WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

Система интерферонов i типа и nk-клеток при часто рецидивирующем простом герпесе

-- [ Страница 1 ] --

1

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени И.М.СЕЧЕНОВА МИНИСТЕРСТВА

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

Карсонова Антонина Васильевна

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ

ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Караулов А.В.

кандидат медицинских наук Пащенков М.В.

Москва -

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирусологические и патогенетические аспекты простого герпеса............... 1.2 Механизмы ускользания ВПГ от противовирусного надзора

1.3 Система интерферонов I типа в противовирусной защите

1.4 NK-клетки

1.4.1 Характеристика NK-клеток

1.4.2 NK-клетки и ВПГ-инфекция

1.4.3 Современные методы исследования функциональной активности NK-клеток: оценка дегрануляции NK-клеток.

1.5 Современные подходы к терапии простого герпеса

1.5.1 Ациклические нуклеозиды

1.5.2 Вакцинотерапия

1.5.3 Иммуномодулирующая терапия

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Пациенты и доноры

2.2 Реактивы, расходные материалы и оборудование

2.2.1 Реактивы для культуральных работ

2.2.2 Моноклональные антитела

2.2.3 Флюоресцентные красители

2.2.4 Прочие реактивы для иммунофлюоресцентной окраски клеток............ 2.2.5 Реагенты для выделения РНК, обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени

2.2.6 Реагенты для гель-электрофореза

2.2.7 Расходные материалы

2.2.8 Оборудование

2.3 Забор крови и выделение мононуклеарных клеток




2.4 Культивирование клеток K562

2.5 Определение дегрануляции NK-клеток по экстернализации CD107a........... 2.6 Определение NK-активности МНК

2.7 Стимуляция МНК рекомбинантным ИФН–2b

2.8 Оценка уровней ИФН- в супернатантах стимулированных вирусом клеток методом иммуноферментного анализа (интерфероновый статус)

2.9 Выделение РНК

2.10 Спектрофотометрия

2.11 Гель-электрофорез

2.12 Обратная транскрипция

2.13 ПЦР в реальном времени

2.14 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Клиническая характеристика пациентов с ЧРПГ

3.2 Результаты оценки состояния системы «NK-клетка / ИФН I типа» у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров

3.2.1 Оценка влияния ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у здоровых доноров.

3.2.2 Оценка влияния ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с ЧРПГ

3.2.3 Оценка влияния ИФН- на цитотоксическую активность NK-клеток (NK-активность) у здоровых доноров и пациентов с ЧРПГ

3.2.4 Оценка особенностей синтеза ИФН- мононуклеарными клетками крови в ответ на вирусные индукторы у пациентов с различными вариантами ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-...... 3.2.5 Оценка экспрессии ИФН-индуцибельных генов с противовирусной функцией OAS1 и Mx1 у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров............... ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИE

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВБН – вирус болезни Ньюкасла 2. ВПГ – вирус простого герпеса 3. ВПГ-1 – вирус простого герпеса 1 типа 4. ВПГ-2 – вирус простого герпеса 2 типа 5. ГГ – генитальный герпес 8. ИФН- – интерферон-альфа 9. ИФН- – интерферон-бета 10. МАТ – моноклональные антитела 11. МНК – мононуклеарные клетки 12. МНС – главный комплекс гистосовместимости 13. мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота 14. ОТ – обратная транскрипция 15. ОФГ – орофациальный герпес 16. ПГ – простой герпес 17. ПКС – полная культуральная среда 18. ПЦР – полимеразная цепная реакция 19. РНК – рибонуклеиновая кислота 20. рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота 21. ТАР - белок транспортной системы презентации антиген 22. ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит 23. ЧРПГ – часто рецидивирующая форма простого герпеса 24. FITC – (fluorescein isothiocynate) флюоресцеина изотиоционат 25. gC – гликопротеин С 26. Ig – иммуноглобулин 27. JAK – (janus kinase) янус киназа 28. Mx1 – ген белка 1 устойчивости к миксовирусам 29. MxA – белок 1 устойчивости к миксовирусам 30. NK – естественные киллеры 31. OAS1 – олигоаденилатсинтетаза 32. PC5 – (phycoerythrin-cyanin 5) фикоэритрин-цианин 33. PC7 – (phycoerythrin-cyanin 7) фикоэритрин-цианин 34. STAT – сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 35. TCR – Т-клеточный рецептор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы Простой герпес (ПГ) вызывается вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1 и ВПГ-2) и является значимой медико-социальной проблемой.





Согласно клиническим рекомендациям стандартом фармакотерапии пациентов с рецидивирующими формами ПГ является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклеозидами. Однако монотерапия противовирусными препаратами зачастую не позволяет добиться контроля над инфекцией. Высокая частота рецидивов и вторичный иммунодефицит, развивающийся вследствие длительной персистенции вируса, определяют необходимость патогенетического лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа при часто рецидивирующих формах простого герпеса (ЧРПГ). На сегодняшний день в арсенале врача имеется широкий спектр препаратов иммуномодулирующей направленности, список которых постоянно пополняется. В последнее время в терапии ЧРПГ широко применяются препараты рекомбинантного интерферонаальфа (ИФН-) и индукторы ИФН- как с лечебной, так и с профилактической целью. Огромное количество публикаций посвящено применению препаратов данной группы в комплексной терапии ЧРПГ [9, 12, 19, 26, 31, 41, 44, 56, 57, 58, 64, 66, 68, 213]. Однако именно назначение иммуномодулирующей терапии является наиболее сложным вопросом в терапии ЧРПГ. Этому способствует иммунокорригирующей терапии, которая сегодня очень часто назначается эмпирически. Эмпирическое назначение провоцируется отсутствием иммунодиагностического комплекса, позволяющего оценивать вариабельность чувствительности пациента к этим препаратам в динамике клинического иммуномодуляторов, оценивать индивидуальный характер выраженности иммунокорригирующей терапии.

Ключевыми факторами естественной противовирусной резистентности являются интерфероны I типа (ИФН I типа), которые обладают как прямым противовирусным, так и иммуномодулирующим действием. ВПГ-1 и ВПГ- являются мощными индукторами выработки ИФН I типа, в частности ИФН-, мононуклеарными клетками (МНК) крови здоровых людей [240]. Основными предендритные клетки, которые распознают ВПГ с помощью рецептора TLR [188, 234]. При ЧРПГ имеется дефицит выработки ИФН I типа МНК крови [33, 34, 172, 227, 276]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжелыми инфекциями, вызванными ВПГ [103, 295].

Однако иммунологическая недостаточность у пациентов с ЧРПГ может быть вызвана не только недостаточностью интерфероногенеза, но и снижением ответа иммунокомпетентных клеток на эти цитокины. Так, известно, что некоторые белки ВПГ могут ингибировать ответ ряда клеточных линий на ИФНВ клетках, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к ИФН-/ в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на ИФН- [107]. Эффект связан, в частности, с нарушением активации Jak/STAT-сигнального пути.

репликации ВПГ, являются NK-клетки. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии герпесвирусной инфекции могут контролироваться исключительно интерферонами, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [282]. По данным ряда исследований, при ЧРПГ имеет место снижение цитотоксической активности и дегрануляции NK-клеток [34, 37].

NK-клетки способны к цитолизу вирус-инфицированных клеток без предшествующей активации. Однако ИФН I типа, продуцируемые в ответ на инфекцию, резко повышают цитотоксичность NK-клеток, являясь мощными активаторами NK-клеток [59].

Учитывая снижение функциональной активности NK-клеток у пациентов с ЧРПГ, способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа in vitro, часто наблюдаемую во врачебной практике клинико-лабораторную диссоциацию, когда тяжлое течение ПГ и высокая частота рецидивов сопровождаются высокими уровнями ИФН- в интерфероновом статусе, неэффективность интерферонотерапии у некоторых больных ЧРПГ, мы предположили, что при ЧРПГ возможно угнетение ответа клеток иммунной системы, в частности NKклеток, на ИФН I типа. Для оценки функциональной активности NK-клеток помимо стандартного метода - оценки NK-активности, использовали реакцию дегрануляции, функциональная значимость которой доказана предыдущими исследованиями [74, 36, 37, 38].

Способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа показана на модельных клеточных линиях (Vero, HeLa) in vitro, тогда как возможность сходных процессов у пациентов с ЧРПГ не исследована. На сегодняшний день становится очевидным, что при выборе вектора иммунокоррекции необходим персонализированный подход с учтом вариабельности «чувствительности»

целевого показателя иммунной системы пациента к потенциальному лечебному воздействию в динамике клинического процесса.

Цель работы: изучить влияние рекомбинантного ИФН- на функциональную активность NK-клеток и экспрессию интерферон-индуцибельных генов с противовирусной функцией в сопоставлении с способностью к синтезу эндогенного ИФН- при часто рецидивирующих формах ПГ.

Задачи исследования:

1) Изучить влияние рекомбинантного ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров 2) Изучить влияние рекомбинантного ИФН- на цитотоксическую активность NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров 3) Изучить экспрессию генов основных противовирусных белков OAS1 и Mx1, индуцибельных интерферонами I типа, у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров 4) Изучить особенности синтеза эндогенного ИФН- у пациентов с часто функциональной активности NK-клеток 5) Выявить возможные варианты иммунологических нарушений в системе интерферонов I типа и NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ Научная новизна рекомбинантным ИФН- на дегрануляцию NK-клеток и на цитотоксическую активность NK-клеток как у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ, так и у здоровых доноров.

Впервые использован комплексный подход к оценке системы интерферонов восприимчивости к рекомбинантному ИФН- мононуклеарных клеток в целом (на основании изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов) и NK-клеток в частности (по изменению функциональной активности), так и способности к вирус-индуцированному синтезу собственного ИФН- у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров.

Впервые предпринята попытка установления факта ингибирования ИФНсигналинга вирусом простого герпеса посредством оценки изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов не на модельных клеточных линиях, а на рецидивирующими формами ПГ и от здоровых доноров.

Впервые идентифицировано два возможных варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка».

Теоретическая и практическая значимость работы Разработан комплексный подход к оценке иммунологических нарушений в иммунодиагностического комплекса идентифицировано два варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка», что позволит применять индивидуальный, иммунодиагностически обоснованный подход к назначению иммунокорригирующей терапии, в особенности препаратами рекомбинантного ИФН- или индукторами ИФН. Установлено дозозависимое увеличение функциональной активности NK-клеток под влиянием ИФН-, что подтверждает целесообразность применения иммуномодуляторов группы рецидивирующих формах ПГ.

