WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 |

«АНТИМИКРОБНЫЕ ФАКТОРЫ В КОНТРОЛЕ ВНЕШНЕЙ И ВНУТРЕННЕЙ СРЕДЫ МЯСНЫХ МУХ (DIPTERA, CALLIPHORIDAE) ...»

-- [ Страница 1 ] --

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КРУГЛИКОВА

Анастасия Анатольевна

АНТИМИКРОБНЫЕ ФАКТОРЫ В КОНТРОЛЕ

ВНЕШНЕЙ И ВНУТРЕННЕЙ СРЕДЫ МЯСНЫХ МУХ (DIPTERA, CALLIPHORIDAE)

03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель доктор биологических наук Сергей Иванович Черныш Санкт-Петербург 2013 Оглавление Оглавление

Введение

Глава I. Литературный обзор

I.1. Иммунная система насекомых

I.1.1. Клеточный иммунный ответ

I.1.1.1. Фагоцитоз

I.1.1.2. Образование узелков и капсул

I.1.2. Гуморальный иммунный ответ

I.1.2.1.Антимикробные пептиды

I.1.2.2. Коагуляция гемолимфы

I.1.2.3. Фенолоксидазная система

I.1.2.4. Эпителиальный иммунный ответ

I.2. Личиночная терапия

I.2.1. Антибактериальные свойства экзосекрета

Глава II. Материалы и методы исследования

II.1. Биологический материал

II.1.1. Краткая характеристика основного модельного объекта исследования Lucilia sericata

II.1.2. Методика лабораторного содержания

II.2. Методы

II.2.1. Инфицирование насекомых

II.2.1.1. Получение бактериальной суспензии для иммунизации

II.2.2. Сбор гемолимфы

II.2.3. Сбор экзосекрета

II.2.4. Анализ антимикробной активности

II.2.5. Анализ фунгицидной активности

II.2.6. Методы концентрации и очистки исследуемых образцов

II.2.6.1. Метод твердофазной экстракции

II.2.6.2. Хроматографическое фракционирование

II.2.7. Масс-спектрометрия

II.2.8. Методы исследования живых гемоцитов

II.2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных

Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata..... III.1. Фунгицидная активность гемолимфы личинок Lucilia sericata

III.2.Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilia sericata, Calliphora vicina, Musca domestica

III.2.1. Фунгицидная активность экзосекрета Lucilia sericata





III.2.2. Фунгицидная активность экзосекрета Calliphora vicina

III.2.3. Фунгицидная активность экзосекрета Musca domestica.

III.3. Фунгицидная активность фракционированного экзосекрета личинок Lucilia sericata

III.3.1. Фунгицидная активность гидрофобной фракции экзосекрета

III.3.2. Фунгицидная активность хроматографических фракций экзосекрета.............. III.4. Выводы

Глава IV. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

IV.1. Антибактериальная активность цельных экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

IV.2. Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

IV.3. Антибактериальная активность хроматографических фракций экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

IV.4. Выводы

Глава V. Масс-спектрометрический анализ

Глава VI. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata............... VI.1. Основные типы гемоцитов Lucilia sericata

VI.2. Иммунологические реакции гемоцитов

VI.3. Выводы

Глава VII. Обсуждение

VII.1. Фунгицидная активность гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata....... VII.2. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

VII.3. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata................ Заключение

Выводы

Список литературы

В естественных местообитаниях основными конкурентами личинок мух являются микроорганизмы, грибы и бактерии. Для личинок мясных мух характерно внекишечное пищеварение, при котором питательный субстрат подвергается предварительной обработке пищеварительными ферментами (Виноградова, 1984).

Поскольку среда обитания личинок мух крайне агрессивна, экзосекрет этих насекомых, по всей видимости, должен содержать антимикробные и фунгицидные соединения. Некоторые виды насекомых, как и позвоночные (Weinbergl et al., 1998; Selsted et al., 1992), выделяют на поверхность слизистых оболочек антимикробные пептиды. Так у дрозофилы антимикробные пептиды обнаружены в нескольких видах эпителия, которые потенциально контактируют с окружающей средой; к ним относятся респираторный, пищеварительный, репродуктивный тракты, мальпигиевы сосуды и ротовые органы (Tzou et al., 2000). Для растений и грибов характерно использование вторичных метаболитов в качестве защиты от вредителей и патогенов, а также в борьбе с конкурентами (Seigler, 1999; Баринова и др., 2008). Для животных такие механизмы менее характерны. Но известно, что часть азота выделяется личинками мясных мух в форме аллантоина, образующегося в результате расщепления мочевой кислоты (Виноградова, 1984), который увеличивает значение pH, что косвенным образом подавляет развитие целого ряда микроорганизмов (Thomas et al., 1999).

Антимикробные пептиды, как известно, являются важнейшим элементом в иммунной системе насекомых, обеспечивая высокую устойчивость к широкому спектру патогенов и паразитов (Bulet et al., 1999; Hoffmann, 1995). Большинство из них индуцибельны, характеризуются небольшим молекулярным весом и являются катионными молекулами (Hoffmann, 1995). Большая часть антимикробных пептидов синтезируется клетками жирового тела и выделяется в гемолимфу (Trenszec et Faye, 1988).





Известно, что для дрозофилы, так же как и для млекопитающих, характерна тканеспецифичная продукция антимикробных пептидов (Tzou et al., 2000). Однако, у личинок L. sericata подобные особенности иммунного ответа до сих пор не были исследованы.

Мухи вида L. sericata имеют огромное экономическое и клиническое значение, поскольку являются первичными факультативными паразитами, вызывающими кожные миазы прежде всего у овец несмотря на то, что могут поражать и других диких и домашних животных и человека (Hall et Hall, 1995). Однако, эта особенность жизненного цикла личинок мух может быть использована человеком в собственных интересах. На сегодняшний день огромное количество публикаций посвящено выдающимся эффектам личиночной терапии, главные из которых очищение, дезинфекция и быстрое заживление хронических ран, зачастую не поддающихся лечению методами традиционной медицины (Nigam et al., 2006а,b; Sherman, 2003; Whitaker et al., 2007). Достоверно известно, что личинки эффективно очищают раны, зараженные таким опасным патогеном, как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA) (Jaklic et al., 2008; Steenvoorde et Jukema, 2004). Также показана активность экзосекрета личинок в отношение MRSA в экспериментах in vitro (Bexfield et al., 2004; Kerridge et al., 2005; Thomas et al., 1999).

Метициллин-устойчивый штамм Staphylococcus aureus является возбудителем одной из госпитальных инфекций и относится к группе так называемых «antibiotic-resistant superbugs» (Kerridge et al., 2005), т.е. к группе бактерий, устойчивых почти ко всем ныне существующим антибиотикам. Поэтому эффективность хирургических личинок и компонентов, синтезируемых ими, в отношение MRSA, имеет огромное значение.

Кроме того, личинки многих мух, особенно личинки Calliphoridae, питаются на разлагающихся субстратах и являются пассивными переносчиками огромного количества патогенных бактерий (Fischer et al., 2004; Habeeb et Mahdi, 2012; Paraluppi et al., 1996).

Поэтому исследование антимикробных компонентов у разных видов мух представляется особенно актуальным.

Цель работы: Изучение факторов гуморального и клеточного иммунитета личинок Lucilia sericata и их роли в контроле внешней и внутренней среды.

Для выполнения целей работы были поставлены следующие задачи:

• Исследование состава и титра антибактериальных компонентов в экзосекрете и гемолимфе иммунизированных личинок Lucilia sericata.

• Исследование состава и титра фунгицидных компонентов в гемолимфе и экзосекрете личинок Lucilia sericata, а также в экзосекрете личинок Musca domestica и Calliphora vicina.

• Исследование клеточных защитных механизмов личинок Lucilia sericata: описание основных типов гемоцитов; изменение состава гемоцитов в ходе развития;

иммунологические реакции гемоцитов.

экспериментов и написании работы научному руководителю Сергею Ивановичу Чернышу, сотрудникам лаборатории биофармакологии и иммунологии насекомых:

Тулину Д. В., Яковлеву А. Ю., Гордя Н. А., Несину А. П., Симоненко Н. П., Кинд Т. В.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной программы поддержки ведущих научных школ (проект НШ-3332.2010.4) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Насекомые, достигшие наивысшего уровня эволюционного развития среди микроорганизмов. Покровы стенки тела, кишки и трахей являются надежной механической преградой для проникновения паразитов из окружающей среды в полость тела насекомого. Однако в случае повреждения покровов чужеродные объекты могут попадать в гемолимфу. Попавшие в гемолимфу патогены становятся мишенью для клеточных и гуморальных факторов сложной координированной системы защиты.

В основе клеточного иммунитета лежат реакции, реализуемые клетками гемолимфы насекомых – гемоцитами. Ключевым эффекторным звеном гуморального иммунитета являются цитотоксические молекулы, образующиеся в ходе реакций, опосредуемых ферментом – фенолоксидазой, а также целый спектр антимикробных пептидов.

клеточного иммунного ответа насекомых, являются клетки кроветворной ткани, перикардиальные клетки, фиксированные и свободноживущие клетки гемолимфы – гемоциты. Гемоциты представляют собой гетерогенную популяцию клеток, принимающих активное участие в иммунных реакциях. На сегодняшний день существует множество классификаций гемоцитов насекомых и есть мнение, что единой системы деления гемоцитов на группы нет (Тулин, Чага, 2003). Традиционно у насекомых выделяют шесть типов гемоцитов: прогемоциты, плазматоциты, гранулоциты, сферулоциты, цистоциты и эноцитоиды; эта классификация основана на исследованиях гемлимфы чешуекрылых (Gupta, 1985; Lackie, 1988; Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).

Прогемоциты являются базовым типом клеток, из которых дифференцируются все остальные гемоциты (Lackie, 1988).

Плазматоциты представляют собой чаще всего агранулярные клетки, обычно специализированные на выполнении фагоцитарных функций. Практически все эти клетки содержат лизосомальные ферменты. В некоторых плазматоцитах выявляется пероксидазная и эстеразная активность, а у представителей отрядов Odonata и Coleoptera – еще и фенолоксидазная активность. Определенная часть этих клеток способна синтезировать лектины (Lackie, 1988).

метаболического характера. Эти клетки высвобождают содержимое гранул, например, в процессе капсулообразования. Доказанной функцией гранулярных гемоцитов бабочек является фагоцитоз, кроме того они первыми контактируют с чужеродным объектом в гемолимфе и секретируют содержимое своих гранул (Ribeiro et Brehelin, 2006). У личинок Calliphoridae настоящих гранулярных клеток не обнаружено, поскольку включения плазматоцитов имеют доказанное катаболическое происхождение (Тулин, Чага, 2003;

Кинд, 2007).

Сферулоциты – большие округлые клетки, которые содержат небольшое количество крупных включений, сферул. О функциях этих клеток ничего неизвестно (Lackie, 1988; Ribeiro et Brehelin, 2006).

Чаще всего к группе эноцитоидов относят клетки, содержащие фенолоксидазу (Ribeiro et Brehelin, 2006). У дрозофилы это хорошо описанные кристаллические клетки (Lemaitre et Hoffmann, 2007).

Цистоциты иногда описывают как коагулоциты. Они содержат большое количество гранул, которые активно высвобождаются при препарировании. Возможно, это определенный тип гранулоцитов, принимающих участие в коагуляции гемолимфы (Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).

Результатом гемоцитарных защитных реакций является изоляция «чужого» от внутренней среды организма в результате фагоцитоза либо образования многоклеточных узелков и капсул вокруг патогена.

