WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 |

«ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НА В-ХРОМОСОМАХ СИБИРСКОЙ КОСУЛИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ

СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

на правах рукописи

ДЕМЕНТЬЕВА ПОЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КОДИРУЮЩИХ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НА В-ХРОМОСОМАХ

СИБИРСКОЙ КОСУЛИ

03.01.07 Молекулярная генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Трифонов В. А.

Новосибирск-2013 2

Работа выполнена в лаборатории сравнительной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Новосибирск.

Автор выражает благодарность своему руководителю Владимиру Александровичу Трифонову и научному консультанту Александру Сергеевичу Графодатскому (ИМКБ СО РАН) за участие и помощь в работе.

Автор благодарит Дмитрия Аркадьевича Афонникова (ИЦИГ СО РАН, Новосибирск) за ценные советы по компьютерному анализу последовательностей и важные замечания при прочтении данной работы.

Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории сравнительной геномики ИМКБ СО РАН и лаборатории цитогенетики животных ИМКБ СО РАН за постоянную помощь и поддержку.

Оглавление Список принятых в работе сокращений и условных обозначений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 В-хромосомы

Происхождение В-хромосом

1.1.1.

1.1.1.1 Происхождение B-хромосом от аутосом

1.1.1.2 Происхождение В-хромосом от половых хромосом

1.1.1.3 Происхождение В-хромосом в результате межвидовой гибридизации

1.1.2 Отличительные свойства В-хромосом

1.1.2.1 Перспективы использования В-хромосом в биотехнологии

1.1.3 Структура В-хромосом

1.1.3.1 Молекулярный состав В-хромосом

1.1.3.2. Локализация уникальных аутосомных генов на добавочных хромосомах.............. 1.1.4 В-хромосомы млекопитающих





1.2 Сегментные дупликации и амплификация генов

1.3 Структура и функции генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3

1.3.1 Структура и функции гена TNNI3K

1.3.2 Структура и функции гена FPGT

1.3.3 Структура гена LRRIQ3

1.4 Род косуля Capreolus

1.4.1 Филогенетические связи семейства Cervidae

1.5 Хромосомная эволюция семейства оленьих (Cervidae)

1.6 Заключение

2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2. Методы

2.2.1 Культивирование культур клеток фибробластов и получение суспензии хромосом.. 2.2.2 Приготовление препаратов метафазных хромосом

2.2.3 GTG-бэндинг

2.2.4 Флуоресцентная in situ гибридизация

2.2.4.1 Гибридизация

2.2.4.2 Постгибридизационные отмывки, детекция и усиление сигнала

2.2.5 Полимеразная цепная реакция

2.2.6 DOP-ПЦР

2.2.7 Получение DOP библиотеки ДНК ВАС клонов

2.2.8 Мечение ДНК ВАС клонов

2.2.9 Полимеразная цепная реакция в реальном времени

2.2.10 Получение Cot10 ДНК косули

2.2.10.1 Реассоциация ДНК

2.2.10.2 Гидролиз однонитчатой ДНК S1-нуклеазой

2.2.11 Секвенирование ДНК

2.2.11.1 Секвенирование ДНК

2.2.11.2 Переосаждение ДНК

3. Результаты и обсуждение

3.1 Стандартизация кариотипа косули, выявление гомологичных районов аутосом косули, коровы и верблюда

3.2 Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули

3.2.1 Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули с помощью ВАС клонов коровы

3.2.2 Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули, с помощью ПЦР на библиотеке сортированных добавочных хромосом

3.3 Оценка копийности генов, присутствующих на добавочных хромосомах у сибирской косули

3.4 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и Вхромосом

3.4.1 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и Вхромосом гена LRRIQ3

3.4.2 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и Вхромосом генов TNNI3K и FPGT

3.5 Оценка эволюционной консервативности генов TNNI3K и FPGT

3.5.1 Сравнение первого экзона гена FPGT в ряду млекопитающих

3.5.2 Сравнение второго экзона гена FPGT в ряду млекопитающих

3.5.3 Сравнение третьего экзона гена FPGT в ряду млекопитающих

3.5.4 Сравнение четвертого экзона гена FPGT в ряду млекопитающих

3.5.5 Сравнение промоторной области гена TNNI3K у оленьих

3.5.6 Сравнение первого экзона гена TNNI3K у оленьих

3.6 Обнаружение транскрипционной активности копии гена FPGT, расположенного на В-хромосомах

4. Заключение

5. Выводы

Список литературы

Приложение 1. Нуклеотидные последовательности первого экзона гена FPGT у представителей семейства оленьих





Приложение 2. Нуклеотидные последовательности второго экзона гена FPGT у представителей семейства оленьих

Приложение 3. Нуклеотидные последовательности третьего экзона гена FPGT у представителей семейства оленьих

Приложение 4. Нуклеотидные последовательности первого экзона гена TNNI3K у представителей семейства оленьих

Список принятых в работе сокращений и условных обозначений дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ – дезоксигуанидинтрифосфат дТТФ – дезокситимидинтрифосфат дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат дУТФ – дезоксиуридинтрифосфат дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфат кДНК – кодирующая ДНК Для сокращенных латинских названий использовали трехбуквенные обозначения: первая буква родового названия и две видового (например, Capreolus pygargus Cpy) п.н. – пара нуклеотидов т.п.н. – тысяча пар нуклеотидов м.п.н. – миллион пар нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция TAE (Tris-acetate Buffer) – трис-ацетатный буфер ЭДТА – этилендиаминтетраацетат AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) – метод, применяющийся для исследований полиморфизмов ДНК BAC – искусственная бактериальная хромосома (Bacterial Artificial Chromosome) CHORI (Children’s Hospital Oakland Research Institute) – библиотека ВАС клонов различных организмов DAPI – 4, 6-диамидино-2-фенилиндол DOP (Degenerated Oligonucleotide Primer) – частично вырожденный праймер FISH – флуоресцентная in situ гибридизация FITC – флуоресцеинизотиоцианат лимитированной протеолитической обработкой препаратов метафазных хромосом и последующей окраской красителем Гимза LINE (Long Interspersed Elements) – длинные диспергированные повторы LTR (Long Terminal Repeats) – длинные концевые повторы, характерные для ДНК ретротранспозонов, фланкирующие функциональные гены PBS (Phosphate Buffer Solution) – фосфатный буфер PSR (Paternal Sex Ratio) – добавочная хромосома у осы Nasonia vitripennis SINE (Short Interspersed Elements) – короткие диспергированные повторы SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) – вариация в последовательности ДНК в одном нуклеотиде SSC (Standard Saline Citrate solution) – стандартный солевой буфер VNTR (Variable Number Tandem Repeats) – вариабельные тандемные повторы Введение Актуальность проблемы необязательностью для жизнедеятельности организма (Camacho et al., 2000).

Основная часть исследований по молекулярной организации В-хромосом показала, что добавочные элементы богаты повторенной некодирующей ДНК: LINE – элементами и SINE – элементами, теломерными и центромерными повторами, рибосомной ДНК, гистоновыми генами и не несут экспрессирующихся уникальных генов. Имеющиеся данные наводили применением молекулярных методов в последнее время был обнаружен целый ряд уникальных аутосомных генов, расположенных на Вхромосомах, у различных организмов: у паразитического гриба Nectria haematococca (Miao et al., 1991), у представителей семейства хищных (Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al., 2007; Duke Becker et al., 2011), у амазонской моллинезии Poecilia formosa (Cyprinodontiforme, Poecillidae) (Lamatsch et al., 2011), у эндемичного вида цихлид озера Виктория (Yoshida et al., 2011), а также в рисе Secale cereale (Martis et al., 2012). Кроме того, в В-хромосомах риса были обнаружены копии митохондриальной и хлоропластной ДНК (Martis et al., 2012).

Вопрос о транскрипционной активности генов, расположенных на Вхромосомах млекопитающих, долго оставался спорным и открытым. Была показана экспрессия рибосомных генов, лежащих на добавочных элементах, у растений (Leach et al., 2005) и животных (Rubtsov et al., 2004; Ruiz-Estevez et al., 2012). Однако обнаружение в данном исследовании транскрипта FPGT-TNNI3K, экспрессирующегося с дуплицированных генов на Вхромосомах в культуре фибробластов сибирской косули – является первым расположенных на добавочных элементах кариотипа млекопитающих.

Варьирование копийности функционально значимых генов в зависимости от числа В-хромосом может оказаться критическим для жизнедеятельности вида. Таким образом, проведенное в данной работе подробное картирование В-хромосом сибирской косули выявило важные функциональные последовательности, локализованные на добавочных элементах, и показало их экспрессию, что способствует пересмотру представления о Вхромосомах и необходимости учитывать их возможную роль в жизнедеятельности организма и в эволюции геномов.

Первоочередной задачей нашего исследования была разработка метода идентификации генов на В-хромосомах позвоночных. В основу нашей методики был положен метод SHAC (глава 2.1). Были созданы млекопитающих, и, в частности, сибирской косули. Из них было отсеквенировано 45 клонов. Некоторые из этих клонов были представлены в генном банке под следующими номерами: JN871269-JN871285 (глава 3, таблица 2). Среди клонов были обнаружены транскрипты уникальных генов, большинство из которых были гомологичны ген-содержащему району хромосомы 3 коровы.

Цель и задачи исследования С учетом имеющейся базы целью представленной работы было детальное картирование В-хромосом сибирской косули Capreolus pygargus (2n=70+0-12B) дуплицированных генов, расположенных на В-хромосомах.

Поскольку косуля не относилась к числу видов, вовлеченных в исследования по картированию генома, то генетический состав и гомология хромосом косули с хромосомами хорошо картированных видов не были известны, а кариотип был охарактеризован только классическими цитогенетическими методами. Поэтому первой задачей данной работы являлась стандартизации кариотипа косули и выявление гомологичных районов хромосом косули, верблюда и коровы с помощью хромосомного пэйнтинга. Второй задачей нашей работы было проведение “грубого” картирования участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули, с помощью флуоресцентной in situ гибридизации ВАС клонов коровы. А также выявление границ и примерного размера аутосомных участков ДНК косули, локализованных на В-хромосомах, с помощью ПЦР на библиотеке сортированных добавочных хромосом.

Данные картирования добавочных элементов не дают ответа на вопрос о копийности участков, расположенных на В-хромосомах, поэтому третья задача нашего исследования заключалась в оценке копийности генов, лежащих на добавочных элементах, у сибирской косули с разным числом В-хромосом с помощью ПЦР в реальном времени.

Четвертая задача нашего исследования – выявление различий первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и Вхромосом с помощью секвенирования – позволила обнаружить В-хромосомспецифичные замены. Данные замены выступают в качестве маркеров при оценке экспрессии генов, расположенных на добавочных элементах.

Пятая задача нашего исследования – оценка эволюционной консервативности генов, локализованных на В-хромосомах, путем сравнения экзонов этих генов у косули, лося, марала, мазама и других видов позвоночных. Степень консервативности генов, расположенных на Вхромосомах, позволит ответить на вопрос о роли добавочных хромосом в эволюции геномов.

Доказательство транскрипционной активности дуплицированных копий генов, расположенных на В-хромосомах, путем выявления аналогичных нуклеотидных замен в ДНК В-хромосом и в клонах кДНК было шестой задачей нашего исследования.

Научная новизна и практическая ценность Впервые проведена стандартизация кариотипа косули относительно кариотипов коровы и верблюда, с помощью хромосомного пэйнтинга выявлены гомологичные районы хромосом косули, верблюда и коровы.

Обнаружены восемь перестроек, разделяющих кариотипы коровы и косули, из них шесть слияний хромосом в линии косули, одно слияние в линии коровы и одна инверсия на хромосоме 11 сибирской косули.