Апробация и публикация результатов диссертационного исследования, практическое внедрение полученных результатов

Работа выполнена на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России и является фрагментом комплексной темы: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» № госрегистрации 01.2. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при подготовке курсантов-слушателей на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России и используются в иммунодиагностической практике в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России.

Полученные результаты в полном объме опубликованы в 6 печатных работах, включая 3 оригинальные статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 11-13 марта 2013 года, Москва (устный доклад и публикация тезисов в материалах конгресса); на Объединенном иммунологическом Форуме 5-9 июля 2013 года в Нижнем Новгороде (устный доклад и публикация тезисов в материалах конгресса); на Конгрессе Европейской академии клинической иммунологии и аллергологии и всемирной организации аллергии (EAACI-WAO) 20-26 июня 2013года в Милане, Италия (стендовый доклад).

Апробация диссертационной работы состоялась 18 июля 2013 года на научно-практической конференции кафедры клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России.

Структура и объм диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Содержание работы иллюстрировано 14 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 71 отечественную и 226 зарубежных работ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирусологические и патогенетические аспекты простого герпеса Простой герпес (Herpes simplex) - вирусное заболевание, вызываемое двумя видами альфа-герпесвирусов - вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) и вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2).

Впервые вирусы простого герпеса были идентифицированы в 1912 году, когда W. Gruter выделил ВПГ из отделяемого герпетической везикулы. ВПГ очень чувствителен к этанолу и другим органическим растворителям, инактивируется ультрафиолетовым и рентгеновским излучением [6, 25], термолабилен и инактивируется при 56 °С в течение 30 минут, но устойчив к низким температурам и повторному замораживанию [6, 40]. В 1962 г. Schneweiss среди ВПГ выделил два серологических типа (ВПГ-1 и ВПГ-2). В настоящее время они принадлежат к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, в которое из патогенных для человека герпесвирусов входит также и VaricellaZoster (герпесвирус 3 типа) [155].

Вирион ВПГ состоит из четырх компонентов: 1) внешняя оболочка с гликозилированными и негликозилированными вирусными белками, липидами и полиаминами; 2) тегумент, представляющий собой аморфный слой белков между внещней оболочкой и капсидом; 3) икосаэдрический капсида, включающий капсомеров; 4) сердцевина с двойной переплетенной линейной ДНК [238].

Тегумент Ройзмана и Фарлонга содержит белки, вовлеченные в начальные фазы вирусной инфекции и репликации, такие как транспорт вирусной ДНК из капсида вируса, раннее подавление синтеза клеточных белков и инициирование транскрипции вирусных генов [199]. Липидный бислой внешней оболочки пронизывают 11 гликопротеинов: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gL, gM, gJ, gN, хотя наличие двух последних убедительно не показано [238]. Гликопротеин gD является наиболее антигеннозначимым белком и вызывает выработку вируснейтрализующих антител. Гликопротеин gC играет роль рецептора СЗкомпонента комплемента, подавляя активацию системы комплемента и лизис инфицированной клетки. Гликопротеин gE способен связывать Fc-фрагмент IgG, препятствуя антител-зависимой противовирусной защите [83].

Геном ВПГ представлен двухспиральной ДНК и включает длинную (L) и короткую (S) часть, которые ковалентно связаны между собой и содержат открытые рамки считывания, 84 из которых кодируют полипептиды [199, 238].

Геном ВПГ-1 и ВПГ-2 составляет 152 тпн и 155 тпн соответственно, при этом гомология в ДНК составляет около 83% в кодирующих белки регионах [260].

Вирусные гены экспрессируются по группам, классифицированным как непосредственно ранние альфа-гены (immediate early - IE, ), ранние бета-гены (early -E,) и поздние гамма-гены (late ), каждый с определенной группой промоторов, регулирующих последовательную экспрессию [238]. Продукты генов - индукторы транскрипции, продукты -генов - вирусные ферменты, такие как тимидинкиназа и вирусная ДНК-полимераза, и продукты - генов структурные вирусные белки. Большая часть ферментов, необходимых для репликации вирусной ДНК, кодируется в геноме ВПГ, что принципиально для репликации ВПГ в нейронах [55].

Инфицирование вирусом простого герпеса начинается с прикрепления вирусной частицы посредством гликопротеинов gB и gC к клеточным рецепторам, роль которых выполняют гликозамингликаны. Процесс прикрепления является обратимым, и служит для удержания вирусных частиц в непосредственной близости к клетке и локализации инфекции на определенном участке [199, 238]. В следующем этапе проникновения ключевая роль принадлежит гликопротеину gD, который связывается с 3 типами рецепторов: 1) герпесвирусный медиатор прониконовения HVEM, (позже названный как HveA герпесвирусный белок проникновения A); 2) нектины: HveC - герпесвирусный белок проникновения С (нектин-1) и HveB - герпесвирусный белок проникновения B (нектин-2); 3) геперансульфатные цепи, модифицированные 3О-сульфотрансферазами [199, 238]. После связывания с одним из этих рецепторов конформационные изменения в гликопротеине gD приводят к взаимодействию с gB или gH-gL димером, что приводит к слиянию мембран. После слияния нуклеокапсид ВПГ транспортируется по микроканальцам к ядерной мембранной поре, где вирусная ДНК проникает в ядро. Как продукты вирусной оболочки, так и клеточные киназы ответственны за инициирование транскрипции -гена [260].

В инфицированной клетке образуется большое количество вирусных структурных белков, капсидные белки проникают в клеточное ядро, где ассоциируются с вновь синтезированной вирусной ДНК. Нуклеокапсиды соединяются с модифицированными участками ядерной мембраны, и вирусные частицы отпочковываются в околоядерное пространство, затем они транспортируются в аппарат Гольджи и оттуда выносятся на поверхность плазматической мембраны.

Таким образом, вирусное потомство приобретает иную оболочку, чем внутренняя ядерная мембрана, что доказано анализом мембранных липидов [260].

По ходу этих начальных событий определение развития инфекции по литическому пути или латентному состоянию, зависит в значительной степени от типа зараженных клеток [130]. Ключевым моментом, возможно, является ранняя индукция белков-транскриптов, отвечающих за латентное состояние, путем подавления активности белков ICP0 и ICP4 [146, 207]. Белок ICP участвует в установлении латентного состояния ВПГ-1 и его реактивации [93, 130]. В латентном состоянии вирусный геном переходит в нереплицирующееся состояние, которое обеспечивают несколько генов вируса: ген, кодирующий синтез самого раннего белка (синтезируется до репликации вирусной ДНК и вовлекается в процесс транскрибирования) и поздний ген вируса (вероятно, для тимидинкиназы). Предполагается, что этот процесс регулируется не самим вирусом, а генным аппаратом клетки хозяина. Для ВПГ характерна пожизненная персистенция в виде двунитчатых кольцевых форм ДНК в нейронах чувствительных ганглиев и в коже (в провоцировании рецидива заболевания наибольшее значение имеют вирусы, сохраняющиеся в ганглиях). Механизм, ответственный за репликацию, неизвестен, но предполагают, что включаются факторы, важные для регуляции нейронной генной транскрипции. В начальной фазе литического цикла продукты IE-гена, помимо того, чтобы быть факторами транскрипции для следующей волны вирусных белков, регулируют функции клетки в пользу репликации вируса и уклонения от иммунного ответа [146].

1.2 Механизмы ускользания ВПГ от противовирусного надзора Характер течения ВПГ-инфекции является результатом взаимодействия биологических свойств штамма ВПГ и особенностей функционирования иммунной системы хозяина, поэтому для ВПГ-инфекции характерен широчайший диапазон клинических форм — от латентной инфекции и бессимптомного вирусовыделения до тяжлых диссеменированных форм. Типоспецифический иммунный ответ формируется в течение 14-28 дней как при манифестном, так и при бессимптомном инфицировании [53, 100, 144].

Одной из первых в механизмах ускользания ВПГ от иммунного ответа была установлена роль продукта немедленно-раннего гена US12 белка ICP47. Вскоре после инфицирования белок ICP47 связывается с белком-транспортером ТАР1/ТАР2, участвующим в процессинге антигена, что приводит к нарушению транспорта вирусных пептидов в ЭР для связывания с молекулой МНС I класса [82, 199, 291]. Нарушение процессинга приводит к нарушению презентации антигена молекулами HLA I и ускользанию от распознавания вириона и его ранних белков посредством CD8+ ЦТЛ. Показана различная чувствительность к ингибирующему влиянию ICP47 у разных клеток in vitro: фибробласты и кератиноциты высоко чувствительны, в то время как В- и Т-лимфоциты менее чувствительны [192]. IFN- предупреждает подавление экспрессии HLA I класса в кератиноцитах и фибробластах in vitro [250]. Под влиянием секреции ИФНпроисходит восстановление экспрессии молекул класса HLA на кератиноцитах, что является необходимым для распознавания инфицированных клеток посредством CD8+ ЦТЛ [200]. Взаимовлияния ВПГ и ИФН- на экспрессию HLA I класса при ПГ изучены недостаточно. Однако даже в случае успешной презентации и распознавания эпитопа CD8+ лимфоцитом, продукт вирусного гена Us3 способен ингибировать TCR-сигналинг на стадии связывания инфицированной клетки с ЦТЛ, инактивируя цитотоксичекую функцию CD8+лимфоцитов [255,256].

ВПГ ингибирует процессинг антигена и его презентацию как молекулами HLA I, так и II класса. По данным литературы вирусный белок ICP22 ингибирует способность В-лимфоцитов к презентации эпитопов ВПГ в комплексе с МНС II класса CD4+ Т-клеткам [81]. Механизмы, лежащие в основе данного явления не изучены. Мишенями для специфического ответа CD4+ Т-клеток являются на структурном уровне белки внешней оболочки (gB, gC, gD, gE и gH), тегумента (VP11/12, VP13/14, VP16, VP22) и капсида (VP5), присутствующие на инфицированных клетках. В литературе задокументированы случаи цитотоксичности СD4+клеток в отношении инфицированных кератиноцитов в присутствии ИФН-, в частности такие клетки обнаружены на слизистой шейки матки и в области герпетических повреждений кожи [225]. Клетки памяти CD4+ к антигенам ВПГ-1, ВПГ-2 составляют приблизительно 0,2 % циркулирующих CD Т-лифоцитов [79].