Фагоцитоз является первым механизмом защиты насекомых от патогенов. Он является специализированной формой рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Фагоцитироваться могут разнообразные нерастворимые субстанции, от инертных частичек (тушь, латекс) до мелких биологических объектов, таких как бактерии.

Фагоцитирование чужеродной частицы – это многоступенчатый процесс. Первым этапом фагоцитоза является аггрегация гемоцитов в месте повреждения. Далее происходит прикрепление фагоцита к частице и ее распознавание. Этап распознавания является ключевым в формировании иммунного ответа. При встрече с чужеродным агентом гемоциты могут использовать весь «арсенал» рецепторов, способных связываться с инородными телами, в том числе и рецепторы, экспрессированные после индукции какого-либо сигнала. Распознавание антигенов осуществляется при помощи специфических рецепторов к основным микробным детерминантам, расположенных на поверхности клетки, либо гуморальных факторов, выполняющих роль опсонинов. В качестве опсонинов у насекомых были идентифицированы следующие соединения:

лектины, гемолин (входит в состав иммуноглобулинового семейства), ЛПС-связывающий белок, белок, распознающий грамотрицательные бактерии, белок, распознающий пептидогликаны и тиоэфир-содержащий белок -TEP1, близкий к 2-макроглобулину позвоночных (Bulet et al., 1999; Schmidt et al., 2001). Исследования показали, что некоторые из этих факторов действительно усиливают фагоцитоз, образование узелков и капсул. Например, у Anopheles gambiae -TEP1 связывается с грамотрицательными бактериями, и подавление этого фактора с помощью интерферирующей РНК приводит к снижению фагоцитоза бактерий гемоцитами (Lavine, 2002). Связывание антигена с рецептором запускает процесс передачи сигнала в ядро иммуноцита. Следствием этого является образование клеткой псевдоподий, поглощение чужеродной частицы и образование фагосомы (Hoffman et Lemaitre, 2007). Механизм, по которому идет уничтожение патогена внутри фагосомы, до конца не изучен. Есть основания полагать, что поглощенные бактерии элиминируются под действием активных соединений кислорода и азота, выделяемых в фагосому.

Более сложным механизмом изоляции патогена является образование капсул, или инкапсуляция. Формирование капсул может происходить также вокруг собственных поврежденных тканей насекомого – процесс, лежащий в основе регенерации. Этот процесс осуществляется при согласованном участии нескольких типов гемоцитов.

Различают две формы инкапсуляции: 1) образование узелков – многоклеточных образований, способных изолировать сразу несколько мелких патогенов, например бактерии; 2) формирование капсул – многослойных скоплений гемоцитов, изолирующих объекты, размер которых превышает размер гемоцита: простейших, многоклеточных паразитов, личинки и яйца паразитоидов (Hoffman et Lemaitre, 2007). Принципиальных различий между этими процессами нет. Сигнальными молекулами, запускающими образование капсулы, являются микробные детерминанты типа липополисахаридов, зимозана, ламинарина или молекул гликополипротеинов (Lackie, 1988). Как при образовании узелков, так и при образовании капсул гемоцитами формируется псевдоткань, изолирующая проникший в гемоцель объект.

Распознавание «чужого» инициирует переход гемоцитов из взвешенного состояния в прикрепленное, в котором возможно присоединение гемоцитов к патогену и другим гемоцитам. Клетками, контактирующими непосредственно с чужеродной поверхностью, являются гранулоциты. При контакте гранулоцитов с бактериями происходит лизис и дегрануляция клеток, в результате выделенный материал прилипает к мишенной поверхности, а дегранулировавшие клетки образуют агрегаты. Они выделяют хемоаттрактанты, вызывающие появление адгезионных молекул на поверхности плазматоцитов (Lavine, Strand, 2002). Некоторые хемотаксические молекулы, привлекающие плазматоциты, известны (Clark et al., 1997). Каркас капсулы формируется несколькими слоями сильно уплощенных плазматоцитов. Образование капсулы заканчивается появлением на ее поверхности слоя, подобного базальной мембране (Lavine, Strand, 2002). Он формируется монослоем нативных гранулоцитов, прикрепившихся к капсуле на конечном этапе ее образования. Сигнальные молекулы, синтезируемые плазматоцитами для привлечения гранулоцитов, не известны.

Капсула может выполнять функции механического барьера и ограничивать развитие патогена. Как правило, проникшие в гемоцель насекомого организмы погибают в ее пределах. Внутренний слой капсулы иногда меланизируется. Было показано, что толщина стенки капсулы зависит от количества содержащегося в ней меланина. Введение ингибиторов реакций синтеза меланина ведет к уменьшению толщины капсульной стенки свободнорадикальных соединений в составе меланотической капсулы, так и образованием высокореакционных соединений в виде промежуточных продуктов реакций в процессе меланизации (Nappi et Christensen, 2005). Антимикробные пептиды, синтезируемые гемоцитами внутрь капсулы, также способны оказывать токсическое действие на патоген (Lavine, Strand, 2002).

Иммунная система насекомых напоминает систему врожденного иммунитета позвоночных животных. Механизм распознавания «чужого» как у позвоночных, так и у насекомых основан на детектировании консервативных структур микроорганизмов, которые принято называть патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП) (Medzhitov et Janeway, 2000). В организме насекомых существует определенный набор рецепторов, распознающих ПАМП (ПРР – паттерн-распознающие рецепторы).

Большинство известных ПАМП – это компоненты наружной мембраны и клеточной стенки бактерий (липополисахариды, пептидогликаны) или клеточной стенки грибов (глюканы), вирусная двунитевая РНК или фрагменты этих молекул (Medzhitov et Janeway, 2000). ПАМП обладают некоторыми особенностями, необходимыми для их иммуногенной активности. Они продуцируются только микроорганизмами, а не клетками хозяина, и являются необходимыми для выживания и патогенности компонентами (Medzhitov et Janeway, 2000). Иммунные клетки могут связываться с ПАМП как напрямую, так и опосредовано через гуморальные ПРР, к которым относятся лектины, гемолин, ЛПС-связывающий белок, белок, распознающий пептидогликаны, белок, распознающий грамотрицательных бактерий и др. (Hoffman et Lemaitre, 2007).

Способность этих молекул связываться с ПАМП с одной стороны и клеточными ПРР – с другой обусловливает их функции: агрегацию паразитов, привлечение гемоцитов в очаг инфекции, облегчение фагоцитирования гемоцитами патогенных микроорганизмов и их опсонизацию, запуск синтеза цитотоксических молекул клетками жирового тела (Hoffman et Lemaitre, 2007).

К группе соединений, обеспечивающих гуморальную защиту, относят различные ферменты, которые могут запускать каскадные реакции, такие как коагуляция гемолимфы (Bidla et al., 2005), репарация повреждений, активация гемоцитов (Lavine et Strand, 2002) и детоксикация продуктов жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести и те вещества, которые не обладают ферментативной активностью, но способные участвовать в формировании иммунитета – антимикробные и фунгицидные белки, ингибиторы протеаз и др.

В ответ на септическую травму насекомые продуцируют огромное количество антимикробных и фунгицидных пептидов. Большинство из них избирательно активны по отношению к различным группам микроорганизмов, грамотрицательным и грамположительным бактериям, дрожжам и простейшим грибам (Bulet et al., 1999;

Chernysh, 1996). В соответствии с особенностями строения все пептидные антибиотики насекомых можно разделить на три группы: цекропины; дефензины и другие антимикробные пептиды, содержащие дисульфидные связи и пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами (пролин-богатые и глицин-богатые) (Bulet et al., 1999;

Chernysh, 1996).

Цекропины впервые были выделены из гемолимфы куколок гигантского шелкопряда Hyalophora cecropia (Steiner et al., 1981). В дальнейшем гомологичные пептиды были выделены и охарактеризованы из гемолимфы чешуекрылых и двукрылых насекомых. Цекропины – это линейные катионные полипептиды, состоящие из 35- аминокислотных остатков. Молекула цекропина условно может быть разделена на полярный положительно заряженный N-концевой участок, переходящий в преимущественно гидрофобный срединный участок, соединяемый пролином и (или) глицином с амидированной С-концевой последовательностью (Holak et al., 1988).

Вторичная структура представляет собой короткий неупорядоченный N-концевой участок, переходящий в амфипатическую -спираль, которая с помощью шарнира соединена с гидрофобной С-концевой -спиралью (Holak et al., 1988). Цекропины чешуекрылых активны как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, но не проявляют активности по отношению к эукариотическим клеткам (Boman et al., 1991; Moore et al., 1996). Известный цекропин C. vicina активен только в отношение грамотрицательных бактерий (Chernysh, 1996). Более узкий спектр действия цекропинов двукрылых может быть объяснен наличием у этих насекомых другой группы пептидов – дефензинов, активных против грамположительных бактерий. У чешуекрылых подобных дефензинов нет, описанный у Heliothis virescens цистеин-богатый пептид, высоко гомологичный дефензинам других насекомых, не эффективен по отношению к бактериям, однако обладает сильной фунгицидной активностью (Lamberty et al., 1999).

Дефензины насекомых и другие антимикробные пептиды, содержащие Дефензины насекомых были открыты независимо двумя группами исследователей.

В 1988 они были обнаружены в культуре эмбриональных клеток Sarcophaga peregrina и названы сапецины (Matsuyama et Natori 1988); в 1989 дефензины были выделены из гемолимфы личинок Phormia terranovae и получили название формицина А и В (Lambert et al., 1989). Дефензины насекомых являются катионными молекулами, состоящими из 34аминокислотных остатков. Для всех дефензинов характерно присутствие шести цистеиновых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика (Hoffamnn et Hetru, 1992). Молекулярная структура дефензинов насекомых представлена тремя разными доменами: гибкая N-концевая петля, центральная амфипатическая спираль и С-концевой -слой, сформированный двумя антипараллельными -тяжами (Bonmatin et al., 1992). Дефензины насекомых токсичны преимущественно для грамположительных бактерий, в отличие от дефензинов позвоночных. Дефензины были обнаружены у представителей отрядов Diptera, Coleoptera, Hemiptera, Hymenoptera, Trychoptera, Odonata (Hoffamnn et Hetru, 1992) и Lepidoptera (Lamberty et al., 1999).

Помимо дефензинов у насекомых были обнаружены другие полипептиды, содержащие дисульфидные связи. Септическая травма индуцирует синтез дрозомицина у плодовой мушки Drosophila melanogaster (Fehlbaum et al., 1994). Этот пептид содержит остатков цистеина, формирующих четыре внутримолекулярных дисульфидных мостика.

Дрозомицин проявляет мощное антифунгальное действие. Ни на клетки бактерий, ни на клетки животных этот пептид не оказывает токсического эффекта. Из гемолимфы клопа Podisus maculiventris был выделен танатин, включающий 21 аминокислотный остаток, в том числе и два цистеина, формирующие один дисульфидный мостик (Fehlbaum et al., 1996). Танатин обладает широким спектром цитотоксического действия. Он токсичен для многих грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также для мицелиальных грибов.