Впервые показано, что на добавочных хромосомах сибирской косули локализуется район размером около 2 м.п.н., гомологичный участку хромосомы 3 коровы (74.6 – 76.4 м.п.н.) и несущий такие важные гены как TNNI3K, FPGT и LRRIQ3.

Удалось установить, что копийность участков генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ прямопропорциональной зависимости. Не все В-хромосомы содержат копии участков этих генов, что говорит об их гетерогенном составе.

Обнаружено, что копии генов, локализованные на В-хромосомах сибирской косули, имеют высокую степень гомологии с аутосомными копиями и не подвергаются влиянию отбора. Однако в двух случаях были обнаружены несинонимичные В-хромосом-специфичные замены: во втором экзоне гена LRRIQ3 и во втором экзоне гена FPGT. Кроме того, в начале первого экзона гена FPGT, в качестве кодона, выполняющего функцию инициации трансляции, выявлен кодон GUG на В-хромосомах вместо AUG относительно рассмотренного ряда позвоночных. Поскольку замены, обнаруженные на добавочных хромосомах, совпали с заменами, обнаруженными в клонах кДНК, был сделан вывод о транскрипционной активности этих генов. Хотя степень экспрессии этих генов может быть низкой, о чем свидетельствует наличие альтернативного кодона GUG, отвечающего за инициацию трансляции. Вместе с тем, добавочные хромосомы могут служить дополнительным источником новых вариантов кодирующих последовательностей за счет накопления мутаций в локализованных на них дуплицированных генах и, ввиду показанной нами экспрессии этих генов, оказывать огромное влияние на жизнедеятельность организма.

Использование разработанных нами молекулярных подходов по картированию В-хромосом сибирской косули в дальнейшем может облегчить задачу исследования молекулярной организации добавочных хромосом у других видов позвоночных.

Апробация работы По результатам работы в соавторстве опубликовано три статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК России.

конференциях:

Левитского Г.А. "Хромосомы и эволюция" (Санкт-Петербург, 2. Международная конференция "Хромосома 2009" (Новосибирск, "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и биоинформатика" (Новосибирск, 14-17 ноября 2011 г);

4. 19-я международная хромосомная конференция (Болонья, Вклад автора Автором выполнена вся экспериментальная работа, включающая локализацию ВАС клонов с помощью FISH и скрининг В-хромосомных библиотек с помощью ПЦР. Автором также проведена оценка копийности участков, представленных на добавочных хромосомах, с помощью ПЦР в реальном времени и секвенирование копий генов, лежащих на Вхромосомах и аутосомах у сибирской косули, европейской косули, лося, хромосомного пэйнтинга была проведена совместно с к.б.н. А.И.

Кулемзиной (ИМКБ СО РАН, Новосибирск). DOP-библиотека В-хромосом и библиотека В-хромосом-специфичной кДНК были получены П.О’Брайен (Центр сравнительной геномики, Кембриджский университет, Великобритания) и зав. лаборатории сравнительной геномики ИМКБ СО РАН к.б.н. В.А. Трифоновым. Обработка, анализ, интерпретация данных и подготовка публикаций были выполнены при участии автора.

Структура и объем диссертации Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 216 ссылок. Диссертация изложена на 148 страниц машинописного текста, содержит 12 таблиц, 18 рисунков и 4 приложения.

1. Обзор литературы В-хромосомы определяют как сверхчисленные, добавочные или необязательные элементы кариотипа. Впервые В-хромосомы были описаны Вильсоном с соавторами в 1907 году у одного из видов краевиков (Metapodius, Coreidae) (Wilson et al., 1907). Позднее добавочные хромосомы были обнаружены у растений: ржи посевной (Secale cereale) (Gotoh, 1924) и кукурузы сахарной (Zea mays) (Kuwada, 1925; Longley, 1927). В 1928 году Рэндольф впервые предложил термин В-хромосомы, для того, чтобы отличать их от основного набора, называемого А-хромосомами (Randolph, 1928). С тех пор добавочные хромосомы были обнаружены во всех основных группах грибов, растений и животных, за исключением птиц (Camacho et al., 2000). Было предположено, что отсутствие у птиц добавочных элементов кариотипа связано с небольшим размером генома птиц и низким содержанием повторов в нем (Vujosevic, Blagoevic, 2004).

трудностями, поскольку количество добавочных элементов может варьировать на внутри- и межиндивидуальном уровне. Так у плоскоиглого бандикута (Echymipera kalubu) В-хромосомы присутствуют только в тестикулярной ткани и роговом эпителии (Hayman et al., 1969). Кроме того, тканевой мозаицизм по числу добавочных хромосом был обнаружен у восточно-азиатской лесной мыши (Apodemus peninsulae) (Bekasova et al., 1980), лисицы (Vulpes vulpes) (Беляев и др., 1974) и других.

Добавочные элементы варьируют по размерам от мелких точечных элементов кариотипа (большинство описанных В-хромосом относят к этой группе) до довольно крупных хромосом, сопоставимых по размеру с первыми самыми крупными аутосомами. Крупные В-хромосомы довольно редки и описаны лишь у нескольких видов: белохвостой чешуехвостой перепончатопалой крысы (Holochilus brasiliensis) (Nachman., 1992), восточно-азиатской лесной мыши (Apodemus peninsulae) (Волобуев, Тимина, 1980), енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides) (Wurster–Hill et al., 1986).

метацентрические, субметацентрические, акроцентрические и точечные Вхромосомы.

Появление добавочной хромосомы – чрезвычайно необычное для организма явление. В настоящее время существуют несколько теорий происхождения B-хромосом: от аутосом, от половых хромосом и в результате межвидовой гибридизации.

По гипотезе Палестиса с соавторами (Palestis et al., 2004) именно в добавочные элементы. Авторы основывают свое предположение на мейотического драйва как результат особенностей мейоза в женском организме, и статистической оценке частоты встречаемости добавочных хромосом в современных видах. У одних видов максимальное число элементов в ходе женского мейоза отходит в яйцеклетку, и эволюция кариотипа этих видов будет идти в сторону накопления акроцентрических хромосом (и, соответственно, В-хромосом). У других видов, наоборот, в яйцеклетку отходит минимальное число центромер, и тогда в кариотипе преобладают метацентрические элементы (De Villena, Sapienza, 2001).

Традиционно считается, что В-хромосомы являются производными Ахромосом. В частности, В-хромосомы могут вести свое происхождение от полисомных А-хромосом. Добавочные элементы могут образовываться из акроцентрических А-хромосом. Например, В-хромосомы у Drosophila albomicans образовались из центрических фрагментов, возникших в результате слияние предковой половой хромосомы и третьей аутосомы (Zhou et al., 2012). Появление В-хромосом также возможно в результате амплификации прицентромерных районов фрагментированных А-хромосом (Jones et al., 1982). Последняя из трех гипотез нашла подтверждение в работе Кейл и Хагели (Keyl, Hagele, 1971). Авторы показали, что политенная В-хромосома мотыля (Chironomus plumosus) ведет свое основываясь на одинаковой картине исчерченности этих двух структур.

Также была проведена работа, демонстрирующая, что в добавочных повторенные последовательности ДНК, которые также расположены и на Ахромосомах. Однако конкретная А-хромосома, от которой В-хромосомы могли вести свое происхождение, так и не была индентифицирована (Jamilena et al., 1994, 1995). Гипотеза о происхождении добавочных хромосом от аутосом была подтверждена в случае лисицы и енотовидной собаки (Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al., 2007). Было показано, что в В-хромосомах содержатся копии 10 аутосомных районов (Duke Becker et al., 2011). В случае саранчи перелетной Locusta migratoria было показано, что добавочные элементы ведут свое происхождение от хромосомы 8 (Teruel et al., 2010).

продемонстрировано, что В-хромосомы вида Lithocromis rubripinnis ведут свое происхождение от хромосомы 1, несущей локусы, отвечающие за определение пола (Yoshida et al., 2011). Кроме того, аутосомное происхождение добавочных хромосом было показано и в виде кузнечиков (Abracris flavolineata) последовательностей U2 snRNA на А- и В-хромосомах (Bueno et al., 2013).

1.1.1.2 Происхождение В-хромосом от половых хромосом Существует предположение, что предшественниками некоторых Вхромосом являются половые хромосомы, поскольку организмы являются более толерантными к полисомному статусу половых хромосом, по сравнению с аутосомами (Hewitt et al., 1973). Возникновение добавочной хромосомы из половой хромосомы было показано на примере плавучей кобылки (Eyprepocnemis plorans). При помощи FISH удалось установить, что В2-хромосома состоит из тандемного повтора длиной 180 п.н. и рибосомной ДНК, что также оказалось характерно и для хромосомы Х (Lopez-Leon et al., 1994). Таким образом, можно предположить, что амплификации двух типов последовательностей перицентромерного района хромосомы Х. Также описан случай возникновения В-хромосомы у происхождение В-хромосомы от унивалентной половой хромосомы W. Эти выводы были сделаны на основании сравнения последовательностей ДНК и (Sharbel et al., 1998) и морфологии добавочной и половой хромосом (Green et al., 1993). В исследованиях В-хромосом цихлид озера Виктория авторы работы предполагали происхождение добавочных элементов от локусов хромосомы 1, отвечающих за определение пола. Проведенная ими работа доказывает этот факт, поскольку в исследуемой популяции наличие Вхромосом в кариотипе влияло на распределение пола. Таким образом, данный случай демонстрирует происхождение добавочных элементов от половой хромосомы и их функциональность (Yoshida et. al., 2011).

1.1.1.3 Происхождение В-хромосом в результате межвидовой гибридизации принадлежит Баттаглия (Battaglia, 1964). Было продемонстрировано спонтанное появление В-хромосом при межвидовых скрещиваниях между двумя видами коикс Coix aquaticus и C. gigantean (Sapre et al., 1987). Подтверждением этой гипотезы также послужило открытие, что пецилии вида Poecilia formosa являются межвидовым гибридом P. mexicana и P. latipinna, причем популяцию P. formosa составляют только самки, использующие для оплодотворения семенную жидкость половых партнеров других видов, а в процессе развития зародышей отцовский генетический материал элиминируется.

Возникновение В-хромосом в данном случае связано с неполной элиминацией отцовских аутосом (Schartl et al., 1995). В 1997 году Макаллистер и Веррен описали случай происхождения В-хромосомы, называемой PSR, у паразитической осы (Nasonia vitripennis) в результате скрещивания с близкородственным видом Trichomalopsis. В этом случае Вхромосомами оказались фрагменты отцовских аутосом, которые подвергаются элиминации вследствие цитоплазматической несовместимости N. vitripennis и Trichomalopsis (McAllister, Werren, 1997).

PSR хромосома обеспечивает гаплодиплоидный тип размножения N.

vitripennis, полностью уничтожая отцовский генетический материал. Таким образом, эмбрион, образовавшийся в результате оплодотворения яйцеклетки сперматозоидами, несущими PSR, развивается в гаплоидного самца, вместо диплоидной самки (Nur et al., 1988). В настоящее время показано, что уничтожение отцовского генетического материала осуществляется за счет нарушения клеточного цикла, путем неверного фосфорилирования гистона Н3, в результате чего конденсиновый комплекс не образуется. Помимо всего прочего, PSR нарушает нормальную организацию хроматина в ядре (Swim et al., 2012). Таким образом, в данном случае добавочная хромосома N. vitripennis ведет себя как типично ”эгоистическая” ДНК.

На начальной стадии механизмы образования добавочных хромосом довольно разнообразны. Однако последующая генетическая изоляция Вхромосом и аутосом происходит на основе модели эволюции половых хромосом – храповика Меллера (Green, 1990; Beukeboom, 1994). Одно из главных требований для работы храповика Меллера – потеря способности рекомбинировать. Поэтому процесс возникновения добавочных элементов тесно связан с процессами, приводящими к относительно быстрой структурной модификации, ведущей к нарушению образования синапсиса.