ВПГ способен инфицировать дендритные клетки (ДК) [133] и нарушать созревание ДК [246], что частично обусловлено ингибированием в ДК экспрессии генов вирусными белками vhs и ICP27 [238]. Нарушение процесса созревания приводит к нарушению процесса активации ДК, движения ДК к лимфатическим узлам и в конечном итоге к нарушению антиген-презентирующей способности [238]. Наконец, некоторые штаммы ВПГ способны вызывать апоптоз ДК [161], что также снижает эффективность процесса презентации АГ. Однако имеются данные о том, что неинфицированные ДК способны поглощать апоптотические ДК и в конечном итоге презентировать эпитопы ВПГ [91]. К настоящему времени, точно не определены вирусные структуры, ответственные за подавление функции дендритных клеток.

ВПГ-инфекция активирует TLR2-сигналинг, что приводит к синтезу провоспалительных хемокинов моноцитами, нейтрофилами, клетками ЦНС (астроцитами, клетками микроглии) [134, 173, 285]. ВПГ-инфекция также активирует TLR9-сигналинг в плазмацитоидных ДК и синтез интерферонов I типа [134, 188]. Вирусный белок ICP0 способен подавлять оба вышеописанных сигналинга [238]. Экспрессия одного только ICP0 достаточна для блокировки ответа на вирусные и невирусные лиганды посредством TLR2 сигналинга [280].

Механизмы данного явления не ясны, указывается роль адаптерного белка MyD и способность ICP0 снижать уровень MyD88 и Mal(TIRAP) в клетке [280].

Вируснейтрализующие АТ покрывают поверхность вируса, тем самым препятствуя его прикреплению к клетке и проникновению его внутрь. С помощью АТ происходит опсонизация вируса, способствующая фагоцитозу и АЗКЦТ. ЦИК, состоящий из вирусных частиц и АТ, связывается с Fc-рецептором МФ с последующим его фагоцитозом и лизисом вируса [119, 242]. Гликопротеин ВПГ- gE в комплексе с гликопротеином gI формируют высокоафинный Fc-рецептор [159], связывающий Fc фрагметы IgG и препятствующий нейтрализации ВПГ посредством антител. Этот процесс был назван биполярным связыванием противовирусных IgG [137]. Этот же механизм защищает ВПГ-инфицированные клетки от АТЗКЦ [125] и фагоцитоза [210]. При незавершенном фагоцитозе вокруг вириона образуются дополнительные мембранные слои за счет компонентов клетки-фагоцита, вследствие чего ВПГ приобретает возможность персистирования. Зрелые вирионы с дополнительными мембранными слоями определяются в материале из очагов инфекции, а преимущество внеклеточных форм ВПГ способствует высокой контагиозности заболевания [129].

Система комплемента необходима в реализации гуморального ответа на ВПГ [120]. Гликопротеин gC ВПГ-1 и ВПГ-2 способен связывать компонент С3b комплемента, прерывая активацию системы и уменьшая эффективность комплемент-зависимой нейтрализации вируса посредством IgМ [152].

Блокирование активности рецепторов комплемента гликопротеином gC предложено в качестве метода оценки противовирусной активности антител [83].

Вируснейтрализующие АТ улавливают свободные вирионы, находящиеся во внеклеточном пространстве при распространении из одной клетки в другую, однако ВПГ обладает способностью распространяться на соседние клетки напрямую через клеточные контакты по цитоплазматическим мостикам, избегая контакта с циркулирующими АТ и системой комплемента [199].

ВПГ-инфекция, относится к инфекциям с нетипичной динамикой антителообразования, когда появление IgM не всегда служит надежным маркером рецидива заболевания [18]. До настоящего времени, не выявлено корреляции между тяжестью инфекции и уровнем антител, их подклассами, функциональной активностью или специфичностью. Возможно, уровень и быстрота специфического гуморального ответа являются факторами, определяющими распространение ВПГ [262]. По данным А.А. Халдина у больных герпесом наряду с клеточным иммунным ответом на активацию ВПГ встречается парадоксальный тип иммунных реакций, когда в ответ на обострение инфекции активируется гуморальное звено[60].

Показано подавление уровня синтезируемых провоспалительных цитокинов в МФ мышей, инфицированных диким типом ВПГ-1, при сравнении с клетками, инфицированными мутантным ВПГ-1 по вирусному белку VP16 (белок, участвующий в индукции вирусных генов). Механизм подобного влияния на экспрессию цитокинов был связан со способностью дикого типа ВПГ-1 снижать стабильность мРНК провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-), таким образом избегая противовирусного ответа организма [204].

При изучении механизмов реактивации ПГ установлена корреляция между повышением уровня ФНО-, ИФН-, ИЛ-6 и ИЛ-10, и развитием антигенемии, что дат основание предполагать роль цитокинов в реактивации ГВИ [188].

Много работ посвящено сравнению соотношения цитокинов Th-1- и Th-2происхождения при ГВИ. В экcпериментах на лабораторных животных показано, что в первые сутки после ВПГ-инфицирования мышей в пораженных тканях значительно повышается концентрация ИЛ-2 и ИФН-, в то время как ИЛ- определяется только на 7-14-й день и в значительно меньших количествах [253].

В других экспериментальных работах было установлено, что цитокиновый ответ на ВПГ-инфекцию преимущественной включает провоспалительный и Thlпрофиль. Однако, в период латентной инфекции в пораженных клетках отмечается выработка и ИЛ-4 [100]. При введении рекомбинантного ИЛ- экспериментальным животным значительно уменьшается репликация ВПГ в тканях, а введение рекомбинантного ИЛ-4 наоборот усиливает размножение вируса. У мышей, дефектных по синтезу ИЛ-2, чаще развиваются летальные формы герпетической инфекции по сравнению с мышами, не синтезирующими ИЛ-4 [232]. У женщин репродуктивного возраста с ГГ выявлены высокий уровень ФНО- и преобладание цитокинов Th-1-хелперов (ИФН-) над цитокинами Th-2хелперов (ИЛ-4), причм данное явление отмечалось как в ремиссию, так и в обострение заболевания [69]. Но стоит отметить, что в большинстве работ по сравнению соотношения цитокинов профилей Тh1- и Th2-происхождения у ВПГинфицированных людей, имеющих клинические проявления заболевания и без проявлений, не выявило статистически значимых различий, хотя показаны тенденции к более сильному протективному действию Th1- ответа [54, 253]. При выраженном уровне секреции ИФН- отмечается более продолжительный период ремиссии у пациентов с ВПГ-2 инфекцией генитальной локализации [253].

CD8+ ЦТЛ способны разрушить все свободные вирионы в кровотоке и в межклеточном пространстве, а также инфицированные клетки, кроме клеток ганглиев периферической нервной системы, являющихся "резервуаром" для ВПГ [46, 148, 177, 228]. По данным литературы фаза обострения РПГ характеризуется снижением ИРИ за счт снижения количества СD4+ клеток и некоторого увеличения количества CD8+ клеток [20, 23, 54, 231]. Фаза ремиссии по одним данным сопровождается снижением количества СD4+ клеток [46, 65], по другим данным в период реконвалесценции уровень СD4+ клеток нормализуется [27].

Выявленные нарушения предопределяют продолжительную персистенцию ВПГ в организме с установлением рецидивирующего течения заболевания.

Механизмы ускользания ВПГ от действия ИФН и NK-клеток описаны в соответствующих разделах.

1.3 Система интерферонов I типа в противовирусной защите В настоящее время у человека выделяют 9 видов интерферонов, обозначаемых греческими буквами :,,,,,, 1, 2, 3 [59, 71, 156]. Такие виды человеческого интерферона как,,,,, связываются с одним общим рецептором IFNAR(1/2) и объединены в семейство интерферонов I типа.

Рецептор для ИФН I типа состоит из двух субъединиц IFNAR1 и IFNAR2 и экспрессируется практически всеми клетками организма. Их количество на поверхности клетки колеблется от 200 до 6000 на клетку [59] и характеризуются высокой афинностью. Молекула ИФН I типа связывается одновременно с обеими молекулами рецептора, встраиваясь между ними. Сигнал от IFNAR(1/2) рецептора передается JAK/STAT сигнальным путем: связывание молекулы ИФН I типа с рецептором приводит к его олигомеризации, в результате чего связанные с транскрипционные факторы STAT1 и STAT2, что необходимо для гомо- и гетеродимеризации молекул STAT и их последующей миграции в ядро, где молекулы STAT связываются с промоторными участками ДНК генов-мишеней и индуцируют их экспрессию. [211, 217, 267]. ИФН- имеет 13 разновидностей.

Каждый вид и разновидность кодируется отдельным геном. Некоторые гены существуют в нескольких аллельных вариантах, которым соответствуют изоформы ИФН- (2а, 2b, 2c). Существует только одна разновидность ИФНкодируемая геном, также расположенным в кластере ИФН I типа на хромосоме 9 для человека.

ИФН II типа представлены только одним видом - ИФН- [250]. Структурно ИФН- отличается от ИФН I типа и взаимодействует с другим рецептором.

Продуцентами ИФН- могут быть различные типы клеток: NKT-клетки, NKклетки, плазмацитоидные ДК и МФ, CD8+ ЦТЛ, CD4+ Th1 клетки [59, 71, 140, 180]. По некоторым данным к продукции ИФН- способны B-лимфоциты и нейтрофилы [59]. Индукция выработки ИФН- в клетках, не относящихся к Тлимфоцитам (например, NK-клетки), происходит под влиянием цитокинов, особенно ИЛ-12 совместно с другими провоспалительными цитокинами, продуцируемыми мононуклеарными фагоцитами [24, 66, 229, 232, 249, 266].

ИФН- взаимодействует с рецептором IFNGR1/R2,состоящим из двух субъединиц R1 и R2. После связывания ИФН- с рецепторным комплексом происходит фосфорилирование ферментов JAK2 и затем JAK1. В результате происходит закрепление рецептора и комплекс R1- STAT1 перемещается к ядру, где связывается с ДНК и вызывает первую волну ответа [169, 218]. Многие из этих начальных продуктов являются факторами транскрипции, участвующими в дальнейшем регулировании ИФН- опосредованного клеточного ответа. Среди данных продуктов - ИФН- регулирующие факторы (IRFs), которые стимулируют или подавляют транскрипцию ИФН-генов. ИФН- участвует во всех иммунных реакциях макрофагов и нейтрофилов и обладает множественным действием, усиливая взаимодействие между лимфоцитами и нелимфоидными клетками (за счет стимуляции экспрессии антигенов МНС на клетках эндотелия, многих эпителиальных клетках и клетках опухолевых линий) и активируя макрофаги и способствуя эффективному уничтожению внутриклеточных микроорганизмов [166].

