили, что цветочные различия могут усиливаться скорее в результате различий в системах сигнальной трансдукции в двух видах, чем в результате различий в самих промоторах, поскольку контраст – это тоже характеристика активности промоторов халкон-синтазы в подобных экспериментах по трансформации. Shufflebottom с сотрудниками (1993) сравнили активности промоторов pal 1 бобов в трех различных трансгенных продуктах: Arabidopsis, картофель и табак. В каждом из них имеется общий и специфичный наборы экспрессии, но одно наблюдение было постоянным. Активность промотора бобов всегда была связана с участками накопления фенилпропаноидных соединений хозяина. Очевидно, растения различаются типами фенилпропаноидных соединений, которые они накапливают, и распределением этих соединений. Экспрессия pal, вероятно, возрастает в зависимости от промотора, действующего не в одиночку, а в комбинации с другими факторами, специфичными для вида растения, ткани и стадии развития. В результате трансформация различных видов идентичными промоторами pal может привести к различиям в экспрессии.

В трансформациях табака, несущих конструкцию бобов pal 2-GUS, наблюдались заметные различия между клеточным слоем ксилемы и элементами смежной ксилемы – клетками на разных стадиях развития. Высокая активность GUS была связана только с клетками ксилемы, в то время как смещение лигнина (что было показано на основании УФ-флуоресценции) было зафиксировано только для отдельных элементов ксилемы [305]. Различия в уровнях GUS в зависимости от типа клеток выявляют транскрипционную активность, контролируемую промотором pal в клетках ксилемы, но и недостатком зрелых клеток, где, вероятно, велико смещение лигнина. Liang с сотрудниками (1989) предположили, что активация гена pal, вероятно, является первым шагом в процессе ксилогенеза.

Другой пример различной транскрипционной активности в зависимости от изменений в развитии наблюдали Ohlefa с сотрудниками (1990), используя ген gus под контролем промотора pal Arabidopsis. Активность GUS была, в основном, высока во всех тканях молодых трансформаций Arabidopsis, но с возрастом экспрессия сильно ограничивалась васкулатурой. Ohl с сотрудниками (1990) предположили, что изменения могут отражать первоначальную уязвимость молодой рассады по отношению к УФ-облучению и необходимы для фенилпропаноидных защитных средств от ультрафиолета. Может происходить переход, поскольку развитие васкулатуры приобретает наибольшую важность, а биосинтез лигнина становится основным способом использования фенольных соединений. На основании активностей промоторов PAL в табаке и трансформациях Arabidopsis можно предположить, что эти последовательности содержат элементы для контроля соответствующей экспрессии, связанной с развитием.

Индукция pal может происходить в ответ на различные изменения условий окружающей среды, т. е. оказывается, что промоторы pal обладают индукционными свойствами. При разрезании клубни картофеля, содержащие конструкцию pal 2gus бобов, окрашивают со стороны поврежденной поверхности, где, как известно, осаждается суберин [250]. Срезание стеблей трансгенного табака приводит к экспрессии gus не только в клетках ксилемы (как в неповрежденных растениях), но также в перваскулярной паренхиме и эпидермальных клетках. Этиолированные табачные растения, выставленные на спектр белого света, повышали активность GUS в васкулярных системах, а также образовывали GUS в эпидермальных и подэпидермальных слоях побегов [305]. Ohl с сотрудниками (1990) сравнили уровни эндогенной м-РНК PAL и транскриптов GUS в трансгенных организмах Arabidopsis с конструкцией промотор pal – gus Arabidopsis.

Как было показано в ряде наблюдений, табачные растения, трансформированные 35S-вирусом табачной мозаики (CaMV) и конструкцией промотор GUS, имели высокие уровни GUS во всех тканях, особенно флоэме, независимо от того, неповрежденные или поврежденные ткани использовались при исследовании [232, 305]. Ohl с сотрудниками (1990) также использовали последовательность промотор gus 35S-CAMV для трансформации Arabidopsis и наблюдали, что повреждение приводит к индукции эндогенных транскриптов pal, а изменений в транскриптах GUS не наблюдалось. Таким образом, высокоспецифичная пространственная и индуцированная экспрессия gus, наблюдаемая в трансгенных организмах, содержащих промоторы pal, вероятно, поддерживалась промотором pal.

