WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 |

«Данилова Ольга Витальевна НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение наук

и Институт

микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

На правах рукописи

Данилова Ольга Витальевна

НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ

БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.02.03 – микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Д.б.н. С.Н. Дедыш Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы…………………………………………………………………. Цель и задачи работы…………………………………………………………………….. Научная новизна и значимость работы………………………………………………... Апробация работы………………………………

Публикации………………………………………………………………………………... Объем и структура………………………………………………………………………... Место проведения работы и благодарности…………………………………………... Часть 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….............. Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот…… ……

1.1. Роль метанотрофных организмов в круговороте метана в биосфере……………. 1.2. Общая характеристика аэробных метанотрофных бактерий………...…………… 1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов……………………….......…………… 1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов……………………..……

1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов…………………………………. Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий……………………………………………………………….. 2.1.Амплификация и анализ филогенетических генов……………………………….... 2.2. Амплификация и анализ функциональных генов…………………………………. 2.3. Количественная ПЦР………………………………………………………………… 2.4. Микрочипы…………………………………………………………………………… 2.5. Метод FISH…………………………………………………………………………... 2.6. Метод стабильных изотопов (SIP)………………………………………………….. Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот………………………………………………………………………….. 3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью молекулярных методов…………………………………………………………………… 3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных метанотрофов……………………………………………………………………………… 3.3. Пробелы в знаниях о метанотрофных сообществах сфагновых болот…………… Часть 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………

Глава 4. Объекты и методы исследования…………………………………………….. 4.1. Образцы нативного торфа, использованные в исследовании……………………... 4.2. Определение активности окисления метана образцами торфа…………………… 4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий с помощью метода FISH……….





4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа……………………………………….. 4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами……………. 4.3.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов для детекции метанотрофов..…………………………………………………………... 4.3.4. Разработка новых зондов и проверка их специфичности……………….…. 4.3.5. Микроскопический анализ…………………………………………………….. 4.3.6. Детекция и учет клеток микроорганизмов в образцах торфа……………. 4.4. Молекулярная идентификация болотных метанотрофов с помощью ПЦРанализа.…………………………………………………………………………………... 4.4.1. Экстракция тотальной ДНК из образцов торфа…………………………… 4.4.2. Экстракция ДНК из микробных клеток……………………………………… 4.4.3. ПЦР-амплификация филогенетических и функциональных генов исследуемых культур…………………………………………………………………. 4.4.4. Получение библиотек клонов генов pmoA болотных метанотрофов и генов 16S рРНК метанотрофов I типа………………………………………….. 4.4.5. Выделение плазмидной ДНК, очистка, секвенирование…………………… 4.4.6. Филогенетический анализ……………………………………………………. 4.5. Культивирование болотных бактерий……………………………………………. 4.5.1. Получение накопительных культур метанотрофов I типа………………. 4.5.2. Получение изолятов метанотрофов………………………………………… 4.5.3. Выделение других бактерий - компонентов метанотрофных сообществ……………………………………………………………………………... 4.6. Изучение свойств изолятов болотных бактерий………………………………….. 4.6.1. Методы изучения морфологических и физиологических характеристик………………………………………………………………………... 4.6.2. Аналитические методы ………………………………………………………. 4.6.3. Электронная микроскопия……………………………………………………. 4.6.4. Энзимологические исследования……………………………………………… 4.6.5. Определение состава хинонов………………………………………………… 4.6.6. Анализы состава жирных кислот и липидов………………………………… 4.6.7. Анализ пигментов……………………………………………………………… 4.6.8. Определение нуклеотидного состава ДНК………………………………….. 4.6.9. Фотодокументирование материалов и обработка данных……………….. Глава 5. Оценка активности окисления метана и дифференцированный учет клеток метанотрофов в кислых сфагновых болотах……………………………….. 5.1. Активность окисления CH4 сфагновым торфом…………………………………. 5.2. Учет клеток метанотрофов I и II типов в сфагновых болотах различного географического положения……………………………………………………………. Глава 6. Оценка филогенетического разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах………

6.1. Состав метанотрофного сообщества по данным анализа генов pmoA………….. 6.2. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов 16S рРНК………………………………………………………………………………… Глава 7. Выделение метанотрофных представителей Gammaproteobacteria из сфагновых болот……………………………………………………………………... 7.1. Представители рода Methylomonas………………………………………………… 7.1.1. Морфология…………………………………………………………………….. 7.1.2. Физиологические характеристики…………………………………………… 7.1.3. Пути ассимиляции углерода…………………………………………………… 7.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов………………………… 7.2. Представители рода Methylovulum………………………………………………… 7.3. Новые метанотрофы спирилло-подобной морфологии………………………….. 7.3.1. Морфология…………………………………………………………………….. 7.3.2. Анализ филогенетической принадлежности………………………………… 7.3.3. Разработка и применение зондов для детекции нового метанотрофа спирилло-подобной морфологии.…………………………………………………………… 7.3.4. Анализ функциональных генов………………………………………………… 7.3.5. Физиологические характеристики……………………………………………. Глава 8. Выделение первого представителя нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофам II типа………………………………………………………………….. 8.1 История выделения и первичный анализ………………………………………….. 8.2. Изучение морфо-физиологических особенностей……………………………….. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………….. ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………

ВВЕДЕНИЕ





Актуальность проблемы Метан (СН4) является одним из наиболее активных парниковых газов Земли. Из всего разнообразия микроорганизмов лишь метанотрофные бактерии способны использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. Аэробные метанотрофы ныне известны в пределах классов Gamma- и Alphaproteobacteria (метанотрофы I и II типов, соответственно), а также филума Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1986;

Гальченко, 2000; Trotsenko, Murrell, 2008; Троценко, Хмеленина, 2008; Op den Camp et al., 2009).

экосистемы (Matthews et al., 1987), среди которых наиболее распространены кислые (pH 3.5-5.5) сфагновые болота. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метанотрофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лет позволили установить, что основным компонентом «метанокисляющего фильтра» кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria, относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (Dedysh et al., 2001; Chen et al., 2008; Dedysh, 2009).

Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях (Dedysh et al., 2000, 2002, 2007; Vorobev et al., 2011; Belova et al., 2013). Помимо адаптации к физико-химическим условиям кислых болот, эти метанотрофы имеют и ряд других экологических преимуществ, в числе которых – способность некоторых представителей к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005;

Belova et al., 2011, 2013) и обладание мембранной метанмонооксигеназой высокого сродства к СН4 (Belova et al., 2013).

В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было.

По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003). Все же, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и pmoA, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Kip et al., 2010, 2011a). Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотрофов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма Methylomonas- и Methylovulum-подобных бактерий из кислого торфа (Kip et al., 2011б).

Эти изоляты, однако, были лишь частично охарактеризованы, а их роль в окислении метана в кислых болотах оставалась неподтвержденной.

Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер принадлежит к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.

Физиологические характеристики представителей этого кластера неизвестны, так как получить культуры представляющих его организмов до последнего времени не удавалось.

Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах.

Настоящее исследование было предпринято для восполнения вышеперечисленных пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем.

Цели и задачи исследования Цель работы – оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в кислых сфагновых болотах, выделение и описание новых представителей болотных метанотрофов, а также филогенетически родственных им неметанотрофных организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение популяционной численности и молекулярная идентификация метанотрофов I типа, населяющих сфагновые болота.

2. Получение репрезентативных изолятов метанотрофов I типа из кислых торфов, изучение их рН-предпочтений и установление таксономической принадлежности.

3. Изучение биологии представителей нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофным бактериям семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.

Научная новизна и значимость работы Впервые проведена комплексная оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в северных сфагновых болотах России.

Описан и узаконен первый ацидотолерантный вид рода Methylomonas - Methylomonas paludis sp. nov., который также является первым ацидотолерантным представителем семейства Methylococcaceae. Установлена способность метанотрофов этого вида развиваться в кислых средах (рН 3.8-4.5). Типовой штамм нового вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Впервые из нескольких болот переходного типа получен в накопительных культурах метанотроф необычной спиралевидной формы Candidatus Methylospira palustris, представляющий новый род и вид семейства Methylococcaceae. С помощью анализа библиотек клонов генов pmoA и 16S рРНК установлено присутствие этих метанотрофов в различных местообитаниях.

Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, факультативно анаэробных бактерий-бродильщиков, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Это первый представитель обширного кластера ранее некультивируемых микроорганизмов, филогенетически равноудаленного от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, и представленного клонами из различных болот и почв. Типовой штамм нового рода и вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Практическая значимость Существенно расширена база данных последовательностей генов pmoA и 16S рРНК метанотрофных бактерий, населяющих северные сфагновые болота. Совокупность полученных в работе новых последовательностей депонирована в GenBank.

Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды для детекции новой группы метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.

2. VII Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2011.

3. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.

4. IX Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2013.

Публикации Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 4 тезисах конференций.

Объём и структура диссертации Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 97 страницах, включая 11 таблиц, 25 рисунков и списка литературы из 224 наименований, из них 21 - на русском и 203 – на английском языке.

Место проведения работы и благодарности

Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2010 по 2013 годы.

Использованные в работе образцы торфа были предоставлены автору к.б.н. И.С.

Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой, а также отобраны автором. Изоляты MG30T и Pf56T были выделены и предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской (ИНМИ РАН, Москва).

Исследования ультратонкого строения клеток были проведены к.б.н. Н.Е. Сузиной, а энзимологический анализ - к.б.н. О.Н. Розовой (ИБФМ РАН, Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б. П. Баскуновым (ИБФМ РАН, Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены совместно с к.б.н. Е. Н. Детковой, а анализ продуктов брожения – с В.В. Кевбрином (ИНМИ РАН, Москва). Автор выражает глубокую признательность научному руководителю С.Н. Дедыш, а также всему составу лаборатории за всестороннюю помощь и советы при выполнении работы.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00768).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот.

Метанотрофы представляют собой уникальную группу прокариотных микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании метана (СН4) в качестве единственного источника углерода и энергии (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Murrell, 2008). Первый метанотроф был описан в году немецким исследователем Зенгеным, который выделил c поверхности растений пресноводного пруда бактерию, способную расти на метане, и назвал ее ‘Bacillus methanicus’ (Shngen, 1906).

Метанотрофы играют ключевую роль в глобальных циклах углерода и азота. Не менее важное свойство данных организмов заключается в способности к деградации опасных загрязнителей (Singleton et al., 2007), что побуждает ученых более внимательно взглянуть на них как на потенциальные агенты биоремедиации загрязненных территорий.