На основе этого можно сделать предположение, что существуют клеточные механизмы, обеспечивающие быструю гетерохроматинизацию добавочных хромосом (Thomas, 1995), которая ведет к образованию В-хромосом (Hewitt 1973).

1.1.2 Отличительные свойства В-хромосом Суммируя свойства добавочных элементов, необходимо отметить, что, несмотря на гетерогенность данной группы, В-хромосомы обладают несколькими отличительными свойствами.

Во-первых, число добавочных хромосом может варьировать на внутрииндивидуальном, межиндивидуальном и межпопуляционном уровне (Bekasova et al., 1980).

вариабельности по числу В-хромосом, обнаруженный советскими исследователями у серебристо-черной лисицы. Были выделены стабильные и мозаичные кариотипы у этих животных. Причем, добавочные хромосомы отличались по морфологии, как в стабильных, так и в мозаичных кариотипах (Беляев и др., 1974).

Во-вторых, помимо унивалентов, В-хромосомы могут образовывать биваленты и мультиваленты. Случаи образования бивалентов выявлены у полевого хомячка (Akodon montensis) (Kasahara et al., 1978), у желтогорлой мыши (Apodemus flavicollis) (Vujosevic et al., 1989) и у восточно-азиатской лесной мыши (Bekasova, Vorontsov, 1975), а также у малой белозубки (Crocidura suaveolens) (Meylan, Hausser, 1974), у гренландского копытного лемминга (Dicrostonyx groenlandicus) (Berend et al., 2001), у бандикута вертлявого (Hayman et al., 1969), у енотовидной собаки (Nyctereutes procyonides) (Shi et al., 1988a), у длиннохвостого мешотчатого прыгуна (Patton et al., 1977), у серебристо-черной лисицы (Vulpes fulvus) (Switonski et al., 1987) и у обыкновенной лисицы (Раджабли и др., 1978). Причем у лисицы в мейозе были обнаружены биваленты и триваленты, однако в большинстве случаев наблюдались униваленты. Преобладание унивалентов в мейозе является возможным объяснением случайного распределения Вхромосом (Раджабли и др., 1978). Помимо всего прочего, добавочные элементы в большинстве случаев не рекомбинируют с основным набором хромосом. Однако показано, что у гренландского копытного лемминга Вхромосомы помимо унивалентов, бивалентов и тривалентов образуют синапсис и с Y-хромосомой (Berend et al., 2001). У черно-бурой лисы (Vulpes vulpes) также была показана рекомбинация добавочных хромосом с А-хромосомами (Basheva et al., 2010).

В-третьих, важной особенностью В-хромосом является их нерегулярное наследование. Поведение добавочных хромосом в митозе и мейозе резко отличается от поведения основного набора хромосом. Вхромосомы накапливаются в клетках зародышевого пути. В настоящее время известно о премейотическом, мейотическом и постмейотическом накоплении. Премейотическое накопление В-хромосом было описано у различных видов саранчовых. Неравномерное распределение В-хромосом в митозе приводит к образованию клеток с разным числом добавочных элементов. При анализе семенников саранчовых наибольшее число Вхромосом было обнаружено в сперматогониях, что свидетельствует в пользу накопления добавочных элементов в зародышевой линии (Nur, 1969). У восточно-азиатской лесной мыши число добавочных элементов на стадии зиготены-пахитены в сперматоцитах было значительно выше, чем в клетках костного мозга, что говорит о накоплении В-хромосом в зародышевых клетках (Kolomiets et al., 1988). Мейотическое накопление Вхромосом было показано в случае длиннохвостого мешотчатого прыгуна (Perognathus baileyi) (Patton, 1977) и лесной мыши (Reithrodontomys megalotis) (Shelhammer, 1969), основанное на преобладающей миграции Вхромосом в ооцит, а не в полярное тельце. Постмейотическое накопление было описано у растений (Jones et al., 1991).

В-четвертых, добавочные хромосомы могут проявлять признаки “эгоистичной” ДНК (Jones, 1985). В большом количестве они оказывают неблагоприятное воздействие на приспособленность вида и понижают его способность к размножению, что, например, характерно для ржи посевной и эгилопса (Jones et al., 2008). Однако случаи, когда В-хромосомы обладают заметными адаптивными преимуществами, не были описаны.

1.1.2.1 Перспективы использования В-хромосом в биотехнологии В-хромосомы обладают рядом отличительных свойств, делающих возможным их использование в качестве искусственных хромосомных платформ. Одним из преимуществ добавочных элементов является их инертность на генетическом уровне. Кроме того, присутствие В-хромосом в низком числе не оказывает влияния на фенотип носителя. В большинстве случаев В-хромосомы не образуют синапсис с основным набором хромосом и, таким образом, могут быть использованы в качестве генетических векторов, несущих заданные функциональные трансгены (Jones et al., 2008).

Один из примеров использования добавочных элементов в качестве генетического вектора был показан у кукурузы: в результате встройки репортерного гена GUS, кодирующего -глюкуронидазу, в В-хромосомах кукурузы наблюдалась экспрессия этого гена во всех тканях растения, в том биотехнологическое значение (Yu et al., 2007).

В большинстве слуаев В-хромосомы обладают гетерохроматиновой природой, содержат повторенные последовательности и мобильные генетические элементы (Camacho et al., 2000, Camacho et al., 2005).

использованием С-окрашивания (Patton et al., 1972, 1977; Wurster-Hill et al., 1986). Путем встраивания 5-бромдезоксиуридина была показана поздняя репликация В-хромосом у черной крысы (Rattus rattus) (Raman, Sharma, 1974) и лисицы (Volobujev et al., 1976). У южноамериканского грызуна Nectomys squamipes (Yonenaga-Yassuda et al., 1988) картина встройки 5бромдезоксиуридина также ясно демонстрировала позднюю репликацию Вхромосом, за исключением проксимального бэнда длинного плеча. Кроме того, в В-хромосомах были найдены рибосомные и уникальные гены у различных видов организмов (Miao et al., 1991; Stitou et al., 2000; Rubtsov et al., 2004; Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al., 2007; Teruel et al., 2010;

Duke Becker et al., 2011; Lamatsch et al., 2011; Yoshida et al., 2011; Martis et al., 2012).

Гены рибосомной ДНК, детектированные методом Ag-окраски, были найдены в В-хромосомах у восточно-азиатской лесной мыши. При окрашивании нитратом серебра была выявлена транскрипционная активность ядрышкообразующих районов (ЯОР) в добавочных хромосомах (Rubtsov et al., 2004). Кроме того, ЯОР в В-хромосомах были обнаружены у южноамериканских грызунов Oryzomys angouya и Akodon montensis (Silva, Yonenaga-Yassuda, 2004). Неактивные гены рибосомных РНК в Вхромосомах были обнаружены у китайской енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides procyonoides) (Szczerbal, Switonski, 2003) и черной крысы (Stitou et al., 2000). Неактивные копии генов 18S рибосомной РНК найдены в В-хромосомах цихлид (Haplochromis obliquidens) эндемичного вида, обитающего в озере Виктория (Poletto et al., 2010). У растений волосовидной (Leach et al., 2005). Неактивные кластеры генов рибосомных РНК (5,8S и 25S), локализованные на добавочных элементах, были найдены в некоторых популяциях вида Brachycome dichromosomatica из семейства сложноцветные (Donald et al., 1997).

Сообщения о присутствии кластеров генов рибосомных РНК в добавочных хромосомах были получены и для насекомых, в частности, для E. plorans (Cabrero et al., 2003). Кроме того, оказалось, что копии генов рибосомных РНК на В-хромосомах кузнечика транскрипционно активны (Ruiz-Estevez et al., 2012).

Гибридизация теломерных проб хромосом енотовидной собаки с Вхромосомами этого вида выявила присутствие теломерных сигналов по всей длине добавочных элементов. Теломерные последовательности были последовательности только на концах хромосом (Wurster-Hill et al., 1988).

южноамериканского грызуна (Nectomys squamipes) (Silva, YonenagaYassuda, 2004).

Маккуэйд с соавторами с помощью микродиссекции исследовали молекулярную структуру В-хромосом сумчатой летяги (Petauroides volans).

центромерным районам аутосом (McQuade et al., 1994).

С помощью гибридизации было показано, что добавочные хромосомы хомячка (Reithrodontomys megalotis) содержат один из типов повторенных последовательностей – LINE – элементы (Peppers et al., 1997). Кроме того, у хромосомой среди позвоночных, наряду с разнообразными повторенными последовательностями был обнаружен ретротранспозон Gypsy (Ziegler et al., 2003).

микродиссекция с последующей двуцветной FISH. Этот метод был использован для изучения структуры В-хромосом японской енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides viverrinus). В-хромосомы этого вида были гомологичны между собой, но не имели гомологию с последовательностями аутосом. Причем В-хромосом-специфичные пробы локализовались на всех добавочных элементах в соответствующих частях хромосом, однако, картина локализации варьировала. Эти данные говорят о гетерогенной структуре добавочных элементов (Trifonov et al., 2002).

Кроме того, с помощью микродиссекции были изучены В-хромосомы восточно-азиатской лесной мыши. У этого вида встречается два типа Вхромосом-специфичного хроматина – В1 и В2. Некоторые добавочные элементы состоят только из В1 или из В2 типов, тогда как другие из того и другого типов хроматина. Оказалось, что В-хромосомы восточно-азиатской лесной мыши содержат последовательности, гомологичные центромерным районам половых хромосом и аутосом, и диспергированные повторы.

Причем последовательности В1 хроматина имели гомологию с последовательностями половых хромосом близких видов мышей Apodemus speciosus и A. agrarius, тогда как хроматин В2 оказался характерным только для добавочных элементов восточно-азиатской лесной мыши (Trifonov et al., 2002).

В кариотипе восточно-азиатской лесной мыши содержится два типа добавочных элементов – микро- и макро-В-хромосомы. При их анализе было показано, что микро-В-хромосомы состоят из двух типов ДНК, а макро-В-хромосомы делятся на две группы. В прицентромерных областях микро-В-хромосом содержатся повторы гомологичные повторам аутосом из районов, характеризующихся положительным С-окрашиванием. Также в микро-В-хромосомах содержится район, который не конденсируется при митозе и содержит специфические последовательности повторенной ДНК.

Макро-В-хромосомы можно разделить на две группы на основании гомологии их прицентромерных районов и прицентромерных районов аутосом, характеризующихся положительным С-окрашиванием. К первой группе, имеющей подобную гомологию, относят некоторых особей из Восточной Сибири и популяции восточно-азиатской лесной мыши, обитающие в Западной Сибири. К другой группе, где подобная гомология отсутствует, относят особей из Дальневосточной популяции, а также Восточной Сибири (Karamysheva et al., 2002; Rubtsov et al., 2004).

Основная часть исследований по молекулярной организации Вхромосом показала, что добавочные элементы богаты повторенной некодирующей ДНК: LINE – элементами, теломерными повторами, рибосомной ДНК, и совершенно не несут экспрессирующихся уникальных генов. Однако с разработкой и использованием новых молекулярных подходов в настоящее время описаны случаи локализации уникальных аутосомных генов на В-хромосомах различных видов организмов.

1.1.3.2. Локализация уникальных аутосомных генов на добавочных Первым уникальным аутосомным геном, обнаруженным на Вхромосомах млекопитающих, оказался протоонкоген C kit (сellular homolog for feline sarcoma viral oncogene v kit). Примечательно, что копии этого гена были найдены на всех В-хромосомах у двух видов отряда хищных – лисицы и енотовидной собаки (Graphodatsky et al., 2005). В связи с этим интересно рассмотреть структуру и функцию этого гена. C kit содержит 21 экзон (Vandenbark et al., 1992) и кодирует трансмембранную тирозиновую киназу, играющую ключевую роль в процессах пролиферации и клеточной дифференциации меланобластов и примордиальных половых клеток (Ashman, 1999). Район матричной РНК (1100 п.н.) гена C kit имеет гомологию со средней частью генома провируса саркомы кошек “ХардиЗукермана 4” (Besmer et al., 1986). В результате мутаций гена C kit возникает множество кишечных стромальных опухолей у человека, мыши, собаки и крысы (Heinrich et al., 2002).