Эксперименты с соединениями промотор-gus pal свидетельствуют о том, что промоторы pal способны контролировать и интегрировать сигналы для специфичной для тканей, связанной с развитием и вызванной внешним неблагоприятным воздействием экспрессии. Промоторы pal, секвенированные до настоящего времени, содержат c/s-действующие транскрипционные контролирующие элементы, которые сохранены в эукариотических генах. Элемент TATA, например, имеется в генных промоторах бобов, петрушки и риса [253, 409, 452]. Участки CAAT были идентифицированы в 5'-верхних областях генов pal как бобов, так и риса, а промотор pal риса также в избытке содержал сегмент GC. Чтобы определить, какие структурные особенности уникальны для промоторов pal и могут быть, таким образом, ответственны за координирование сложного процесса экспрессии, детально исследовались нуклеотидные последовательности.

In vivo применялась технология «диметилсульфатных отпечатков» [292, 337, 404] для очерчивания элементов промотора, которые участвуют во взаимодействии с белками. Эти белки, или frans-действующие ядерные транскрипционные факторы, распознают и связывают специфические последовательности ДНК, оказывая влияние на транскрипционную активность. Взаимодействие ДНК белок изменяет реакционную способность диметилсульфата в месте связывания.

Эти отличия или изменения, происходящие в метилированных участках внутри специфической области, обеспечивает отжиг, который позволяет идентифицировать место связывания. Lois с сотрудниками (1989) выделили области гена pal петрушки (Pcpal -1), которые включаются в белковые взаимодействия только после воздействия на клетки петрушки ультрафиолета или какого-либо вещества.

Они были обозначены, как «индуцированные отпечатки». Два из них («A» и «B») ответственны за оба воздействия, а третий («С») индуцировался только после обработки реагентом. Роль этих промоторных последовательностей PAL петрушки в транскрипционной регуляции подтвердилась тем наблюдением, что элементы, похожие на индуцированные отпечатки, проявляются в промоторах генов pal из других растений, включая французские бобы и Arabidopsis [319, 409, 468]. Также наблюдается гомология между промоторами генов, чьи продукты играют похожие роли и проявляют похожую экспрессию. PAL, 4-кумарат СоА-лигаза (4CL, EC 6.2.1.12) и халкон синтаза (CHS, EC 2.3.1.74) – это ферменты, принимающие участие в фенилпропаноидном и флавоноидном путях биосинтеза. PAL согласованно индуцируется CHS в суспензиях клеточных культур бобов [319, 409, 468] и 4CL and CHS в обработанных ультрафиолетом суспензиях клеточных культур петрушки. Гомологи обеих последовательностей «А» и «В», описанные выше для промоторов pal, были идентифицированы в промоторах генов, кодирующих также два других фермента. Последовательность «В» может быть обнаружена в промоторах CHS Arabidopsis и петрушки [380]. Обе последовательности «А» и «В» были идентифицированы в промоторах 4CL-1 и 4CL-2 петрушки [417, 436], а также в CHS-промоторах из Phaseolus vulgaris [362], Zea mays и Antirrhinum majus. На основании анализа баз данных, две последовательности «А» и «В» обычно обнаруживаются не вместе с особенно высокой частотой в растительных генах [253].

Это позволяет выдвинуть гипотезу о том, что комбинация двух промоторных последовательностей может представлять собой цис-элементы, которые способствуют особой экспрессии, например, отклик на вредное воздействие или стимул.

