WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И МОНИТОРИНГ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМА P450 BM3 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ

ХИМИИ ИМЕНИ В.Н.ОРЕХОВИЧА»

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

Бухарина Наталья Сергеевна

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И МОНИТОРИНГ АКТИВНОСТИ

ЦИТОХРОМА P450 BM3 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Иванов Москва –

СОДЕРЖАНИЕ

Введение Глава 1. Обзор литературы Цитохром P450 BM 1.1 Энзимология единичных молекул ферментов 1.2 Методы измерения каталитической активности 1.2. единичных молекул ферментов Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных 1.2. молекул ферментов АСМ-визуализация с использованием стандартных и 1. сверхтонких зондов АСМ для исследования активности отдельных 1.3. молекул ферментов Глава 2. Материалы и методы Использованные реактивы и материалы 2.1 Характеристика исследуемого белка 2.2 Методика приготовления образцов для АСМизмерений Методика АСМ-визуализации BM3 с использованием 2. стандартных и сверхтонких зондов Обработка АСМ-изображений 2.4.1 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты 2. единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента Дополнительные методы 2.6 Масс-спектрометрический анализ 2.6.1 Фотонная корреляционная спектроскопия 2.6.2 Методика АСМ-мониторинга температурной 2. денатурации BM3 Флуоресцентный анализ 2.8 Глава 3. Результаты и их обсуждение АСМ-визуализация и определение олигомерного 3. состояния BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов Исследование олигомерного состояния BM3 методом 3.1. фотонной корреляционной спектроскопии АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и 3.1. воздухе с использованием стандартных зондов АСМ-визуализация BM3 в воздухе и в вакууме с 3.1. использованием сверхтонких зондов Определение олигомерного состояния BM3 из данных 3.1. АСМ-экспериментов Мониторинг активности единичных молекул BM3 c 3. АСМ-измерения колебаний высоты BM3 на разных 3. Флуоресцентный анализ температурной денатурации Обсуждение полученных результатов исследования Благодарности Список используемых сокращений АСМ – атомно-силовой микроскоп, атомно-силовая микроскопия МС – масс-спектрометрия RH – относительная влажность PBSD - фосфатно-солевой буфер Дульбекко FAD – флавинадениндинуклеотид FMN – флавинмононуклеотид ММ – уравнение Михаэлиса-Ментен

ВВЕДЕНИЕ





Актуальность исследования Изучение единичных молекул ферментов, их физико-химических свойств и активности является одним из приоритетных направлений в биохимии, которое называется энзимологией единичных молекул. Преимущество такого подхода состоит в получении информации о свойствах отдельных биомолекул, а не об усредненных по ансамблю величинах. Например, это позволяет проводить прямой мониторинг стадий (ан)фолдинга белка, наличие которых в стандартных экспериментах лишь предполагается, или наблюдать за работой единичных ферментов на различных стадиях каталитического цикла, характеризовать их промежуточные переходные состояния [1].

Помимо того, что традиционные методы исследования дают возможность получить только усредненные характеристики систем, они обладают также более низкой чувствительностью по сравнению с методами изучения единичных молекул. Это приводит к тому, что в традиционных методах приходится проводить исследования при достаточно высоких концентрациях растворов белков. Использование высоких концентраций растворов приводит к тому, что биомолекулы, склонные к агрегации, находятся в олигомерном состоянии.

Работа же с малыми концентрациями позволяет сместить равновесие в сторону мономерной формы белков и следить за свойствами мономеров и олигомеров.

Также манипуляции с единичными молекулами, в том числе с иммобилизованными единичными молекулами, позволяют напрямую измерять молекулярные силы, структуру и функциональный отклик отдельных молекул на механическое воздействие.