последовательностей на аутосомах и В-хромосомах лисицы и енотовидной собаки осуществлялось с помощью методов ПЦР-картирования и секвенирования. Были определены размеры В-хромосомных фрагментов, гомологичных аутосомным участкам. Аутосомный фрагмент на Вхромосомах лисицы составляет минимум 480 т.п.н. и включает ген C kit, псевдоген Rpl23a и большой межгенный участок с 5’ и 3’ концов от C kit.

Аутосомный фрагмент в В-хромосомах енотовидной собаки составляет минимум 490 т.п.н. и включает ген C kit, псевдоген Rpl23a, часть гена KDR и большой межгенный участок с 5’ конца от гена C kit (Yudkin et al., 2007).

В результате данных исследований была подтверждена гипотеза о возникновении добавочных хромосом от аутосом. Кроме того, наличие одного и того же гена на добавочных хромосомах разных видов хищных, разошедшихся 12 млн. лет назад, предполагает наличие каких-то функций, обеспечивающих консерватизм этих элементов в эволюции (Graphodatsky et al., 2005).

В 2011 году Беккером с соавторами были подтверждены данные о локализации протоонкогена C kit на В-хромосомах хищных. Кроме того, были обнаружены новые гены, локализующиеся на добавочных элементах хищных, в том числе протоонкогены, ведущие свое происхождение от аутосомных районов. Среди протоонкогенов встретились такие как LRIG (leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain protein 1), RET (receptor tyrosine kinase), CTNND2 (cadherin-associated protein) и ген-супрессор опухолеобразования LRP1B (LDL receptor related protein 1B). На Вхромосомах лисицы были представлены семь из десяти аутосомных участков, на В-хромосомах китайской енотовидной собаки – пять из десяти аутосомных районов, на В-хромосомах японской енотовидной собаки – один из десяти районов.

последовательности, был локализован с помощью шести ВАС клонов и составлял 601 т.п.н. Данный район был картирован только на В-хромосомах китайской енотовидной собаки.

Район, содержащий ген C kit, был картирован на В-хромосомах лисицы, китайской енотовидной собаки и японской енотовидной собаки.

Последовательности, прилежащие к C kit, были представлены на добавочных хромосомах лисицы и китайской енотовидной собаки.

При помощи FISH было показано, что районы, содержащие гены C kit и LRIG1, дуплицированы на В-хромосомах китайской енотовидной собаки, однако точное число копий неизвестно.

На основании подробного картирования генома хищных с помощью ВАС клонов собаки, авторами была предложена гипотеза о том, что видообразование у хищных осуществлялось через хромосомные перестройки благодаря наличию специфических точек разломов, а Вхромосомы представляют собой артефакты этих перестроек и несут копии протоонкогенов, которые часто обнаруживаются вблизи “горячих” точек разломов (Duke Becker et al., 2011).

В 2011 году вышла в печать обширная работа, посвященная влиянию добавочных хромосом на соотношение полов в одной из популяции цихлид, проанализировали кариотипы одиннадцати видов цихлид из диких популяций. У большинства рыб В-хромосомы варьировали по размерам, что затрудняло точный подсчет добавочных элементов в кариотипе. В одном из видов цихлид добавочные элементы присутствовали в кариотипе только у самок. Для того чтобы выявить точное число добавочных хромосом в кариотипе у цихлид, у одного из видов рыб были изолированы В1 и В добавочные элементы с помощью микродиссекции, причем В1-хромосома была больше по размерам, чем В2-хромосома, и проведена флуоресцентная in situ гибридизация. Пэйнтинг пробы В1 и В2 метили и В1-, и В2хромосомы, при этом не наблюдалось сигнала на аутосомах. Хотя В1хромосома больше, чем В2-хромосома, проба В2 полностью метила В1хромосому. Эти данные показывают, что на В1- и В2-хромосомах содержатся повторенные последовательности, специфичные для добавочных элементов. Далее В1 проба была использована для выявления точного числа добавочных элементов у рыб из разных популяций. Было показано, что число добавочных элементов варьирует от нуля до трех, причем у рыб вида Lithocromis rubripinnis из популяции, обитающей возле острова Матумби, самки являлись носителями В-хромосом в кариотипе, тогда как у самцов добавочные элементы отсутствовали. Эти данные показывают, что в данной популяции наличие В-хромосом связано с полом.

Для того чтобы обнаружить влияние добавочных элементов на определение пола, были выполнены скрещивания самцов без В-хромосом и самок с различным числом В-хромосом (0В, 1В, 2В). В экспериментах с участием самок без добавочных элементов распределение полов было 1:1. В трех повторных скрещиваниях с самками, несущими одну В-хромосому, в новом поколении рождались самки в 74%, 91%, 79% случаев. В одном скрещивании с самками, несущими две В-хромосомы, в новом поколении появлялись самки в 100% случаев. Кариотипический анализ показал отсутствие В-хромосом у потомства, полученного от скрещиваний самок и самцов без В-хромосом, тогда как у потомства, полученного в результате скрещиваний самок с В-хромосомами и самцов без В-хромосом, наблюдалось повсеместное присутствие добавочных элементов в кариотипе.

Эти данные подтверждают существование локуса на добавочных хромосомах, влияющего на определение пола.

Влияние добавочных хромосом на определение пола у вида цихлид L.rubripinnis, вероятно, связано с тем, что эти хромосомы могут нести некоторые функциональные гены. Для подтверждения этой гипотезы исследователями была выделена В-хромосом-специфичная последовательность ДНК и клонирована в ВАС клон. Затем было проведено секвенирование полученного ВАС клона. В результате анализа отсеквенированной последовательности приходится на повторенные элементы: LTR, ретротранспозоны, LINE – элементы, SINE – элементы, транспозоны и простые повторы. Помимо всего прочего удалось обнаружить пять белок-кодирующих генов, которые оказались практически идентичны их аутосомным копиям, что позволяет сделать предположение об их функциональности. В частности, были найдены: второй экзон гена indian hedgehog homolog b, 12 экзонов (10-22 экзоны) гена Lysosomal amannosidase, весь ген Ribonuclease-like 2, первый и второй экзон гена VPS domain receptor protein SORCS 3–like, 11 экзонов (60-67, 70, 79-82 экзоны) гена Ryanodine receptor-like unnamed protein. Кроме того, было показано, что копийность гена indian hedgehog homolog b примерно в сорок раз выше на В-хромосомах по сравнению с аутосомами. Это говорит о том, что на добавочных хромосомах присутствуют множественные дупликации исследуемого гена.

Локализация ВАС клона, содержащего В-хромосом-специфичную ДНК, на хромосомы цихлид с помощью FISH показала наличие сигналов на коротком плече самой большой аутосомы (хромосома 1), также как и на добавочных хромосомах. На основании этих данных можно заключить, что В-хромосомы в кариотипе цихлид озера Виктория ведут свое происхождение от хромосомы 1, которая содержит локусы, отвечающие за определение пола. Однако подобные локусы, связанные с определением пола, не были найдены в результате секвенирования ВАС клона, содержащего В-хромосом-специфичную ДНК. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования добавочных элементов, направленные на поиск генов, влияющих на определение пола (Yoshida et. al., 2011).

Наличие В-хромосом в кариотипе у саранчи перелетной (Locusta migratoria) Цитогенетический анализ выявил, что проксимальная часть добавочных хромосом состоит из эухроматина, тогда как дистальная часть – из гетерохроматина (Cabrero et al., 1984). Затем было показано, что дистальный гетерохроматин состоит из А-Т обогащенной ДНК, а проксимальный район из Г-С обогащенной ДНК (Camacho et al., 1991). Далее, для того чтобы ответить на вопросы о происхождении В-хромосом и их молекулярном составе у саранчи перелетной, в 2010 году Теруэл и ее соавторами было проведено картирование повторенных последовательностей (45S и 5S рДНК, теломерной ДНК и Н3-Н4 гистоновых генов) аутосом и В-хромосом.

Кроме того, было проведено секвенирование геномых последовательностей ДНК саранчи без добавочных элементов и В-хромосом-специфичной ДНК, полученной с помощью микродиссекции. Оказалось, что гены Н3 и Н гистонов локализуются на хромосоме 8 саранчи перелетной и на добавочных элементах. Сравнение копий последовательностей гистона Н на В-хромосомах и аутосомах показало, что число синонимичных замен на сайт в копии гистона Н3 на добавочных хромосомах в три раза выше, чем на аутосомах. Причем число несинонимичных замен на сайт в копии гистона Н3 на В-хромосомах оказалось в 6,56 раз выше по сравнению с аутосомной локализующегося на добавочных хромосомах, намного консервативнее копии гена Н3. Таким образом, в данном исследовании впервые было продемонстрировано наличие мультигенного семейства гистонов на Вхромосомах и показано, что В-хромосомы ведут свое происхождение от хромосомы 8 саранчи перелетной.

Была дана оценка времени расхождения копий гистоновых генов аутосом и В-хромосом. Оказалось, что добавочные хромосомы достаточно давно (750 000 лет) отделились от аутосом и существуют в природных популяциях саранчи в течение долгого периода времени (Teruel et al., 2010).

У вида амазонской моллинезии Poecilia formosa (Cyprinodontiforme, Poecillidae) экспрессия генов, оказывающих влияние на пигментацию, связана с присутствием в кариотипе В-хромосом. Кроме того, добавочные элементы моллинезии содержат неохарактеризованные участки, благоприятствующие опухолеобразованию в пигментных клетках.

Подробное изучение В-хромосом моллинезии осуществлялось с помощью исследований полиморфизмов ДНК. Выделение добавочных хромосом посредством микродиссекции и гибридизация полученной библиотеки на метафазные хромосомы P. formosa показали, что В-хромосомы содержат последовательности сходные с повторенными прицентромерными и субтеломерными последовательностями аутосом. С помощью метода AFLP было выявлено, что В-хромосомы содержат, по крайней мере, одну копию района одной из аутосом, которая высококонсервативна в роде Poecilia (Lamatsch et al., 2011).

Еще одним уникальным исследованием, показывающим не инертную природу В-хромосом, было исследование добавочных элементов риса (Secale cereale). В результате тотального секвенирования В-хромосом риса были обнаружены последовательности ДНК гомологичные последовательностям аутосомных генов Brachypodium distachyon, риса (Oryza sativa) и сорго (Sorghum bicolor). Кроме того, на добавочных элементах Secale cereale также локализовалось значительное количество последовательностей митохондриальной и хлоропластной ДНК (Martis et al., 2012).

У паразитического гриба нектрии гематококка (Nectria haematococca), поражающего горох, было обнаружено три гена, обуславливающие его патогенность. Эти гены лежали на добавочных хромосомах и имели длину 25 т.п.н. Один из этих генов PDA1 кодировал цитохром P450 (Han et al., 2001). В добавочных хромосомах овса (Avena sativa) были обнаружены гены, отвечающие за устойчивость растения к ржавчине (Camacho et al., 2000).

Таким образом, применение современных молекулярных методов, таких как флуоресцентная in situ гибридизация, секвенирование и ПЦР в реальном времени, позволило обнаружить уникальные аутосомные гены, локализующиеся на В-хромосомах разных видов позвоночных, насекомых, и грибов.