Последовательность из 10 п. н., совпадающая с 5'-последовательности гена pal петрушки, индуцируемым отпечатком «B», переходит в более 30 стрессиндуцированных генов и определена как «TCA»-мотив. Активность связывания этого белка с последовательностью TCA была выше в табачных растениях, обработанных салициловой кислотой (индуктор патогенезиса связанных белков в этом растении), чем в контрольных растениях, обработанных водой. Goldsbrough с сотрудниками (1993) предположили, что последовательность TCA может функционировать как c/s-действующий элемент, регулирующий экспрессию стрессиндуцированных генов также в других растениях.

В добавление к находке in vivo индуцированных отпечатков в промоторе ДНК клеток петрушки Lois ef с сотрудниками (1989) наблюдали присоединение белков к двум областям, которые не претерпевали изменений после обработки клеток ультрафиолетом или реагентом. Однако наблюдались различия в реакционной способности DMS в этих местах при сравнении отпечатков клонированного промотора Pcpal-1. Все это указывает на то, что эти места могут представлять собой точки для основного связывания транскрипционного фактора, хотя функция взаимодействия до сих пор неизвестна.

Другой подход, используемый для изучения промоторной организации, основан на получении недостающих звеньев в промоторе и последующей оценке влияния этих делеций на регуляторные свойства. Ohl с сотрудниками (1990) трансформировали Arabidopsis конструкцией промотор-gus, содержащей транскипционный стартовый участок pal Arabidopsis. Сравнение извлекаемой активности GUS трансформаций привело к области в промоторе, которая вносит вклад в количественную экспрессию. Leyva с сотрудниками (1992) также детектировали уровни промоторных последовательностей pal, влияющих на экспрессию, с использованием трансформаций табака, несущих участки промотора pal 2 бобов (связанных с геном gus). Обычное уменьшение экспрессии gus в табачных стеблях наблюдалось, как степень увеличения делеций в каждом участке гена.

Leyva с сотрудниками (1992) открыли некоторые элементы в промоторе гена pal 2 бобов, которые управляют аспектами пространственной экспрессии в сосудистых тканях. Сегменты полного промотора были трансляционно связаны с GUS, кодирующим область, и использованы для трансформации табака. В предыдущих исследованиях полный промотор управлял экспрессией gus в табачных стеблях, которые ограничены клетками ксилемы [285, 305]. Leyva с сотрудниками (1992) обнаружили, что удаление специфической области расширяет экспрессию gus во флоэме и сосудистых паренхимных тканях (PVP). Это демонстрирует существование отрицательного цис-элемента, способного подавлять экспрессию во флоэме и PVP. Другая особенность, наблюдаемая в некоторых трансформациях, это слабая экспрессия GUS в тканях ксилемы, что указывает на возможный положительный цис-элемент ксилемы. Анализ удаленной области показал, что она содержит последовательность, похожую на мотив «А» в гене ДНК петрушки, по предварительным данным, связанную со стресс-индуцированной экспрессией множества растительных генов [253]. Tаким образом, Leyva с сотрудниками (1992) предположили, что сегмент 135 – 119 не содержит дискретных или перекрывающихся цисэлементов, каждый из которых поставляет различные способы для сосудистой экспрессии (ксилема, флоэма, индукция), а содержит скорее единственный c/sдействующий элемент. Последний может функционировать как место связывания для транс-факторов, которые могут иметь комбинацию регуляторных особенностей, что позволяет увеличить очевидную функциональную сложность, связанную с относительно короткой последовательностью.

Определяя и характеризуя специфичные области промотора pal 2 бобов, вовлеченных в экспрессию в сосудистых тканях стеблей трансгенного табака, Leyva с сотрудниками (1992) продолжали устанавливать, имеют ли эти области идентичные функции в других органах. Оказалось, что контроль сосудистой экспрессии в корнях и черешках листьев управляется механизмами, подобными для листьев, несмотря на различия в распределении сосудов в этих органах. Leyva с сотрудниками (1992) исследовали, регулирует ли область, содержащая элементы, управляющие экспрессией, экспрессию, специфичную для других тканей. Было обнаружено, что c/s-действующие элементы, вовлеченные в пространственную экспрессию в черешках листьев, апикальных и центральных тканях (в стороне от сосудистых механизмов), могут действовать независимо от элементов, оказывающих влияние на распределение в сосудистых тканях.