Пептиды с высоким содержанием пролина и аргинина Данная группа пептидных антибиотиков широко представлена у насекомых. К этой группе относятся апидацин (Casteels et al., 1989) и абецин (Casteels et al., 1990), выделенные из гемолимфы медоносной пчелы Apis mellifera. Характерной особенностью апидацина является комбинация остатков пролина и аргинина в аминокислотной последовательности встречаются и в пептиде из гемолимфы D. melanogaster – дрозоцине (Bulet et Hetru, 1993). К этой же группе относится пиррокорицин клопа Pyrrhocoris apterus (Cociancich et al., 1994) и лебоцин, выделенный из гемолимфы иммунизированных личинок тутового шелкопряда, Bombyx mori (Hara et Yamakawa, 1995). И дрозоцин, и пиррокорицин, и лебоцин являются гликопептидами. В отличие от пиррокорицина метальниковины – пептиды, обнаруженные в гемолимфе клопов семейства Pentatomidae, не гликозилированы и проявляют более слабую антимикробную активность (Chernysh et al., 1996). Все перечисленные пролин/глицин-богатые пептиды обладают антиграмотрицательной активностью. Однако есть пептиды, обладающие комбинированной бактерицидной и фунгицидной активностью. К ним относится мечниковин, выделенный из дрозофилы (Levashina et. al., 1995).

Недавно были описаны пролин-богатые пептиды C. vicina, не имеющие близких аналогов среди известных антимикробных пептидов насекомых. Они токсичны для грамположительных бактерий (Черныш и др., 2008). Р-пептиды в различных отрядах насекомых характеризуются значительным разнообразием структуры. Примером этому служат метальниковины, выделенные из гемолимфы клопа Palomena prasina (Chernysh et al., 1996).

В работе, посвященной исследованию индуцибельных генов личинок Lucilia sericata, экспрессия которых во много раз усиливается под действием септической травмы, были идентифицированы открытые рамки считывания, кодирующие потенциальные пролин-богатые антимикробные пептиды (Altincicek et Vilcinskas, 2009).

Они обладают некоторым сходством с дрозоцином и мечниковином дрозофилы. Эти искусственно синтезированные пептиды обладают антимикробной активностью по отношению к грамположительному M. luteus.

У чешуекрылых глицин-богатые полипептиды представлены аттацинами (Boman, 1991). Для аттацинов характерен довольно узкий спектр антибактериальной активности, направленный против некоторых грамотрицательных бактерий, обитающих в кишечнике насекомых. Однако их активность, вероятно, может существенно увеличиваться в присутствии других антимикробных факторов, секретируемых в гемолимфу одновременно с аттацинами.

Наиболее близкий аналог аттацинов - полипептид саркотоксин II был выделен из S.

peregrina (Ando et al., 1987). Колеоптерицин и холотрицин - другие глицин-богатые полипептиды были обнаружены в гемолимфе жесткокрылых насекомых (Cociancich et al., 1994). Все эти антибиотики токсичны главным образом для грамотрицательных бактерий.

Более широкий спектр антибактериальной активности, который включает также и грамположительные бактерии, характерен для гименоптецина медоносной пчелы (Casteels et al., 1993).

Еще одни глицин-богатые пептиды - диптерицины - найдены у некоторых двукрылых, в том числе у синей мясной мухи Calliphora vicina (Chernysh, 1996) и зеленой мясной мухи L. sericata (Altincicek et Vilcinskas, 2009). Диптерицины представляют собой химерические молекулы, которые состоят из пролин-богатого и глицин-богатого доменов.

При этом последовательность первого домена гомологична таковой апидацина, а последовательность второго - последовательности аттацинов и особенно саркотоксину II (Cociancich et al., 1994 (b)). Диптерицины токсичны для грамотрицательных бактерий и мицелиальных грибов Neurospora crassa (Chernysh, 2000).

К противогрибковым веществам относятся глицин/гистидин-богатые фунгицидные белки и полипептиды: например, холотрихин из личинок Holotrichia diomphalia (Lee et al., 1995), антифунгальный белок AFP из серой мясной мухи Sarcophaga peregrina (Iijima et al., 1993), тенецин из Tenebrio molitor (Dae-Hee et al., 1998). Все вышеперечисленные вещества ингибируют рост Candida albicans, очень распространенного патогена человека.

Однако, механизм их действия изучен недостаточно хорошо. Кроме того, гемолимфа насекомых содержит ряд фунгицидных пептидов, которые могут синтезироваться под действием септической травмы, как дрозомицин – цистеин – богатый белок (Lemaitre et al., 1996) и мечниковин – пролин-богатый полипетид (Levashina et al., 1995), выделенные из Drosophila melanogaster или танатин из клопа Podisus maculiventris (Fehlbaum et al., 1996). К тому же было показано, что существует синергизм в действии фунгицидных белков и антимикробных пептидов. Небольшое количество саркотоксина I значительно усиливает летальный эффект фунгицидного белка S. peregrina по отношению к C. albicans (Iijima et al., 1993). Сами по себе дефензины насекомых активны в отношении некоторых грибов и дрожжей, в то время как основной их мишенью являются грамположительные бактерии (Hetru et al., 1998). Но дефензин, выделенный из гемолимфы иммунизированных гусениц Heliothis virescens, гелиомицин (Lamberty et al., 1999), а также цистеин-богатый полипетид жука-носорога, скарабецин (Tomie et al., 2003), обладают преимущественно фунгицидной активностью. Аминокислотная последовательность гелиомицина обладает большим сходством с фунгицидным пептидом дрозофилы, дрозомицином, и дефензинами насекомых, и содержит шесть остатков цистеина. Искусственно синтезированные гелиомицин и скарабецин характеризуется широким спектром действия в отношении различных типов грибов. Гелиомицин проявляет активность и по отношению к C. albicans (Lamberty et al., 1999).

Биологическая активность и механизм действия антимикробных пептидов Амфипатический характер строения молекул большинства антимикробных пептидов обеспечивает их внедрение в билипидный слой мембраны бактерии и нарушение его целостности. В состав цитоплазматической мембраны бактерий входят кислые фосфолипиды в существенно более высокой концентрации, чем в плазмалемму эукариотических клеток (Oren et al., 1998). Это объясняет преимущественное сродство антимикробных пептидов к мембранам бактериальных клеток.

В организме насекомых есть антимикробные пептиды, которые более эффективно поражают грамположительную микрофлору, нежели грамотрицательную, но присутствуют также и пептиды, действующие против грамотрицательных бактерий.

Действие последних обусловлено взаимодействием с липополисахаридом – основным компонентом наружной мембраны (Boman, 1995).

Для описания механизма цитотоксического действия антимикробных пептидов предложена модель «бочарной клепки» (Reddy et al., 2004). Первым этапом является адсорбция нескольких молекул пептида на поверхности мембраны бактериальной клетки за счет электростатических взаимодействий с ее отрицательно заряженными молекулами.

Затем за счет гидрофобных взаимодействий происходит внедрение молекул антимикробных пептидов в липофильную фазу липидного бислоя. На заключительной стадии внедрившиеся и ориентированные поперек мембраны молекулы пептида формируют поры с умеренной селективной проницаемостью для анионов. Это приводит к утечке ионов из клетки и, как следствие, деполяризации мембраны. Вода устремляется внутрь клетки, вызывая разбухание и осмотический лизис Рассеивание мембранного потенциала лишает клетки возможности осуществлять активный транспорт ионов и веществ против градиента концентраций, что в итоге резко снижает их жизнеспособность (Christensen et al., 1988).

Некоторые антимикробные пептиды взаимодействую с внутриклеточными мишенями. Например, белок РР-39 ингибирует белковый синтез бактерии и вызывает распад белков, задействованных в процессе репликации бактериальной ДНК (Reddy et al., 2004); нисин и другие белки могут индуцировать автолизис, активируя гидролазы, разрушающие клеточную стенку бактерий (Bierbaum et Sahl, 1985); пиррокорицин ингибирует АТФ-азы и белковый фолдинг (Kragol et al., 2001).

Коагуляция гемолимфы – это процесс образования нерастворимого матрикса, который способствует остановке кровотечения, заживлению ран и защищает от проникновения инфекции. У всех членистоногих повреждение запускает два протеолитических каскада, которые приводят к быстрому тромбообразованию и меланизации в сайте повреждения. Чужеродная частица, также как и паразит или бактерия, попадая в полость тела, может вызвать локальное тромбообразование и меланизацию (Kurata, 2006). Каскад коагуляции гемолимфы не достаточно полно изучен у насекомых, но серьезные исследования были посвящены свртыванию крови у мечехвостов (Iwanaga, 1998). Две протеазы этого каскада, фактор В и просвертывающий фактор, содержат маленький домен с 3 дисульфидными мостиками. Похожий домен присутствует в предшественниках протеаз SNAKE и EASTER у дрозофилы, которые участвуют в спецификации дорзо-вентральной оси у эмбриона. Коагулоген лимулюса, аналог фибриногена позвоночных, обладает определенной гомологией со SPAEZLE, который является мишенью для SNAKE и EASTER у эбриона дрозофилы. Так как продукт гена spaezle необходим для индукции синтеза антимикробных пептидов, то не исключено сосуществование двух параллельных систем, участвующих в одном процессе (Nagai et Kawabata, 2000).

У дрозофилы коагулоген обнаружить не удалось. Тем не менее, у некоторых видов насекомых идентифицирован его аналог в виде липид-содержащего протеина, названного липофорин, это многофункциональная молекула, принимающая непосредственное участие в иммунном ответе у насекомых (Theopold et al., 2002). У табачного бражника фиброзный тромб сформирован 22-кДа белком, гемофибрином (Geng et Dunn, 1988), у дрозофилы – гемолектином (Lemaitre et Hoffmann, 2007). В гемолимфе дрозофилы в качестве одного из факторов свертывания была идентифицирована трансглутаминаза (Karlsson et al., 2004). Продукты генов fon и hml также участвуют в процессе коагуляции.

Экспрессия гена fon индуцируется инфекцией; продукт этого гена, белок fondue, является субстратом для трансглутаминазы. С помощью методов молекулярной генетики было показано, что этот белок участвует в формировании тромба и компонентов кутикулы у личинок дрозофилы (Scherfer et al., 2006). У млекопитающих трансглутаминаза участвует в формировании поперечных сшивок фибриновой сети и связывании ее с белками плазмы (Iwanaga et al., 1998). Этот фермент является общим фактором свертывания для многих членистоногих, например, он вовлечен в процесс коагуляции гемолимфы у мечехвостов и, возможно, также катализирует образование сшивок между коагулином, бактериальной клеточной стенкой и белками плазмы (Iwanaga et al., 1998).

У некоторых насекомых описан целый ряд белков, участвующих в индукции каскада свертывания гемолимфы. К ним относятся М13 (Minnick et al., 1986) и сколексин M. sexta (Finnerty et al., 1999), гемоцитин B. mori (Kotani et al., 1995). В гемолимфе дрозофилы были обнаружены полипептиды, относящиеся к семейству пентраксинов (Garlanda et al., 2005). Пентраксины включают С-реактивный белок и другие родственные молекулы, участвующие в активации каскада комплимента и свертывания, как у членистоногих, так и у позвоночных.

Наиболее заметным биохимическим сходством в каскадах свертывания гемолимфы у насекомых и крови у позвоночных является перемещение отрицательно заряженных фосфолипидов с внутреннего полулистка мембраны клеток во внешний с помощью ферментов (Theopold et al., 2002). Scavenger-рецепторы обладают сродством к этим липидам как у позвоночных, так и у беспозвоночных (Rigotti et al., 1995; Franc et White, 2000). На следующем этапе из гемоцитов происходит кальций-зависимое высвобождение микрочастиц, покрытых цитоплазматической мембраной (Theopold et Schmidt, 1997).