Большинство из описанных ныне метанотрофов являются мезофиллами, растущими в диапазоне температур 20 - 35°С и предпочитающими около-нейтральные значения рН (5Однако, среди них также встречаются термофильные ( 40°С) и психрофильные (15°С) представители. Ряд метанотрофов предпочитает расти в щелочных средах (рН 9.0), тогда как другие представители этих бактерий обитают в кислых условиях (рН 5).

Несмотря на все многообразие метанотрофных организмов, они объединены одним общим признаком – способностью окислять СН4, что делает их ключевым звеном глобального цикла углерода (Nazaries et al., 2013).

1.1. Роль метанотрофных организмов в круговороте метана в биосфере.

Метан является вторым после углекислого газа наиболее активным парниковым газом Земли. Его вклад в общий эффект, оказываемый парниковыми газами, составляет не менее 20-30% (Conrad, 2009). С начала индустриальной эпохи (начало XIX в.), концентрация метана в атмосфере постоянно увеличивалась с 0.7 p.p.m (объемная концентрация) до 1.745 p.p.m. к 2000 году. Начиная с 2005 года, наблюдалось некоторое замедление прироста метана, и уровень его в течение нескольких лет колебался в пределах 1.77-1.78 p.p.m. На сегодняшний день происходит медленное увеличение количества метана в атмосфере на 0.1% в год, и его глобальный бюджет оценивается в 500-600 Тг СН4 год-1 (Lelieveld et al., 1998; Wang et al., 2004).

Микробное образование метана осуществляется группой метаногенных архей в процессе конечного этапа анаэробного разложения органического вещества.

Метаногенные представители Euryarcheota способны синтезировать метан из водорода и углекислого газа, а в некоторых случаях, из ацетата и метанола в строго анаэробных условиях (Thauer et al., 2008). В дальнейшем, образованный метан окисляется метанотрофными бактериями, которые в большинстве своем аэробы, замыкая тем самым цикл углерода (Рис.1).

Рисунок 1. Глобальный цикл углерода в природе и роль метана в нем. Серыми прямоугольниками показаны главные звенья цикла углерода (Nazaries et al., 2013).

пресноводные осадки, растения, термиты (Conrad, 2009). Примерно 25% общего количества метана, поступающего в атмосферу, связано с разработкой месторождений полезных ископаемых, сжиганием ископаемого топлива, а также с окислением органической биомассы (Рис. 2).

Крупнейшими природными источниками поступления метана в атмосферу Земли являются болотные экосистемы. На их долю приходится около 2/3 общего потока природного метана (Conrad, 2009). С другой стороны, за последние 100 лет значительно возросла роль антропогенных источников в эмиссии метана, на долю которых приходится до 63% потока СН4. Наиболее значимыми из них являются рисовые чеки, животноводство, а также обширные свалки, в которых происходит разложение органических отходов с образованием больших количеств метана. Метан, Рисунок 2. Глобальные источники атмосферного метана. На рисунке показаны крупнейшие источники метана – мировые (на левой диаграмме) и антропогенного характера (на правой диаграмме) (цитировано по Nazaries et al., 2013).

продуцируемый в результате процессов брожения в кишечнике термитов, а также образующийся в океане и высвобождающийся из газовых гидратов, вносит сравнительно небольшой вклад в общий бюджет (Conrad, 2009). Дальнейшая судьба атмосферного метана может быть различна. Около 90% его подвергается фотохимическому окислению в тропосфере, инициированному реакциями с ОН-радикалами (Cicerone, Oremland, 1988).

Около 7% атмосферного метана диффундирует в стратосферу, где также достаточно быстро окисляется. Третьим важным стоком метана (5-7%) является его поглощение и последующее окисление до СО2 в автоморфных почвах. Однако, для большинства источников величины продукции СН4 обычно намного больше величин его эмиссии, что объясняется активным потреблением значительной части образованного метана метанотрофными бактериями, населяющими данные местообитания (Frenzel, 2000;

Reeburgh, 2003).

На сегодняшний день, способность к аэробному росту на метане выявлена у представителей двух филогенетических групп домена Bacteria: Proteobacteria и Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1996; Op den Camp et al., 2009). Метанотрофные представители Verrucomicrobia были описаны недавно и информация об их разнообразии и распространении в природе пока чрезвычайно ограничена. Они представляют собой уникальную группу организмов, способных развиваться в экстремальных условиях (рН 1.0, температура 50°С) и обладающих многими чертами метанотрофов Proteobacteria.

Тем не менее, метанотрофные представители Verrucomicrobia имеют ряд существенных отличий. Так, они обладают ключевым ферментом окисления метана, мембранной метанмонооксигеназой, однако внутрицитоплазматические мембраны в клетках этих бактерий отсутствуют. Кроме того, у метанотрофов Verrucomicrobia отсутствуют известные для аэробных метанотрофов пути ассимиляции формальдегида, а необходимый углерод для клетки они получают путем фиксации СО2 через цикл Кальвина-Бенсона (Dunfield et al., 2007). Несмотря на успешное выделение некоторых метанотрофов Verrucomicrobia в чистую культуру, сложность их культивирования затрудняет процесс депонирования в международных коллекциях, тем самым делая невозможным процесс валидации новых таксонов. Эти трудности, тем не менее, не мешают всесторонним исследованиям новых необычных метанотрофов, которые уже привели к значительным успехам в понимании физиологии, биохимии и генетики данной уникальной группы организмов (Hou et al., 2008; Khadem et al., 2010, 2011, 2012a,b,c).

Биология и экология метанотрофных представителей Proteobacteria активно изучается в течение последних 40 лет (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Murrell, 2008). По отношению к кислороду все таксономически охарактеризованные на настоящий момент метанотрофные бактерии являются облигатными аэробами. Тем не менее, существование микробного процесса окисления метана в анаэробных условиях известно уже довольно давно. Более 30 лет назад было впервые показано существование градиента концентрации метана в морских осадках (Reeburgh, 1976, 1980; Иванов и др., 1984; Пименов и др., 2000). По оценкам исследователей, большая часть вновь образованного метана (около 90%) поглощается в анаэробной зоне, и суммарный вклад океанов в мировую эмиссию данного газа составляет не более 3% (Conrad, 2009).

Установлено, что анаэробный процесс окисления метана осуществляется синтрофной ассоциацей метанокисляющих водородобразующих архей и водородокисляющих сульфатвосстанавливающих бактерий (Hoehler et al., 1994; Thauer, Shima, 2008). Сульфат в данном процессе используется в качестве акцептора электронов в реакции окисления метана путем процесса обратного метаногенеза. Организмы, способные выполнять этот процесс – это сульфатредуцирующие бактерии родов Desulfosarcina and Desulfococcus и археи группы ANME (Hinrichs et al., 1999; Boetus, 2000). Данная группа архей родственна Methanosarcinales и Methanomicrobiales и содержит в себе подгруппы ANME-1, ANME- и ANME-3 (Knittel, Boetus, 2009). Археи группы ANME, помимо присутствия в морях, также широко распространены в других природных экосистемах, таких как осадки пресноводных озер, полигоны ТБО, почвы, а также шахтные воды (Cadillo-Quiroz et al., 2008; Castro et al., 2004; Grossman et al., 2002; Maclean et al., 2007). Присутствие их в данных местообитаниях было подтверждено путем обнаружения ключевого фермента метаногенеза – метил-коэнзим-М-редуктазы (ген mcrA).

Еще один ныне известный вариант анаэробного окисления метана связан с процессом денитрификации. Голландским исследователям удалось получить накопительную культуру микроорганизмов, осуществляющих процесс окисления метана до СО2 с одновременным восстановлением нитрата (Raghoebarsing et al., 2006). Первоначально предполагалось, что такую реакцию осуществляет синтрофная ассоциация архей с нитратредукторами по аналогии с сульфатредуцирующими бактериями. Однако, анализ генома доминирующего в смешанной культуре микроорганизма показал, что процесс окисления метана у него идет по аэробному пути, с использованием молекулы кислорода, образованной данной бактерией в процессе денитрификации. Окисление метана происходит обычным для аэробных метанотрофов путем, с участием мембранной менамонооксигеназы (Wu et al., 2011, 2012). Организм, осуществляющий данный процесс, получен в виде высоко обогащенной накопительной культуры, условно назван Candidatus Methylomirabilis oxifera и относится к филе-кандидату NC10 (Ettwig et al., 2009; 2010).

В настоящее время рассматриваются также возможности протекания в морских экосистемах процессов анаэробного окисления метана, связанных с использованием марганца и железа в качестве акцепторов электронов (Beal et al., 2009). Однако, микробные агенты, осуществляющие данные реакции, до настоящего времени остаются неизвестны. Исследование биохимических и микробиологических особенностей процесса анаэробного окисления метана является приоритетной задачей для ряда ведущих лабораторий в области метанотрофии.

1.2. Общая характеристика аэробных метанотрофных бактерий.

Исторически, все аробные метанотрофные бактерии были разделены на две большие группы, на основании их различий в морфологии, ультраструктуре клеток и вариантах метаболических путей - метанотрофы I и II типов (Whittenbury et al., 1970). Для дифференциации метанотрофов I и II типов было предложено использовать ряд характеристик, включающих особенности организации внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ), вариабельность путей ассимиляции формальдегида, различия в составе основных жирных кислот клеток, а также способность к фиксации молекулярного азота.

На настоящий момент лишь часть из них остаются надежными дифференцирующими признаками.

ВЦМ метанотрофов I типа представляют собой стопки уплощенных везикул, заполняющие большую часть содержимого клетки и ориентированные перпендикулярно клеточной мембране. ВЦМ метанотрофов II типа, напротив, ориентированы параллельно внешней мембране и расположены по периметру клетки (Whittenbury et al., 1970).

Причины такой структурно-функциональной корреляции, возможно, связаны с различной эффективностью энергетических процессов, происходящих на мембранах I и II типов и/или разной энергоемкостью основных путей метаболизма (Троценко, Хмеленина, 2008).

Другой характеристикой, отличающей метанотрофов разных групп, являются различия в путях ассимиляции С1-соединений. Метанотрофы Gammaproteobacetria используют рибулозомонофосфатный путь (РМФ) фиксации формальдегида, в то время как метанотрофы Alphaproteobacteria – сериновый путь. Ряд метанотрофов - к ним относятся представители родов Methylococcus и Methylocaldum - были объединены в так называемую группу Х, благодаря наличию у них наряду с РМФ-путем ассимиляции углерода процесса фиксации углерода с использованием цикла Кальвина (Taylor, 1977;

Hanson, Hanson, 1996; Bodrossy et al., 1997; Троценко, Хмеленина, 2008).