Исследования различных промоторов pal обеспечивают основной базис для понимания сложных операций, вовлеченных в транскрипционную регуляцию.

Изученные промоторы pal, таким образом, имеют способность управлять связанной с экспрессией и стимулиндуцированной экспрессией pal так же, как влиять на специфическое распределение тканей в трансгенных системах. Эти способности были приписаны действию множества c/s-действующих элементов, некоторые из них высокоспецифичны среди подобных регулирующих генов. Наблюдалось взаимодействие различных c/s-действующих элементов, и некоторые из них проявляли мультиплетные функции, что предоставляет возможный механизм для интегрирования активности промоторов pal. Было обнаружено основное и индуцированное связывание предполагаемых транскрипционных факторов со специфичными промоторными последовательностями, которое, по-видимому, принимает участие в регулировании транскрипционной активности.

Роль транскрипционной регуляции исследовалась не только в отношении уровней активности PAL, но также в отношении динамики популяций изоформ PAL. Полиморфизм ферментов может увеличиваться по ряду причин:

1) мультигенные семейства;

2) различия в функционировании м-РНК;

3) пост-трансляционные модификации;

4) варианты в совокупности субъединиц или их комбинации.

Имеется доказательство существования семейства генов pal в ряде растений, где были идентифицированы изоформы PAL, и экспрессия этих генов может привести к вариантам субъединиц и тетрамеров и различиям в свойствах изоформ.

Раздельная экспрессия этих генов может быть средством контроля соотношения изоформ на транскрипционном уровне.

Bolwell с сотрудниками (1985) наблюдали, что во время мечения белков in vivo в клетках обработанных элиситорами бобов [ 35S]-метионин объединялся в различно зараженные субъединицы PAL в разных количествах (субъединицы PAL иммунно осаждались, подвергались 2D-гель-электрофорезу и анализировались флюорографически). Bolwell (1985) пришли к выводу о том, что разные типы субъединиц синтезировались с различной скоростью, приводя к тому, что количество метиониновых остатков и оборотные скорости для разных субъединиц были одинаковыми. Этот результат мог оказывать влияние на раздельную транскрипцию генов pal или разные скорости трансляции.

Cramer с сотрудниками (1989) сравнили экспрессию трех генов pal в бобах (pal 1, 2, 3), следующую за обработкой элиситором или за повреждением. Нуклеазный S1-анализ выявил, что два из этих генов индуцируются обоими воздействиями, тогда как третий ген индуцировался только повреждением. Liang с сотрудниками (1989) исследовали возможность раздельной экспрессии этих трех генов в различных органах бобов, а также влияние факторов окружающей среды. Получали ген-специфичные гибридизационные пробы, и RNase защитный анализ показал, что действительно существуют заметные различия в уровнях разных транскриптов pal в каждом случае. Транскрипты PAL1 детектировались во всех исследуемых органах (корни, ответвления, чашелистики, листья, гипокотиль и черешки листьев) и гипокотиле в ответ на все три воздействия (облучение, повреждение и грибковое поражение). PAL 2 экспрессировалась во всех тканях, кроме листьев, но только в ответ на облучение и повреждение. Распределение PAL 3 заметно отличалось от первых двух, поскольку ее транскрипты детектировались только в корнях, и индукции в ответ на облучение не наблюдалось. Оказалось, что пространственная и индуцированная экспрессия PAL 3 в бобах соответствует клеточному синтезу суберина. Liang с сотрудниками (1989) предположили, что, возможно, гены для специфичных изоформ чувствительны к воздействиям для синтеза специфичных макромолекул/продуктов, таких как суберин.