Негативно заряженные фосфолипиды – это общая особенность для апоптотических клеток, клеток, участвующих в коагуляции и бактериальных клеток. Поэтому в процессе коагуляции не исключено участие антимикробных пептидов (Boman, 1995).

фенолоксидаза - небольшой пептид, молекулярный вес которого у насекомых не превышает нескольких сотен кДа, состоящий из нескольких субъединиц (Ashida, 1974;

Soderhall et al., 1990). Фенолоксидаза инициирует преобразование тирозиноподобных соединений, молекулы которых содержат фенильные радикалы, в органический гетерополимер - меланин. Меланин определяет потемнение кутикулы насекомого и ее затвердевание при образовании новых покровов или при репарации старых.

Промежуточные продукты синтеза меланина – это хиноны и фенольные соединения, придающие кутикуле прочность (Nappi et Christensen, 2005). В ходе реакций меланогенеза образуются высокореактивные соединения: хиноны и активные формы кислорода, которые вызывают закисление среды в месте повреждения и в очаге локализации неспецифическое токсичное действие на патогены (Nappi et Christensen, 2005).

Фенолоксидаза находится в неактивном состоянии, в виде предшественника – профенолоксидазы – в гемолимфе, гемоцитах, клетках жирового тела, в кутикуле и, повидимому, эпителиальных клетках кишечника (Li et al., 1992; Saul et al., 1987; Gillespie, 1997). Преобразование профенолоксидазы в активную форму происходит на последней стадии серинового протеолитического каскада. (Hultmark, 1993). Наружные структуры паразита (ПАМП) узнаются эстеразами, которые, в свою очередь, активируют сериновые протеазы и запускают протеолитический каскад (Ashida et Yamazaki, 1990).

Активированные молекулы сериновых протеаз являются катализаторами реакции образования фенолоксидазы из неактивного предшественника (Ashida et Yamazaki, 1990).

Один из путей регулирования активности фенолоксидазной системы связан с существованием ингибиторов сериновых протеаз (Soderhall et al., 1990) - факторов, которые, специфически блокируя активность последних, обеспечивают гомеостаз всей системы. Профенолоксидазная система активируется бактериальными полисахаридами, такими как ЛПС, 1,3--D-глюканы и пептидогликаны в небольших концентрациях, а также – немикробными агентами, денатурированными белками, липофоринами, определенными фосфолипидами из разрушенных клеток (Theopold et al., 2002). Часто фенолоксидазная система не в состоянии остановить развитие паразитов из-за высокой скорости их размножения (Hoffmann, 1995). Поэтому есть основания полагать, что основной функцией данной системы является не защита, а распознавание чужеродных микроорганизмов и последующая активация синтеза антимикробных пептидов, т.е.

функция опсонизации. Выделяемые в ходе реакций соединения привлекают к защите организма гемоциты.

Поскольку барьерный эпителий постоянно контактирует с огромным количеством микроорганизмов, его поверхность должна быть снабжена эффективной системой распознавания и контроля. Это особенно важно для насекомых, и в первую очередь для тех из них, чьи личинки развиваются в разлагающихся субстратах, например личинки мясных мух или фруктовых мушек. Просвет кишки этих насекомых является не очень подходящей средой для микробной колонизации благодаря физическим и физиологическим свойствам, а также секреции лизоцима (Hoffmann et Lemaitre, 2007).

Вдобавок, локальная продукция антимикробных пептидов и активных форм кислорода обеспечивает двойную индуцибельную систему, защищающую барьерный эпителий. В ряде работ была показана локальная продукция антимикробных пептидов клетками поверхностного эпителия. При воздействии живых бактерий или компонентов бактериальной клеточной стенки на поврежденные участки эпикутикулы личинок Bombyx mori и Hyalophora cecropia эпителиальные клетки, подлежащие под поврежденным слоем, и клетки жирового тела начинают экспрессировать ген цекропина (Brey et al., 1993).

Исследования на дрозофиле с использованием гена GFP показали экспрессию генов антимикробных пептидов в клетках некоторых поверхностных эпителиев. К ним относятся гиподерма, репродуктивная система, пищеварительный и респираторный тракты. Антимикробные пептиды, синтезирующиеся в этих тканях, обеспечивают локальный иммунный ответ и не всегда являются индуцибельными. Так гены дрозомицина в слюнных железах и сперматеке экспрессируются конститутивно (Tzou et al., 2000). Клетки эпидермиса, в т.ч. клетки трахейной системы, у личинок Galleria melonella в больших количествах содержат лизоцим (Vilcinscas et Gotz, 1999). Однако локальный синтез дрозомицина и диптерицина индуцируется и в трахеях, и в кишечном эпителии дрозофилы в ответ на заражение грамотрицательными бактериями (Tzou et al., 2000). Кроме того, авторами данного исследования на личинках и имаго дрозофилы был показан эффект тканеспецифичной экспрессии генов тех или иных антимикробных пептидов. Так у личинок плодовой мушки дрозоцин и дрозомицин секретируются в просвет трахей; дефензин и мечниковин синтезируются в эпителиальных клетках ротовых органов и пищевода; дефензин, диптерицин и аттацин обнаружены на всем протяжении пищеварительного тракта. У имаго дрозофилы в лабелярных железах на конце хоботка были идентифицированы дефензин и мечниковин; в слюнных железах – дроцомицин; в кардиальном отделе желудка и средней кишке – диптерицин (Tzou et al., 2000)..

Интересно, что почти во всех исследованных тканях детектируется экспрессия как минимум двух типов антимикробных пептидов с комплементарным спектром активности (Tzou et al., 2000), что характерно и для слизистых оболочек млекопитающих (Huttner et Bevins, 1999). Тканеспецифичная экспрессия очень характерна для слизистых оболочек позвоночных (Wah, 2006) и даже для поверхностных эпителиальных клеток некоторых видов растений (Thomma et Broekaert, 1998). Например, -дефенсины продуцируются клетками Панета, нейтрофилами и альвеолярными макрофагами (Ouellette, 2005). дефенсины характерны для эпителия пищеварительного тракта в целом, ресничного эпителия трахей, эпителия почек, мочеполового тракта, потовых и слюнных желез (Chen et Fang, 2004).

антимикробными пептидами, участвующими в системном ответе, но и бактерицидными белками, характерными только для данного типа тканей. В средней кишке мухи Stomoxys calcitrans конститутивно экспрессируются тканеспецифичные дефензины Smd-семейства (Munks et al., 2001). Группой ученых был обнаружен полипептид, андропин, который синтезируется в семяпроводе у самцов дрозофилы в ответ на спаривание и не индуцируется при микробной инвазии, несмотря на то что ген, кодирующий андропин, грамположительных бактерий, но в высоких концентрациях демонстрирует и антиграмотрицательную активность (Samakoviis et al., 1991).

Кроме антимикробных пептидов барьерные эпителии насекомых выделяют вторичные метаболиты, обладающие бактерицидными и фунгицидными свойствами.

Секреторные железы личинок горчичного листоеда Phaedon cochleariae выделяют фунгицидные соединения, прежде всего монотерпеновые иридоиды, ингибирующие рост и созревание спор паразитических грибов Beauveria bassiana, специфичных для данного вида жуков, а также вещества, характеризующиеся антиграмотрицательной активностью (Gross et al., 1998). Фитопатогенный клоп Nezara viridula выделяет гексеналь и десеналь, которые действуют одновременно и как феромоны тревоги, и как ингибиторы роста грибов Metarhizium anisopliae (Gross et al., 1998).

История применения «хирургических личинок» уходит своими корнями в далекое прошлое. Существуют данные о том, что личинок использовали представители различных древних культур, таких как аборигены племени Нгемба Нового Южного Уэльса в Австралии (Dunbar, 1944), племена на севере Бирмы (Greenberg, 1973) и целители Майя в Центральной Америке (Sherman, 1988). Исследователи полагают, что Майя вымачивали одежду в крови крупного рогатого скота и оставляли ее на солнце, перед тем как нанести на рану, для того чтобы обеспечить присутствие личинок мух (Dunbar, 1944).

Французский хирург, Амбруаз Паре (1510-1590), был первым врачом, отметившим замечательное влияние личинок мух на заживление ран (Whitaker et al., 2007). Он, однако, настаивал на деструктивной природе личинок и препятствовал заражению ран пациентов.

Но однажды Паре исследовал случай глубокого повреждения черепа. Рана не заживала в течение длительного времени. Только после того, как произошло заражение огромным количеством личинок мух и, несмотря на серьезные повреждения костной ткани, пациент вылечился. Впоследствии Паре оставлял личинок развиваться в ранах и усиливать восстановительные процессы.

Другой французский хирург, Доминик Жан Ларей (1766-1842), выдающийся французский военный хирург, участник всех походов Наполеона I, один из основоположников военно-полевой хирургии, во время Египетского похода заметил, что личинки синей мухи питаются только мертвыми тканями и оказывают положительное влияние на нижележащие живые (Whitaker et al., 2007).

Первое задокументированное упоминание о применении хирургических личинок было сделано Захариасом во время Гражданской войны в США (Whitaker et al., 2007). Но именно Уильям Бэр считается основателем личиночной терапии, который также был военным хирургом, а свои полевые наблюдения стал использовать для лечения остеомиелита, применяя стерильных личинок (Baer, 1931). Успехи исследовательской работы Бэра привели к тому, что личиночная терапия стала активно распространяться с середины 30-х годов ХХ века до начала 40-х, но с открытием пенициллина и повсеместным внедрением антибиотиков в медицину интерес к хирургическим личинкам стал угасать. Уже спустя 4 года после широкого распространения пенициллина 50% госпитальных инфекций, вызванных Staphylococcus aureus, не поддавались лечению (Barber et al., 1948). В 1960 году появилась структурная модификация пенициллина, метициллин, который активно боролся с пенициллин-устойчивыми штаммами S. aureus, а в 1961 уже были выделены первые клинические изоляты метициллин-устойчивого S.

aureus (MRSA) (Jevons, 1961). Широкое распространение штаммов бактерий, устойчивых ко всем традиционным антибиотикам (например, MRSA и ванкомицин-устойчивый Enterococcus) привело к новому расцвету личиночной терапии. В последнее время многие исследования показали, что личинки Lucilia sericata обладают способностью бороться с инфекциями, вызванными золотистым стафилококком (Thomas et al., 1999; Bexfield et al., 2004).

контролируемый миаз. Среди мух, вызывающих миазы человека и животных, выделяют группы облигатных и факультативных паразитов. Факультативные паразиты заражают живого хозяина очень редко, чаще развиваясь на мертвых тканях; таким образом, именно такие виды подходят для медицинских целей. Бэр использовал в своих исследованиях личинок зеленой мясной мухи, Lucilia sericata, которых и по сей день применяют чаще всего. Подходящими для личиночной терапии особенностями данного вида являются поедание преимущественно некротических тканей без внедрения в живые, возможность ведения лабораторных культур и стерилизации всех возрастов, начиная с яиц.

Личиночная терапия успешно применяется при лечении хронических ран, зачастую не поддающихся традиционным методам лечения, к ним относятся: абсцессы, ожоги, гангрены, диабетические язвы, пролежни, язвы, вызванные остеомиелитом, артериальными заболеваниями и др. (Nigam et al., 2006а).