Долгое время считалось, что для метанотрофов разных типов характерно преобладание в клеточных мембранах определенных жирных кислот. Для метанотрофов Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria – это жирные кислоты с 16-ю и 18-ю атомами углерода, соответственно (Андреев, Гальченко, 1978; Гальченко и др., 1986; Bowman et al., 1991; Guckert et al., 1991; Гальченко, 2001). Однако, на настоящий момент, этот признак уже не является универсальным, так как были описаны метанотрофы, составляющие исключение из этих правил. Например, в клетках Methylocella и Methylocapsa отсутствует кислота 18:18с, считавшаяся раннее ‘индикаторной’ для метанотрофов Alphaproteobacteria (Dedysh et al., 2002, 2004; Dunfield et al., 2003). В составе жирных кислот Methylohalobius crimensis, относящегося к Gammaproteobacteria, преобладают жирные кислоты с 18 атомами углерода и отсутствует жирная кислота 16:18с – ‘индикатор’ метанотрофов I типа (Heyer et al., 2005). В составе жирных кислот метанотрофа II типа Methylocystis heyeri есть как 18:18с, так и 16:18с (Dedysh et al., 2007).

Способность к фиксации молекулярного азота на настоящий момент также уже не является отличительным признаком метанотрофов II типа, так как было показано, что многие представители родов Methylomonas, Methylobacter и Methylococcus являются азотфиксаторами (Auman et al., 2001).

Таким образом, очевидно, что с течением времени происходило описание новых таксонов метанотрофных бактерий, а также развитие методов их исследования, вследствие чего некоторые из вышеперечисленных характеристик, на основании которых метанотрофы относили к I или II типу, утратили свое значение.

Метанотрофы I типа относятся к классу Gammaproteobacteria и на настоящий момент представлены 13 родами в пределах семейства Methylococcaceae: Methylobacter, Methylomicrobium, Methylomonas, Methylocaldum, Methylosphaera, Methylothermus, Methylosarcina, Methylohalobius, Methylosoma, Methylovulum, Methylomarinum, Methylogaea и Methylococcus. К ним также относятся не полученные пока в чистых культурах необычные нитчатые метанотрофы ‘Crenothrix polyspora’ (Stoecker et al., 2006) и ‘Clonothrix fusca’ (Vigliotta et al., 2007). Метанотрофы II типа принадлежат к классу Alphaproteobacteria и представлены пятью родами в пределах семейств Methylocystaceae (роды Methylocystis и Methylosinus) и Bejerinckiaceae (роды Methylocella, Methylocapsa и Methyloferula) (Табл.1). Интересно, что метанотрофы Bejerinckiaceae существенно отличаются от метанотрофов II типа организацией ВЦМ. Так, ВЦМ в клетках Methylocapsa располагаются всегда лишь на одной стороне клетки, в то время как у метанотрофов Methylocella и Methyloferula они вовсе отсутствуют.

Ключевым свойством всех метанотрофных организмов является способность к использованию метана, что реализуется благодаря наличию специализированной ферментной системы, рассмотрению которой посвящен следующий раздел.

1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов.

Метанотрофы окисляют метан через образование формальдегида и формиата в качестве интермедиатов до углекислого газа и воды (Рис. 3). Поэтапное окисление метана и метанола до СО2 происходит с образованием энергии в форме, доступной для использования в метаболических реакциях – НАДН2 и восстановленных цитохромов, при последующем окислении которых в дыхательной цепи образуется АТФ.

Рис. 3. Пути окисления метана и ассимиляции формальдегида аэробными метанотрофными бактериями (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008).

Окисление метана. Первичную атаку молекулы СН4 катализирует уникальный мультикомпонентный комплекс – метанмонооксигеназа (ММО), существующий в двух формах – растворимой (рММО), локализованной в цитоплазме, и мембранной (мММО), связанной с мембранами. Последняя имеется у всех изученных метанотрофов, за исключением представителей родов Methylocella и Methyloferula (Dedysh et al., 2000;

Vorobev et al., 2011). Лишь немногие метанотрофы имеют оба фермента, причем Таблица 1. Современная таксономия аэробных метанотрофов.

Methylobacter albus Methylomonas fodinarum Methylococcus thermophilus Methylocapsa acidiphila Methylobacter marinus Methylomonas methanica Methylogaea oryzae Methylocella Methylomicrobium Methylomonas Психрофиллы, термофилы, галофилы, ацидофилы, термоацидофилы.

присутствие рММО является штаммовым признаком этих бактерий. Причины ограниченного распространения рММО у метанотрофов, возможно, связаны со специфической функцией фермента. рММО не является конститутивным ферментом, при этом единственным фактором, определяющим его активность в клетках, является отношение содержания иона меди к биомассе (Murrell et al., 2000). При высоком соотношении меди к биомассе ( 2.5 µмоль/г клеток) синтезируется мембранная форма фермента – мММО, при низком – рММО (Троценко, Хмеленина, 2008).

пиридиннуклеотидзависимое окисление метана молекулярным кислородом до метанола:

рММО детально изучена у Mc. capsulatus Bath и Methylosinus trichosporium OB3b (Stafford et al., 2003; Сsaki et al., 2003). Фермент состоит из трех компонентов:

гидроксилазы (MmoA), редуктазы (MmoC) и регуляторного белка (MmoB) (Green, Dalton, 1985).

Гидроксилазный комплекс (MmoA) представляет собой негемовый гексамерный металлопротеин (250 кДа), состоящий из трех субъединиц –,, и (65, 45 и 20 кДа, соответственно). Содержащий два атома железа негемовый центр -субъединицы катализирует образование метанола из метана и кислорода (Fox et al., 1989; Green, Dalton, 1985).

Редуктаза (MmoC) представляет собой Fe-S флавопротеин (39 кДа), при восстановлении которого происходит внутримолекулярный перенос двух электронов от НАДН2 к Fe2S2 центру, имеющему одноэлектронную емкость. Затем электроны передаются от Fe2S2 центра редуктазы к гидроксилазе, имеющей сайт окисления метана и восстановления кислорода (Троценко, Хмеленина, 2008).

Регуляторный белок (MmoB) представляет собой небольшой полипептид (16 кДа). Он абсолютно необходим для гидроксилазной активности у Mc. capsulatus Bath (Green, Dalton, 1985)и у Ms. trichosporium OB3b (Fox et al., 1989), несмотря на отсутствие в своем составе атомов металла и простетической группы.

Все компоненты рММО образуют стабильный ферментный комплекс, для которого предложен следующий механизм реакции (Fox et al., 1989). Метан связывается с активным центром окисленного фермента, возможно, растворяясь в гидрофобном кармане, поскольку не выявлено его непосредственное связывание с атомом железа.

Затем один из атомов железа восстанавливается с образованием смешанной валентности (Fe2+/Fe3+) фермента. Второе одноэлектронное восстановление активного центра приводит к полному восстановлению (Fe2+/Fe3+) фермента (Троценко, Хмеленина, 2008).

Связывание молекулы кислорода с биядерным железным центром приводит к образованию активного пероксида (Fox et al., 1989; Woodland, Cammack, 1985) и его последующему разложению. рММО катализирует включение кислорода не только в метан, но также в широкий спектр субстратов, включая алканы, алкены, ароматические углеводороды, галогенированные алканы и галогенированные ароматические углеводороды. Как следствие этого, метанотрофы, имеющие рММО, выполняют важную экологическую функцию и перспективны для использования в биотехнологии (Троценко, Хмеленина, 2008).

Мембранная метанмонооксигеназа (мММО). В отличие от рММО, мММО крайне нестабильна, что существенно сдерживает ее изучение. Лишь относительно недавно была выделена и охарактеризована мММО из Mc. capsulatus Bath (Nguyen et al., 1994, 1998;

Kitmitto et al., 2005). В отличие от рММО, она способна окислять субстраты более ограниченного спектра (алканы и алкены с длиной цепи до С5). Однако ее присутствие повышает эффективность конверсии метана в биомассу на 34%, по сравнению с клетками, содержащими только рММО. Как правило, фермент локализован во внутрицитоплазматической мембране (ВЦМ) и составляет до 60-80% общего содержания мембранных белков (Nguyen et al., 1998).

Фермент мММО представляет собой тример ()3 и состоит из 3 субъединиц с молекулярной массой 45, 27 и 23 кДа. Активная форма мММО содержит 2 атома железа и около 15 атомов меди на молекулу фермента, что, однако, лишь частично подтверждено и требует дальнейших уточнений (Zahn, Dispirito, 1996; Choi et al., 2003; Lieberman, Rosenzweig, 2004). С мММО ассоциированы медь-связывающие соединения (метанобактины), которые синтезируются при исчерпании меди в среде и, очевидно, ответственны за ее транспорт, являясь своеобразным «медным челноком» (DiSpirito et al., 1998; Kim et al., 2004; Graham, Kim, 2011).

В хромосоме Mc. capsulatus Bath имеется 2 копии гена мММО (pmoCAB) и дополнительная копия pmoC (Stolyar et al., 1999). У нитрифицирующих бактерий установлено подобная дупликация гена amoCAB, кодирующего аммоний монооксигеназу (АМО). Сравнение последовательностей pmo и amo генов свидетельствует в пользу их эволюционной связи (Троценко, Хмеленина, 2008).

Недавно у Methylocystis sp. SC2 были обнаружены две изоформы мММО, имеющие разные кинетики окисления метана – ранее известную форму PmoA, или PmoA1 и новую форму PmoA2 (Dunfield et al., 2002; Baani, Liesack, 2008). При концентрации метана выше 600 ppm происходила экспрессия гена pmoCAB1, кодирующего мММО1.

Напротив, при следовых количествах метана (до 100 ppm) конститутивно экпрессировался кластер генов pmoCAB2, кодирующий мММО2. Примечательно, что гены pmoCAB2 в большинстве своем присутствуют у метанотрофов II типа, в то время как у метанотрофов I типа они пока не обнаружены (Yimga et al., 2003). Возможность использовать метан в широком диапазоне его концентрации, очевидно, объясняет доминирование метанотрофов II типа в автоморфных почвах и их выживание за счет потребления атмосферного метана.

Несмотря на общий механизм реакции окисления метана, рММО и мММО существенно различаются между собой. Для работы мММО необходимо большое количество меди (15 атомов на 1 молекулу фермента). Данный фермент имеет высокое сродство к СН4 (Km=1-2 µM) и О2 (Km=0.1 µM), но обладает узкой субстратной специфичностью, окисляя лишь короткие алканы и алкены. С другой стороны, рММО имеет пониженное сродство к метану (Km=3 µM) и О2 (Km=16.8 µM). Поскольку для функционирования рММО необходим НАД(Ф)Н2, этот фермент энергетически менее эффективен (Троценко, Хмеленина, 2008).

Окисление метанола. Метанол образуется при окислении метана, а также доступен из экзогенных источников, например, будучи продуктом деградации пектина и лигнина.