Liang с сотрудниками (1989) [306] показали, что in vitro трансляция м-РНК, выделенной из поврежденной, инфицированной или облученной ткани, приводит к различным дополнениям форм субъединиц, как можно ожидать в том случае, если раздельная транскрипция приводит к экспрессии различных изоформ. Двумерный гель-электрофорез транслированных продуктов показал, что в поврежденной или инфицированной ткани было два кислотных и несколько основных типов субъединиц. В облученных тканях наблюдались кислотные формы в добавление к субъединице интермедиата, но основных форм не было совсем. Эти результаты согласовывались с наблюдениями хроматографического фокусирования, которые показали, что две наиболее кислые изоформы нативной PAL (с наименьшим значением ) преобладали в гипокотиле бобов, выставленных на свет, в то время как при повреждении наблюдались все четыре формы [306, 420].

Liang с сотрудниками (1989) смогли установить связь между разными типами субъединиц и транскриптов, кодирующих их, путем ингибирования in vitro трансляции специфичных транскриптов с помощью ген-специфичной антисмысловой РНК. Оказалось, что большинство кислотных и основных субъединиц кодируются pal 2 и pal 3, соответственно. Таким образом, pal 1 и другие гены этого класса, вероятно, кодируют изоформы интермедиата. Эти обобщения согласуются с индуцированной экспрессией различных транскриптов и субъединиц PAL [306, 355, 364].

Функционирование c/s-действующих элементов в части генов pal, очевидно, является важным в определении характера экспрессии гена. Хотя постоянные последовательности были идентифицированы в различных промоторах pal, до сих пор часто наблюдаются значительные различия между некодируемыми областями (интрон, 3',5'-последовательность) [372, 409].

Shufflebottom с сотрудниками (1993) сравнили активности конструкций промотор-gus генов pal 2 и pal 3 в картофеле, табаке и Arabidopsis, чтобы ответить на вопрос, как структура промотора (и/или ведущей последовательности) может влиять на раздельную транскрипцию. Исследования образующихся трансгенных растений показали, что наблюдалось частичное совпадение активностей двух разных промоторов. Например, оба промотора были активны в участках ДНК, выделенных на кончиках корней, и в окрашенных областях черешков цветков в картофеле и табачных растениях. Однако также наблюдался специфический характер, где экспрессия была характерна исключительно для одного из промоторов. В тканях ксилемы всех трех видов был активен только промотор pal 2, а в корневом эндодермисе экспрессии подвергался только pal 3-gus. Также наблюдались пространственные различия в ответ на повреждение или обработку элиситорами в листьях. Применение фильтрата культуры Erwinia carotovora к поврежденным листьям или другим растениям индуцировало экспрессию как pal 2, так и pal 3gus. Однако pal 2-gus был активен в узком диапазоне клеток вокруг места инокуляции, в то время как pal 3-gus подвергался экспрессии в большом ареале, который, в конечном счете, распространялся на весь лист. Лишенная хлорофилла рассада табака, трансгенная по pal L2-gus, при выставлении на свет покрывалась пятнами gus в семядолях, однако параллельные опыты с промоторной конструкцией pal 3 не вызвали подобного индуцированного светом эффекта [446].

Пространственная и индуцированная экспрессия, управляемая двумя промоторами, сравнивалась с экспрессией соответствующих транскриптов pal в клетках бобов [306]. В результате выдвинуто предположение о том, что существуют заметные различия в путях двух промоторов, ответственных за сигналы для активации генной экспрессии, и/или в свойствах, приписанных соответствующим видам РНК нетранслируемыми ведущими последовательностями. Похожий способ, который сохраняет регуляторные элементы и предположительно увеличивает общую экспрессию, различные последовательности или различные наборы промоторных элементов, может быть ответственным за наблюдаемую раздельную активацию генов pal в бобах.