Личиночная терапия характеризуется тремя главными эффектами: очищение раневой поверхности, дезинфекция и ускорение процессов заживления. Очищение раны включает в себя удаление омертвевших тканей, а также уничтожение связанных с ними патогенных бактерий. В ходе заживления раны во время острого воспалительного процесса лейкоциты играют важную роль в удалении поврежденных компонентов внеклеточного матрикса за счет высвобождения протеаз. Повреждение заполняется временной тканью, в основном представленной фибрином и фибронектином. Протеазы, участвующие в деградации этого внеклеточного матрикса, выделяются нейтрофилами, макрофагами, фибробластами, эндотелиальными и эпителиальными клетками; в это же время синтезируются новые составляющие, коллаген, эластин и протеогликаны (Schultz et al., 2003). Однако стоит отметить, что хронические раны не проходят через все эти стадии нормального заживления, а характеризуются затяжным воспалительным процессом, ингибированием клеточной пролиферации, неполной перестройкой внеклеточного матрикса и отсутствием эпителизации. Чрезмерная экспрессия и неэффективная очистка раны от компонентов временного внеклеточного матрикса (фибрина и фибронектина) ведет к тому, что хронические раны практически не заживают (Bucalo et al., 1993).

хирургическую, механическую, энзиматическую очистки, промывание и т.д. Каждый из этих методов связан с рядом неудобств, например, продолжительное время воздействия, боль, механическое повреждение подлежащих здоровых тканей (Schultz et al., 2003).

Альтернативный способ очистки – это личиночная терапия, действующая быстро и эффективно без повреждения живых тканей (Nigam et al., 2006а).

В настоящее время большое количество работ посвящено исследованию механизмов личиночной терапии, а именно очищению ран от некротических тканей.

Показано, что личинки выделяют множество пищеварительных ферментов, включая карбоксипептидазы А и Б, лейциновые аминопептидазы, коллагеназы, аспартиловые и сериновые протеазы (трипсино- и химотрипсино-подобные) и металлопротеазы с молекулярными массами от 20 до 40 кДа, сохраняющими активность в широком диапазоне рН. Их субстратами являются фибриновые сгустки, фибронектин, коллаген I и III типа и ламинин (Chambers et al., 2003). Протеолитическая активность экзосекрета связана с изменением адгезии фибробластов человека к коллагеновой поверхности и особенно фибронектину; молекула фибронектина подвергается фрагментации, в результате высвобождаются небольшие по молекулярной массе биоактивные пептиды, модулирующие поведение, пролиферацию и миграцию фибробластов; сила клеточной адгезии также, в свою очередь, влияет на скорость миграции клеток, следовательно, экзосекрет влияет на миграцию фибробластов (Horobin et al., 2005). Кроме того, фибробласты выделяют определенные цитокины, разрушающие фибриновый сгусток, тем самым, усиливая приток новых клеток к очагу поражения, пролиферируют, формируя главные клеточные компоненты новой ткани (Horobin et al., 2003).

Данные доказывают, что выделяемые личинками гликозидазы удаляют углеводные остатки с белков временной соединительной ткани, находящейся в хронической ране (Telford et al., 2012). Как было показано ранее, отсутствие углеводных компонентов на поверхности белковых молекул увеличивает эффективность протеиназ (Grenier et Mayrand, 2001) и ускоряет протеолитическое очищение раневой поверхности с помощью других ферментов, выделяемых личинками. Кроме того, гликозидазы способствуют стерилизации раны, воздействуя непосредственно на бактерий. Компоненты клеточной стенки бактерий чувствительны к действию гликозидаз (Selsted and Martinez, 1978). Эти ферменты могут разрушить клеточную стенку и привести к лизису бактериальной клетки или могут способствовать свободному поступлению АМП, синтезируемых личинками, к цитоплазматической мембране бактерии.

Заживление раны – это комплексный согласованный процесс. Важными регуляторами этого процесса являются ростовые факторы, хемокины и цитокины. К ростовым факторам относятся митогены, которые стимулируют пролиферацию и хемотаксис эпителиальных, эндотелиальных клеток и фибробластов (Nigam et al., 2006b).

Присутствие ростовых факторов, хемокинов и цитокинов обеспечивает расширение сосудов, увеличение проницаемости капилляров и, как следствие, приток клеток. В хронических ранах, однако, чрезмерная экспрессия внеклеточного матрикса мешает распространению сигнальных молекул (Falanga et al., 1994). Ранние теории связывали усиленное ранозаживление под действием личинок с дополнительным снабжением тканей кислородом (Wollina et al., 2000). Другие исследователи предполагали, что процессы ускоренной регенерации связаны с действием аллантоина (Robinson, 1935) или гидрокарбоната аммония (Robinson, 1940). За счет выделения личинками в качестве конечных продуктов обмена свободного аммиака и аллантоина создается щелочная среда.

(Виноградова, 1984). Во многих работах по исследованию антибактериальных свойств экзосекрета было показано, что для выделений личинок харатерен рН 8-8,5 (Bexfield et al., 2004; Thomas et al., 1999; Cazander et al., 2009a и др.).

способствующий процессу заживления, связан с воздействием на нейтрофилы. В хронических ранах эти клетки усиливают повреждение тканей, а не способствуют их заживлению. Экзосекрет доза-зависимо ингибирует высвобождение эластазы и продукцию пероксида водорода активированными нейтрофилами, а также уменьшает экспрессию адгезионных молекул CD11b и CD18 этими клетками, тем самым, модулируя адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам и процесс трансэндотелиальной миграции. В целом, экзосекрет, ингибирует множественные провосполительные механизмы активированных нейтрофилов (Van der Plas et al., 2007).

I.2.1. Антибактериальные свойства экзосекрета Исследования, посвященные антимикробному действию выделений хирургических личинок, проводятся в течение многих лет. Предполагается, что некоторые механизмы связаны с простым промыванием раны выделяемой личинками жидкостью, продукция которой стимулируется поглощением размягченных некротических тканей (Wollina et al., 2000).

Существует теория о том, что комменсальные бактерии вида Proteus mirabilis, обитающие в средней кишке личинок мясных мух, продуцируют антимикробные компоненты, а именно фенилуксусную кислоту (ФУК) и фенилацетальдегид (ФАА) (Erdmann, 1987). Но участие этих веществ в дезинфекции ран маловероятно, поскольку в личиночной терапии используются стерильные личинки, к тому же pH личиночных выделений 8-8,5 (Bexfield et al., 2004; Thomas et al., 1999; Cazander et al., 2009a), в таких условиях ФУК обладает низким антимикробным потенциалом, а ФАА нестабилен.

Более вероятно, что личинки заглатывают бактерий и уничтожают их в пищеварительном тракте. Робинсон и Норвуд в 1934 году исследовали жизнеспособность и обилие бактерий в желудочно-кишечном тракте хирургических личинок. Личинок помещали их в инфицированную рану на 24-48 часов, затем пищеварительную систему делили на фрагменты и наносили на агар или вымачивали в питательной среде. Было показано, что задняя кишка личинок практически стерильна, в то время как передняя и средняя были сильно заражены. Основными видами бактерий, обнаруженными в пищеварительном тракте личинок, были S. aureus, Streprococcus sp. (Robinson et Norwood, 1934). Похожее исследование с аналогичными результатами было проведено другими исследователями с использованием GFP (green fuorescent protein)-продуцирующих бактерий Escherichia coli (Mumcuoglu et al., 2001). Авторы данного исследования предположили, что происходит сорбция бактерий на поверхности перитрофической мембраны за счет лектинов, что было показано для пищеварительного тракта другого вида мясной мухи Calliphora vicina (Peters et al. 1983).

Уже в 1935 году Саймонсом было проведено исследование, посвященное прямому антимикробному действию экзосекрета хирургических личинок L. sericata. Он собирал продукты элиминации личинок и обнаружил значительную антибактериальную активность в тестах на 7 видах бактерий, возбуждающих пиогенные инфекции. Поскольку задняя кишка личинок стерильна, автор полагал, что антимикробной активностью обладают фекалии. В этом же исследовании была обнаружена термостабильность бактерицидных компонентов выделений и было показано, что 5-10 минут воздействия экскрета на бактериальную суспензию достаточно, чтобы бактерии становились не способны расти и размножаться (Simmons, 1935).

Некоторые исследователи предпринимали попытки определить антимикробную активность личинок L. sericata in vivo, т.е. непосредственно в ране. Сравнивая численность и разнообразие бактерий до и после применения личиночной терапии, авторы обнаружили, что число КОЕ снижается, особенно это характерно для грамотрицательных бактерий (Jaklic et al., 2008; Steenvoorde et Jukema, 2004). Подобные исследования, но уже in vitro, также проводились разными группами ученых, их результаты были не однозначны. Так инкубация личинок L. sericata с бактериальной суспезией S. aureus в течение трех часов приводила к полному ингибированию роста бактерий (Thomas et al., 1999). Такой же эффект наблюдался при действии живых личинок на культуры бактерий E. coli и M. luteus (Daeschlein et al., 2007). Однако в аналогичном исследовании даже часов инкубации с экзосекретом не произвели на бактерий никакого эффекта (Cazander et al., 2009b). Аналогичный эксперимент, но с применением метода тестирования на агаровых пластинах проводился другой группой ученых. На культуры бактерий, инокулированных в агар (MRSA, P. aeruginosa, ванкомицин устойчивый Enterococcus sp., C. albicans) помещали живых личинок и накрывали сверху маленькими чашками Петри.

Зоны лизиса были исследованы спустя 24 часа после удаления личинок и оставались неизменны в течение 5 последующих суток; личинки оказались активны по отношению ко всем видам бактерий (Margolin et Gialanella, 2010). Трудно сопоставить результаты подобных экспериментов, поскольку количество личинок и концентрация их выделений в таком случае не определяемы.

Легко предположить, что искусственно собранный экзосекрет личинок L. sericata, возможно также способен ингибировать рост ряда бактерий. Такие работы проводились несколькими группами исследователей, но сравнивать их результаты довольно сложно, поскольку и методы получения экзосекрета, и способы тестирования его антимикробной активности отличаются друг от друга. Общая особенность этих исследований, которая также характерна и для экзосекрета, действующего in vivo, заключалась в том, что выделения личинок оказались более эффективны по отношению к грамположительным бактериям, чем к грамотрицательным (Jaklic et al., 2008; Kerridge et al., 2005; Thomas et al., 1999). Томас и коллеги использовали сразу несколько методик в своем исследовании и обнаружили, что экзосекрет, действующий в жидкой среде, ингибирует рост грамположительных бактерий (S. aureus, Streptococcus группы A и B, частично MRSA), а грамотрицательные (E. coli, Enterococcus sp., Proteus sp.) в присутствии экзосекрета растут быстрее; авторы связывают это с повышением рН, потому что данные виды бактерий в отличие от других хорошо переносят слабощелочные условия (Thomas et al., 1999).

Другие независимые группы исследователей, используя тот же метод, обнаружили и антиграмположительную (S. aureus), и в меньшей степени антиграмотрицательную (E.

coli, Pseudomonas aeruginosa) активности в выделениях личинок L. sericata (Bexfield et al., 2004; Jaklic et al., 2008). Метод дифференциального биотестирования на агаровых пластинах, который традиционно используется для определения антимикробной активности бактерицидных препаратов, был признан некоторыми исследователями неэффективным и низко чувствительным (Bexfield et al., 2004, Kerridge et al., 2005).

Однако и с помощью этого метода удалось обнаружить бактерицидную активность экзосекрета, более высокую по отношению к грамположительным (S. aureus, Streptococcus, MRSA) бактериям и меньшую по отношению к грамотрицательным (E. coli, P. aeruginosa) (Kerridge et al., 2005; Van der Plas et al., 2008).