Метанотрофы окисляют метанол посредством периплазматической метанолдегидрогеназы (МДГ). Детальное строение и активность данного фермента была изучена на примере грамотрицательных метилотрофных бактерий (Anthony, Williams, 2003). МДГ представляет собой тетрамер 22, включающий две большие (67 кДа) и две малые (8.5 кДа) субъединицы (Anthony, 1992; Anthony et al., 1994). Две -субъединицы, сцепленные характерным мотивом, образуют радиально-симметричную структуру в виде «пропеллера». -субъединица не составляет структурно выраженного домена в молекуле фермента и функция ее пока не выяснена (Anthony, Ghosh, 1998).

Ген, кодирующий большую субъединицу МДГ, mxaF, крайне консервативен у метано- и метилотрофов, что позволяет использовать его в исследованиях молекулярной экологии (Anthony, Williams, 2003).

Окисление формальдегида. Формальдегид является ключевым интермедиатом в процессе окисления метана до СО2. Большая часть восстановительных компонентов, необходимых для оксигенирования метана, образуется при окислении ФА через формиат до СО2. Метанотрофы имеют несколько ферментов, окисляющих ФА. В соответствии с природой акцептора электронов, ФА-окисляющие ферменты разделены на 2 группы:

НАД(Ф)+-специфичные и связанные с цитохромами. В свою очередь, НАД(Ф)+специфичные ФАДГ подразделяются на основе зависимости от вторичных кофакторов, тетрагидрометаноптерин (ТГМП) (Троценко, Хмеленина, 2008).

Окисление формиата до СО2 является конечной стадией в полиферментной цепи окисления метана. За данный процесс отвечает присутствующая у всех изученных метанотрофов НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ), которая у Ms. trichosporium OB3b состоит из двух субъединиц (53 и 102 кДа, соответственно), локализованных в цитоплазме. ФДГ содержит негемовое железо и сульфидные группы и наиболее активна в диапазоне pH (6.5-7.5), обладая низкими значениями Km к формиату и НАД+ (Yoch et al., 1990). В геноме Mc. capsulatus Bath были обнаружены три последовательности генов, гомологичных ФДГ, роль которых еще предстоит выяснить (Ешинимаев, 2006).

1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов.

Метанотрофы используют окисленные и замещенные производные метана, строя клеточные компоненты из С1-субстратов. Благодаря исследованием Квейла известно, что метанотрофы реализуют два основных пути первичной С1-ассимиляции – рибулозомонофосфатный и сериновый. В этих циклах фосфотриозы синтезируются из формальдегида – ключевого интермедиата центрального метаболизма (Троценко, Хмеленина, 2008). Ассимиляция углерода возможна также на уровне СО2 (посредством анаплеротического карбоксилирования (фосфоенол)пирувата или РБФ путем (Quayle, 1980; Anthony, 1982)).

Рибулозомонофосфатный цикл.

Ассимиляция формальдегида через РМФ путь осуществляется у метанотрофов I типа.

В данном цикле синтезируется одна молекула триозы из трех молекул формальдегида (Anthony, 1982). В первой части РМФ-пути фомальдегид конденсируется с рибулозо-5фосфатом с образованием 3-гексулозо-6-фосфата в реакции, катализируемой гексулофосфатсинтазой (ГФС). Далее 3-гексуло-6-фосфат изомеризуется во фруктозо-6фосфат фосфогексулоизомеразой (ФГИ). С участием этих ферментов происходит образование С-С связи и центральных метаболитов у метанотрофов класса Gammaproteobacteria (Троценко, Хмеленина, 2006).

Во второй части РМФ-цикла фосфогексозы распадаются до (фосфо)триоз. В дальнейшем из (фосфо)триоз образуется рибулозо-5-фосфат, т.е цикл завершается регенерацией акцептора ФА (Троценко, Хмеленина, 2006). ГФС – индикаторный фермент РМФ пути (Рис. 4).

Рис. 4. Схематическое изображение пути ассимиляции формальдегида метанотрофами I типа. ГФС – гексулофосфатсинтаза - индикаторный фермент РМФ пути (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008).

РМФ путь, первоначально обнаруженный у аэробных метилотрофов, достаточно широко распространен и у неметилотрофных бактерий, где он выполняет функцию детоксикации формальдегида (Ешинимаев, 2006).

Сериновый путь.

Метанотрофы II типа ассимилируют ФА через сериновый путь, в котором первичным акцептором ФА является тетрагидрофолат (ТГФ). В первой части две молекулы ФА, конденсируясь ТГФ, реагируют с двумя молекулами глицина, с образование серина и оксипирувата. Последующие превращения включают образование и изомеризацию фосфоглицерата, карбоксилирование фосфоенолпирувата в оксалоацетат и образование малата с дальнейшей активацией до малил-КоА. Последний в дальнейшем распадается на глиоксилат и ацетил-КоА, который является первичным продуктом серинового пути. Во второй части серинового пути ацетил-КоА окисляется в глиоксилат, из которого впоследствии регенерируется глицин – первичный акцептор ФА. Серинглиоксилатаминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР) и малил-КоА-лиаза являются индикаторными ферментами серинового пути (Рис. 5).

Рис. 5. Схематическое изображение пути ассимиляции формальдегида серинглиоксилатаминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР), малил-КоАлиаза (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008).

Ассимиляция СО2. У метанотрофов I типа от 5 до 15% углерода биомассы происходит из углекислоты, тогда как у метанотрофов II типа – до 50%. За анаплеротическую фиксацию СО2 у этих бактерий ответственна ФЕП-карбоксилаза (Шишкина, Троценко, 1986). Интересно, что у представителей рода Methylococcus в ассимиляции СО2 также участвует рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа (РБФК/О) (Taylor et al., 1981). Гены РБФК/О (cbbl) выявлены у Methylococcus и Methylocaldum и также доказана способность у Mc. capsulatus Bath расти автотрофно (Baxter et al., 2002). Эти факты подтверждают ранее постулированную эволюционную связь путей первичного С1 метаболизма у метанотрофов и автотрофов (Quayle, Ferenci, 1978; Whittenbury, 1980; Троценко, Хмеленина, 2008).

1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов.

Метанотрофы относятся к наиболее широко распространенным микроорганизмам.

Они населяют самые разнообразные экосистемы: болота, разнообразные почвы, озера, моря, осадки, сточные воды, рисовые чеки, полигоны ТБО. Кроме прямого окисления вновь образованного в анаэробных зонах этих местообитаний метана, некоторые метанотрофы способны использовать атмосферный СН4, что делает их высоко приспособленными к обитанию в разнообразных эконишах (Semrau et al., 2010).

Термофильные и термотолерантные метанотрофы. Как упоминалось выше, большинство метанотрофов являются умеренными организмами и предпочитают обитать в условиях около-нейтрального значения рН при 25-30 °С. Тем не менее, известен ряд метанотрофных бактерий, оптимально растущих при повышенных температурах. Все известные на настоящий момент метанотрофы-термофилы относятся к классу Gammaproteobacteria. Первый описанный из них - Methylococcus capsulatus предпочитает расти при температуре 45°С и является одним из наиболее изученных метанотрофных организмов. Чуть позже был описан еще один род термофильных метанотрофов – род Methylocaldum. Виды Methylocaldum tepidium и Methylocaldum gracile характеризуются, скорее как термотолерантные бактерии, с оптимумом роста при температуре 42 °С. В отличие от них, Methylocaldum szegendiense является истинным термофилом, поскольку температура 55 °С является для него оптимальной (диапазон 37 С). Другими представителями метанотрофов-термофилов среди Proteobacteria являются метанотрофы рода Methylothermus. На настоящий момент описано два представителя данного рода - Methylothermus thermalis и Methylothermus subterraneus.

Первый из них был выделен из термальных источников Японии, и был способен расти в диапазоне температур 37 – 67°С (Tsubota et al., 2005). Другой вид рода Methylothermus, M.

subterraneus, был выделен относительно недавно, в 2011 году, из горячих шахтных вод Японии. В отличие от M. thermalis, он предпочитает расти в более кислых и менее соленых условиях. Рост культуры наблюдался в диапазоне температур 37 - 65°С (Hirayama et al., 2011). Необходимо отметить, что верхняя планка температуры в 65°С показана лишь для описанных видов термофильных метанотрофов, однако, ныне утерянный штамм Methylothermus sp. HB, выделенный из термальных источников Венгрии, был способен к росту и при температуре 72 °С (Bodrossy et al., 1997). Таким образом, возможность существования экстремально-термофильных метанотрофов не исключена. Необходимо отметить, что метанотрофы-термофилы имеют ряд отличий от остальных метанотрофов класса Gammaproteobacteria. Так, для представителей родов Methylococcus и Methylocaldum показано наличие генов, кодирующих некоторые ферменты серинового пути ассимиляции формальдегида, что характерно для метанотрофов II типа. А у метанотрофов рода Methylothermus в клетке присутствуют в равной доле жирные кислоты с 16-ю и 18-ю атомами углерода, индикаторные для метанотрофов I и II типов, соответственно (Троценко, Хмеленина, 2008; Hirayama et al., 2011).

Как уже было сказано выше, к термофильным метанотрофам относятся также метанотрофные представители Verrucomicrobia, выделенные недавно из различных геотермальных местообитаний – грязевых вулканов Южной Италии, геотермальных полей Новой Зеландии, а также кислых горячих источников Камчатки (Op den Camp et al., 2009). Независимо друг от друга разными исследователями были получены в чистую культуру три представителя таких метанотрофов: ‘Acidomethylosilex fumarolicum’ штамм SoiV (Pol et al., 2007), ‘Methyloacida kamchatkenesis’ штамм Kam1 (Islam et al., 2008) и ‘Methylokorus infernorum’ штамм V4 (Dunfield et al., 2007), ни один из которых на настоящий момент не описан таксономически. Дальнейшие исследования физиологии, биохимии и генетического потенциала новых метанотрофов показали что они очень близки между собой, вследствие чего были отнесены к роду ‘Methylacidiphilum’. О метаболических особенностях метанотрофных веррукомикробий пока известно мало.

Показано, что у них отсутствуют гены ключевых ферментов РМФ пути ассимиляции формальдегида – гексулофосфатсинтазы и гексулофосфатизомеразы (Hou et al., 2008). В то же время, некоторые ферменты серинового пути (глицераткиназа и малил-КА-лиаза) также не обнаружены у новых метанотрофов, что ставит под сомнение возможность использования данных путей в процессах ассимиляции углерода. У метанотрофов Verrucomicrobia присутствуют гены глиоксилатного шунта – изоцитратлиаза и малатсинтаза, а добавление CO2 стимулирует рост, что может быть следствием использования в процессах ассимиляции углерода ферментов цикла Кальвина-Бенсона (Hou et al., 2008; Op den Camp et al., 2009).