В-хромосомы среди млекопитающих наиболее часто встречаются у видов, кариотипы которых состоят в основном из акроцентрических хромосом (Palestis et al., 2004).

Согласно Wilson и Reeder (1993) на сегодняшний день существует более 4,5 тысяч видов млекопитающих. По подсчетам, проведенным Вилошевичем, распространение В-хромосом среди видов млекопитающих составляет примерно 3,6% (Vujosevic, Blagoevic, 2004). Высказана гипотеза, что В-хромосомы намного реже встречаются у млекопитающих, чем у других организмов, в связи с низкой толерантностью млекопитающих к появлению дополнительных элементов генома (Vujosevic, Blagoevic, 2004).

Таблица 1. Млекопитающие, несущие добавочные хромосомы (по Vujosevic, Blagoevic, 2004).

(arviculoides) 31 Dicrostonyx torquatus 44-45 1- 33 Holochilus brasiliensis 48-51 1-2 SM, M Freitas et al., iherengi 53 Reithrodontomys megalotis 42 1-7 Mi Blanks, Shellhammer gazzelae *Примечания: М – метацентрическая хромосома, SM – субметацентрическая, А – акроцентрическая, mi – микрохромосома.

Согласно таблице 1, добавочные элементы в одних отрядах млекопитающих представлены очень широко, в других – встречаются очень редко или совсем отсутствуют. Так только в одном семействе Canidae отряда хищных у шести видов были обнаружены добавочные хромосомы. И единичное число видов, относящихся к отрядам насекомоядных, рукокрылых и приматов, содержат добавочные элементы в своем кариотипе. В отряде рукокрылых существует два вида, несущих Вхромосомы. В отряде насекомоядных встречается только один вид с Вхромосомами малая белозубка.

Из таблицы 1 также ясно видно, что рекордсменом по числу видов, несущих В-хромосомы, является отряд грызунов.

Вероятно, это связано с тем, что отряд грызунов отличается высокими темпами кариотипической эволюции и, соответственно, кариотип грызунов отличается наиболее высокой перестроенностью по сравнению с другими группами млекопитающих. Помимо грызунов данный феномен характерен и для семейства собачьих Canidae (Trifonov et al., 2002).

В отряде парнокопытных можно выделить четыре вида, несущих добавочные элементы: сибирская косуля (Capreolus pygargus) (Sokolov et al., 1978; Graphodatsky et al., 1990), большой мазама (Mazama americana) (Taylor et al., 1969), серый мазама (Mazama gouazoubira) (Neitzel et al., 1987) и кабарга (Moschus sibiricus) (Sokolov, Prikhodko, 1998). Примечательно, что все эти виды обладают кариотипом с большим числом акроцентрических хромосом.

1.2 Сегментные дупликации и амплификация генов Первые исследования генома человека были ориентированы на уникальные гены и, в меньшей степени, на некодирующие участки генома;

на второй план отодвигались районы, прилежащие к центромерам и теломерам. Недавние исследования структуры прицентромерных и субтеломерных последовательностей выявили, что эти районы часто содержат огромное число сегментных дупликаций (Bailey et al., 2001).

Сегментные дупликации – это дуплицированные блоки геномной ДНК, варьирующие по размерам от 1 до 200 т.п.н., имеющие взаимное сходство более 90% (Eichler, 2001). Они содержат высококопийные повторы, такие, как Alu и LINE – элементы, и генные последовательности с экзон-интронной структурой (Bailey et al., 2001). Возникновение новых функций организма осуществляется вследствие изменения генов и кодируемых ими продуктов. В течение долгого времени считается, что подобные изменения обеспечиваются сегментными дупликациями генома (Ohno et al., 1968).

Существенная роль сегментных дупликаций в эволюции геномов показана на различных примерах. Было выявлено, что многие семейства дупликаций ДНК у ранних хордовых (McLysaght et al., 2002). Кроме того, на основе филогенетических анализов было показано, что многочисленные сегментные дупликации возникали на ранних стадиях эволюции эукариот и, таким образом, обеспечивали возможность их успешной дивергенции (Zhou et al., 2010). После того, как было проведено полное секвенирование генома коровы, оказалось, что сегментные дупликации составляют примерно 3,1% генома. Причем, было показано, что сегментные дупликации в большинстве случаев обеспечивают хромосомные перестройки посредством негомологичной рекомбинации, и что участки, аккумулирующие сегментные дупликации, неслучайно распределяются в геномах парнокопытных (Elsik et al., 2009). Кроме того, было выявлено, что сегментные дупликации могут приводить к созданию новых функциональных интронов, что и происходило в предковой линии позвоночных челюстных около полумиллиарда лет назад (Hellsten et al., 2011).

C другой стороны, сегментные дупликации играют существенную роль в возникновении многих геномных заболеваний, таких как синдром Ангельмана и синдром Прадера-Вилли (Shaikh et al., 2000). Было показано, что развитие аутизма, шизофрении и эпилепсии также связано с сегментными дупликациями (Mefford, Eichler, 2009).

В геномах эукариот известны два основных механизма дупликации районов, кодирующих гены. Это ретротранспозиция и негомологичная рекомбинация.

Механизм трансдукции, связанный с ретротранспозицией мобильных элементов, был изучен наиболее детально. В результате были выявлены гены, претерпевшие дупликацию при участии семейства ретротранспозонов SVA. Ретротранспозоны SVA состоят из повторенных элементов, подобных SINE, VNTR, Alu. Отсюда и название “SVA” по первым буквам повторенных элементов, входящих в состав этих ретротранспозонов.

Семейство ретротранспозонов SVA возникло около 25 млн. лет назад и увеличилось до трех тысяч копий в геноме человека. С момента возникновения данного семейства 53 т.п.н. генома человека было дуплицировано в результате 143 трансдукционных событий, опосредованных различными типами SVA. Была идентифицирована группа SVA элементов, посредством которых был трижды дуплицирован ген AMAC в геноме человека. Таким образом, было показано, что ретротранспозонопосредованная трансдукция последовательностей не только является механизмом для перетасовки экзонов, но и механизмом дупликации генов и создания новых семейств генов (Xing et al., 2006).

Тандемные дупликации приводят к появлению пар изначально сходных генов, которые в результате перестройки могут попасть в разные части генома (Song et al., 1995). Если в результате дупликации возникла полная копия дуплицированного гена, включая регуляторную область, то это может привести к генной избыточности. В дальнейшем одна из копий генов вырождается до псевдогена или утрачивает свою функцию в результате хромосомных перестроек, делеций или точечных мутаций. Чаще всего для выполнения определенной функции достаточно одной копии гена, тогда как другая копия может аккумулировать эволюционно нейтральные мутации в кодирующем регионе. В результате данные мутации могут приводить к возникновению новых функций генов.

Имеется другая модель, объясняющая широкое распространение дуплицированных генов в геноме. Предлагается, что после дупликации обе копии генов после частичной утраты первоначальной функции комплементарно дополняют друг друга и восстанавливают изначальную функцию гена-предшественника (Force et al., 1999). Например, в результате изменений в регуляторных областях генов возможна экспрессия различных доменов этих генов, что может приводить к комплементации и восстановлению изначальной функции гена-предшественника (Force et al., 1999).

Было показано, что двуцепочечные разрывы в ДНК инициируют амплификацию генов и играют ключевую роль в определении структуры и размеров амплифицируемой ДНК (Windle et al., 1991). В клетках млекопитающих увеличение числа копий генов связано со степенью геномной неустойчивости, предрасположенностью к опухолеобразованию и амплификация генов наблюдается в опухолевых клетках и в клеточных линиях, имеющих высокое число копий онкогенов (Wright et al., 1990).

Отсутствие амплификации генов в нормальных клеточных линиях связано с эффективностью репарационных процессов, которые могут препятствовать повреждению ДНК и предотвращать пролиферацию поврежденных клеток.

В подтверждение этому было показано, что инактивация р53 гена, одного из наиболее важных генов, вовлеченных в контроль генной стабильности, способствует амплификации в нормальных клетках (Livingstone et al., 1992).

Мутации в гене АТМ, участвующем в сохранении стабильности генома, приводят к увеличению возможности амплификации генов (Mondello et al., 2001).

Сегментные дупликации обладают рядом общих закономерностей. В большинстве случаев сегментные генные дупликации располагаются тандемно. Со временем, дуплицированные копии перемещаются в другие районы хромосом. Кроме того, большинство генов дуплицируются дуплицированных сегментов. Особенно интересным является то, что гены с функциональными. Одним из примеров такой копии является ген, кодирующий ETS-2 рецептор и регулирующий пролиферацию клеточных линий рака. Другим примером является частичная копия гена Sp5, являющаяся фактором транскрипции. Копии этого гена и у человека, и у кодирующего района относительно полной копии этого гена и вмещают еще целый домен, идентифицируемый как цинковый палец. Среди других неполных копий этого гена были обнаружены разные варианты доменов, определенных как цинковые пальцы, которые были частично гомологичны доменам полной копии этого гена. Таким образом, было показано, что ген Sp5 подвергался нескольким раундам частичной дупликации и перемещался внутри генома (Suyama et al., 2006).

Помимо сегментных дупликаций выделяют еще CNV (Copy Number Variations) последовательности, или последовательности, варьирующие по числу копий. Главной характеристикой данного класса последовательностей является их внутрипопуляционный полиморфизм по копийности. При последовательностей человека на основе изучения 270 индивидуумов из четырех популяций, ведущих свое происхождение из Европы, Африки или Азии. В сумме было идентифицировано 1447 CNVRs (Copy Number Variable Regions), составляющих 360 м.п.н. (12% генома человека). Данные районы функциональные элементы и сегментные дупликации (Redon et al., 2006).

Таким образом, изучение сегментных дупликаций необходимо, как минимум по двум основным причинам. В районах сегментных дупликаций вызывающие различные заболевания (Sharp et al., 2006), а также специфичные точки разломов, по которым идут хромосомные перестройки (Bailey et al., 2004). Дуплицированные последовательности, в основном, подвергаются неравному кроссинговеру в процессе мейоза, что с одной стороны является преимуществом, так как обеспечивает пластичность генома, а с другой стороны, может вызывать мутации, приводящие к развитию заболеваний. Вторая причина заключается в том, что сегментные дупликации могут быть транскрипционноактивными и регулировать экспрессию специфических генов (Pink et al., 2011), а также обеспечивать образование новых генов и быструю адаптацию организма к меняющимся условиям, благодаря повышенным темпам мутирования дуплицированных участков (Han et al., 2009).

1.3 Структура и функции генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ В данной работе было показано, что копии генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3 расположены на добавочных хромосомах сибирской косули. Но наиболее интересным оказалось то, что копия гена FPGT транскрибируется.

В связи с этим возникла необходимость рассмотреть и обсудить структуру и функции этих генов.

Поскольку в настоящее время не проведено полное секвенирование генома сибирской косули, можно предположить, что гены TNNI3K, FPGT и LRRIQ по размеру и структуре сходны у коровы и косули. Кроме того, в силу консервативности функции этих генов одинаковы в ряду позвоночных, в том числе у косули и человека.

Ген TNNI3K (синоном CARK – (Cardiac Ankyrin Repeat Kinase)) локализуется в хромосоме 3 коровы, имеет протяженность 344 190 п.н. и состоит из 25 экзонов и 24 интронов (по данным genome.ucsc.edu). Ген TNNI3K экспрессируется только в сердце и, таким образом, продукт этого гена является сердечно-специфической киназой. Более подробное изучение межжелудочковой перегородке и сердечном апексе. Менее интенсивная экспрессия наблюдается в левом желудочке (Zhao et al., 2003).