Помимо двух традиционных групп ИФН была описана III группа ИФНподобных цитокинов и названа ИЛ-28А (ИФН-1), ИЛ-28В (ИФН-2) и ИЛ- (ИФН-3). Эти цитокины представляют собой противовирусные белки, взаимодействующие с рецептором, состоящим из ИФН-ARl и ИЛ-10R2 (содержит цепь, общую с рецептором для ИЛ-10). Хотя идентичность по аминокислотному составу между ИФН- и ИФН- составляет не более 20%, функционально интерфероны III типа сходны с ИФН I типа и обладают сильной противовирусной активностью [59, 129].

ВПГ являются мощными индукторами выработки ИФН I типа (в частности, ИФН -) МНК крови здоровых людей [193, 240]. Хотя практически все клетки, инфицированные вирусами или бактериями, могут синтезировать ИФН I типа, наиболее мощными их продуцентами являются плазмацитоидные ДК, которые распознают вирус с помощью рецептора TLR9 и синтезируют ИФН / в раз больше, чем любой другой клеточный тип [188, 234]. ДК, инфицированные in vitro ВПГ, экспрессировали мРНК ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ГМ- КСФ и ФНО- от 4 ч до 12 ч после инфицирования [192]. Установлено, что при РПГ имеется дефицит выработки ИФН I типа МНК крови [32, 33, 34, 172, 227, 276]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжело протекающими инфекциями, вызванными ВПГ [103, 295]. Все эти данные послужили теоретической основой для целого ряда клинических испытаний препаратов ИФН I типа и индукторов ИФН при РПГ, лечебный эффект которых связан как с прямым противовирусным, так и с иммуномодулирующим действием ИФН I типа. [9, 12, 13, 19, 41, 56, 57, 58, 64, 66].

ИФН образуют автономную группу цитокинов, общее свойство которых – наличие у них противовирусной активности. В то же время, подобно другим цитокинам, они участвуют в регуляции иммунных процессов. Сочетание этих свойств делает ИФН важными факторами врожднного (а в случае ИФН- ещ и адаптивного) иммунитета и служит основанием для широкого применения ИФН в качестве лечебных препаратов [11, 32, 33, 34, 71, 208, 244] В частности, ИФН I типа обладают противовирусным и антипролиферативным действием, активируют Т-лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, МФ и ДК, повышают экспрессию молекул MHC-I, активируют про-апоптотические гены и ингибируют анти- апоптотические механизмы, модулируют дифференцировку клеток и блокируют ангиогенез [14, 24, 32, 33, 34, 200, 240, 245].

Для целого ряда вирусов описаны белковые структуры, вызывающие цитокиновый ответ организма [24]. Ранняя продукция цитокинов может зависеть от типа проникшего вируса в организм. Для ВПГ центральным белком, вызывающим первичный цитокиновый каскад, является гликопротеин D (gD).

Этот этап выработки цитокинов включает продукцию ИФН/ и ФНОпосредством активации протеинкиназ. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии ГВИ могут контролироваться исключительно ИФН, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [282]. Дополнительно к немедленной gD-зависимой продукции цитокинов ВПГ вызывает выработку других цитокинов - ИЛ-6 и ИЛ-12 путем активации других более медленных механизмов. Многочисленными работами показано, что продукция и секреция провоспалительных цитокинов (ИФН /, ИЛ-1, ФНО, ИЛявляется ранним неспецифическим ответом организма на ГВИ [24, 32, 33, 34, 70]. Таким образом, ранняя фаза иммунного ответа на первичное инфицирование или рецидив ВПГ-инфекции возникает в первые 6—12 ч развития инфекционного процесса и обеспечивается в основном выработкой ИФН I типа [282]. ВПГ — мощный индуктор ИФН, этот эффект опосредуется распознаванием вирусных нуклеиновых кислот паттерн-распознающими рецепторами TLR3, TLR9 и DAI [103, 272, 295]. Продуцентами ИФН I типа могут быть как инфицированные эпителиоциты, так и лейкоциты, среди которых основной вклад вносят плазмацитоидные дендритные клетки [252]. Ранняя продукция ИФН-/ коррелирует с устойчивостью к ВПГ. ИФН-/ препятствуют экспрессии немедленно-ранних генов ВПГ как в ганглиях, так и в эпителиоцитах [126]. Кроме того, ИФН I типа активируют протеинкиназу R, которая фосфорилирует фактор элонгации трансляции eIF-2, что ведет к остановке трансляции в клетке. Другой мишенью ИФН-/ является РНКаза L, которая неизбирательно разрезает иммунорегуляторным действием, в частности индуцируют экспрессию хемокинов, активируют МФ, ДК и NK-клетки. Врожденные дефекты индукции интерферонового ответа проявляются именно тяжелой ВПГ-инфекцией в форме энцефалита [103, 126, 295].

Несмотря на множество механизмов, посредством которых ИФН I типа и другие цитокины могут подавлять репликацию вирусов, ВПГ обладает способностью подавлять продукцию ИФН и/или других провоспалительных цитокинов, препятствовать или прерывать сигнальные и антивирусные пути их действия. По сравнению с другими вирусными инфекциями ингибирующее влияние ИФН-/ на ВПГ-инфекцию сравнительно невелико [126], что обусловлено способностью ВПГ вызывает деградацию компонентов сигнального пути от рецептора ИФН-/, блокировать синтез ИФН и/или других провоспалительных цитокинов, препятствовать или прерывать сигнальные и антивирусные пути их действия различными путями, снижая ответ клеток на эти цитокины ВПГ [107, 160, 192, 207]. ИФН I типа индуцируют в инфицированных клетках синтез профермента протеинкиназы R, которая активируется при взаимодействии с двухцепочечной РНК [288]. PKR фосфорилирует эукариотический фактор элонгации трансляции eIF-2, что ведет к остановке трансляции всех белков в инфицированной клетке. Продукт гена 134.5 ВПГ- подавляет вызванное ИФН- фосфорилирование ранних генов вируса, а именно:

дефосфорилирует альфа субъединицу eIF-2, в результате чего трансляция в инфицированной клетке несмотря на действие ИФН I типа продолжается [107, 126, 149]. Белок VHS, кодируемый геном UL41 и находящийся в инфицированных клетках как компонент вириона, обладает эндорибонуклеазной активностью и расщепляет транскрипты, индуцированные ИФН- [107, 194, 241, 253]. Белок ICP0, кодируемый одним из немедленно-ранних генов ВПГ, вызывает деградацию клеточных белков, включая протеосомы [147, 194, 207]. В частности ICP вызывает деградацию белка PML (promyelocytic leukemia protein), чем отменяет ингибирующее действие интерферонов I типа на репликацию ВПГ [147, 207, 237].

ICP0 вызывает деградацию IRF-3, но даже в случае отсутствия ICP0, ВПГ способен блокировать индукцию синтеза ИФН- через RIG-1, в том числе посредством секвестрации IRF3 от гена-мишени [194] и блокирования PKRопосредованных эффектов на трансляцию. ВПГ способен блокировать индукцию как генов ИФН, так и генов-мишеней ИФН [127] посредством блокирования образования транскрипционного фактора IRF-3 в ответ на внутриклеточный рецептор RIG-1 [181, 194].

ВПГ вызывает синтез неактивных аналогов 2’,5’-олигоаденилатов, которые конкурируют с активными формами 2’,5’-олигоаденилатов и препятствуют активации РНКазы L [1].

В клетках модельной клеточной линии Vero, Hela, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к ИФН-/ в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на ИФН-, в частности, посредством ингибирования фосфорилирования STAT1 киназой Jak1 [107, 290].

ВПГ-инфицированные клетки способны синтезировать растворимые гомологи цитокиновых рецепторов. В частности обнаружен гомолог, связывающий ИФН-, что способствует ингибированию противовирусного и иммуномодулирующего действия этого цитокина [39, 204]. Белок ICP27 ВПГ вызывает секрецию ВПГ-инфицированными клетками термостабильного белка — антагонист интерферонов I типа, блокирующего ИФН-/ рецептор и/или передачу сигнала от него в ядро [160], что приводит к ингибированию эффектов ИФН I типа, в т.ч. активирующего действия на NK-клетки.

1.4 NK-клетки 1.4.1 Характеристика NK-клеток Поскольку в настоящее время не выявлено специфических маркров NKклеток предлагается следующее определение NK-клеток: NK-клетки – это NKp46+CD3-, IL-15 зависимые, IL-12- индуцируемые лимфоциты, присутствующие у человека и у всех видов млекопитающих, способные быстро развивать цитотоксическую активность по отношению к различным клеточным мишеням, не имеющим молекул МНС I класса и экспрессирующим стрессиндуцируемые (лиганды для NKG2D) или микробные молекулы [59, 284].

В отсутствии известных специфических маркров главными маркрами NKклеток считаются молекулы CD56 и CD16 [59]. CD 16 –низкоаффинный рецептор для Fc-фрагментов антител субклассов IgG1 и IgG3 (у человека) [145, 156], является одним из наиболее мощных активационных рецепторов NKклеток, представляет собой трансмембранный белок суперсемейства иммуноглобулинов. Различают две изоформы этого антигена — CD16a (FcIIIA) и CD16b (FcIIIB); NK-клетки экспрессируют только первую из них. Антитела субклассов IgG1 и IgG3 играют роль опсонинов, своими Fab-фрагментами взаимодействуя с поверхностными антигенами клеток-мишеней, а Fcфрагментами — с CD16, что индуцирует литическую атаку NK-клеток против мишеней, покрытых антителами (АЗКЦТ). CD 56 - адгезивная молекула из семейства молекул адгезии нервной системы (N-CAM) из суперсемейства разделяются на основную субпопуляцию (CD56dim), составляющую около 90 % NK-клеток крови и минорную субпопуляцию (CD56 bright ), составляющую около 10 % крови. Между этими субпопуляциями имеются существенные различия [115, 116, 132, 292]. Две субпопуляции NK-клеток первоначально рассматривались как независимые: CD56dim субпопуляция — как «эффекторная», CD56bright — как «регуляторная». Однако в последующем было показано, что CD56bright и CD56dim NK-клетки представляют собой последовательные стадии дифференцировки [106, 154, 239]. CD56bright NK-клетки, по сравнению с CD56dim, характеризуются: 1) низкой или отсутствующей экспрессией CD16 (CD16 ) и KIR; 2) высокими уровнями -цепи рецептора для IL-2 (CD25+++); 3) низкой экспрессией перфорина и гранзимов, низкой цитотоксичностью в реакциях естественной цитотоксичности и АЗКЦТ; 4) высокой продукцией ИФН- при активации цитокинами ИЛ-12 и ИЛ-15; 5) высокой экспрессией NCR, NKG2D и CD94/NKG2A; 6) наличием экспрессии хемокинового рецептора CCR7, который дает возможность CD56bright NK-клеткам мигрировать в Т-клеточные зоны вторичных лимфоидных органов (CD56dim NK-клетки, на которых CCR отсутствует, мигрируют преимущественно в нелимфоидные ткани) [114, 132, 288].