Психрофильные и психротерантные метанотрофные организмы.

Природные экосистемы, где господствуют низкие температуры, являются одними из наиболее распространенных на Земле. К крупнейшим из них относятся обширные тундровые и северные болотные экосистемы, а также большая часть мирового океана, где средняя температура воды держится на уровне +5 – 7°С. Несмотря на низкие температуры, данные экосистемы, за счет обширных анаэробных зон, являются мощными источниками метана. Следовательно, метанотрофы являются одними из ключевых организмов в микробном сообществе этих местообитаний.

Истинно психрофильных метанотрофов пока описано мало. Все они принадлежат к классу Gammaproteobacteria и предпочитают расти при температурах ниже 15°С. К метанотрофам-психрофилам относятся Methylobacter psychrophilus (Омельченко и др., 1996), выделенный из почв тундровой зоны России, а также Methyloshaera hansoni и Methylomonas scandinavica, изолированные из антарктического озера и холодных глубоководных вод вблизи побережья Балтийского моря (Bowman et al., 1997;

Kalyuzhnaya et al., 1999). Эти метанотрофы несколько отличаются в температурных предпочтениях, однако температура 10°С для большинства из них является оптимальной.

Метанотрофы соленых и щелочных экосистем.

Экосистемы с повышенным содержанием солей достаточно широко распространены в природе. К ним относятся моря, эстуарии, некоторые арктические почвы, соленые водоемы, а также содовые озера. За исключением содовых озер, в большинстве своем, они характеризуются нейтральными значениями рН среды.

По отношению к солености среды метанотрофные организмы разделяются на галотолерантов и галофилов. Последние облигатно зависят от присутствия NaCl в среде.

Среди галлофилов следует отдельно выделить экстремальных галлофилов, способных расти при очень высокой концентрации NaCl в среде. Например, Methylohalobius crimeensis, выделенный из гиперсоленого озера полуострова Крым, предпочитает развиваться при 5.8 – 8.7 % NaCl в среде. Максимальная же концентрация соли, при которой наблюдался рост, составляет около 15%, что является верхним пределом для известных на настоящий момент метанотрофных бактерий (Heyer et al., 2005).

В большинстве своем, галофильные и галотолерантные метанотрофные организмы, принадлежат к классу Gammaproteobacteria. К ним относятся представители родов Methylobacter и Methylomicrobium, выделеные из различных соленых местообитаний (Bowman et al., 1993; Khmelenina et al., 1997, 1999; Kaluzhnaya et al., 2001, 2008;

Wartiainen et al., 2006). К галофильным метанотрофам относится также описанная ранее психрофильная метанотрофная бактерия Methylosphaera hansoni, требующая для роста присутствия в среде культивирования морской воды, что соответствует около 3.5 % NaCl (Bowman et al., 1997). Недавно из морской гидротермы был выделен еще один представитель галофильных метанотрофов – Methylomarinum vadi, растущий оптимально при 3% NaCl (Hirayama et al., 2013). Большинство морских метанотрофов являются нейтрофилами.

Из содовых озер был выделен также ряд галофильных метанотрофов, растущих при высоких значениях рН. Содовые озера представляют собой уникальные экстремальные природные экосистемы. В щелочных средах большинство катионов металлов переходят в осадок, тем самым обеспечивая доступность фосфата, который в содовых озерах перестает быть лимитирующим фактором. Для эукариотных организмов, в том числе высших, щелочные и соленые условия содовых озер являются малопригодными для существования. Микробное разнообразие в данных экосистемах представлено многочисленными алкалофильными прокариотами, относящимся практически ко всем известным физиологическим группам микроорганизмов. Благодаря способности большинства из них фиксировать атмосферный азот, для активного развития микроорганизмов в содовых озерах практически отсутствуют лимитирующие факторы (Заварзин, 2006; Троценко, Хмеленина, 2008). Из содовых озер были выделены представители рода Methylomicrobium – M. alcaliphilum, M. buryatense и M. kenyense (Kaluzhnaya et al., 2008). M. kenyense, выделенный из содовых озер Кении, был способен расти при рН 10, являясь тем самым истинным алкалофильным метанотрофом (Sorokin et al., 2000).

Присутствие метанотрофов класса Alphaproteobacteria в щелочных озерах было неоднократно подтверждено с помощью методов молекулярной экологии (Lin et al., 2004, 2005). Однако, попытки выделить алкалофильных метанотрофов II типа в чистую культуру остаются малоэффективными, и, на данный момент, удалось поучить лишь один изолят таких бактерий, принадлежащих к роду Methylocystis и способных расти при высоких значениях рН (6.0 – 9.7) (Ешинимаев и др., 2008).

Сведения об ацидофильных метанотрофах детально изложены в главе 3.

Как следует из вышеприведенных данных, метанотрофные бактерии чрезвычайно разнообразны по своим экофизиологическим характеристикам. Они населяют аэробные и анаэробные зоны различных экосистем с контрастными характеристиками: от холодных соленых озер до термальных кислых источников. Высоко специализированные метаболитические пути позволяют метанотрофам успешно использовать С1-соединения.

Отсутствие конкурентов в борьбе за использование метана в качестве единственного источника углерода и энергии приводит к широкому распространению данных организмов практически во всех экосистемах, где доступен метан. Метанотрофы способны развиваться в самых бедных условиях, не требуя факторов роста и витаминов, а также деградировать широкий спектр органических хлорзамещенных соединений, что делает их перспективными агентами технологий биоремедиации. Тем не менее, многие аспекты метаболизма метанотрофов на настоящий момент остаются изучены слабо. В силу сложностей культивирования метанотрофов и отсутствия универсальных сред и приемов, использование культуральных подходов для исследования метанотрофных сообществ тех или иных экосистем во многих случаях является малоэффективным.

Хорошей альтернативой культуральным подходам в исследованиях метанотрофных бактерий являются современные методы молекулярной экологии, краткая характеристика которых дана в главе 2.

Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий.

Исследования разнообразия и распространения метанотрофных организмов в различных экосистемах, их участия в глобальных биогеохимических циклах находятся в фокусе внимания международного научного сообщества. Метанотрофы населяют широкий спектр различных местообитаний, таких как почвы, болота, пресноводные и морские осадки, горячие источники, ткани животных, моллюсков, растений, захоронения бытовых отходов и др. (Conrad, 2009). Среди подходов, используемых для изучения экологической роли данной группы микроорганизмов, значительным потенциалом обладают молекулярные методы. Методические сложности культивирования и получения изолятов, трудоемкость изучения особенностей метаболизма метанотрофных бактерий относят их к категории сложных в работе организмов. Попытки выделения новых метанотрофов из какого-либо местообитания могут потребовать годы работы исследователя. Ростовые потребности и кинетические характеристики метанотрофов разных групп настолько различны, что приходится констатировать невозможность введения некой универсальной среды и условий культивирования этих бактерий (Дедыш, 2006).

В качестве метода, альтернативного трудоемкому процессу культивирования до недавних пор широко применялся анализ экстрагируемых из нативных образцов жирных кислот. Как отмечалось выше (см. главу 1), клетки метанотрофов содержат необычные жирные кислоты, которые почти не встречаются у других бактерий - кислоты 16:18с и 18:18с. Их было предложено использовать в качестве ‘индикаторных’ жирных кислот метанотрофов I и II типов, соответственно (Андреев, Гальченко, 1978; Гальченко и др., 1986; Bowman et al., 1991; Guckert et al., 1991). Однако впоследствии был описан ряд метанотрофных организмов, составляющих исключение и нарушающих универсальность такого подхода. Таким образом, как культуральные приемы, так и метод анализа жирных кислот имеют очень значительные ограничения для анализа состава и численности популяций метанотрофных бактерий in situ (Дедыш, 2006).

молекулярные методы, позволяющие идентифицировать и всесторонне исследовать метанотрофные организмы, ранее не описанные и не культивируемые в лабораторных условиях, а также оценить их разнообразие и роль в различных экосистемах (Murrell et al., 1998, 2000; Wise et al., 1999; Graef et al., 2011; Gupta et al., 2012).

2.1. Амплификация и анализ филогенетических генов.

Наиболее оптимальным целевым маркером для создания специфичных праймеров и олигонуклеотидных зондов является ген 16S рРНК, так как рибосома является эволюционным изменениям (Троценко, Хмеленина, 2008). Применение генов 16S рРНК как маркеров в исследованиях экологии метанотрофных бактерий основано на принадлежности последних к нескольким филогенетически тесным группам. Как упомянуто выше (см. главу 1), все ныне известные аэробные метанотрофные организмы относятся лишь к двум филогенетическим ветвям домена Bacteria - Proteobacteria и Verrucomicrobia (Дедыш, 2006). К двум классам в пределах Proteobacteria – охарактеризованные и хорошо изученные метанотрофы (Hanson, Hanson, 1996;

последовательностей генов 16S рРНК, связанное с выделением и описанием новых родов и видов метанотрофных бактерий, привело к поискам целевых последовательностей, специфичных для метанотрофов I и II типов (Costello, Lidstrom, 1999; Brusseau et al., 1994;

McDonald et al., 1996; Aumann et al., 2000). Однако при дальнейшем расширении спектра известных метанотрофов оказалось, что ранее разработанные праймеры теряют свою группо-специфичность, поскольку ни одна из групп не является монофилетичной.

Methylosinus/Methylocyctis и Methylocella/Methylocapsa, а в пределах метанотрофов I типа - группы Methylococcus и Methylobacter/Methylosarcina (Дедыш, 2004; Kolb et al., 2003).

олигонуклеотидных зондов для гибридизации все больше внимания уделяется поиску целевых последовательностей, имеющих родовую специфичность. Для адекватной местообитаниях групповые зонды уже не обладают требуемым уровнем специфичности.

Основные целевые последовательности, используемые в исследованиях экологии метанотрофных организмов, приведены в Таблице 2. Одними из первых были созданы праймерные системы 1035-RuMp, 1041-5 и 1034-Ser, позволяющие селективно амплифицировать фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофов I и II типов (Brusseau et al., 1994). Однако последующее расширение базы данных за счет описания новых метанотрофов показало, что данные праймерные системы, к сожалению, не являются универсальными и выявляют лишь небольшую часть известных метанотрофов. В дальнейшем усилия исследователей были направлены на создание родо- и видоспецифичных праймерных систем. Так появилась целая группа праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК родов Methylobacter (Holmes et al., 1995; Gulledge et al., 2001), Methylococcus и Methylomonas (Gulledge et al., 2001), Methylosphaera (Калюжная и др., 2004), Methylocaldum (Gulledge et al., 2001), Methylosinus (Holmes et al., 1995). С расширением базы данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофных организмов были разработаны более совершенные праймерные системы, позволяющие эффективно идентифицировать метанотрофов I и II типов в экосистемах (Chen et al., 2007).