В настоящей работе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) используется для исследования иммобилизованных на подложке отдельных молекул белков в условиях, близких нативным [2], в том числе, для визуализации и изучения физико-химических свойств единичных макромолекул и макромолекулярных комплексов [3]. Субнанометровое вертикальное разрешение этого метода и полуконтактный режим АСМизмерений позволяют с высокой точностью определять высоту белка с минимальным воздействием на него со стороны АСМ-зонда. Таким образом, АСМ можно использовать для визуализации белков, их идентификации по высотам и, соответственно, определения их степени олигомеризации, а также для мониторинга конформационной динамики фермента в процессе осуществления ферментативной реакции. Эти возможности метода АСМ были продемонстрированы в данной работе на примере изучения свойств фермента цитохрома P450 BM3 (BM3), катализирующего монооксигенацию жирных кислот [4]. BM3 принадлежит к суперсемейству гем-содержащих цитохромов P450 и играет важную роль в метаболических путях в организме. Этот белок является самодостаточным ферментом, который не требует наличия дополнительных белков-партнеров для реализации каталитического цикла. В структуре этого фермента редуктазный и гемовый домены объединены в единую полипептидную цепь [5], что обуславливает интерес к нему как к удобной упрощенной модели цитохром P450-содержащих монооксигеназных систем, а также позволило упростить схему измерения активности фермента с помощью АСМ. Ранее было также показано, что полноразмерный BM3 может существовать в мономерной и олигомерной формах, главным образом в виде димерной (50%) [6]. Причем димеры проявляют большую активность, нежели мономеры: kcat =50 s-1 и kcat =10 s-1 для димеров и мономеров, соответственно [7].





Цель работы Цель настоящей работы – визуализация и измерение активности отдельных молекул фермента цитохрома P450 BM3 с использованием АСМ.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Подбор условий нековалентной иммобилизации фермента на АСМподложку для визуализации отдельных молекул.

АСМ-визуализация иммобилизованного фермента в различных средах, определение его олигомерного состояния на основе данных измерений с использованием стандартных и сверхтонких зондов.

Исследование влияния температуры на олигомерное состояние BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа.

АСМ-измерение амплитуды колебаний высоты молекул BM3 на отдельных стадиях каталитического цикла (при добавлении субстрата, донора электронов, ингибитора) при разных температурах и разработка методики определения каталитической активности ферментов из полученных АСМданных.

Научная новизна работы Разработана методика определения олигомерного состояния иммобилизованного фермента BM3 с помощью АСМ c двумя типами зондов:

стандартным и сверхтонким. Исследовано влияние среды АСМ-измерений (жидкость, воздух, вакуум) и типов АСМ-зондов на высоты изображений BM и на его олигомерное состояние. С использованием АСМ-измерений стандартным зондом получено подтверждение, что BM3 в жидкости может находиться как в мономерном, так и в олигомерном состоянии, а с использованием сверхтонкого зонда в вакууме удалось разрешить более детально олигомерное состояние BM3.

Разработана методика определения каталитической активности фермента с помощью АСМ по изменению амплитуды колебаний высоты его отдельных молекул. Показана зависимость амплитуды колебаний высоты отдельных молекул BM3, иммобилизованных на подложке, от температуры с помощью АСМ.

Проведено исследование температурной денатурации цитохрома P450 BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа. Предложен подход для температуры и его температурной денатурацией, который объединяет мониторинг плавления фермента и АСМ-исследование его агрегации в процессе температурной денатурации. В низкотемпературной области 10-33°C с помощью флуоресцентного анализа было обнаружено 3-и кооперативных перехода, а с помощью АСМ-анализа для BM3 продемонстрировано сохранение его глобулярной формы при изменении степени олигомеризации в этой области.

Научно-практическая ценность работы Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора, наиболее интересны следующие полученные результаты: детальное разрешение олигомерного состояния BM3 с помощью сверхтонкой АСМ-иглы, определение особенностей колебаний высоты отдельных молекул фермента BM3, иммобилизованных на подложке, и обнаружение 3-х кооперативных переходов в низкотемпературной области на кривой плавления BM3.