предшественника пре-NKT в костном мозге [138]. Дифференцировка NK-клеток контролируется факторами транскрипции Ets1 и Id2 [71]. NK-клетки, как и Тклетки зависят от одних и тех же ростовых факторов (ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-2), но основным дифференцировочным и антиапоптотическим фактором NK-клеток функционально эквивалентный селекции Т-клеток в тимусе. Суть обучения состоит в том, что цитотоксический потенциал приобретают только те NK-клетки, которые могут распознать собственные молекулы MHC организма хотя бы через один ингибиторный рецептор (как правило, CD94/NKG2A и/или KIR) [151, 216].

NK-клетки, не отвечающие этим условиям, являются гипореактивными (неспособны лизировать клетки-мишени), хотя у них сохранена экспрессия перфорина/гранзимов, а также способность секретировать цитокины [76].

Описанный механизм позволяет предотвратить случайное повреждение здоровых клеток организма NK-клетками, ингибиторные рецепторы которых не распознают MHC-лигандов. NK-клетки, не распознавшие MHC-лиганд, не погибают, а циркулируют в крови в составе CD56dimCD16+ субпопуляции, а литическая функция «необученных» NK-клеток может быть восстановлена под действием цитокинов, вырабатываемых, например, при острых вирусных инфекциях [269].

На сегодняшний день существуют несколько моделей для объяснения данного процесса - «вооружения», «разоружения», реостатная модель, но молекулярные основы обучения NK-клеток по большей части неясны [95, 143, 160, 165].

Наиболее ранним маркером NK-клеток, развивающихся in vitro и во вторичных лимфоидных органах in vivo, является CD161 (NKR-P1A) [84, 138]. Клетки с фенотипом CD3–CD56–CD161+ способны продуцировать цитокины, в частности ФНО- [84], но не обладают перфорин-зависимой цитотоксичностью [294]. С появлением маркеров CD56, CD94, NKG2D и NKp46 NK-клетки вторичных лимфоидных органов приобретают способность к выработке ИФН- и перфоринзависимому киллингу [138, 294]. CD56bright NK-клетки крови приобретают цитотоксические свойства в ходе дальнейшей дифференцировки, которая сопровождается нарастанием экспрессии цитотоксических белков, а также снижением экспрессии CD56 и появлением CD16, в результате чего NK-клетки приобретают фенотип CD56dimCD16+ (основная субпопуляция NK-клеток крови).

Скорее всего, этот процесс идет через промежуточную стадию CD56brightCD16+ клеток [87]. Превращение CD56bright NK-клеток в CD56dimCD16+, видимо, сопровождается несколькими клеточными делениями, что ведет к укорочению теломер [106, 239]. С приобретением фенотипа CD56dimCD16+ дифференцировка NK-клеток не заканчивается. CD56dim NK-клетки постепенно утрачивают экспрессию CD94/NKG2A, приобретают экспрессию одного или нескольких ингибиторных KIR-рецепторов, а также CD57 — маркера терминальной дифференцировки NK-клеток и Т-клеток [89, 187, 292]. Это сопровождается снижением способности пролиферировать и вырабатывать ИФН-. Естественная цитотоксичность NK-клеток в ходе терминальной дифференцировки существенно не меняется, однако CD57+ NK-клетки являются более мощными эффекторами АЗКЦТ [187]. Таким образом, NK-клетки и T-клетки имеют много общего и при первичных иммунодефицитах функции NK-клеток и CD8+ Т-клеток, как правило, страдают одновременно [135].

NK-клетка распознает потенциальную мишень с помощью двух типов рецепторов — ингибиторных и активационных. Ингибиторные рецепторы распознают поверхностно экспрессированные молекулы MHC I, что блокирует активацию [174,176]. Соответственно, собственные клетки организма с частичной или полной утратой поверхностной экспрессии молекул MHC I класса являются основными мишенями NK-клеток, что было впервые сформулировано H.-G. Ljunggren и K. Krre в гипотезе «отсутствия своего» (missing self) [183, 184].

Активационными рецепторами NK-клеток взаимодействуют с молекулами, индуцируемыми клеточным стрессом [77, 175, 205], появляющимися на поверхности клеток, инфицированных вирусом или злокачественно трансформированных клеток, а также вирусными белками, экспонированными на поверхности инфицированной клетки, в связи с чем NK-клетки участвуют в ранней фазе иммунного ответа на вирусную инфекцию [156] и способны распознавать самые ранние этапы онкогенной трансформации [279]. Описаны также случаи прямого распознавания вирусных белков NK-клетками: так, рецептор Ly49H, экспрессирующийся на небольшой субпопуляции NK-клеток мышей, распознает белок m157 мышиного цитомегаловируса [77]. В редких случаях NK-клетки могут распознавать и убивать непосредственно клетки возбудителя; NK-чувствительные микроорганизмы, как правило, относятся к эукариотам [189]. NK-клетки, прямо распознающие вирусные белки, после распознавания антигена могут подвергаться клональной экспансии, а в последующем ускоренно и усиленно реагируют на повторный контакт с вирусным белком, т.е. ведут себя как клетки памяти [268, 270].

Запуск литической атаки NK-клетки определяется суммой сигналов от активационных и ингибиторных рецепторов. Активационные рецепторы либо сами содержат активационные ITAM-мотивы (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs), либо взаимодействуют с ITAM-содержащими адаптерами.

ITAM-мотивы, фосфорилированные по остаткам тирозина, служат сайтами прикрепления киназ Syk и ZAP-70, которые активируются и фосфорилируют GEF-белок VAV1 (GEF = guanine nucleotide exchange factor) [150, 156]. Активный VAV1 индуцирует переход молекулы адгезии LFA-1 из закрытой в открытую (активную) конформацию [96]. Активный LFA-1 взаимодействует с лигандами на поверхности клетки-мишени (CD54, CD50), что приводит к формированию прочного межклеточного контакта [96]. ITAM-ассоциированные киназы ZAP-70 и Syk активируют фосфолипазу C, которая расщепляет фосфатидилинозитолбисфосфат (PIP2) на диацилглицерол (ДАГ) и инозитолтрифосфат (IP3); ДАГ активирует протеинкиназу C, тогда как инозитолтрифосфат индуцирует вход ионов Ca2+ в цитозоль [156]. Эти события важны как для индукции дегрануляции, так и для передачи активационного сигнала в ядро NK-клетки.

Ингибиторные рецепторы содержат ITIM-мотивы (immunoreceptor tyrosinebased inhibition motifs), служащие сайтами связывания фосфатаз SHP-1, SHP-2 и SHIP, которые дефосфорилируют VAV1 и ряд других ключевых сигнальных молекул, участвующих в активации клетки [96,221]. Если на поверхности мишени присутствует достаточное количество лигандов, распознаваемых ингибиторными рецепторами NK-клеток, то в результате LFA-1 остается в неактивной конформации и NK-клетка отделяется от мишени.

реорганизации актинового цитоскелета, перестройке ИС с образованием центрального активационного комплекса (cSMAC), в котором концентрируются активационные рецепторы и формированию устойчивого активационного сигнала в NK-клетке и периферического (pSMAC), который кольцом окружает cSMAC — молекулы адгезии (CD2, CD11a/CD18, CD11b/CD18), которые связываются со своими лигандами на поверхности клетки-мишени. отграничивает полость ИС от окружающей среды [214]. Ключевую роль в передаче активационного сигнала с мембранных рецепторов на сеть актиновых микрофиламентов играет белок синдрома Вискотта—Олдрича (Wiskott-Aldrich syndrome protein или WASP) [190], который регулирует переход актина из глобулярной формы в полимерную фибриллярную — f-актин.

Для индукции естественной цитотоксичности и реализации эффективного киллинга необходима одновременная стимуляция как двух активационных рецепторов (в случае с АЗКЦТ достаточно одного рецептора CD16), так и рецептора LFA-1, т.к. дегрануляция приобретает направленность на клеткумишень в том случае, если мишень экспрессирует лиганды для LFA-1 [97, 98].

Азурофильные гранулы NK-клеток содержат цитотоксические белки:

перфорин, сериновые протеазы гранзимы (A и B), небольшой сапозинподобный белок гранулизин и полипептид LL-37 [59, 73, 170]. Гранулы NK-клеток являются секреторными лизосомами т. е. лизосомами, способными к экзоцитозу содержимого [224] и имеют многочисленные сходства с последними, в частности:

1) кислый pH (около 5—5,5); 2) присутствие лизосомальных гидролаз, в частности катепсинов; 3) присутствие протеазоустойчивых протеогликанов (серглицин); 4) присутствие мембранных лизосомальных белков (в частности, белков CD107a, CD107b и CD63 из семейства LAMP — lysosome-associated membrane proteins) на лимитирующей мембране гранул [167, 168, 224].

Активность синтезированного перфорина ингибируется кальретикулином, а также аутоингибируется собственным C-концевым фрагментом, содержащим крупный остаток гликана, который отщепляется в кислой среде гранул, способствуя образованию зрелого перфорина [230, 278]. Внутри гранул зрелый перфорин остается неактивным вследствие отсутствия свободного Ca2+ (ионы Ca2+ связываются кальретикулином) и образования комплекса с серглицином, что создает стерическое препятствие для мультимеризации перфорина [230].