2.2. Амплификация и анализ функцинальных генов.

Анализ гена 16S рРНК является достаточно быстрым и точным способом установить филогенетическое положение искомых организмов. Однако он не дает возможности сделать точное заключение о принадлежности исследуемых бактерий к метанотрофам в случае, если они занимают достаточно отдаленное филогенетическое положение от известных метанотрофных организмов. Дополнительную информацию, в таком случае, дает анализ функциональных генов. Функциональные гены метанотрофных бактерий кодируют ключевые ферменты метаболизма этих микроорганизмов – мембранную и растворимую формы метанмонооксигеназы (гены pmoA и mmoX, соответственно), а также метанолдегидрогеназу (ген mxaF). Основные праймерные системы, используемые для амплификации фрагментов этих генов, приведены в таблице 2.

Наиболее универсальным молекулярным маркером метанотрофов является ген pmoA, который кодирует белок, несущий активный центр мембранной ММО. Филогенетические деревья, построенные на основе последовательностей данного гена, в большинстве своем, когерентны филогенетическим деревьям, постоенным на основе гена 16S рРНК (Kolb et al., 2003; Holmes et al., 1995; McDonald, Murrell, 1997b; Heyer et al., 2002). Изначально считалось, что мембранная ММО присутствует в клетках всех метанотрофов. Недавно, однако, были описаны ацидофильные метанотрофы родов Methylocella и Methyloferula, которые обладают лишь растворимой формой ММО. Ген pmoA у данных метанотрофов отсутствует. Тем самым, существование подобных метанотрофных организмов несколько ограничивает использование гена pmoA в качестве универсального маркера.

На настоящий момент существует несколько праймерных систем, используемых для амплификации гена pmoA у метанотрофов. Самая универсальная пара праймеров, A189f/A682r, была разработана довольно давно, в середине 90-x годов прошлого века (Holmes et al., 1995). Она обладает широким спектром детекции, однако амплифицирует не только ген pmoA, но и ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (АМО На настоящий момент существует несколько праймерных систем, используемых для амплификации гена pmoA у метанотрофов. Самая универсальная пара праймеров, A189f/A682r, была разработана довольно давно, в середине 90-x годов прошлого века (Holmes et al., 1995). Она обладает широким спектром детекции, однако амплифицирует не только ген pmoA, но и ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (АМО) – фермент, эволюционно родственный ММО. Тем не менее, данная праймерная система широко используется при изучении состава метанотрофных сообществ различных местообитаний (Bourne et al., 2001; Heyer et al., 2002; Holmes et al., 1999; Horz et al., 2002;

Kalyuzhnaya et al., 2002; Radajewski et al., 2002) и способна выявлять новые группы метанотрофов (Holmes et al., 1999; Knief et al., 2003; Pacheco-Oliver et al., 2002).

Большинство праймеров более позднего поколения не амплифицируют ген amoA, однако они либо менее универсальны (Kolb et al., 2003), либо позволяют амплифицировать слишком короткий фрагмент гена pmoA (Cheng et al., 1999; Дедыш, 2006). Так, сравнение наиболее используемых на настоящий момент праймерных пар A189f/A682r, A189f/mb661r и A189f/A650r на примере исследования метанотрофного сообщества почв показало существенное различие полученных результатов (Bourne et al., 2001).

Праймерная система A189f/mb661r наиболее широко охватывала метанотрофное разнообразие в исследуемой экосистеме, в то время как две другие пары праймеров былименее специфичны, однако позволяли улавливать потенциально новые группы метанотрофных организмов. В настоящее время широко используется комбинирование данных праймерных пар (Hutchens et al., 2004; Knief et al., 2005; Lin et al., 2005; Morriset al., 2002). Например, при использовании метода «вложенной» ПЦР праймеры A189f/A682r используются в ПЦР на первом этапе, в то время как последующая, более селективная ре-амплификация полученных ПЦР-продуктов осуществляется с помощью праймерных пар A189f/mb661r или A189f/A650r (Horz et al., 2005). Такой подход позволяет максимально полно охватить разнообразие метанотрофов в природных экосистемах.

Таблица 2. Праймеры, используемые для специфической амплификации фрагментов филогенетических и функциональных генов метанотрофных бактерий.

CATCTCTGRCSAYCATACCGG

Type IF ATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG

Type IR CCACTGGTGTTCCTTCMGAT

CCTGAAATTCCACTCTCCTCTA

CCCTCCTTGCGGTTAGACTACCTA

ACAGATTCTCTGGATGTC

GGGGGAACTTCTGGGGITGGAC

GGGGGRCIACGTCITTACCGAA

mmoX882f/mmoX1403r GGCTCCAAGTTCAAGGTCGAGC Метанотрофы, обладающие McDonald et al.,

GGCTCGACCTTGAACTTGGAGCCATACTCG

ACCCANGGCTCGACYTTGAA

TGGCACTCRTARCGCTC

CACTCGTAGCGCTCCGGCTC

TGGGAGGGCGAYGCCTGGAA

CCCGGCCARCCGCCGAC

Другим важным функциональным геном метанотрофных бактерий является ген mmoX, кодирующий -субчастицу гидроксилазного компонента растворимой ММО.

Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей данного гена, также формируют два различных кластера, соответствующие метанотрофам I и II типов, что позволяет использовать их для идентификации этих бактерий. На настоящий момент существуют разнообразные праймерные системы, позволяющие амплифицировать гены mmoX метанотрофов как в экологических исследованиях, так и при изучении чистых культур (Auman, Lidstrom, 2002; Baker et al., 2001; Fuse et al., 1998; Horz et al., 2001; McDonald et al., 2006; Shigematsu et al., 1999).

Однако, использование генов mmoX для детекции метанотрофных организмов в природных образцах существенно ограничено как недостаточной универсальностью данных праймеров, так и относительно редкой встречаемостью рММО у метанотрофов.

Ген mxaF кодирует главную субчастицу метанолдегидрогеназы, второго фермента в цепочке окисления метана. Использование его в качестве маркера в исследованиях экологии метанотрофов ограничено, так как он присутствует не только у метанотрофов, но и у грамотрицательных метилотрофных организмов. Гены mxaF метанотрофов и метилотрофов часто образуют общие кластеры, что затрудняет идентификацию организмов. Тем не менее, многие исследователи успешно используют данные гены в исследованиях метанотрофных сообществ различных экосистем (McDonald, Murrell, 1997a; Neufeld et al., 2007).

2.3. Количественная ПЦР.

Количественная оценка метанотрофных организмов в природных экосистемах является достаточно сложной задачей. Одним из традиционных способов определения численности различных групп микроорганизмов является метод определения наиболее вероятного числа - most probable number (MPN). Однако, в случае с метанотрофными организмами он малоэффективен. Так как на настоящий момент не существует универсальной для всех метанотрофов среды культивирования, то результаты количественного учета данной группы микроорганизмов методом MPN напрямую зависят от условий культивирования (Bussmann et al., 2007; Воробьев, Дедыш, 2008).

Альтернативный способ оценки численности метанотрофов в природных экосистемах предполагает использование метода количественной ПЦР - кПЦР (Knief et al., 2006; Kolb et al., 2003, 2005; Halet et al., 2006). Особенностью данного метода является возможность наблюдения процесса амплификации в режиме реального времени, что позволяет оценить численность целевых организмов в образцах. Количественная ПЦР, однако, дает информацию лишь о количестве копий целевого гена в полученных экстрактах, а не о количестве клеток исследуемых организмов. Было показано, что в геномах Methylococcus capsulatus Bath, Methylosinus trichosporium OB3b и Methylocystis sp. M содержится по две копии гена pmoА (Semrau et al., 1995; Stoylar et al., 1999; Murrell et al., 2000). Также, при исследовании метанотрофов, обитающих в озерных осадках было показано, что количество копий генов pmoA варьировало от одного до трех (Aumann et al., 2000). Таким образом, применение метода кПЦР для количественной оценки метанотрофов в природных или лабораторных образцах способно вносить существенную ошибку в оценку численности, поскольку не существует каких-либо фиксированных коэффициентов пересчета.

Известно также, что клетки метанотрофов I и II типов лизируются с различной эффективностью (Meyer et al., 1986; Лысенко и др., 1998; Bowman et al., 1993), что в результате приводит к неадекватной представленности ДНК данных групп метанотрофов в полученных экстрактах, используемых для дальнейших молекулярных исследований.

Подтверждением этому служит исследование по разработке метода кПЦР на основе гена pmoA (Kolb et al., 2003). В качестве апробации разработанной методики авторами была предпринята попытка оценки численности внесенных в почву популяций метанотрофов I и II типов. Применительно к метанотрофам I типа – Methylococcus capsulatus и Methylomicrobium album – метод показал 100% эффективность, однако в опыте с метанотрофами II типа – Methylosinus trichosporium, удалось зарегистрировать лишь 20% внесенных клеток (Дедыш, 2006). Необходимо отметить, что недавно описанные ацидофильные метанотрофы рода Methylocapsa требуют еще более жестких условий для эффективного лизиса клеток (Дедыш, 2004). Таким образом, методы, подразумевающие экстракцию ДНК из образца, вряд ли могут служить источником строго количественной информации в исследованиях экологии метанотрофных бактерий (Дедыш, 2006).

2.4. Микрочипы.

Технология микрочипирования позволяет одновременно анализировать большое количество образцов, и в настоящее время активно используется в диагностике.

Например, в медицине, ветеринарии, растениеводстве, при контроле качества воды и пищи с помощью микрочипов возможна быстрая детекция патогенов или контаминантов.

В качестве мишеней могут выступать как филогенетические, так и функциональные гены микроорганизмов. Микрочипы представляют собой нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны, с нанесенными на них рядами олигонуклеотидных проб, количеством до нескольких тысяч (Bodrossy et al., 2003). Американскими исследователями было проанализировано бактериальное разнообразие некоторых природных образцов с использованием микрочипов с более чем 30 тысячами вариантами 16S рРНК олигонуклеотидных проб (Wilson et al., 2002). Кроме использования микрочипов на основе нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК, позволяющих детектировать лишь известные организмы, широко применяются микрочипы с различными функциональными генами в качестве мишеней. В случае метанотрофных организмов основой для разработки таких «функциональных зондов» служат последовательности генов pmoA и mmoX. Так, на основе базы данных последовательностей гена pmoA недавно был создан диагностический микрочип, состоящий из 68 проб и позволяющий быстро оценить разнообразие метанотрофов в различных экосистемах (Bodrossy et al., 2003).