Продукт гена TNNI3K содержит три рода доменов: N-концевой участок, состоящий из семи анкириновых повторов, протеин-киназный домен и С-концевой участок, обогащенный серином. Структурный домен продукта гена TNNI3K гомологичен структурному домену интегринсцепленной киназы (integrin-linked представляющей собой сериновую/треониновую киназу, которая взаимодействует с интегринами цитоплазмы, тем самым, обеспечивая регулирование реконструкции цитоскелета, клеточный рост, пролиферацию и дифференцировку клеток (Hannigan et al., 1996). Интегрин-сцепленная киназа локализуется в цитоплазме и является звеном ферментативного каскада, обеспечивающего подавление апоптоза и продвижение клеточного цикла (Dedhar et al., 2000).

кардиомиоцитов (Zhao et al., 2003), более чем на половину имеет сходную структуру с интегрин-сцепленной киназой и, таким образом, возможно, обладает похожими биологическими функциями с этим белком, включая клеточный рост, пролиферацию и дифференцировку кардиомиоцитов.

исследователями, которые показали, что продукт гена TNNI3K способствует улучшению сердечной деятельности путем увеличения частоты сокращений, причем размер клетки кардиомиоцита не изменяется. Кроме того, продукт гена TNNI3K предотвращает инфаркт миокарда путем подавления апоптоза за счет фосфорилирования белков р38 и JNK и ускоряет созревание кардиомиоцитов на ранних стадиях дифференциации.

Моделирование активности продукта гена TNNI3K может быть полезно при лечении ишемической болезни сердца (Lai et al., 2008).

Функции TNNI3K были также изучены в искусственно созданной биологической модели. Была создана трансгенная линия мышей с повышенной экспрессией кальций-связывающего белка, что в большинстве случаев в совокупности с влиянием определенного генетического фона приводило к развитию кардиомиопатии (Jones et al., 1998). Авторы этой работы исследовали семь генетических локусов, предположительно оказывающих влияние на развитие заболеваний сердца и конечный исход этого заболевания, одним из этих локусов был ген TNNI3K. Было показано, что повышенная экспрессия этого гена у трансгенных мышей не вызывала развитие кардиомиопатии, тогда как экспрессия мутантной формы этого гена приводила к усилению развития заболевания. Таким образом, было показано, что TNNI3K играет ключевую роль в определении пути, по которому пойдет развитие болезни сердца (Wheeler et al., 2009). Кроме того, в состав локуса, отвечающего за устойчивость к вирусному миокардиту у мышей, входили гены FPGT и TNNI3K (Wiltshire et al., 2011).

На основе статистического анализа SNPs в геноме человека было показано, что единичные замены в гене TNNI3K связаны с развитием гипертонии (Chen et al., 2010). Кроме того, был описан клинический случай, в результате которого единичная мутация в гене TNNI3K (R204H) обусловила развитие дефекта желудочковой перегородки у новорожденного. Первые признаки кардиомиопатии были обнаружены в возрасте 18 месяцев и, не смотря на медикаментозное лечение, понадобилась пересадка сердца (Yang et al., 2010).

существенную часть сложных углеводов, гликолипидов и гликопротеинов (Becker et al., 2003). Фукоза доступна для синтеза этих веществ через переходное состояние - ГДФ--L-фукозу. В большинстве случаев ГДФ--Lфукоза формируется в результате окислительно-восстановительных реакций и реакций полимеризации ГДФ--D-маннозы (Bulet et al., 1984). Однако в клетках млекопитающих существует альтернативный путь образования ГДФ--L-фукозы, который и катализируется ГТФ-L-фукоза фосфорилазой, являющейся продуктом гена FPGT (Fucose-1-phosphate guanylyltransferase).

В среднем приблизительно 10% фукозы в клетке метаболизируется по второму пути.

Впервые реакция с участием ГТФ-L-фукоза фосфорилазы была описана в 1998 году и выглядит следующим образом: продукт гена FPGT – ГТФ-L-фукоза фосфорилаза катализирует обратную реакцию формирования ГДФ--L-фукозы из гуанозин трифосфата и -L-фукоза-1-фосфата. Впервые этот белок был выделен из почки свиньи, и затем была получена его нуклеотидная и аминокислотная последовательность. Наибольшая экспрессия гена FPGT была обнаружена в почках свиньи, причем в легких, печени и поджелудочной железе наблюдалась меньшая экспрессия. С помощью нозерн анализа была выявлена экспрессия гена FPGT у человека в селезенке, предстательной железе, семенниках, яичниках, тонкой и ободочной кишке (Pastuszak et al., 1998). Одно из интересных явлений – альтернативный сплайсинг, способствующий образованию различных сочетаний доменов в транскриптах, был обнаружен у генов FPGT и TNNI3K (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids= 0526835). Т.е. можно ожидать, что данные гены помимо классических обладают и другими функциями.

Ген LRRIQ3 (leucine-rich repeats and IQ motif containing 3) в настоящее время является плохо изученным. Поэтому о структурных особенностях отсеквенированных последовательностей у разных организмов, в том числе у коровы. Ген LRRIQ3 локализуется в хромосоме 3 коровы, имеет протяженность 111 801 п.н. и состоит из 5 экзонов и 4 интронов (по данным genome.ucsc.edu). О функциях этого гена на сегодняшний день ничего не известно.

исследования. В связи с этим возникла необходимость рассмотреть экологию рода Capreolus, филогенетические связи и хромосомную эволюцию семейства Cervidae.

Одним из представителей отряда парнокопытных (Artiodactyla) (большинство современных систематиков объединяет парнокопытных с китообразными в общий отряд Cetartiodactyla) является род косуля насчитывающий два вида: сибирская косуля (Capreolus pygargus) и европейская косуля (Capreolus capreolus).

рассматривались как подвиды одного вида — С. capreolus capreolus Linnaeus, (1758) и С. сapreolus pygargus Pallas, (1771) (Grubb, 1993), однако имеющиеся на сегодняшний день данные подтверждают их видовую самостоятельность (Randi et al., 1998; Xiao et al., 2007). Согласно современной систематике сибирская косуля включает четыре подвида: C. p.

bedfordi, C. p. mantschuricus, C. p. ochraceus, C. p. pygargus (Wilson et al., 2005).

Род косуля занимает обширный ареал, включающий почти всю Европу и значительную часть континентальной Азии (Danilkin et al., 1996).

морфометрическим особенностям и кариотипу. Морфологически сибирская косуля имеет бльшие размеры и вес тела по сравнению с европейской косулей. Виды способны скрещиваться в неволе, но большинство гибридных самцов оказываются стерильными (Danilkin et al., 1996).

Европейская косуля (С. capreolus) имеет хромосомный набор 2n= (Gustavsson et al., 1968). Сибирская косуля (C. pygargus) имеет варьирующее число хромосом 2n=70 + (2B-14B) (Graphodatsky et al., 1990; Sokolov et al., 1978). На уровне генетических различий и филогеографических связей природные популяции косули изучены плохо (Hartl, Reimoser, 1988).

Изучение полиморфизма популяций и межвидовых отличий проводилось путем анализа последовательностей мтДНК (Avise et al., 1987). Одним из наиболее вариабельных некодирующих районов мтДНК является контрольный район (CR – control region) (Moritz et al., 1987). В результате оценки частот замен нуклеотидов в кодирующем регионе мтДНК было сделано предположение, что сибирская и европейская косуля разделились на границе плиоцена/плейстоцена и независимо эволюционируют последние 2-3 млн. лет. В результате секвенирования контрольного района 45 особей сибирской и европейской косули было найдено более 50 замен, на основе которых выделили около 20 различных гаплотипов. Шесть различных гаплотипов было обнаружено среди сибирской косули и гаплотипов среди европейской косули. Гаплотипы кластеризуются в две группы внутри каждого вида. Эти кластеры соответствуют различным географическим популяциям. На основании этого было выделено две популяции сибирской косули в Курганской и в Амурской области. Также для европейской косули выделена популяция на западе Альп и восточноальпийская популяция, в состав которой входит С. с. italicus (Randi et al., 1998a). Однако недавно были получены новые данные, описывающие полиморфизмы внутри популяций сибирской косули. Основываясь на географическом распределении четырех подвидов сибирской косули, авторы гаплотипировали образцы животных, отловленных на Алтае, в Якутии, в горах Тянь-Шаня и Дальнем Востоке России. Было выделено гаплотипов сибирской косули, среди них 5 – в алтайской популяции, 4 – в якутской популяции, 7 гаплотипов в тянь-шанской популяции и 3 – в определенными подвидами. На основании этого было сделано заключение, что деление на подвиды у сибирской косули не имеет оснований и показано, что данный вид отличается высокой мобильностью и вследствие этого генетической вариабельностью (Vorobieva et al., 2011). Таким образом, последние данные в отличие от полученных ранее, выявили, что сибирская косуля характеризуется значительным генетическим разнообразием, и попытки деления этого вида на подвиды являются весьма условным.

1.4.1 Филогенетические связи семейства Cervidae Для выяснения филогенетических связей рода Capreolus было проведено сравнение полных последовательностей митохондриального гена цитохрома b у 11 видов, принадлежащих к подсемействам: настоящие олени - Cervinae (благородный олень (Cervus elaphus), пятнистый олень (C.

nippon), европейская лань (Dama dama)), мунтжаковые - Muntiacinae (чернохвостый олень (Odocoileus hemionus), род Мазама (Mazama sp.), европейская косуля (Capreolus capreolus), сибирская косуля (C. pygargus), северный олень (Rangifer tarandus), лось (Alces alces)) и водяные олени Hydropotinae (водяной олень (Hydropotes inermis)). По имеющимся данным подсемейство настоящие олени и род Muntiacus были объединены в группу евразийских видов. Вторую группу составили Capreolus, Hydropotes и Alces.

Mazama, Odocoileus и Rangifer представляют третью группу (Randi et al., 1998b) (схема 1).

Схема 1. Филогения оленьих на основании сравнения полных последовательностей митохондриального гена цитохрома b (Randi et al., 1998b).

На сегодняшний день существуют и другие модели филогенетических связей внутри семейства оленьих. В 2004 году Питра с соавторами предложили схему филогенетических связей, а также определили время возникновения и расхождения группы оленьих Старого Света (Pitra et al., 2004). Исследователи проводили построения на основании сравнения полных последовательностей митохондриального гена цитохрома b.

Хронограмма оленьих была сконструированна на основе датированных ископаемых и филогенетичких отношений внутри семейства оленьих. В исследовании было задействовано 49 таксонов из семейства оленьих.

Авторы построили неукорененное филогенетическое дерево, на основании этого построения была выделена группа видов, называемая telemetacarpalian, в которую входили подсемейства: американские олени, косули, водяные олени и лоси. В другую группу видов, называемую plesiometacarpalian, входили подсемейство мунтжаковые, выделенные в подгруппу IV и подсемейство настоящие олени, выделенные в подгруппу III (схема. 2).

На основании предложенной филогении подсемейство мунтжаковые представляет собой сестринскую группу оленей, входящих в подсемейства настоящие олени и американские олени. Характеризуя подсемейство настоящие олени, мы наблюдаем разделение между аксисом (Axis axis), барасингой (Rucervus duvaucelii), оленем шомбургка (Rucervus schomburgki), с одной стороны, и остальными Cervinae, с другой стороны.

Схема 2. Филогения оленьих на основании сравнения полных последовательностей митохондриального гена цитохрома b (Pitra et al., 2004). I – таксон telemetacarpalian. II – таксон plesiometacarpalian. III – группа оленьих Старого Света. IV – сестринская группа оленьих Старого Света – мунтжаковые.

Внутри этой группы барасинга и олень шомбургка являются сестринскими видами, тогда как близкородственные взаимоотношения между аксисом и свиным оленем (Axis porcinus) не подтверждаются, указывая на то, что род аксис является парафилетическим. Характеристика рода лани (Dama), представленного в этом исследовании двумя видами, европейской ланью (Dama dama) и иранской ланью (Dama mesopotamica), указывает на то, что эти два вида являются сестринскими. Неожиданным было обнаружение близких филогенетических связей между оленем давида (Elaphurus davidianus) и оленем-лира или таменгом (Cervus eldii).