Перфорин секретируется в едином комплексе с серглицином и гранзимом B [198], однако, попав в слабощелочную или нейтральную межклеточную среду, вероятно, освобождается от серглицина [168]. Свободный Ca2+, взаимодействуя с C2-доменом, переводит перфорин в активную конформацию. Согласно «классической» модели, выведенной из опытов на искусственных фосфолипидных мембранах, молекулы перфорина с помощью C9-гомологичного домена встраиваются в поверхностную мембрану клетки-мишени, где мультимеризуются и образуют каналы, через которые в цитозоль клетки-мишени проникают гранзимы, запускающие процесс апоптоза [230]. Предшественники гранзимов в гранулах тоже остаются в неактивном состоянии вследствие связи с серглицином и другими протеогликанами [162]. В настоящее время открыто более 10 видов гранзимов, из которых у человека экспрессируются гранзимы A, B, K и M; из них гранзим В обладает наиболее значимыми эффекторными свойствами [118, 258]. Гранзим B, попав при помощи перфорина в цитозоль, путем ограниченного протеолиза активирует проапоптотический белок BID, который запускает митохондриальный путь апоптоза и ряд прокаспаз (в т.ч. прокаспазу-3), которые запускают каспазный апоптотический каскад [118]. Мишенями гранзима A являются различные нуклеопротеины [118]. Кроме того, гранзимы A и B могут активировать ИЛ-1-конвертазу (каспазу-1), вследствие чего атака NK-клеток или ЦТЛ против моноцитов или МФ, содержащих про-ИЛ-1, вызывает секрецию активного ИЛ-1, что способствует индукции воспалительного ответа [197].

Кроме того, через образовавшиеся поры мишень теряет ионы, что ведет к осмотическому лизису. Эти события объединяют термином «летальный удар».

Многие авторы высказывают мнение о том, что реальный механизм действия перфорина и гранзимов, вероятно, сложнее и указывают на роль эндоцитоза [78, 85, 139, 198, 230, 273].

Перфорин-гранзим-зависимый механизм клеточной гибели может быть заблокирован, в результате чего клетка-мишень приобретает устойчивость к действию NK-клеток. Данное явление может быть обусловлено, в частности, экспрессией у клеток-мишеней антиапоптотического фактора Bcl-2 и описано у опухолевых клеток костномозгового происхождения [271], а также у клеток, пораженных вирусом Эпштейна—Барр [289]. Помимо основного перфорингранзим-зависимого механизма, NK-клетки располагают другими средствами киллинга, в частности посредством Fas-лиганда (FasL/CD178) [251]. В покоящихся цитотоксических лимфоцитах FasL находится на внутренней поверхности мембраны литических гранул и в результате дегрануляции экспонируется на поверхности NK-клетки [92, 297]. Однако эффективность этого механизма киллинга невысока, т. к. FasL быстро «срезается» с поверхности клетки металлопротеазами [202]. В гранулах, имеющих морфологию мультивезикулярных телец, FasL находится на поверхности внутренних везикул, которые отшнуровываются от лимитирующей мембраны гранулы в ее просвет.

При дегрануляции эти везикулы секретируются в виде экзосом, что является очень эффективным средством доставки FasL к мембране клетки-мишени [157].

Хотя перфорин/гранзимы и FasL хранятся в одних и тех же органеллах, условия, необходимые для их мобилизации на поверхность цитотоксического лимфоцита могут различаться [163]. FasL связывается с молекулами Fas (CD95) на поверхности клетки-мишени (при условии, что мишень экспрессирует Fas) [247];

в результате в клетке-мишени индуцируется рецептор-зависимый путь апоптоза с участием адаптора FADD и каспаз-8 и -10. В роли индуктора рецепторзависимого апоптоза может выступать другая поверхностная молекула семейства ФНО - TRAIL/CD253, взаимодействующая с рецепторами TRAILR1 и TRAILR2.

TRAIL экспрессируется в основном незрелыми CD56–CD161+ NK-клетками [294].

ФНО-, секретируемый NK-клетками, тоже может вызывать апоптоз некоторых мишеней через рецептор TNFR1 (CD120a, p55).

Кроме того, как было рассмотрено ранее, благодаря экспрессии Fcрецепторов, NK-клетки могут участвовать в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ), т.е. уничтожать мишени, опсонизированные IgG [156].

Продукция цитокинов и хемокинов является второй важнейшей функцией NK-клеток. Стимуляция активационных рецепторов приводит к активации митоген-индуцируемых протеинкиназ и протеинкиназы C, активации факторов транскрипции NF-B и AP-1 [153] и индукции экспрессии генов, в частности провоспалительных цитокинов (ИФН- -) и воспалительных хемокинов MIP-1/ и RANTES, тем самым вовлекая в иммунный ответ другие клетки иммунной системы [115, 116, 131, 158]. Одним из инициаторов МAP-киназного каскада является упоминавшийся выше белок VAV1 [156]. Описаны и так называемые регуляторные NK-клетки, вырабатывающие преимущественно интерлейкин-10 (ИЛ-10) и способствующие подавлению иммунного ответа [122].

1.4.2 NK-клетки и ВПГ-инфекция В отличие от ИФН I типа, NK-клетки вступают в действие на более позднем этапе ответа на ВПГ-инфекцию [282], и их активность во многом регулируется ИФН, продуцируемыми на ранней стадии. Стимуляция цитотоксической активности NK-клеток является одним из основных эффектов ИФН I типа [124]. Кроме того, ИФН-индуцибельные цитокины (RANTES, IP-10) привлекают NK-клетки в очаг инфекции [235]. Основная функция NK-клеток при ВПГ-инфекции — лизис вирус-инфицированных клеток. NK-клетки ингибируют репликацию ВПГ-1 in vitro [136] и in vivo [282]. В отсутствие Т-клеток NK-клетки достаточны для предотвращения летального исхода ВПГ-энцефалита у мышей [72]. В то же время пациенты с дефицитом NK-клеток [88] или их киллерной функции [215] страдают именно от тяжелых форм ВПГ-инфекции. NK-клетки способны распознавать ВПГ-инфицированные мишени на самых ранних стадиях инфекции, причем для распознавания инфицированной мишени и ее киллинга по механизму естественной цитотоксичности достаточно экспрессии немедленнораннего гена ICP0 в клетке-мишени [109]. Кроме того, NK-клетки распознают и убивают мишени, покрытые антителами к ВПГ [112]. Помимо киллинга мишеней, NK-клетки продуцируют цитокины, наиболее важными из которых являются ИФН- и ФНО-. ИФН-, наряду с ИФН I типа, препятствует репликации вируса [121], сенсибилизирует клетки-мишени к цитотоксическому действию перфорина [85], а также обладает многочисленными иммунорегуляторными эффектами.

ВПГ обладает богатым набором средств противодействия NK-клеткам.

Контакт с ВПГ-инфицированными клетками-мишенями приводит к «разоружению» NK-клеток, т.е. потере ими цитотоксических свойств [113];

механизм этого эффекта до сих пор не ясен [293]. ВПГ ингибирует экспрессию лигандов NKG2D инфицированными клетками, препятствуя их распознаванию активирующими рецепторами NK-клетками [248], а некоторые вирусные белки способны взаимодействовать с ингибирующими рецепторами NK-клеток [20,111].

При ЧРПГ, как правило, описывают снижение NK-активности [36, 37, 48, 53, 60, 104, 108, 178, 254], однако детали этих работ разнятся. Сухих с соавт.

отмечают снижение цитотоксической активности NK-клеток приблизительно у 60% больных с манифестными формами ГВИ. Отмечена четкая тенденция к понижению цитотоксичности NK- клеток в среднем за 7 дней до очередного рецидива и последующее е повышение в острый период ГВИ. По данным А.А.

Халдина [60], у больных редко рецидивирующим герпесом цитотоксическая активность NK-клеток снижена незначительно, до 35-40% (норма 45-50%), при частых обострениях снижение более значительное - до 20-25%. По данным С.Б.Чекнева и соавт., снижение NK-активности при рецидивирующем генитальном герпесе более выражено в стадию ремиссии заболевания [108]. Cauda и соавт., напротив, сообщают о снижении NK-активности и содержания NKклеток (определяемых как CD16+ лимфоциты) преимущественно в ходе обострения генитального герпеса, с нормализацией во время ремиссии [104], Leszczyszyn-Pynka приводит сходные данные для рецидивирующего лабиального герпеса [178]. Наконец, по данным Sirianni и соавт., NK-активность при рецидивирующем генитальном герпесе снижена независимо от стадии заболевания, причем это снижение обратно коррелирует с повышенным процентным содержанием NK-клеток, которые определяли как HNK-1+ (CD57+) лимфоциты [254]. Трактовка данных Sirianni и соавт. затруднена, поскольку CD не является специфичным маркером NK-клеток. По данным Муругина и соавт.

NK-активность также снижена при ЧРПГ в ремиссию и имеет нормальные показатели в обострение [36, 37]. Муругин и соавт. исследовали у пациентов с ЧРПГ помимо стандартного параметра NK-активности, дегрануляцию NK-клеток и отмечают, что как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии у пациентов с ЧРПГ умеренно снижена дегрануляция NK-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение NK-активности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562. В целом, данные по состоянию NK-клеток при ЧРГ противоречивы.

1.4.3 Современные методы исследования функциональной активности NKклеток: оценка дегрануляции NK-клеток.

Из рассмотренных выше механизмов цитотоксичности NK-клеток дегрануляция — главный механизм, с помощью которого NK-клетки осуществляют киллерную функцию, поэтому ее исследование необходимо для оценки состояния NK-клеток. Поляризации гранул, т.е. движению литических гранул в зону ИС, является Ca-зависимыми и обеспечиваются тубулиновым цитоскелетом (микротрубочками) в направлении активированного LFA-1 [97]. В передаче сигнала с LFA-1 на тубулиновый цитоскелет участвуют белки талин, WASP и CIP-4, устанавливающий связь между WASP и центром организации микротрубочек (ЦОМТ) [80]. Поляризованные гранулы скапливаются непосредственно под ИС у поверхностной мембране NK-клетки [233]. Возможно, в окончательном движении гранул от ЦОМТ к мембране участвуют актиновые филаменты и миозин II [75]. Во взаимодействии гранул с поверхностной мембраной выделяют несколько этапов: прикрепление (docking), подготовку к слиянию (priming) и слияние (fusion). Прикрепление обеспечивается малой ГТФазой Rab27, которая ассоциирована с наружной поверхностью гранул, тогда как в подготовке к слиянию ключевую роль играет белок Munc13-4 [135].