Уровень специфичности данных проб варьирует от штаммовой до родовой и групповой, что обеспечивает широкий спектр детекции и высокую разрешающую способность анализа (Дедыш, 2006). Однако, данный метод имеет ряд недостатков, связанных, в основном, с невозможностью оптимизировать условия гибридизации для всех проб, что может привести к неспецифическому связыванию и, как следствие, неверным результатам качественного и количественного анализа.

2.5. Метод FISH.

Метод FISH (fluorescent in situ hybridization) совмещает в себе возможности идентификации и определения численности целевой популяции микроорганизмов в любых природных средах (Дедыш, 2006). Он основан на гибридизации клеток с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-меченными олигонуклеотидными зондами и дальнейшей детекции связавшихся клеток. Достоинством метода FISH является непосредственная визуализация целевых объектов, оценка их морфологии и локализации в нативных образцах. Данный метод позволяет проводить прямую количественную оценку искомых групп микроорганизмов в природных образцах, что делает его по-своему уникальным. Из недостатков метода FISH следует отметить невозможность детекции покоящихся форм микроорганизмов из-за низкого содержания молекул 16S рРНК в этих клетках, вероятность неспецифической детекции и недоучет клеток неизвестных организмов.

Интенсивность сигнала FISH связана с количеством копий гена 16S рРНК в клетке.

Когда их численность меньше порогового уровня, что часто бывает в случае мелких форм бактерий или при стагнации роста, сигнал не может быть детектирован. В этом случае используют модифицированный вариант данного метода – метод CARD-FISH (catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization), который предусматривает значительное (до 20 раз) усиление сигнала (Teira et al., 2004).

Ряд FISH-зондов различного уровня специфичности (от видо- до родо- и группоспецифичных) был разработан и для метанотрофных бактерий. Спектр их пока относительно невелик (Таб. 3). Область применения этих «метанотрофных» зондов до недавнего времени ограничивалась лишь анализом смешанных и накопительных культур (Holmes et al., 1995; Bourne et al., 2000). Примером первого количественного исследования состава метанотрофной популяции с использованием метода FISH является детальный анализ метанотрофов кислых сфагновых болот России (Dedysh et al., 2001, 2003), который показал доминирование в кислых торфах ацидофильных метанотрофов родов Methylocystis, Methylocella и Methylocapsa, принадлежащих к Alphaproteobacteria. Напротив, численность метанотрофных представителей Gammaproteobacteria в данных образцах не превышала 1% общей численности метанотрофного сообщества сфагновых болот (Дедыш, 2006).

2.6. Метод стабильных изотопов (SIP).

Отдельного упоминания заслуживает метод SIP, позволяющий связать организм с его биологической ролью в природных образцах без выделения в чистую культуру. Суть метода заключается в кратковременной инкубации анализируемых нативных образцов с отдельными субстратами, содержащими стабильный изотоп углерода 13С, последующим выделением С-меченной ДНК и ее ПЦР-анализом (Dumont, Murrell, 2005; Friedrich, 2006). Так как природное обогащение С не превышает 1%, то добавление к нативным образцам 99% С-меченного субстрата приводит к его встраиванию в метаболически активные клетки. В дальнейшем С-ДНК отделяют от С-ДНК бактерий, которые не Таблица 3. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, разработанные для специфической детекции метанотрофных бактерий (цитировано по Dedysh et al., 2003).

- концентрация формамида в гибридизационном буфере, - температура гибридицазии, - концентрация NaCl в буфере для промывки.

ассимилировали меченый субстрат, ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl (Троценко, Хмеленина, 2008). Одним из преимуществ метода SIP является возможность использовать в качестве ПЦР-мишеней не только филогенетические, но и загрязнители окружающей среды, такие как бензоат, нафталин и др. (Jeon et al., 2003;

продемонстрировать на аэробных метано- и метилотрофных бактериях (Radajewski et al., 2000). В качестве мишени в таких экспериментах, помимо ДНК, может быть использована и РНК (РНК-SIP). Такая модификация метода, однако, является болеетрудоемкой и технически сложной, чем ДНК-SIP (Whiteley et al., 2006). Выделение РНК из нативных образцов является достаточно сложным процессом ввиду ее нестабильности, однако метод РНК-SIP имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с методом ДНК-SIР. Во-первых, РНК-SIP позволяет выявить метаболически активные, но неделящиеся клетки, в то время как меченый углерод встраивается в молекулу ДНК только в процессе репликации, что происходит при делении клетки. Вовторых, несвязанное с процессом репликации накопление копий РНК позволяет оценить степень активности того или иного метанотрофа в процессе окисления метана при кратковременной инкубации с СН4 (Manefield et al., 2002; Dumont et al., 2011). Еще одной разновидностью данного подхода является метод PLFA-SIP, который позволяет идентифицировать активный компонент метанотрофного сообщества на основании анализа состава жирных кислот (Bodelier et al., 2009). Данные PLFA анализа, однако, не всегда можно однозначно интерпретировать, что несколько ограничивает его применение. Различные варианты метода SIP широко востребованы ныне для выявления и идентификации метаболически активного метанотрофного компонента микробных сообществ различных природных экосистем – от кислых лесных почв и торфяников до осадков пресноводных и содовых озер (Radajewski et al., 2002; Lin et al., 2004; Maxfied et al., 2006; Cebron et al., 2007; Bodelier et al., 2009; Dumont et al., 2011).

В целом, необходимо признать, что прогресс в понимании роли и разнообразия метанотрофных организмов в микробных сообществах связан, прежде всего, с развитием и усовершенствованием методов молекулярной экологии. Сложности получения метанотрофов в чистых культурах стимулировали активный поиск косвенных методов изучения этих бактерий. Эти методы позволяют не только визуально оценить локализацию метанотрофов в природных местообитаниях, но и определить вклад отдельных организмов в процесс окисления метана, а также выявить потенциально новые группы метанотрофов. В настоящее время все больше внимания уделяется исследованию роли метанотрофных организмов в природных экосистемах, а также их влияния на микробное сообщество и экосистему в целом.

Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот.

Одним из наиболее распространенных типов северных болотных экосистем являются верховые сфагновые болота. Это типичные представители автономных ландшафтов.

Верховые болота развиваются на водоразделах и в своем питании ограничены тем, что поступает к ним из воздуха с атмосферными осадками и пылью. От минерального грунта они отделены слоем торфа. Вода в верховых болотах отличается низкой минерализацией, составляющей 5-100 мг/л, низкой электропроводностью, низким значением рН 3-5, обусловленным органическими кислотами, углекислотой и ионным обменом на поверхности растений (Заварзин, 2004). Большую часть вегетационного сезона уровень воды находится вблизи или на поверхности почвы, что приводит к стагнации процессов аэробного разложения растительных остатков. В результате, северные сфагновые болота представляют собой глобальный сток CO2, со скоростью процессов захоронения углерода около 10-30 мг С в год на один квадратный метр. Северные торфяники занимают около 3-5% общей площади поверхности суши и содержат в себе одну треть мирового запаса органического углерода (Gorham, 1991). В то же время, сфагновые болота являются одними из важнейших источников парникового газа метана (Matthews, Fung, 1987;

Gorham, 1991; Panikov, 1999; Friborg, 2003). Конечный этап разложения органических веществ в глубоких анаэробных слоях болотного профиля приводит к образованию значительных количеств метана, который диффундирует сквозь торфяную толщу и попадает в атмосферу. Эмиссию метана из болот контролируют метанотрофные организмы, формирующие своеобразный бактериальный фильтр. Эти бактерии, развитие которых приурочено к уровню стояния болотных вод, способны эффективно перехватывать метан на его пути в атмосферу (Dedysh, 2009).

Начиная с момента их открытия, метанотрофные организмы превратились в объекты активного изучения для целого поколения исследователей. Поиск новых метанотрофов осуществлялся во всех экосистемах, где имеет место образование метана. Несмотря на то, что первая метанотрофная бактерия была описана в далеком 1906 году, прорыв в массовом культивировании новых метанотрофов произошел только в 1970 годах (Whittenbury et al., 1970). В последующие 40 лет было получено большое количество изолятов, среди которых встречались представители различных экофизиологических типов: термофилы, психрофилы, алкалофилы (См. табл. 1, стр.18). В этом перечне, однако, долгое время отсутствовали ацидофильные метанотрофы, населяющие кислые сфагновые болота.

Первое сообщение о молекулярной детекции метанотрофных организмов в кислых торфяниках было опубликовано около 20-ти лет назад (McDonald et al., 1996).

Полученные из сфагнового торфа нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и ряда функциональных генов принадлежали метанотрофам II типа, однако представляли филогенетически обособленную подгруппу без охарактеризованных организмов.

Параллельно с этими первыми молекулярными анализами предпринимались попытки выделения неизвестных болотных метанотрофов в чистую культуру. Однако эти попытки долгое время они оставались безрезультатными. Тщательное изучение физикохимических особенностей болотной экосистемы привело к созданию новой селективной среды, на которой впоследствии и были выделены первые ацидофильные метанотрофы (Dedysh et al., 1998), которые оказались приспособлены к существованию в экстремальных условиях кислых сфагновых болот (см. раздел 3.2).

Основные этапы в изучении метанотрофов кислых сфагновых болот условно можно разделить на две большие группы: данные, полученные с помощью молекулярных методов и данные, полученные с помощью культуральных подходов.

3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью молекулярных методов.

В середине 1990 годов был впервые проведен молекулярный анализ состава сообществ метанотрофов в ряде сфагновых торфяников Великобритании (McDonald et al., 1996). В этой работе на основании анализа последовательностей генов 16S рРНК, амплифицированных из экстрактов ДНК образцов кислых торфов, удалось показать присутствие метанотрофов, филогенетически близких родам Methylosinus и Methylocystis, но формирующих отдельную ветвь в пределах Alphaproteobacteria. Дополнительное доказательство наличия метанотрофов в кислых торфах было получено при использовании в качестве ПЦР-мишеней функциональных генов метанотрофов, таких как pmoA и mmoХ, кодирующих мембранную и растворимую формы метанмонооксигеназы, а также гена mxaF, кодирующего большую субъединицу метанолдегидрогеназы.

Результаты этих исследований подтвердили гипотезу о существовании в кислых болотах неизвестной группы метанотрофов (McDonald et al., 1995а; 1995b, 1997). Как мы знаем сейчас, данные последовательности принадлежали метанотрофам новых видов рода Methylocystis, типичным обитателям сфагновых болот (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013).