Следующую обширную группу составляет подсемейство настоящие олени Cervus, содержащее роды: Rusa, Sika и Przewalskium. В группе Rusa взаимоотношения между свиным оленем и гривистым замбаром (Rusa timorensis). Индийский замбар (Rusa unicolor) оказался сестринским видом свиного оленя и гривистого замбара.

Вид благородный олень (Cervus elaphus) делится на четыре отдельных подвида. Первая группа включает четыре европейских подвида (C. e.

hippelaphus, C. e. corsicanus, C. e. atlanticus, C. e. hispnicus), один подвид из северной Африки (C. e. barbarus) и один подвид, обитающий на Кавказе, в Турции и северном Иране (C. e. maral). Вторая группа включает два подвида из средней Азии (C. e. bactrianus и C. e. yarkandensis). Третья группа включает два подвида из Сибири (C. e. songaricus и C. e. sibiricus) и один подвид из северной Америки (C. e. canadensis). Четвертая группа включает четыре подвида, населяющих Китай и Тибет (C. e. wallichi, C. e.

macneilli, C. e. kansuensis, C. e. xanthopygus). Последние две группы формируют клад подвидов вида пятнистый олень (Cervus nippon). Вид беломордый олень (Przewalskium albirostris) представляет собой часть группы подвидов вида Cervus nippon.

Отдельная группа семейства оленьих, называемая telemetacarpalian, делится на пять подсемейств: американские олени, лоси, косули и водяные олени. Вид водный олень (Hydropotes inermis) составляет одну группу с подсемейством Capreolinae. Отдельно выделяется подсемейства Alcinae и Odocoileinae. Однако нужно отметить, что вид северный олень (Rangifer tarandus) в данной филогении занимает неопределенную позицию, поэтому построение филогенетического дерева оленьих должно быть основано на большем числе молекулярных данных (схема 2).

Для того чтобы оценить точное время расхождения видов семейства филогенетического дерева семейства оленьих, была создана хронограмма.

Ключевыми точками в этой хронограмме являются узел А (схема 3), соответствующий разделению подсемейств мунтжаковые и настоящие олени (7 млн. лет до н.э.) и узел В, соответствующий возникновению подсемейства американские олени (5 млн. лет до н.э.).

Наиболее примитивным предком подсемейства настоящие олени Cervinae считается Cervocervus novorossiae, ископаемые отстанки которого датируют поздним миоценом (Stefano, Petronio, 2002) (на схеме обозначено цифрой 1). Азиатский род Procapreolus является предковым для рода Capreolus и датируется поздним миоценом - ранним плиоценом (2), однако не ясно, является ли он предковым также и для Hydropotes. Вид Axis shansius, датированный примерно 5 млн. лет до н.э., является наиболее ранним предполагаемым предком вида Axis axis (Stefano, Petronio, 2002) (3).

Вид Cervus magnus, датированный ранним плиоценом, является предковым подсемейству настоящие олени (Stefano, Petronio, 2002) (4). Вид Rusa elegans является предковым виду индийский замбар (Stefano, Petronio, 2002) (5). Наиболее поздней находкой из среднего плиоцена по сравнению с видом Axis shansius является вид Axis lyra, также являющийся предковым современному аксису (Stefano, Petronio, 2002) (6). Ископаемый вид Rucervus hilzheimeri, современному виду Przewalskium albirostris (Stefano, Petronio, 2002) (7).

Также был обнаружен ископаемый вид, датируемый поздним плиоценом, который является предковым современному виду Elaphurus davidianus (Taru, Hasegawa, 2002) (8). Ископаемые останки пятнистого оленя были впервые найдены в позднеплиоценовых отложениях Европы (Geist et al., 1998) (9). Ископаемый вид Axis lydekkeri, обнаруженный в отложениях на острове Ява, датируемый 1,5 млн. лет до н.э., может быть предковым виду аксис Axis axis (Stefano, Petronio, 2002) (10), однако, эти данные не нашли подтверждение в работе Питры с соавторами (Pitra et al., 2004). Ископаемый вид Cervus grayi является наиболее поздним общим предком видов Cervus elaphus и Cervus nippon (Stefano, Petronio, 2002) (11). Ископаемый вид Cervus bactrianus, живший в Европе в раннем плейстоцене, является общим предком для подвидов C. e. bactrianus и C. e. yarkandensis (Stefano, Petronio, 2002) (12). Первые ископаемые находки вида Cervus elaphus датированы 0, млн. лет до н.э. (13) (схема 3).

Схема 3. Хронограмма оленьих, сконструированная на основе датированных ископаемых и филогенетичких отношений внутри семейства оленьих. А – узел, соответствующий разделению подсемейств мунтжаковые и настоящие олени. В – узел, соответствующий возникновению подсемейства американские олени. Номера в данной схеме, отражают возраст найденных ископаемых (Pitra et al., 2004).

Построение филогенетических отношений на основе молекулярных данных и датированных ископаемых является наиболее точным и наводит на мысль о том, что некоторые современные виды семейсва Cervidae представляют собой гибридные таксоны различных видов оленьих, но это предположение требует дополнительных исследований (Pitra et al., 2004).

1.5 Хромосомная эволюция семейства оленьих (Cervidae) На основе сравнительного хромосомного бэндинга оленьих было предположено, что предок семейства Cervidae мог иметь кариотип 2n = 70, включающий 68 акроцентрических аутосом, акроцентрическую Ххромосому и небольшой субметацентрический Y (Neitzel et al., 1987). К группе видов, сохранивших предковый кариотип, относятся водяной олень (Hydropotes inermis) (Hsu et al., 1974), серый мазама (Mazama gouazoubira) (Neitzel et al., 1987), европейская косуля (С. сapreolus) (Gustavsson et al., 1968), сибирская косуля (C. pygargus) (Sokolov et al., 1978), северный олень (Rangifer tarandus) (Nes et al., 1965) и чернохвостый олень (Odocoileus hemionus) (Wurster et al., 1967).

Эволюция хромосом оленьих характеризуется неравномерными темпами в разных группах. Подсемейство мунтжаковые Muntiacinae включает виды с минимальным числом хромосом среди млекопитающих:

индийский мунтжак (Muntiacus muntjak vaginalis, 2n=6, 7) (Wurster et al., 1970), мунтжак Рузвельта (M. rooseveltorum, 2n=6) (Wurster-Hill et al., 1985) и черный мунтжак (M. crinifrons, 2n=8f, 9m) (Shi et al., 1988b). Данное явление было объяснено Янгом с соавторами. На основе проведенных детальных исследований хромосом оленьих был предложен сценарий кариотипической эволюции Cervidae. Кариотип китайского мунтжака (M.

reevesi, 2n = 46) ведет свое происхождение от предкового кариотипа семейства Cervidae. Хромосомы 1-5 и 11 китайского мунтжака образовались в результате 12 слияний 18 хромосом предкового кариотипа (Yang et al., 1997c). Также путем слияний предкового кариотипа сформировались малохромосомные кариотипы индийского мунтжака (M. muntjak vaginalis, 2n=6f, 7m) (Yang et al., 1995; Yang et al., 1997b) и черного мунтжака (M.

crinifrons, 2n=8f, 9m) (Yang et al., 1997a).

Можно заключить, что одним из путей уменьшения числа хромосом в подсемействе Cervinae являлись тандемные слияния. Но большинство видов обладают кариотипами, произошедшими от предкового кариотипа путем робертсоновских транслокаций. Так произошли кариотипы таких видов, как аксис (Axis axis, 2n=66), пятнистый олень (Cervus nippon, 2n = 66), белогубый олень (Cervus albirostris, 2n=66), благородный олень (Cervus elaphus, 2n=62), гривистый замбар (Cervus timorensis, 2n=60) и индийский замбар (Cervus unicolor, 2n=58/56) (Huang et al., 2006).

Интерес к В-хромосомам возник еще в начале ХХ века. По мере совершенствования молекулярно-биологических подходов удалось выявить молекулярной организации. Буквально за последние несколько лет в связи с использованием методов секвенирования, FISH и ПЦР в реальном времени было показано, что В-хромосомы содержат целые участки аутосом, которые могут функционировать по своим определенным законам. Гены, расположенные на добавочных элементах, имеют различные функции, однако появляется все больше данных о значительном преобладании протоонкогенов на В-хромосомах. До сих пор остается загадкой, почему Вхромосомы присутствуют у одних видов и отсутствуют у других даже внутри отдельного семейства. Для ответа на этот вопрос и вопросы, связанные с механизмами и временем возникновения добавочных хромосом у изучаемого вида, необходимо учитывать его филогенетические взаимосвязи и особенности хромосомной эволюции. Кроме того, знание кариотипической эволюции позволит выявить роль добавочных элементов в эволюции геномов.

Семейство Cervidae отличается огромным разнообразием видов, живущих в разных климатических зонах. История оленьих насчитывает несколько млн. лет. Замечательным является то, что кариотип многих представителей Cervidae является очень консервативным и мало отличается от предкового. Отличительной особенностью семейства оленьих, а также и всего отряда парнокопытных является наличие видов, несущих кариотипы с преобладанием акроцентрических элементов. Как уже отмечалось выше, по гипотезе Палестиса с соавторами (Palestis et al., 2004) именно в кариотипах с акроцентрическими хромосомами чаще встречаются добавочные элементы.

Сибирская косуля как раз обладает кариотипом с преобладанием акроцентрических элементов, и в согласии с приведенной выше гипотезой несет разнообразное число В-хромосом. Число добавочных элементов у сибирской косули может варьировать от 0 до 14, что делает этот вид очень привлекательным для изучения феномена В-хромосом.

2. Материалы и методы Биотин-11-дУТФ ”Medigene” Бромистый этидий ”Sigma” Глицерин ”Serva” Декстран-сульфат ”Pharmacia” Дигоксигенин-11-дУТФ ”Medigene” Колхицин «Fluka» (сухой) Ксилол (осч) “Реахим” Ледяная уксусная кислота (ч) “Реахим” Метанол (ч) “Реахим” Набор дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ) “Sigma” Раствор красителя Гимза “Merk” Рабочий раствор красителя Гимза (основной раствор красителя Гимза (2 мл); 0.1% гидрокарбоната натрия (1 мл), вода дистиллированная до 50 мл) Твин-20 “Sigma” Тритон Х100 “Serva” Формамид ”Sigma” секвенирования ДНК СО РАН) DABCO (1,4-диазабисцикло(2,2)октан) ”Sigma” DAPI ”Sigma” SYBR Green PCR Master Mix “Синтол” Антибиотики, культуральные среды, сыворотки Гентамицин “Биохимик” Канамицин “Биохимик” Пенициллин “Биохимик” Сыворотка крупного рогатого скота “HyClone” Эмбриональная бычья сыворотка “HyClone” MEM “Gibco” DMEM “Gibco” F12 “Gibco” Буферы Блокирующий буфер (1-3% обезжиренное сухое молоко, 4xSSC, 0,05% Тритон X100) секвенирования ДНК СО РАН) Буфер для Taq ДНК-полимеразы (67 мМ трис-НСl рН 9.4, 18 мМ (NH4)2SO4, 0,01% твин-20) TAE (0,04 М трис-ацетат рН 7.5; 0,002 М ЭДТА) TE буфер (0,01 М трис-HCl pH 8.0; 0,001 М ЭДТА) Фиксатор: метанол: уксусная кислота 3: PBS буфер (0,13 М NаCl; 0,27 М KCl; 7 мM Na2HPO4; 3 мМ NaH2PO4, рН 7.2) SSC буфер (0,15 М NаCl; 0,15 М цитрат натрия) Ферменты и конъюгаты Авидин-FITC “Vector” USA Антидигоксигенин-родамин ” Medigene ” Биотинилированный антиавидин “Vector” USA Нуклеаза S1 “Sigma” Пепсин “Sigma” Протеиназа К “Sigma” РНКаза А “Sigma” Трипсин ”DIFCO” Taq ДНК-полимераза, выделена в ИЦиГ СО РАН ExoSap “GE Healthcare” Библиотека В-хромосом сибирской косули Библиотека В-хромосом сибирской косули была получена с помощью хромосомного сортинга П.О’Брайен (Центр сравнительной геномики, Кембриджский университет, Великобритания) и В.А. Трифоновым (лаборатория сравнительной геномики ИМКБ СО РАН) из культуры фибробластов сибирской косули, отловленной в Новосибирской области ( хромосом на библиотеку) осуществляли с помощью метода DOP-ПЦР (см.