Интересно, что в покоящихся клетках Rab27 и Munc13-4 связаны не с гранулами, а, соответственно, с поздними и с рециклизирующимися эндосомами. Слияние Rab27+ и Munc13-4+ везикул с гранулами происходит непосредственно перед прикреплением гранул к мембране и, вероятно, представляет собой еще один механизм, препятствующий случайной дегрануляции [194]. Слияние мембраны гранул с поверхностной мембраной NK-клетки обеспечивается взаимодействием белков v-SNARE (со стороны гранулы) и t-SNARE (со стороны поверхностной мембраны) [135, 214]. В результате слияния мембран происходит собственно дегрануляция, т.е. выход содержимого цитотоксических гранул в щель ИС — полость глубиной около 50 нм [191], отграниченную от межклеточной среды барьером из молекул адгезии (pSMAC). Гранула при этом запустевает, а ее мембрана встраивается в наружную мембрану NK-клетки. Однако возможна и неполная дегрануляция, когда содержимое гранулы секретируется лишь частично, после чего сообщение полости гранулы с внеклеточной средой закрывается и гранула отходит от мембраны в глубь цитоплазмы [182]; значение и механизмы этого явления неясны. После дегрануляции NK-клетка остается конъюгированной с клеткой-мишенью около часа, что, вероятно, необходимо для индукции апоптоза [214], а также, возможно, для эндоцитоза цитотоксических белков (в частности, гранзима B), выделившихся в полость ИС, но не поглощенных клеткой-мишенью для быстрого восстановления литического потенциала [179].

Наиболее очевидный способ оценки дегрануляции — измерение уровней содержимого гранул в культуральном супернатанте NK-клеток (например, с помощью Вестерн-блоттинга, иммуноферментного анализа или путем измерения активности гранзимов) [198]. Кроме того, количество клеток, секретирующих перфорин, можно оценить методом ELISPOT (enzyme-linked immunospot) [296].

Недостаток данного подхода — необходимость использовать очищенные NKклетки, т.к. иначе нельзя точно судить об источнике перфорина/гранзимов. Кроме того, поскольку значительная часть перфорина и гранзимов поглощается клетками-мишенями, то измерение их свободных уровней в супернатанте ведет к недооценке их реальной секреции.

Другой подход — измерение убыли секретируемых белков внутри клетки, например с помощью иммунофлюоресцентной окраски и проточной цитометрии.

Чувствительность этого подхода невысока, т. к. при однократной литической атаке NK-клетка выбрасывает лишь небольшую часть цитотоксических белков, потери которых к тому же восполняются за счет повторного использования или синтеза de novo.

Наконец, еще один подход основан на том факте, что при дегрануляции NKклетки происходит слияние мембраны литических гранул с поверхностной мембраной, в результате чего мембранные белки, располагающиеся на внутренней поверхности гранул, оказываются на поверхности NK-клетки (экстернализируются), где могут быть выявлены с помощью иммунофлюоресцентной окраски. К числу таких белков относятся CD107a (LAMP-1 или lysosome-associated membrane protein-1) и родственный ему CD107b (LAMP-2) [224]. Эти два высокогликозилированных белка составляют около 50% мембранных белков лизосом и их производных [141]. Вероятно, они защищают мембрану гранул, а после дегрануляции — также и поверхностную мембрану цитотоксического лимфоцита от повреждения цитотоксическими белками.

Экстернализация CD107a была предложена в качестве маркера дегрануляции вначале для CD8+ Т-клеток [86], а затем для NK-клеток [74] и CD4+ Т-клеток [102]. Экстернализацию CD107a оценивают после кратковременной (2—4 ч) стимуляции клеток in vitro. В качестве стимуляторов NK-клеток обычно используют клетки K562 (MHC-I-негативная клеточная линия, полученная от больного эритромиелоидным лейкозом и являющаяся классической мишенью NK-клеток), другие NK-чувствительные клеточные линии, моноклональные антитела к активационным рецепторам NK-клеток, а также нерецепторные стимулы (форбол-12-миристат-13-ацетат в сочетании с иономицином) [74].

Результаты теста на экстернализацию CD107a обычно оценивают с помощью проточной цитометрии [74, 99]. Тест получил широкое распространение, что обусловлено следующими его преимуществами: 1) относительная простота; 2) высокая чувствительность; 3) возможность визуализировать и подсчитывать «настоящие» эффекторные лимфоциты, т.е. клетки, отвечающие на ту или иную стимуляцию выбросом цитотоксических белков; 4) возможность определять фенотип дегранулирующих клеток; 5) возможность одновременно исследовать другие функции дегранулирующих и недегранулирующих клеток, в частности продукцию ими цитокинов. По данным Tomescu и соавторов, CD107a+ и CD107a– NK-клетки, полученные после 3-часовой коинкубации с клетками K562, не различаются по внутриклеточному содержанию перфорина и гранзимов [275], неизвестно, существуют ли более чувствительные маркеры дегрануляции, чем CD107a/b.

Значение CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток, а также значимость реакции дегрануляции NK-клеток в оценке функций NK-клеток при первичных иммунодефицитах подтверждена в работах Муругина и соавт. [36, 37, 38].

Муругин и соавт. отмечают, что CD107a является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции NK-клеток, чем CD63 [36]. Лишь небольшая часть циркулирующих NK-клеток и их CD56dim субпопуляции дегранулирует при взаимодействии с NK-чувствительными клетками-мишенями K562, при этом значительная часть NK-клеток активируется, но не дегранулирует, причм более высокий процент дегранулирующих клеток наблюдается в субпопуляции CD56dim CD159a+ CD94bright CD335dim NK-клеток [36]. У здоровых доноров в возрасте до 50 лет NK-активность МНК коррелирует с процентным содержанием NK-клеток среди МНК и с процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками K562, но не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в NK-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной NK-клеткой при взаимодействии с клетками K562. У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной NK-активности МНК; нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562 [38].

При синдроме Вискотта—Олдрича резко снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на рецепторный стимул (K562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением NK-активности у этих больных, корреляция между показателями дегрануляции NK-клеток и NK-активностью МНК отсутствует [36]. При хронической гранулематозной болезни функциональные показатели NK-клеток существенно не изменены. У пациентов с часто рецидивирующим герпесом как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии умеренно снижена дегрануляция NK-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение NKактивности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562 [37].

1.5 Современные подходы к терапии простого герпеса 1.5.1 Ациклические нуклеозиды Элиминирование вируса из организма на данный момент развития науки не представляется возможным вследствие уникальной способности альфагерпесвирусов формировать состояние латентности в нейронах регионарных ганглиев [238]. Если элиминировать вирус невозможно, то необходимо добиться контроля над инфекцией, в связи с чем основными целями лечебных мероприятий при ПГ являются: а) ускорение разрешения клинических проявлений б) предупреждение развития осложнений в) уменьшение частоты рецидивов и улучшение качества жизни г) снижение риска передачи ВПГ здоровому партнру новорожденному [47, 105, 220] Стандартом фармакотерапии пациентов с ЧРПГ является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклеозидами (АЦН) [47, 105, 220]. Первый АЦН был создан и внедрн в практику в 1974 г.

британской фирмой Glaxo Wellcome Foundation LTD. Ацикловир – 9[(2гидроксиэтокси-)-метил]-гуанин – синтетический ациклический аналог пуринового нуклеозида дезоксигуанозина, нормального компонента ДНК.

Гуанозин – один из самых частых концевых и внутренних нуклеозидов ДНК герпесвирусов и составляет 16% всех повторов в цепях ДНК герпеса. Механизм действия ацикловира складывается из трех основных компонентов:1) Ацикловир высокоспецифичен ферменту тимидинкиназе именно герпесвирусов, поэтому АЦВ ингибирует in vitro и in vivo репликацию герпесвирусов человека, включая следующие (перечислены в порядке снижения противовирусной активности ацикловира в культуре клеток): вирус Herpes simplex 1 и 2 типов, вирус Varicella zoster, вирус Эпштейна-Барр и ЦМВ; 2) Тимидинкиназа герпесвирусов в тысячи фосфорилированный ацикловир накапливается практически только в инфицированных клетках (в остальных клетках его содержание не более 1%), чем объясняется отсутствие цитотоксических, тератогенных и мутагенных свойств; 3) вирусная ДНК-полимераза включает ацикловира трифосфат в цепочку вирусной ДНК вместо естественного дезоксигуанозинтрифосфата, что вызывает обрыв цепи и блокирует дальнейшую репликацию вирусной ДНК без повреждения клеток хозяина [45].

репликации вирусов на любой стадии и новые генерации вирусов не образуются.

Будучи включенным в какой-либо участок новой ДНК, ацикловир никогда не заменяется естественным гуанином [142].

Установлено, что у 5–7% пациентов, страдающих рецидивирующим герпесом (РГ), в процессе лечения развивается резистентность к ацикловиру или он изначально не оказывает лечебного действия. В большинстве клинических изолятов, полученных от АЦВ-резистентных больных, обнаруживается относительный дефицит вирусной тимидинкназы или ДНК-полимеразы, либо нарушение структуры ферментов вследствие генной мутации, что приводит к нарушению субстратной специфичности [РЛС]. Кроме того, АЦВ обладает низкой биодоступностью при пероральном приме (10-20%) и требует частого прима по 200 мг 5 раз в сутки или по 400мг 3 раза в сутки [47, 105, 220]. Вс это обусловило появление в клинической практике двух новых ациклических нуклеозидов – валацикловира и фамцикловира.

Валацикловир (Валтрекс) представляет собой L–валиновый эфир АЦВ.

Эфирная надстройка обеспечивает высокий уровень всасываемости после перорального прима, повышая биодоступность до 50-70% в зависимости о дозы [286]. Благодаря высокой биодоступности валтрекс является лидером по комплаентности среди аналогов нуклеозидов [128]. Механизмы действия валтрекса и АЦВ отличаются только на первом этапе: в кишечнике и печени валтрекс гидролизуется под действием фермента валацикловир-гидралазы и освобождается от эфирной надстройки, полностью (около 99%) превращаясь в АЦВ, который далее включается в синтез дефектных вирусных ДНК [286, 259].

Валацикловир является эффективным средством подавления рецидивов ГГ независимо от иммунокомпетентности пациентов [Марченко 2000, Corey 2004].

Достоинство валацикловира в сравнении с ацикловиром состоит в том, что его оральный прием создает концентрации ацикловира в сыворотке крови и других внутренних средах, эквивалентные тем, которые достигаются только при внутривенном введении ацикловира. Именно это позволяет пациенту уменьшить число приемов препарата при рецидиве до 2–х раз в день (в отличие от ацикловира, который принимают 5 раз в день) и принимать валацикловир 1 раз в день при супрессивной терапии.