разработанный алгоритм связи каталитической активности единичного фермента и амплитуды колебаний его высоты, полученной из АСМ-данных.

теоретический вклад в развитие методов определения каталитической активности единичных молекул ферментов. Этот подход может быть использован для других ферментативных систем.

Предложен подход совмещения АСМ с флуоресцентным анализом для исследования температурной денатурации ферментов.

Фундаментальные результаты, полученные в диссертационной работе, могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных разработке новых биокаталитических технологий на основе иммобилизованных ферментов для решения задач фармацевтической, пищевой и энергетической промышленности.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих научных конференциях и школах:

«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» 2010, Москва, Россия;

25th International Symposium on Microscale BioSeparations MSB 2010, Prague, Czech;

бионаноскопии» 2010, Москва, Россия;

состояние и перспективы развития» 2011, Москва, Россия;

17th International Conference on Cytochrome P450 2011, Manchester, European Proteomics Association 2012 Scientific Congress, Glasgow, Scotland.

Личный вклад автора Все экспериментальные АСМ-измерения и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Эксперименты по флуоресцентному к.б.н. Петушковой Н.А.

к.б.н. Кайшевой А.Л. под руководством д.б.н. Згоды В.Г. Эксперименты по электронной микроскопии проведены совместно с Канашенко С.Л. Разработка программного обеспечения для получения траекторий изменения высоты молекул из АСМ-кадров проведена совместно с Крохиным Н.В. Эксперименты по фотонно-корреляционной спектроскопии проведены совместно с к.ф.м.н. Медведевой Н.В.

экспериментальных данных, формулировка теоретических положений выполнены Бухариной Н.С. лично под руководством д.б.н., профессора Иванова Ю.Д.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи, 3 из которых – в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Структура и объем работы Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 101 источник.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цитохром P450 BM Цитохромы P450 – суперсемейство гемсодержащих монооксигеназных ферментов, играющих важную роль в окислении как эндогенных соединений (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты и др.), так и экзогенных (лекарства, яды, пестициды и др.), последние из которых называют ксенобиотиками [8]. Монооксигеназы катализируют реакции внедрения одного атома кислорода в различные субстраты, другой атом кислорода восстанавливается до воды. Общая схема каталитического механизма может быть представлена как [9]:

где RH – субстрат, (2+2Н+) – донор электронов, которым может быть как NADPH, так и NADH.

Монооксигеназная система цитохрома P450 широко распространена в природе, и в общем случае состоит из трех ферментов: это цитохром Р450, флавопротеин, передающий на него электрон и редуктаза, участвующая в окислении NADH (NADPH) [10,11]. Однако, известны и двухкомпонентные системы, включающие, только два фермента: монооксигеназная система микросом печени эукариот состоит из флавопротеина, содержащего FAD и FMN (NADPH-зависимая P450-редуктаза), и цитохром P450. Все компоненты этой системы – истинные мембранные белки, что затрудняет их детальное изучение, так как они не водорастворимые. Хотя и известна атомарная структура некоторых P450 млекопитающих и NADPH-зависимой P450редуктазы крысы [12-14], но она модифицирована – удалением N-концевого фрагмента пептидной цепи, выполняющего роль якорного пептида с сигнальной последовательностью, ответственной за встраивание белка в мембрану [15]. Этот участок важен для продуктивного электронного переноса между NADPH-зависимой P450-редуктазой и цитохромом P450 [7]. Поэтому особый интерес для изучения представляет уникальный цитохром P450 BM (BM3) c молекулярной массой 119 кДа [4], который содержит редуктазный (FMN/FAD) и гемовый домены, объединенные в единую полипептидную цепь, что обуславливает интерес к нему как к удобной упрощенной модели цитохром P450-содержащих монооксигеназных систем [16]. Это придает изучению фермента стратегическое значение: исследование структурных факторов, определяющих субстратную селективность и электронный перенос в цитохромах P450.