До определенного времени, исследования разнообразия метанотрофного сообщества болот с помощью молекулярных методов были в значительной степени ограничены лишь кругом известных на тот момент метанотрофов. Однако первые успехи в выделении ацидофильных метанотрофов и описание представителей новых родов Methylocapsa и Methylocellа существенно расширили спектр праймерных систем и зондов, доступных для успешной идентификации основных групп болотных метанотрофов (Dedysh et al., 2001;

2003). Было также показано, что представители рода Methylocella не содержат мембранную ММО, а имеют лишь ее растворимую форму. Следовательно, при исследовании разнообразия метанотрофного сообщества на основании анализа гена pmoA как минимум одна группа метанотрофов оставалась неучтенной.

Применение метода FISH для анализа ряда кислых олитотрофных болот Северной Германии и Западной Сибири показало, что общая численность метанотрофных бактерий в них достигала 106 – 107 клеток на грамм сырого торфа (Dedysh et al., 2001, 2003).

Болотные метанотрофы были представлены родами Methylocapsa, Methylocella и Methylocystis. Представители рода Methylocystis составляли абсолютное большинство от общей численности метанотрофов. Метанотрофы класса Gammaproteobacteria, олигонуклеотидных зондов М84 и М705, не представляли численно значимого компонента и составляли не более 0.1-1.0% от всех болотных метанотрофов. Было также отмечено, что численность и разнообразие болотных метанотрофов существенно варьировали в зависимости от особенностей болотных экосистем. Например, в кислых сфагновых болотах (рН 3.9 – 4.2) доминировали метанотрофы класса Alphaproteobacteria, достигая в некоторых случаях 107 клеток в грамме торфа (Dedysh, 2009). В то же время, в менее кислых (рН 5.0 - 6.0) и более холодных болотах тундры численная представленность метанотрофов I и II типов была приблизительно одинакова, что неудивительно, поскольку среди метанотрофов класса Gammaproteobacteria имелись психрофильные представители - например, Methyloshaera hansoni и Methylobacter psychrophilus - но до последнего времени ацидофилы известны не были.

Метод стабильных изотопов (SIP) также был использован для идентификации метаболически активных метанотрофов в кислых болотах. Так, в исследованиях метанотрофного сообщества мезотрофного болота на основе анализа С-ДНК, выделенной из нативных образцов торфа после их инкубирования с СН4 был выявлен ряд последовательностей гена 16S рРНК, принадлежащих представителям родов Methylocella, Methylocystis/Methylosinus, а также Methylobacter (Morris et al., 2002). Анализ последовательностей фрагментов гена pmoA, амплифицированных из этого же образца ДНК, подтвердил преобладание метанотрофных альфапротеобактерий. Из разновидностей метода SIP при исследовании болот применялся также метод PLFA-SIP, позволяющий оценить активную составляющую метанотрофоного сообщества на основании анализа выделенных жирных кислот. Так, группой голландских исследователей при анализе кислого торфа были идентифицированы жирные кислоты 16:17, 18:19 и 18:17 (Chen et al., 2008). Последняя являлась индикаторной для болотных метанотрофов Methylocella, Methylocapsa и Methylocystis (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004а, 2007). Присутствие кислоты 16:17 достаточно сложно интерпретировать.

Она является индикаторной для метанотрофов I типа, однако, недавние исследования показали, что она присутствует и у некоторых представителей рода Methylocystis.

Например, в клетках ацилофильных M. heyeri и M. bryophila данная кислота является одной из доминирующих (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013). Таким образом, оценка метанотрофного сообщества сфагновых болот на основании анализа жирных кислот не является методически безупречной, хотя и косвенно подтверждает доминирование метанотрофов класса Alphaproetobacteria.

Еще один подход, примененный для анализа разнообразия метанотрофов кислых торфяников, это метод микрочипирования (Bodrossy et al., 2003). Так, при исследовании осокового (рН 4.6) и сфагнового (рН 4.6 – 4.8) болот было обнаружено существенное различие в составе населяющих их метанотрофных организмов. В сфагновом болоте доминировали Methylocystis spp., а также присутствовали представители Methylocella и Methylocapsa. Болото же с преобладанием осоковых растений населяли как Methylocystis и Methylocella, так и неизвестные представители метанотрофов I типа (Сhen et al., 2008).

Таким образом, использование метода микрочипов также подтверждает численное доминирование присутствие в сфагновых болотных экосистемах метанотрофов класса Alphaproteobacteria.

Как видно, результаты исследования метанотрофного сообщества кислых болот с использованием перечисленных выше молекулярных методов однозначно свидетельствовали в пользу доминирующей роли метанотрофов II типа в процессах окисления метана в этих экосистемах. Тем не менее, первое же использование метода высокопроизводительного пиросеквенирования гена pmoA показало необычайно высокую долю метанотрофов класса Gammaproteobacteria в метанотрофном сообществе сфагновых болот. Так, в работе голландских исследователей было показано равноценное присутствие представителей родов Methylocystis и Methylomonas в микробном сообществе сфагнового болота (Kip et al., 2011). Интерпретация данного факта до последнего времени оставалась затруднительной, так как ацидофильные представители метанотрофов I типа были ранее неизвестны.

3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных метанотрофов.

Ключевым приемом, позволившим успешно выделить первых метанотрофов из кислых болот, стало применение кислых (4.5 – 5.8), разбавленных культуральных сред, содержащих 100-500 мг солей в литре и обладающих низкой буферной емкостью (Dedysh et al., 1998). При использовании метана в качестве единственного источника углерода и энергии на данной среде удалось получить стабильные накопительные культуры, присутствие в которых метанотрофных бактерий было подтверждено с помощью метода FISH со специфическими для метанотрофов II типа зондами. Для получения изолятов использовали либо метод рассева на плотные среды, либо метод предельных разведений (Dedysh et al., 1998, 2002, 2004a, 2007; Dedysh, 2009).



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«Бондарев Станислав Александрович ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35 НА СВОЙСТВА ПРИОНА [PSI+] ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae Специальность 03.02.07 – генетика. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор, Г.А. Журавлева Санкт-Петербург Оглавление 1. Список сокращений 2. Введение 3. Обзор...»

«КРИВОШЕЙ Ирина Васильевна ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ И ЕГО КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ У БОЛЬНЫХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ 03.02.07 – генетика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Чурносов Михаил Иванович Белгород – 2014 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ 5- ГЛАВА 1. Обзор литературы 12- 1.1. Молекулярные основы этиологии и...»

«МАКСИМОВ ДАНИИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗЛИЧИЯ В ХРОМОСОМНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКА SUUR В РАЗВИТИИ DROSOPHILA MELANOGASTER КОРРЕЛИРУЮТ С АКТИВНОСТЬЮ ГЕНОВ И СОСТОЯНИЕМ ХРОМАТИНА Молекулярная генетика – 03.01.07 Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н. Белякин Степан Николаевич Новосибирск...»

«Доан Хоанг Жанг БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА MOMORDICA L. (CUCURBITACEAE) ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 03.02.01 – ботаника ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный...»

«УДК: 579.846.2[063+22+26](043) НАМСАРАЕВ Зоригто Баирович МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМ. Специальность 03.00.07. – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.М. Горленко МОСКВА – 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика основных типов щелочных гидротерм 1.1.1. Основные типы щелочных гидротерм...»

«Лукина Юлия Николаевна ПРОБЛЕМЫ ЗДОРОВЬЯ РЫБ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ЕВРОПЕЙСКО-СИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ ПАЛЕАРКТИКИ Специальности: 03.02.08 – экология 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ,...»

«Кулаков Сергей Сергеевич Очаговое усыхание Pinus sylvstris на юге Красноярского края в результате воздействия корневых патогенов Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.08 – Экология Научный руководитель, доктор биологических наук, профессор И.Н. Павлов Красноярск 2014 1 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. 1 Современное...»

«Лыкшитова Людмила Станиславовна ЭКОЛОГО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ MALUS BACCATA (L ), ULMUS PUMILA (L ), SYRINGA VULGARIS( L. ) К ВОЗДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.01 – ботаника (биологические науки) 03.02.08 – экология (биологические науки) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«НИЗКИЙ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ АНТРОПОГЕННО НАРУШЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ В АМУРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.14 – биологические ресурсы (биологические наук и) Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Благовещенск...»

«Бабоша Александр Валентинович МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ Специальность 03. 01. 05 – Физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Основные представления о природе...»

«Науменко Сергей Анатольевич ДИНАМИКА ОДНОЛОКУСНОГО МУЛЬТИАЛЛЕЛЬНОГО АДАПТИВНОГО ЛАНДШАФТА В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭВОЛЮЦИИ БЕЛОККОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК 03.01.09 — математическая биология, биоинформатика Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Г.А. Базыкин Москва — 201 Оглавление Введение Объект...»

«БУХАРЕВА ОЛЬГА АНДРЕЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ НОРНЫХ СИСТЕМ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В РАЗНЫХ ПРИРОДНЫХ ЗОНАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ТЕРРИТОРИИ РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук А.В. Быков Москва 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ ПОНЯТИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛАВА 1 СРЕДООБРАЗУЮЩАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ НОРНЫХ СИСТЕМ 1.1....»

«Бухарина Наталья Сергеевна ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И МОНИТОРИНГ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМА P450 BM3 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Иванов Москва –...»

«Сафиуллина Регина Ринатовна ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО ПОД РАСТЕНИЯМИ-ФИТОМЕЛИОРАНТАМИ В ЗАУРАЛЬЕ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 03.02.13 – Почвоведение 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«Орлова Ольга Геннадьевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА Специальность 03.00.07 - микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.т.н. Медведева Н.Г. Научный консультант : к.б.н.Зайцева Т.Б. Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. Обзор литературы.....»

«Коваленко Константин Алексеевич Молекулярно-генетическая характеристика факторов цитокиновой системы при ранних эмбриональных потерях 03.02.07 – генетика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Е.В. Машкина Ростов-на-Дону...»

«Максимишин Сергей Валентинович СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ПРИ ОСТРОЙ ИШЕМИИ И ИХ КОРРЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРФТОРАНА (экспериментально-клиническое исследование) 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология 14.00.37 – анестезиология и реаниматология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные...»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.б.н., с.н.с. Картавцева Ирина Васильевна Владивосток –...»

«Черняк Борис Викторович МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ КЛЕТКИ ПРИ ДИСФУНКЦИИ МИТОХОНДРИЙ 03.00.25 – Гистология, цитология, клеточная биология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2010 1 Научный консультант : академик РАН, профессор Владимир Петрович Скулачев Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Галина Евгеньевна Онищенко...»

«ВОСКРЕСЕНСКАЯ Екатерина Александровна Новые подходы к микробиологическому мониторингу популяций Yersinia.pseudotuberculosis и лабораторной диагностике псевдотуберкулеза 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант : Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.