Попытки определить и выделить из экзосекрета определенный действующий компонент или их смесь стали предприниматься недавно. В одном из таких исследований электрофоретического разделения был выделен компонент массой 6 кДа, обладающий широким спектром антимикробной активности (по отношению и к грамотрицательным E.coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, и к грамположительным бактериям S.

aureus, MRSA, S. epidermidis, Listeria sp.). Но, к сожалению, дополнительные характеристики данного фактора не исследовались (Mumcuoglu et al., 2001).

Фракционирование экзосекрета личинок L. sericata позволило обнаружить, что фракции экзосекрета от 5 до 10 кДа и менее 1 кДа обладают антистафилококковой активностью (Kerridge et al., 2005).

Но наиболее активно исследовалась фракция экзосекрета 500 Да. Данная фракция ингибирует рост ряда бактерий; наиболее чувствительными оказались Bacillus subtilis и Klebsiella pneumoniae, а также 12 штаммов MRSA. Резистентными к этой фракции оказались P. mirabilis и S. epidermidis. После инкубации с фракцией экзосекрета 500 Да бактерии вида Bacillus cereus формировали филаментозные нити, превышающие длину отдельной бактериальной клетки в контроле в 17 раз, бактерии E. coli приобретали лимоновидную форму, и их деление полностью ингибировалось. Использование проточной цитометрии позволило определить характер действия фракции экзосекрета 500 Да по отношению к бактериям. На MRSA и цельный экзосекрет, и его фракция Да оказывают бактериостатическое действие. Для E. coli фракция 500 Да оказалась бактерицидной (Bexfield et al., 2008).

Как известно насекомые продуцируют значительное количество антимикробных и фунгицидных пепетидов, полипептидов и гликопепетидов (Chernysh, 1996; Hetru et al., 1998). Однако молекулярная масса этих веществ превышает 500 Да, например масса дефензина P. terranovae около 4кДа (Hoffmann et Hoffmann, 1990), масса диптерицинов C.

vicina порядка 9 кДа (Черныш и др., 2008). Но известно, что насекомые синтезируют и короткие антимикробные пептиды. Личинки серой мясной мухи Neobellieria bullata продуцируют модифицированный дипептид, -аланил-тирозин, молекулярная масса которого 252 Да (Meylaers et al., 2003), имаго другого вида серых мясных мух Sarcophaga peregrina синтезируют трипептид 5-S-GAD массой 573 Да (Leem et al., 1996); другой низкомолекулярный антимикробный агент был выделен из иммунизированных личинок пилильщика Acantholyda parki (148 Да) (Leem et al., 1999) и 1-лизофосфатидилэтаноламин (451,2 Да) из личинок домашней мухи Musca domestica (Meylaers et al., 2004). Личинки зеленой мясной мухи продуцируют не только антимикробные полипептиды, дефензины и диптерицины, например (Altincicek et Vilcinskas, 2009), но и низкомолекулярные антимикробные вещества, к которым относятся п-гидроксибензойная кислота (138 Да), пгидроксифенилуксусная кислота (152 Да) и дипептид, циклический димер пролина, молекулярная масса которого 194 Да (Huberman et al., 2007). Другие фенольные производные были выделены исследователями из личинок пилильщика (Leem et al., 1999), а у некоторых видов водных жуков обнаружилась п-гидроксибензойная кислота, которую продуцируют пигидиальные железы этих насекомых и выделяют на поверхность тела (Schildknecht, 1971). Однако все вышеперечисленные бактерицидные агенты выделяются в гемолимфу и их синтез зачастую носит индуцибельный характер (Huberman et al., 2007).

Вопрос о том, способны ли личинки мясных мух выделять эти вещества или их часть во внешнюю среду, остается открытым.

Глава II. Материалы и методы исследования II.1.1. Краткая характеристика основного модельного объекта Объектом исследований служила зеленая мясная муха Lucilia sericata (Meigen).

Кроме того, в ряде экспериментов использовали лабораторные культуры личинок мух Calliphora vicina и Musca domestica.

Простота культивирования зеленой мясной мухи в лабораторных условиях, возможность массового разведения, высокая жизнеспособность и невосприимчивость к заболеваниям способствовали широкому использованию этого объекта для решения разных вопросов из области физиологии, экологии, токсикологии и других дисциплин (Виноградова, 1991).

Для L. sericata и C. vicina характерна личиночная диапауза. Наступление диапаузы детерминируется преимущественно сочетанием короткого фотопериода и низких температур, при этом материнское влияние на диапаузу потомства ослаблено (Saunders et al., 1986, цит. по Виноградова, 1991). Диапаузирующим личинкам свойственны остановка развития и неспособность к пупаризации. Возобновление развития наблюдается как при повышенной температуре, так и в результате длительного охлаждения при низких температурах.

II.1.2. Методика лабораторного содержания В опытах использовали личинок лабораторной линии, используемой в качестве хирургических личинок. Культура характеризуется относительно стабильной личиночной диапаузой, контролируемой фотопериодическими и температурными условиями содержания личинок.

Имаго содержали в садках квадратной формы объемом около 30 дм, обтянутых мельничным газом. Плотность содержания имаго варьировала в пределах 0.3 – 0.5 дм на особь. Кормом служили свежее мясо и творог.

Закончивших питание личинок через 1-2 дня после очищения кишечника от остатков пищи помещали в слегка влажные опилки в камеру с температурой +4. Диапаузу индуцировали содержанием личинок в темноте при температуре +12 °С (Виноградова, 1991). Для экспериментов использовали питающихся личинок (L. sericata, C. vicina, M.

domestica) или диапаузирующих в течение нескольких недель (L. sericata).

Иммунный ответ индуцируют проколом кутикулы насекомых тонкой иглой (минуция 00), смоченной в концентрированной суспензии клеток кишечной палочки Escherichia coli штамма D31 (2x1011 клеток/мл) и кокка Micrococcus luteus штамма А (2x1011 клеток/мл).

II.2.1.1. Получение бактериальной суспензии для иммунизации Небольшое количество бактерий E. coli и M. luteus микробиологической петлей переносят в стеклянные колбы со 100-150 мл жидкой среды (Luria broth base, 25 г/л) и инкубируют в течение ночи при +37°С. Содержимое каждой колбы центрифугируют мин. при 3000 об./мин., удаляя надосадочную жидкость. Осадок, представленный бактериальными клетками, ресуспендируют в небольшом объеме жидкой среды, разливают в эппендорфы и еще раз центрифугируют 15 мин при 3000 об./мин.

Надосадочную жидкость удаляют.

Перед сбором гемолимфы поверхность тела личинок стерилизуют 70% раствором этилового спирта, промывают дистиллированной водой и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Гемолимфу иммунизированных и интактных личинок собирают через прокол кутикулы от большого количества особей в пластиковые пробирки, погруженные в лед.

Сбор гемолимфы иммунизированных личинок проводят спустя сутки с момента иммунизации. Образцы гемолимфы центрифугируют в течение 8 минут при 3000 об/мин в условиях комнатной температуры. Супернатант тестируют, основную его часть переносят в температурные условия – 20 °С.

Сбор экзосекрета производят от активно питающихся личинок. Личинок (масса 150-220 г.) очищают от субстрата, стерилизуют 70 % этиловым спиртом и помещают в чистую банку на 2 часа. Через 2 часа в банку приливают 50 мл дистиллированной воды;

через 30 мин личинок помещают в воронку, из которой экзосекрет поступает в сборную емкость (чашка Петри, погруженная в лед). Накапливающийся экзосекрет периодически пропускают через бумажные фильтры и центрифугируют 10 минут при 7000 об./мин и + °С. По данной методике собирают темноокрашенный экзосекрет. Также была разработана методика по сбору экзосекрета, не содержащего темноокрашенных примесей. Активно питающихся личинок отделяют от питательной среды кратковременным нагреванием кюветы со средой. Отделенных личинок помещают в небольшое количество опилок до опустошения зоба. Затем добавляют питательную среду, состоящую из опилок и творога.

Через некоторое время личинок, наполнивших зобы новым субстратом, отделяют от питательной среды и используют для получения экзосекрета по описанной выше методике (Дольник, неопубликованные данные). Для использования в дальнейших тестах экзосекрет пропускают через бактериальные фильтры Millipore (0,22 мкм).

Бактерицидную активность образцов определяют при помощи стандартного метода определения зон ингибирования роста бактерий (Lambert et al., 1989), используя в качестве тест-организмов грамотрицательную бактерию Escherichia coli штамма D31 и грамположительный кокк Micrococcus luteus штамма дикого типа А270. Выбор этих штаммов объясняется их высокой чувствительностью к цитотоксическим пептидам насекомых. В некоторых тестах использовали дополнительные виды грамположительных бактерий (Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Listeria monocytogenes EGD, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphilococcus aureus 203, MRSA ATCC 33591 и E. coli 774.1).

Микроорганизмы переносят в стерильную жидкую среду и инкубируют в течение ночи при температуре +37°С. На следующий день переносят аликвоту (50 мкл) ночной культуры в стерильную жидкую среду (5 мл) и инкубируют 4-4,5 часа (log-фаза).

Определяют оптическую плотность бактериальной суспензии при 620 нм (А620) и рассчитывают объем аликвоты для засева одной чашки по формуле V(мкл/чашку)=15/А (5*105 КОЕ/мл). В стерильный мерный цилиндр добавляют растопленную агаровую среду (LB agar, 32 г/л), из расчета 7,5 мл на одну чашку, и аликвоту жидкой среды с бактериями.

Агаровую среду разливают в стерильные чашки Петри диаметром 90 мм. Чашки хранят в холодильнике и используют в течение недели.

Тестирование антимикробной активности производят следующим образом. Пробы анализируемых образцов наносят микропипеткой на поверхность твердой агаровой среды, инокулированной бактериями. Чашки Петри со средами инкубируют в течение 15- часов в термостате при температуре +37 °С. После инкубации среда в чашках становится непрозрачной вследствие появления видимых бактериальных колоний, за исключением области вокруг нанесенных проб, в пределах которой антимикробные вещества подавляют рост бактериальных колоний. Так как площадь этой области пропорциональна содержанию цитотоксических пептидов в гемолимфе, описанный метод используют для количественного определения антимикробной активности гемолимфы.

Тестирование фунгицидной активности проводят на грибах видов Aspergillus versicolor, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Cladosporium sphaerospermum, Trichoderma viride, Penicillium fuscum. Анализируемый образец добавляют в теплую питательную среду (бактериальный агар или агаризованная среда Чапека – питательная среда для культивирования грибов) в определенном соотношении; в контрольном опыте используют только питательную среду. Теплую среду разливают в стерильные чашки Петри диаметром 40 мм или лунки 96-луночного планшета. Кусочек мицелия наносят в центр чашки или лунки уколом микологической иглы. Чашки или планшет инкубируют в термостате при постоянной температуре +25°С. За развитием грибных колоний следят в течение нескольких дней; по замедленному росту мицелия или отсутствию роста судят о фунгицидной или фунгистатической активности анализируемого образца.