главу Методы 2.2.6).

Трифоновым (ИМКБ СО РАН, Новосибирск) на основе метода SHAC (“Selection of Hybrids by Affinity Capture ” отбор гибридов афинной сорбцией) (Chen-Liu et al., 1995). Из культуры клеток фибробластов сибирской косули с 8 В-хромосомами была выделена тотальная РНК и получена кДНК библиотека с помощью BD SMART PCR cDNA Synthesis Kit (BD Biosciences) по протоколу производителя. Затем полученная кДНК библиотека была амплифицирована со специфичным праймером (BD биотинилированной библиотекой, которая была помечена с помощью метода DOP-ПЦР.

микрочастицами с иммобилизованным авидином. Фрагменты кДНК амплифицировали с помощью ПЦР со специфичным праймером (BD Biosciences). Продукты ПЦР клонировали с использованием TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, UK) и секвенировали по стандартному протоколу.

Полученные последовательности были выровнены относительно генома коровы UCSC genome browser on Cow Oct. 2011 (Baylor Btau_4.6.1/bosTau7).

Суспензии клеток приготовленные из культур фибробластов в лаборатории цитогенетики животных ИМКБ СО РАН:

1. Сибирская косуля, самец (Сapreolus pygargus, СРУ, 2n=70+8B), отловлен в Шебалинском районе Алтайского края.

2. Сибирская косуля, самец (2n=70+4B), отловлен в Шебалинском 3. Сибирская косуля, самец (2n=70+0B), отловлен в Краснозерском районе Новосибирской области.

4. Корова, (Bos taurus, ВТА, 2n=60).

ДНК животных В работе использовались образцы ДНК сибирской и европейской косули, лося и марала выделенные из тканей животных:

Европейская косуля (Capreolus capreolus, CCA, 2n=70+0B), отловлена в Англии.

Европейская косуля (2n=70+0B), отловлена в Англии.

Лось (Alces alces, AAL, 2n=68), отловлен в Горном районе республики Якутия.

Марал алтайский (Cervus elaphus sibiricus, CEL, 2n=68), отловлен в Алтайском крае.

В работе использовались образцы ДНК сибирской косули, коровы и мазама, выделенные из культуры фибробластов:

Серый мазама (самец) (Mazama gouazoubira, MGO, 2n=70). Суспензия хромосом была любезно предоставлена профессором Янгом.

Сибирская косуля (2n=70+8B), отловлена в Шебалинском районе Алтайского края.

Сибирская косуля (2n=70+4B), отловлена в Шебалинском районе Алтайского края.

Сибирская косуля (2n=70+0B), отловлена в Краснозерском районе Новосибирской области.

Корова (2n=60), город Новосибирск.

Праймеры Праймеры, использованные для амплификации ДНК ВАС клонов, синтезированы фирмой “Биоссет” (Новосибирск).

DOP1-праймер (5’-CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA-3’) DOP2-праймер (5’-CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG-3’) DOP3-праймер (5’-CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG-3’) DOP4-праймер (5’-GGAAACAGCCCGACTCGAG-3’) последовательностей на В-хромосомах в количестве 40 пар для геномной ДНК, приведены в главе 3.2.2 (Таблица 5). Cинтезированы фирмой “Биоссет” (Новосибирск).

Праймеры, использованные для секвенирования продуктов ПЦР в количестве 9 пар, приведены в главе 3.5 (Таблица 8). Синтезированы В.А.

Рябининым ИХБФМ СО РАН. Праймеры, использованные для ПЦР в реальном времени в количестве 4 пар, приведены в главе 3.3 (Таблица 6).

Синтезированы В.А. Рябининым ИХБФМ СО РАН.

ВАС клоны Клоны BAC библиотеки коровы CHORI-240 (8 штук) любезно предоставлены д-ром Д.М. Ларкиным (Университет Иллинойса, США);

список приведен в главе 3.2.1 (Таблица 4).

2.2.1 Культивирование культур клеток фибробластов и получение Культуры фибробластов косули были взяты из банка клеточных Культивирование клеток проводили при 37С на средах F12, DMEM и MEM с добавлением 10% сыворотки и антибиотиков: пеницилина ( мкг/мл) и канамицина (100 мкг/мл). Среду меняли 2-3 раза в неделю. Как только образовывались равномерные и плотные колонии, клетки снимали с помощью 0,25%-ного раствора трипсина с ЭДТА (0,3 г/л) и переносили в новую емкость, таким образом, осуществляя пересевание культуры фибробластов. Фиксацию культуры клеток фибробластов проводили следующим образом: через 24 часа после последнего пересева в культуральную среду добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,025 мг/мл на 2 часа. Затем вводили колхицин в концентрации 0,05 мг/мл на 45 мин. Потом среду сливали и добавляли теплый (37С) 0,25%-ный раствор трипсина с ЭДТА в количестве, достаточном для снятия клеток. Для остановки действия трипсина во флакон добавляли 3-4 мл ростовой среды. Клетки переносили в центрифужную пробирку и проводили центрифугирование в течение минут со скоростью 1000 оборотов/мин. Затем к осадку клеток добавляли свежий гипотонический 3,7*10-4 М раствор KCl, содержащий 2-3% эмбриональной бычьей сыворотки, и осадок клеток суспендировали.

Пробирки помещали в термостат и выдерживали при 37С в течение 45- мин. Стадия предфиксации после гипотонической обработки проводилась следующим образом: несколько капель метанол-уксусного фиксатора (3:1) добавляли к гипотоническому раствору с клетками. Раствор перемешивали и оставляли на 5-10 мин. Затем центрифугировали и снова добавляли свежеприготовленный охлажденный (при метанол-уксусный фиксатор (3:1). Раствор с клетками тщательно суспендировали и фиксировали при -20С в течение 20 мин. Затем проводили конечное центрифугирование и замену фиксатора. После чего раствор оставляли на 12 часов при -20С. Потом еще раз меняли фиксатор и оценивали качество полученного материала.



Pages:   || 2 | 3 |
 
Похожие работы:

«БУХАРЕВА ОЛЬГА АНДРЕЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ НОРНЫХ СИСТЕМ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В РАЗНЫХ ПРИРОДНЫХ ЗОНАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ТЕРРИТОРИИ РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук А.В. Быков Москва 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ ПОНЯТИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛАВА 1 СРЕДООБРАЗУЮЩАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ НОРНЫХ СИСТЕМ 1.1....»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.б.н., с.н.с. Картавцева Ирина Васильевна Владивосток –...»

«УДК: 579.846.2[063+22+26](043) НАМСАРАЕВ Зоригто Баирович МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМ. Специальность 03.00.07. – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.М. Горленко МОСКВА – 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика основных типов щелочных гидротерм 1.1.1. Основные типы щелочных гидротерм...»

«Багдасарян Александр Сергеевич БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПОЧВ ТЕХНОГЕННЫХ ЗОН ГОРОДСКИХ ТЕРРИТОРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ 03.00.16 экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, профессор И.М. Мануйлов Ставрополь 2005 1 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 1.1 Почва как депонирующая среда техногенных загрязнителей. 1.1.1 Химическое...»

«УДК 577.322.6 Наташин Павел Викторович РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н. Е.С. Высоцкий Красноярск,...»

«Гималов Фуат Рамазанович СИГНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ ПРИ ХОЛОДОВОМ СТРЕССЕ 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант : доктор биологических наук, профессор В.А.Вахитов Уфа – 2014 СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант :...»

«Кузьменко Александр Анатольевич РАСТИТЕЛЬНОСТЬ МОРЕННЫХ И ВОДНО-ЛЕДНИКОВЫХ РАВНИН ЮЖНОЙ ОКРАИНЫ СМОЛЕНСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ Специальность 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор...»

«СЫСОЕВА Ольга Валерьевна Факторы, влияющие на микробиоту раствора для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения Специальность 03.02.08 – экология (биология) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук Тирранен Л.С. Красноярск – СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 ОБЗОР...»

«Карпеченко Никита Александрович АНАЛИЗ БЕЛКОВЫХ СПЕКТРОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПУТЕЙ И ИНВЕРТИРОВАНЫХ ПОВТОРОВ ДНК ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В ЛЕСОСТЕПИ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный...»

«Каткова Екатерина Владимировна ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВ Специальность 03.01.02 – Биофизика, 03.01.08 – Биоинженерия Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Ф.И. доктор физико-математических наук Сулимов В.Б. Москва –...»

«Шевченко Сергей Михайлович ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА CERASUS L. В УСЛОВИЯХ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 03.02.01 - ботаника ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид МОРФОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ГЕНОТИПОВ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ, ОТОБРАННЫХ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ И УРОВНЮ ИХ СТРЕССТОЛЕРАНТНОСТИ К МЕТЕОТРОПНЫМ РИСКАМ Специальность: 03.02.07 – генетика; 06.01.05 – селекция и семеноводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук доцент О.Г.Семенов Москва - ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«БЕЛОЗЕРОВА Наталья Сергеевна Влияние салициловой кислоты и цитокинина на экспрессию генов митохондриальных белков (03.01.05 – физиология и биохимия растений) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Пожидаева Елена Станиславовна Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВНУТРИУТРОБНЫХ ПНЕВМОНИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ИСХОДОМ 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц, доктор медицинских наук, профессор Г.Г. Фрейнд Пермь – ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....»

«ТАРАСОВА Екатерина Владимировна БИОТРАНСФОРМАЦИЯ БЕТУЛИНА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS 03.02.03. Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна кандидат химических наук, доцент Гришко Виктория...»

«Ломакин Яков Анатольевич Структурно-функциональный анализ моноклональных антител, кроссреактивных к вирусным антигенам, при рассеянном склерозе Специальность 03.01.03 Молекулярная биология диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.х.н. Белогуров А.А. Москва – 2...»

«КОБОЗЕВА Елена Валерьевна ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ВИДОВ StY-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА ELYMUS L. АЗИАТСКОЙ РОССИИ 03.02.01 – “Ботаника” 03.02.07 – “Генетика” ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д.б.н., c.н.с. А.В. Агафонов, д.б.н., c.н.с. С.В. Овчинникова...»

«ЧЕБОТАРЕВА Наталья Александровна ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИКОГЕНОЛИЗА В УСЛОВИЯХ МОЛЕКУЛЯРНОГО КРАУДИНГА 03.00.04 – Биохимия ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2006 Работа выполнена в отделе структурной биохимии белка Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Муронец...»

«ЯРЫМОВА ИННА АЛЕКСАНДРОВНА МИНЕРАЛЬНАЯ ВОДА КАК РЕГУЛЯТОРНЫЙ ФАКТОР ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЖЕЛУДКА ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ 03.00.13 – физиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.И. Гриднева Томск – 2003 2 Список сокращений АДГ - антидиуретический гормон АКТГ - адренокортикотропный гормон АТФ - аденозинтрифосфат ВИП - вазоактивный...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.