Другая система, в которой исследовалось сравнение экспрессии генов pal, это картофель (Joos and Hahlbrock, 1992). В отличие от промоторов pal бобов, верхние области двух представителей большого семейства генов pal картофеля проявляют значительную гомологию. Она включает область, окружающую предполагаемое место старта транскрипции, а также две области значительного подобия (более чем 55 п. н.), следующие за верхней. Два гена представляют два разных подмножества (12) семейства генов pal картофеля, классифицированных на основании рестрикционного эндонуклеазного анализа. Нозер-блотт-эксперименты с генспецифичными пробами показали, что два гена подвергаются похожей экспрессии в отношении их распределения внутри различных органов картофеля, а также временных рамок индукции при повреждении или инфицировании листьев несовместимым родом Phytophthora infestans. Эти результаты согласуются с моделью о том, что промоторы pal оказывают большое влияние на характер экспрессии, поскольку промоторы и характер экспрессии были подобны. Однако наблюдались значительные различия во временных рамках экспрессии двух генов в ответ на инфицирование листьев несовместимым родом P. infestans. Оказалось, что транскрипты pal накапливаются быстрее, и затем снижение их содержания происходит с большей скоростью, чем транскриптов pal 2. Tаким образом, Joos and Hahlbrock (1992) предположили, что включаются механизмы, отличающиеся от тех, которые связаны с различиями в проксимальных промоторных последовательностях. Например, анализировались c/s-элементы верхней области. Была предложена другая возможность, согласно которой подобные rans-действующие элементы взаимодействуют с двумя промоторными последовательностями разными способами, хотя четкого доказательства этого предположения представлено не было.

Чтобы эти первоначальные исследования функции промотора PAL были информативны, важно осознавать, что наблюдения селективной активации генов PAL относятся к ограниченному количеству покрытосеменных растений. Поэтому до сих пор невозможно сформулировать основные принципы, рассматривающие контроль раздельной экспрессии изоформ на транскрипционном уровне. Благодаря недостатку знаний в отношении регуляции pal на уровне генной экспрессии в голосеменных растениях, до сих пор невозможно сравнить механизмы транскрипционного контроля.

Большинство эукариотических м-РНК подвергаются посттранскрипционному поэтапному процессу перед транспортировкой из ядра в цитоплазму. Он включает 5'-терминальный переход (образование 7-метилгуанозина на 5'-конце транскрипта, который может существовать сотранскрипционно) и полиаденилирование (добавление остатка аденозина к 3'-концу транскрипта) [293, 461]. Затем присоединяются интроны (когда они присутствуют), превращая основной транскрипт в зрелую м-РНК [93, 283]. Оказывается, заново синтезированные транскрипты растительной PAL являются предметом каждой из таких пост- трансляционных модификаций.

Schroeder с сотрудниками (1979) показали, что in vitro трансляция м-РНК PAL из УФ-обработанных клеток петрушки может быть ингибирована 7метилгуанозином-5'-монофосфатом, который специфически ингибирует трансляцию «запечатанной» м-РНК. Присутствие поли(A)+-хвостов на м-РНК PAL становится очевидным из следующих наблюдений:



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 
Похожие работы:

«ВОЛОТКА ФЁДОР БОРИСОВИЧ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ РЫБНЫХ ФОРМОВАННЫХ ИЗДЕЛИЙ ИЗ РЫБ ПРИБРЕЖНОГО ЛОВА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПИВНОЙ ДРОБИНЫ Специальность 05.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств Диссертация на...»

«АПЁНЫШЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ МЯГКИХ КИСЛОТНОСЫЧУЖНЫХ СЫРНЫХ ПРОДУКТОВ С РАСТИТЕЛЬНЫМ ЖИРОМ Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических...»

«КОДАЦКИЙ Юрий Анатольевич ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПЕРЕРАБОТКИ СЕМЯН СОИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАЗВУКА Специальность: 05.18.01 – технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.