II.2.6. Методы концентрации и очистки исследуемых образцов Экстракцию производят на картриджах Sep-Pak (Waters) для очистки гемолимфы и Sep-Pak Vac 20cc (Waters) для очистки экзосекрета с сорбентом C18, который обратимо связывает гидрофобные группы пептидов и полипептидов. Образцы подкисляют равным по объему количеством 0.1% водного раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ) и центрифугируют в течение 10 минут при 8000 об./мин для удаления нерастворимого осадка. Полученную надосадочную жидкость наносят на предварительно активированную метанолом (5 мл в случае гемолимфы и 50 мл в случае экзосекрета) и стабилизированную 0,05% ТФУ (те же объемы) колонку в одном направлении. Гидрофильные компоненты удаляют промыванием колонки 0,05% ТФУ (те же объемы), при необходимости собирают, лиофилизируют и используют в дальнейших тестах. Далее колонку элюируют гидрофобным растворителем (50% ацетонитрил в 0,05% ТФУ). Элюат собирают, подвергают лиофильной сушке и используют для определения антимикробной и (или) фунгицидной активности, а также для последующего хроматографического фракционирования.

II.2.6.2. Хроматографическое фракционирование Хроматографическое фракционирование осуществляют в режиме гидрофобной обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии под высоким давлением (ОФ ВЭЖХ) на хроматографе Gold System с детектором Beckman 166A (Beckman). Выбор данного метода объясняется его высокой эффективностью для разделения пептидов и полипептидов (Chicz, Regnier, 1990).

При хроматографии использовали колонку Ascentic C18 (10x250мм). Колонку уравновешивют 0.1% раствором ТФУ, SepPak-экстракт растворяют в 0,05% ТФУ и наносят на колонку. Элюирование проводят при линейном градиенте ацетонитрила от 0% до 50% за 50 мин, регистрируя изменение поглощения при 225 нм. Пробы собирали в минисорбы с помощью автоматического коллектора фракций «Beckman SC» (Beckman).

Полученные фракции высушивали в вакууме, замораживали и хранили при температуре – 70°С.

Для масс-спектрометрического анализа органических соединений используют два различных метода ионизации. Метод ионизации при атмосферном давлении - ионизация в электроспрее (ESI-TOF=electrospray ionization - time of flight) и ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI-TOF= matrix assisted lazer desorption ionization - time of flight).

В первом случае используется ионизация электрораспылением анализируемого раствора при атмосферном давлении, позволяющая получать квазимолекулярные ионы термолабильных соединений непосредственно из раствора. Ионы из области ионизации при атмосферном давлении через систему дифференциальной откачки транспортируются в высоковакуумную область масс-анализатора. В качестве масс-анализатора используется времяпролетный анализатор с ортогональным вводом ионов.

В методе MALDI-TOF фотоны лазерного луча ионизуют и испаряют матрицу мишени, на которую нанесен образец, а образующиеся из матрицы ионы ионизуют молекулы образца, не разрушая их.

Исследования с использованием метода ESI-TOF выполнены на базе лаборатории масспектрометрии Института аналитического приборостроения (С.Петербург), метода MALDI-TOF – на базе ЦКП аналитической спектрометрии при Политехническом университете (С.Петербург).

II.2.8. Методы исследования живых гемоцитов Гемолимфа, выделенная через прокол в головной области личинок, помещалась на ограниченный вазелиновой рамкой участок предметного стекла с предварительно нанесенной каплей физиологического раствора и немедленно исследовалась под микроскопом с использованием дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) по Номарскому. Эта методика позволяет получить барельефные изображения клеток и ряда клеточных структур, включая ядра, ядрышки и вакуоли. Она очень удобна для распознавания отдельных типов гемоцитов и для анализа их состояния в процессе функционирования. Изображения гемоцитов были получены с использованием цифровой видеокамеры Digital CDSP, установленной на микроскопе Jenamed. Они захватывались с помощью программы iuVCR и редактировались в Corel PHOTO-PAINT X3.

Для индукции клеточной защитной реакции личинкам различного возраста инъецировали по 10 мкл стерильной 2-5 % суспензии мелко растертого медицинского активированного угля в физиологическом растворе (NaCl 0.65г., KCl - 0.014г., CaCl2 г., дистиллированной воды до 100 мл.). Фракции с различным размером частиц получали путем отстоя первичной суспензии. В надосадочной жидкости через 3-4 ч отстоя превалируют частицы величиной 1-3 мкм, а через 16-20 ч – 0.1-0.5 мкм. Для предотвращения дополнительного бактериального заражения личинки перед инъекцией промывались в 70% этиловом спирте и просушивались на фильтровальной бумаге.

II.2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическая обработка включала вычисление среднего арифметического и ошибки среднего.

Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и III.1. Фунгицидная активность гемолимфы личинок Lucilia интактных личинок L. sericata проводилось на грибах видов Aspergillus flavus и Cladosporium sphaerospermum. Гемолимфа предварительно центрифугировалась 8 минут при 3000 об/мин в условиях комнатной температуры; надосадочная жидкость смешивалась с теплой питательной средой (бактериальный агар) в соотношении 1:5 (0, мл гемолимфы / 0,5 мл агара) в случае гемолимфы иммунизированных личинок и 1:1 (по 0,5 мл) в случае гемолимфы интактных личинок; в контроле – 1,5 мл бактериального агара. Тестирование проводили в чашках Петри диаметром 40 мм, кусочек мицелия наносили в центр чашки уколом микологической иглы. Чашки инкубировались в термостате при постоянной температуре +25°С. Наблюдение за развитием грибных колоний производилось в течение 10 дней; замедленный рост мицелия (+) или отсутствие гемолимфы. Результаты анализа фунгицидной активности гемолимфы представлены в таблице (Таблица 1).

иммунизированных и интактных личинок L. sericata.

A. flavus C. sphaerosp. A. flavus C. sphaerosp. A. flavus C. sphaerosp.

споры споры к – контроль фунгицидной активностью. Наиболее эффективно гемолимфа действует на грибы вида C.

sphaerospermum. Однако было отмечено, что гемолимфа иммунизированных личинок не полностью ингибирует рост и развитие мицелия A. flavus. Но, несмотря на это, и тот, и другой тип гемолимфы эффективно подавляют спорообразование, в то время как в контрольном опыте споры появляются уже на 4 день инкубации.

III.2.Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilia sericata, Calliphora vicina, Musca domestica При изучении особенностей и свойств экзосекретов «хирургических личинок»

исследователи в своих работах использовали разные виды мух: Phormia terranovae (Pavillard et Wright, 1957); Musca domestica (Wollina et al., 2000); Lucilia cuprina (Elkington et al., 2009; Paul et al., 2009) и Lucilia sericata (Thomas et al., 1999 и др.).

Фунгицидная активность противомикробных компонентов хирургических личинок практически не освещена в литературе. Еще меньше известно о сравнительных характеристиках этих компонентов у нескольких видов мух.

III.2.1. Фунгицидная активность экзосекрета Lucilia sericata.

Тестирование фунгицидной активности цельного экзосекрета L. sericata на грибах видов A. flavus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, C. sphaerospermum, Trichoderma viride и Penicillium fuscum производили в чашках Петри диаметром 40 мм. Экзосекрет предварительно пропускали через бумажные фильтры, центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин +10°С; надосадочная жидкость была пропущена через бактериальный фильтр. Затем экзосекрет добавляли в теплую питательную среду (бактериальный агар) в соотношении 1:1 (500 мкл экзосекрета / 500 мкл агара); в контроле – 1 мл агара.

Результаты исследования фунгицидной активности представлены на рисунках (рисунки и 2) и в таблице 2.

Рисунок 1. Влияние экзосекрета личинок L. sericata на рост C. sphaerospermum.

а) опыт: при добавлении экзосекрета в питательную среду гриб не развивается, в центре чашки остается кусочек мицелия от укола микологической иглы;

б) контроль: в чашке Петри, содержащей только стерильную питательную среду, мицелий разрастается от центра к периферии.

Рисунок 2. Влияние экзосекрета личинок L. sericata на рост A. versicolor.

а, б) контроль и опыт: в чашке Петри, содержащей как стерильную питательную среду, так и агар, содержащий экзосекрет, мицелий разрастается от центра к периферии; цвет колоний в контроле и опыте отличается, поскольку данный вид гриба приобретает различную окраску на разных питательных средах.

Таблица 2. Спектр фунгицидной активности экзосекрета личинок L. sericata.

ЭС – экзосекрет к – контроль - - отсутствие роста + - незначительный рост ++ рост +++ - активный рост Экзосекрет личинок зеленой мясной мухи проявляет избирательную активность по отношению к некоторым видам грибов, таких как A. flavus, C. sphaerospermum (см. рис.1) и T. viride; A. versicolor (см. рис.2), A. niger и P. fuscum оказались не чувствительны к действию компонентов экзосекрета L. sericata.

Для того, чтобы определить фунгицидной или фунгистатической активностью характеризуется действие экзосекрета L. sericata на мицелий грибов были проведены следующие эксперименты. Мицелий A. flavus предварительно инкубировали при комнатной температуре +20°С в неразбавленном экзосекрете (100%) и в экзосекрете, смешанным со стерильной водой в соотношении 1:1 (50%). Время инкубации мицелия с экзосекретом составило 1 час и 18 часов. В контрольных опытах мицелий инкубировали со стерильной водой. Затем мицелий высевали на чашку Петри диаметром 40 мм с бактериальным агаром, помещая в предварительно вырезанные лунки (~2 мм). После инокуляции мицелия в агаровую среду чашки инкубировались в термостате при температуре +25°С. Наблюдение за развитием грибных колоний производилось в течение 5 дней. Результаты экспериментов представлены в таблице (Таблица 3).

Таблица 3. Влияние предварительной инкубации A. flavus с экзосекретом личинок L.

sericata на рост и развитие мицелия.

Условные обозначения: см. таблицу 2.

Поскольку мицелий, который инкубировали 18 часов, высевали на следующий день после начала инкубации, первая цифра, указанная в столбце «день инкубации»

соответствует именно этим пробам.

Опираясь на данные, полученные в этом эксперименте, можно предположить, что экзосекрет личинок L. sericata обладает скорее фунгистатической, а не фунгицидной активностью. Инкубация мицелия в течение одно часа как в стерильной воде, так и в экзосекрете, не вызывает никаких изменений в росте и развитии грибной колонии. Однако 18 часовая инкубация в любой из жидкостей вызывает отставание в росте мицелия и задержку спорообразования. Вероятно, это связано с длительным пребыванием мицелия в неблагоприятных для его развития условиях. Таким образом, чтобы подавлять развитие грибных колоний, экзосекрет должен присутствовать постоянно и оказывать фунгистатический эффект, поскольку после предварительного контакта с экзосекретом гриб остается жизнеспособным.

III.2.2. Фунгицидная активность экзосекрета Calliphora vicina.

Тестирование экзосекрета C. vicina производилось на грибах вида A. flavus и P.

fuscum в маленьких чашках Петри. В одном случае экзосекрет добавляли на поверхность застывшего агара (1,5 мл агара, 1,5 мл экзосекрета); при этом было отмечено, что экзосекрет плохо впитывался питательной средой; сверху помещались кусочки мицелия гриба. В другом случае экзосекрет смешивали с питательной средой в соотношении 1: (500 мкл экзосекрета, 500 мкл агара). Результаты эксперимента представлены в таблицах Таблица 4. Фунгицидная активность экзосекрета личинок Calliphora vicina в отношении Aspergillus flavus.

Условные обозначения: см. таблицу 2.

Таблица 5. Фунгицидная активность экзосекрета личинок Calliphora vicina в отношении Penicillium fuscum.

Условные обозначения: см. таблицу 2.

Экзосекрет личинок синей мясной мухи полностью блокирует рост и развитие мицелия A. flavus и оказывается неэффективным в отношении P. fuscum.

III.2.3. Фунгицидная активность экзосекрета Musca domestica.