Фамцикловир (Фамвир) является пролекарством другого синтетического аналога дезоксигуанозина – пенцикловира. Биодоступность и противовирусный спектр пенцикловира при пероральном приме сопоставимы с таковыми для АЦВ[ Spruance 1996] Биодоступность пенцикловира значительно повышается при применении его пролекарства – фамцикловира [94]. При применении фамцикловира биодоступность пенцикловира составляет 77% [223, 277], что превосходит биодоступность АЦВ при применении валацикловира, составляющую около 55 % [281]. Фамцикловир обладает рядом существенных преимуществ в сравнении с АЦВ. Это прежде всего его высокий аффинитет к тимидинкиназе, значительное блокирование синтеза ДНК in vitro в инфицированных клетках, более выраженное блокирование репликации вируса между примами препарата. Время, необходимое для достижения максимальной концентрации препарата, почти в 2 раза меньше, чем у АЦВ, соотношение концентрации препарата в клетках, поражнных вирусом, к концентрации в здоровых клетках 16,95:1 In vivo резистентность ВПГ к фамцикловиру не превышает 0,3%.

Валацикловир и фамцикловир имеют важные различия в тропности к ферментам герпесвирусов. Так, фамцикловир в 75-100 раз активнее валацикловира фосфорилируется тимидинкиназой, что создат перевес синтетического нуклеозида над естественным. В свою очередь, валацикловир в 160 раз активнее фамцикловира тропен к вирусной ДНК-полимеразе, что обрывает процесс наращивания цепи вирусной ДНК. Многочисленными исследованиями доказана эффективноть терпи фамцикловиром ГГ. Так, в исследовании Diaz-Mitoma et al. доказана эффективность всех трх режимов дозирования фамцикловира в сравнении с плацебо (125х3, 250х3, 250х2) [123]. В противорецидивной терапии ГГ фамцикловир при приме внутрь 2 раза в сутки, также как и валацикловир [90, 277], был сопоставим по эффективности с АЦВ, принимаемым 5 раз в сутки [110]. Накопленные данные позволяют говорить об абсолютной безопасности, высокой эффективности, хорошей переносимости препаратов и отсутствии значимых побочных эффектов при применении АЦВ [274]. Не отмечено и тератогенных эффектов АЦВ и валтрекса при приме во время беременности [265].

На данный момент согласно международным стандартам лечения ГВИ препаратами выбора являются Ацикловир, Валтрекс, Фамвир, показавшие равную эффективность и безопасность в ходе многочисленных клинических исследований [105, 200].

В настоящее время существует два варианта терапии рецидивирующего ПГ с использованием АЦН: эпизодическая и превентивная (супрессивная) терапия.

Стратегию лечения больных с РПГ определяется рядом факторов: частота рецидивов, тяжесть клинических симптомов (на основании субъективной оценки больного), состояние иммунной системы, психосоциальные особенности, наличие риска передачи инфекции половому партнеру или новорожденному, а также экономические аспекты терапии.

Эпизодическая терапия подразумевает пероральный прием препаратов в момент обострения инфекции. Для эпизодической противовирусной терапии ГГ Центром по контролю за заболеваемостью рекомендовано начало терапии в продромальный период, но не позже 1 суток появления кожных проявлений [105] в одном из следующих режимов: АЦВ 400 mg 3 раза в сутки в течении 5 дней, либо 800 мг 2 раза в сутки в течение 5 дней, либо 800 мг 3 раза в сутки в течение дней, или фамцикловир 125 мг 2 раза в сутки в течение 5 дней, либо 1000 мг раза в сутки в течение 1 дня, либо 500 мг однократно, затем 250 мг 2 раза в сутки в течение 2 дней, или валацикловир 500 мг 2 раза в сутки в течение 3 дней, либо 1г 1 раз в сутки в течение 5 дней. Клиинические рекомендации Российского общества дерматовенерологов [47] предписывают следующие режимы эпизодической терапии ГГ: АЦВ 200 мг 5раз в сутки в течение 5 дней, либо 400мг 3раза в сутки в течение 5 дней, или валацикловир 500мг 2 раза в сутки в течение дней,или фамцикловир 125 мг 2 раза в сутки в течение 5 дней. Такой метод терапии показан больным с редкими, клинически невыраженными обострениями и при наличии четко определяемого продромального синдрома, во время которого следует начинать прием препаратов [265].



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«НИКИТИН Евгений Александрович ДИФФЕРЕНЦИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА (14.01.21 – Гематология и переливание крови) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант : академик РАН А.И. Воробьев Москва Оглавление Раздел Стр. Список сокращений Введение 1 Актуальность проблемы 1.1 Цель и задачи исследования 1.2 Научная...»

«Призова Наталия Сергеевна МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ СКРИНИНГА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В КРУПНОМ АДМИНИСТРАТИВНОМ РЕГИОНЕ Специальности: 14.01.12 – онкология; 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н., профессор,...»

«Винокурова Ирина Геннадьевна ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ РИСКА У ЛИЦ С НОРМАЛЬНЫМ ДАВЛЕНИЕМ И БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА 14.01.04 – внутренние болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Арабаджи Оксана Анатольевна Состояние гемостаза и уровень гомоцистеина у женщин на фоне приема синтетических прогестинов с контрацептивной и лечебной целью 14.01.01 – акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук,...»

«Агиевич Татьяна Борисовна ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ ТКАНИ У БОЛЬНЫХ С ОКСАЛАТНОЙ НЕФРОПАТИЕЙ 14.01.04 – внутренние болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Н. В. Воронина Хабаровск,...»

«КУЧИН НИКИТА ЕВГЕНЬЕВИЧ МЕДИКО-СОЦИАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ МОЛОДЕЖИ ПРИЗЫВНОГО ВОЗРАСТА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИНФОРМАЦИОННОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ВОЕННО-ВРАЧЕБНОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ 14.02.03 - Общественное здоровье и здравоохранение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель :...»

«Воробьев Владимир Иванович Высокодозная программная риск-адаптированная терапия лимфомы из клеток мантии. 14.01.21 –Гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Е.В. Домрачева Кандидат медицинских наук, доцент С.К. Кравченко Москва-20...»

«АМИРАСЛАНОВ Эльрад Юсифович ПРОГНОЗИРОВАНИЕ АКУШЕРСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ПАЦИЕНТОК С НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ДИСПЛАЗИЕЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ 14.01.01 – акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Кан Н.Е.,...»

«БУТОВСКИЙ ДМИТРИЙ ИГОРЕВИЧ ОПТИМИЗАЦИЯ ДЕЙСТВИЙ ВРАЧА ПРИ ОСМОТРЕ ТРУПА НА МЕСТЕ ЕГО ОБНАРУЖЕНИЯ В УСЛОВИЯХ МЕГАПОЛИСА 14.03.05 - СУДЕБНАЯ МЕДИЦИНА...»

«ИВАННИКОВ ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ НЕКОТОРЫЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ ПЛАЗМЕННОГО ГЕМОСТАЗА И ИХ ДИАГНОСТИКА ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ГЕПАТИТАХ И ЦИРРОЗАХ ПЕЧЕНИ Специальность 14.01.04 - Внутренние болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор...»

«Максимов Александр Викторович СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ОЦЕНКА ДЕФЕКТОВ ОКАЗАНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ ПОСТРАДАВШИМ С СОЧЕТАННОЙ ТРАВМОЙ 14.03.05 - судебная медицина Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор В.А. Клевно Москва – 2013 г. ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Мочалова Анна Сергеевна КАЧЕСТВО ЖИЗНИ ПАЦИЕНТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМЫ ХОРИОИДЕИ 14.01.07 Глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : Панова Ирина Евгеньевна доктор медицинских наук, профессор Челябинск...»

«КУЛИКОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА ПРИНЦИПЫ ПРОФИЛАКТИКИ РАЗВИТИЯ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ВЕНТРАЛЬНЫХ ГРЫЖ ПОСЛЕ СРЕДИННОЙ ЛАПАРОТОМИИ 14.01.17. – хирургия Диссертация на соискание ученой степени...»

«САШКО Сергей Юрьевич СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА ПОВРЕЖДЕНИЙ И СЛЕДОВ ОТ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОБЪЕКТОВ С РЕЗИНОВОЙ СЛЕДООБРАЗУЮЩЕЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ Специальность 14.03.05 – судебная медицина Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант : доктор...»

«Марданян Гайк Ваникович КЛИНИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ЧРЕСКОЖНЫХ КОРОНАРНЫХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТЕНТОВ С РАЗНЫМИ ТИПАМИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПОКРЫТИЯ 14.01.26 – сердечно-сосудистая хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель д.м.н., профессор С.А. Абугов...»

« БАРИНОВ ВИКТОР ЕВГЕНЬЕВИЧ ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРЫХ ВЕНОЗНЫХ ТРОМБОЗОВ У ХИРУРГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ С ВЫСОКИМ РИСКОМ ТРОМБОЭМБОЛИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ 14.01.17 – хирургия Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант : доктор медицинских наук профессор Бояринцев В.В. МОСКВА ОГЛАВЛЕНИЕ стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.. ВВЕДЕНИЕ...»

«ЛОГУТЕНКО РОМАН МИХАЙЛОВИЧ РЕЛИГИОЗНО-АРХАИЧЕСКИЙ БРЕДОВЫЙ КОМПЛЕКС ПРИ ПАРАНОИДНОЙ ШИЗОФРЕНИИ (КЛИНИКО-ДИНАМИЧЕСКИЙ И РЕАБИЛИТАЦИОННЫЙ АСПЕКТЫ) 14.01.06 Психиатрия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«МАГОМЕДОВА САИДА АЛИРЗАЕВНА МЕДИЦИНСКИЕ И СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БОЛЕЗНЕЙ СИСТЕМЫ КРОВООБРАЩЕНИЯ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант : доктор медицинских наук, профессор В.С. Нечаев МОСКВА -...»

«Карякин Николай Николаевич Научное обоснование повышения эффективности управления медицинской помощью в условиях разграничения полномочий между уровнями власти Специальность: 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант Доктор медицинских наук, Профессор Н.Б. Найговзина Москва – 2014 2 Система здравоохранения в государстве может иметь самую различную структуру, формы организации, типы...»

«Шарафутдинова Анфиса Фаритовна Морфофункциональные изменения в организме животныхпод воздействием эраконда и крезацина 1 06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных; патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.