Тестирование экзосекрета M. domestica производилось на грибах видов A. flavus, A.

niger и P. fuscum с использованием маленьких чашек Петри. Экзосекрет добавляли в теплую питательную среду (бактериальный агар) в соотношении 1:1 (500 мкл экзосекрета, 500 мкл агара); в контроле – 1 мл агара.

микологической иглы. Чашки инкубировали в термостате при постоянной температуре +25°С. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

Таблица 6. Фунгицидная активность экзосекрета личинок M. domestica.

Условные обозначения: см. таблицу 2.

Экзосекрет личинок M. domestica подавляет рост и развитие грибов рода Aspergillus, испльзумых в данном эксперименте, однако, P. fuscum предпочитает экзосекрет питательной среде и развивается на нем активнее. Вероятно, фунгицидные компоненты экзосекрета M. domestica не эффективны в отношении грибов P. fuscum, но экзосекрет также содержит некоторое количество белков (например, коллагеназы и др.

протеолитические ферменты (Chambers et al., 2003; Constable, 1994; Telford et al., 2010)), которые могут быть использованы в качестве питательного субстрата. Хотя естественные пищевые субстраты домашней мухи и синей мясной мухи отличаются, их экзосекреты обладают сходным спектром фунгицидной активности.

III.3. Фунгицидная активность фракционированного III.3.1. Фунгицидная активность гидрофобной фракции Экзосекрет личинок представляет собой многокомпонентную смесь. Часть этих компонентов или их сочетания ответственны за фунгицидную или скорее фунгистатическую, а также антибактериальную активность экзосекрета. Чтобы определить являются ли они веществами пептидной природы, экзосекрет подвергли фракционированию Известно, что антимикробные пептиды обычно характеризуются промежуточной степенью гидрофобности и положительным зарядом молекулы. Поэтому для дальнейших исследований производили предварительную очистку экзосекрета от соединений гидрофильных и «супер»-гидрофобных. Гидрофобную фракцию выделяли методом твердофазной экстракции на картриджах SepPak, используя в качестве элюента 50% раствор ацетонитрила в 0.05% ТФУ (см. «Материалы и методы»). Органический растворитель и воду из фракции удаляли при вакуумной сушке. Лиофилизат хранили при температуре –70 °С. Лиофилизированные SepPak экстракты растворяли в дистиллированной воде, и центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре для удаления нерастворимого в воде осадка. Надосадочная жидкость смешивалась с теплой питательной средой (агаризованная среда Чапека) в соотношении 1:1; в контроле использовали питательную среду Чапека.

Определение фунгицидной или фунгистатической активности гидрофобной и гидрофильной фракций экзосекрета L. sericata проводилось на грибах видов A. versicolor, A. niger, C. sphaerospermum, T. viride. Тестирование проводили в 96-луночном планшете, кусочек мицелия наносили в центр лунки уколом микологической иглы. После инокуляции мицелия планшет инкубировался в термостате при постоянной температуре +25°С. За развитием грибных колоний наблюдали в течение 8 дней. Результаты экспериментов представлены в таблице (Таблица 7).

Таблица 7. Влияние гидрофобной и гидрофильной фракций экзосекрета личинок L.

sericata на рост и развитие грибных колоний.

1 – гидрофобная фракция экзосекрета; 2- гидрофильная фракция экзосекрета Условные обозначения: см. таблицу 2.

По результатам данного эксперимента можно сделать следующие выводы.

Гидрофобная фракция экзосекрета подавляет рост C. sphaerospermum, гидрофильная ингибирует развитие T. viride. Виды рода Aspergillus не чувствительны к фракциям экзосекрета, как не были чувствительны и к цельному экзосекрету. Как было показано фракционирование экзосекрета позволило сконцентрировать компоненты, оказывающие свое воздействие на грибы и приблизительно определить природу действующих веществ.

Логично предположить, что фунгицидная активность характерна для пептидов и полипептидов, тем более в организме насекомого, следовательно, основное действие должны оказывать компоненты гидрофобной фракции. Однако развитие T. viride подавляется действием гидрофильной фракции, которая, скорее всего, содержит вещества иной природы. На данном этапе можно предположить, что экзосекрет личинок L. sericita содержит компоненты фунгистатического механизма действия двух типов: гидрофобные соединения, активные в отношении C. sphaerospermum и, возможно, относящиеся к катионным пептидам, и гидрофильные соединения неизвестной природы.

III.3.2. Фунгицидная активность хроматографических фракций Для дальнейших исследований гидрофобные компоненты экзосекрета L. sericita были подвергнуты обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Каждая фракция была протестирована на предмет фунгицидной активности по отношению к C. sphaerospermum. Таким образом, была определена область на хроматограмме гидрофобной фракции экзосекрета, отвечающая за данный тип активности. Фракции лиофилизировали и растворяли в стерильной воде объемом 100 мкл.

Поскольку для ОФ ВЭЖХ использовали навеску в 12 мг, то условная концентрация вещества в одной фракции составила 120 мг.эквивалентов/мл. Это содержание сухого вещества примерно сопоставимо с действующей концентрацией гидрофобной фракции экзосекрета (60 мг/мл), которая подавляет рост грибов C. sphaerospermum. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 8.

Таблица 8 Фунгицидная активность хроматографических фракций экзосекрета личинок L. sericata.

Условные обозначения: см. таблицу 2.

Фунгицидной активностью обладают вещества, которые элюируются с колонки при низких концентрациях ацетонитрила (6 – 13%, 16%), таким образом, были получены новые, хроматографические характеристики антифунгальных компонентов экзосекрета личинок L. sericata.

1. Гемолимфа интактных и иммунизированных личинок L. sericata проявляет фунгицидную активность по отношению к C. sphaerospermum.

2. Экзосекрет личинок L. sericata проявляет избирательную активность по отношению к некоторым видам грибов, таких как C. sphaerospermum и T. viride. Экзосекрет M.

domestica подавляет рост A. flavus и A. niger, экзосекрет C. vicina – A. flavus, Грибы вида P. fuscum оказались не чувствительны к действию экзосекрета любого из использованных видов мух.

3. Гидрофобная фракция экзосекрета подавляет рост и спорообразование C.

sphaerospermum, гидрофильная - T. viride.

4. Хроматографические фракции экзосекрета L. sericita, которые элюируются с колонки при концентрациях ацетонитрила от 6 % до 13% и 16%, характеризуются фунгицидной активностью по отношению к C. sphaerospermum.



Pages:   || 2 | 3 |
 
Похожие работы:

«АЛЕЙНОВА ОЛЬГА АРТУРОВНА РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА РЕЗВЕРАТРОЛА ГЕНАМИ Сa2+ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В КЛЕТКАХ ВИНОГРАДА АМУРСКОГО VITIS AMURENSIS RUPR. 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н. Киселёв К.В. ВЛАДИВОСТОК СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...»

«НИЗКИЙ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ АНТРОПОГЕННО НАРУШЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ В АМУРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.14 – биологические ресурсы (биологические наук и) Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Благовещенск...»

«БУРДУКОВСКИЙ МАКСИМ ЛЕОНИДОВИЧ ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ХИМИЗАЦИИ ПОЧВ ЮГА ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА НА БИОЛОГИЧЕСКИЙ КРУГОВОРОТ И СОДЕРЖАНИЕ МАКРО– И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Голов Владимир Иванович...»

«Чвартацкая Оксана Викторовна Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека Специальность 03.01.04 биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент...»

«Данилова Ольга Витальевна НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : Д.б.н. С.Н. Дедыш Москва - 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ Часть 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.. Цель и задачи работы.....»

«Старков Алексей Иннокентьевич ЭКОЛОГИЯ ДАУРСКОЙ ПИЩУХИ (OCHOTONA DAUURICA PALLAS, 1776) В ЮГО-ЗАПАДНОМ ЗАБАЙКАЛЬЕ Специальность 03.02.08 — Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : канд. биол. наук Н.Г. Борисова Улан-Удэ - 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ...»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВНУТРИУТРОБНЫХ ПНЕВМОНИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ИСХОДОМ 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц, доктор медицинских наук, профессор Г.Г. Фрейнд Пермь – ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....»

«ТАРАНОВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА КОМПЛЕКСЫ АНТИТЕЛ С НАНОДИСПЕРСНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ: СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ 03.01.04 Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научные руководители: доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев кандидат биологических наук А.В. Жердев МОСКВА ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ...»

«Сафиуллина Регина Ринатовна ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО ПОД РАСТЕНИЯМИ-ФИТОМЕЛИОРАНТАМИ В ЗАУРАЛЬЕ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 03.02.13 – Почвоведение 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«ГОРБАЧЕВ АЛЕКСЕЙ ЮРЬЕВИЧ СИСТЕМА РЕПАРАЦИИ ДНК У БАКТЕРИИ MYCOPLASMA GALLISEPTICUM 03.01.04 – биохимия 03.01.03 – молекулярная биология диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН...»

«Пильганчук Оксана Александровна ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА НЕРКИ, ONCORHYNCHUS NERKA (WALBAUM), ПОЛУОСТРОВА КАМЧАТКА 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Н.Ю. Шпигальская Петропавловск-Камчатский – ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....»

«Баканев Сергей Викторович Динамика популяции камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) в Баренцевом море (опыт моделирования) Специальность 03.00.18 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор А. В. Коросов Мурманск – 2009 Содержание Введение... Глава 1....»

«Лыкшитова Людмила Станиславовна ЭКОЛОГО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ MALUS BACCATA (L ), ULMUS PUMILA (L ), SYRINGA VULGARIS( L. ) К ВОЗДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.01 – ботаника (биологические науки) 03.02.08 – экология (биологические науки) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Федосеева Лариса Абрамовна Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ 03.02.07 – генетика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д.б.н., проф. А.Л.Маркель д.б.н., проф. Г.М.Дымшиц Новосибирск 2  ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................»

«БОЕВА Валентина Анатольевна Идентификация и анализ тандемных повторов и близких структурированных сигналов в ДНК ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИХ НАУК ПО СПЕЦИАЛЬНОСТИ 03.00.02 БИОФИЗИКА Научные руководители: Кандидат физико-математических наук, В.Ю. Макеев Доктор биологических наук, А.А. Миронов Москва - СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Стр. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Микро-, минисателлиты и другие...»

«БАШКАТОВ АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ УПРАВЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ БИОТКАНЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА НИХ ОСМОТИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ ИММЕРСИОННЫМИ ЖИДКОСТЯМИ 03.00.02 - биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научные руководители: доктор физико-математических наук профессор В.В. Тучин кандидат физико-математических наук с.н.с. В.И. Кочубей Саратов...»

«Фисунов Глеб Юрьевич Функциональная геномика микоплазм при адаптации к стрессовым условиям внешней среды 03.01.04 – Биохимия 03.01.03 – Молекулярная биология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.б.н., профессор, член-корр. РАМН Говорун Вадим Маркович Москва – 2014 2 Оглавление Оглавление 1. Введение 1.1 Научная новизна и значимость работы...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 - экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1. Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1...»

«Азаренок Анастасия Александровна РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – доктор биологических наук Жилинская И.Н. Санкт-Петербург 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ № стр ВВЕДЕНИЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Структура вируса гриппа Гемагглютинин 1. Нейраминидаза 1. Мембранный белок М2...»

«Бондарев Станислав Александрович ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35 НА СВОЙСТВА ПРИОНА [PSI+] ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae Специальность 03.02.07 – генетика. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор, Г.А. Журавлева Санкт-Петербург Оглавление 1. Список сокращений 2. Введение 3. Обзор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.