Флавоцитохром P450 BM3 (BM3), изолированный из почвенной бактерии Bacillus megaterium в 1974 году Miura и Fulco [17], принадлежит к суперсемейству гемсодержащих ферментов цитохромов P450. Он занимает особенное место в суперсемействе цитохромов P450 как первый открытый бактериальный цитохром P450, использующий редокс-партнер подобно эукориотическим P450 (FAD/FMN-редуктаза= NADPH-зависимая цитохром P450 редуктаза, CPR) и как первый найденный фермент P450, объединенный (fused) со своим редокс-партнером [4, 8].

ВМ3 катализирует гидроксилирование (в основном, (-1), (-2) и (-3) – гидроксилирование) насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с различной длиной цепи [18], спиртов и амидов [8]. Точная физиологическая функция ВМ остается пока неизвестной (2002 г.), хотя предполагается, что его роль – удаление токсичных жирных кислот из окружающей среды, то есть защита бактерии B. Megaterium [19]. Он обладает максимально известной для цитохромов P450 монооксигеназной активностью: скорость окисления арахидоновой кислоты 250 с-1 [20]. Каталитическая активность ВМ обусловлена переносом электронов с NADPH кофактора через флавиновый домен на гем [21]. Исследования кинетики переходных процессов показали, что быстрые скорости электронного переноса в флавиновом домене и между флавиновым доменом и P450 лежат в основе каталитической эффективности фермента [21].

ВМ3 – водорастворимый белок, но его полная структура неизвестна (возможно, кристаллизация осложняется из-за наличия нескольких доменов и гибких линкеров между ними [22]). Поэтому ключом к пониманию механизма его работы стала информация об атомарной структуре гемового домена без субстрата и в комплексе с субстратом (пальмитиновая кислота), полученная с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [23, 24], а также проведен РСА части белка, содержащей два связанных домена: FMN- и гемсодержащий [5].

Атомарные структуры гемового домена выявили [23, 24], что аминокислотный остаток (а.о.) W96 (Trp96, филогенетически консервативная аминокислота) вовлечен в водородные связи с гемовым пропионатом. Также было показано, что гемовый домен имеет длинный гидрофобный субстрат-связывающий канал, ведущий к гему, а при связывании с субстратом происходит соответствующая структурная перестройка так, что -конец жирной кислоты остается на расстоянии 7 от гемового железа. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) подтвердил наличие большого расстояния между субстратом и гемом, и что восстановление гема является триггером для секундного конформационного изменения, при котором жирная кислота оказывается в положении ближе к железу гема для осуществления окислительной реакции [25]. Таким образом, эти атомарные структуры обеспечили основу исследований роли различных аминокислот в BM3. Имеются данные и по вторичной структуре BM3 (часть последовательности 13-628 а.о. [26]), основной вклад в эту структуру вносит спираль (56%), а доля -листов и поворотов составляет 31% и 13% соответственно.

ВМ3 является важной модельной системой для изучения и понимания структурно-функциональных механизмов в суперсемействе цитохромов P450.

К тому же исследование ВМ3 имеет биотехнологический потенциал. Несмотря на успехи структурной биологии в исследовании цитохромов P млекопитающих и их редуктазных систем, ВМ3 является гибкой моделью благодаря его удобной модульной конструкции и растворимой природе.

Изучение этого фермента может внести ясность как в вопросы по конформационной динамике, так и по термодинамическому контролю электронного переноса.

различных научных групп, направленных на изучение структуры и функций ВМ3. Так, в работе [6] (20C) на основе методов гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования было показано, что полноразмерный ВМ3 может существовать в мономерной и олигомерной формах, главным образом в виде димерной (50%). В работе [7] была измерена Кd димеризации продемонстрировано, что местом агрегации белка является главным образом редуктазный домен, и что даже мономер BM3 проявляет значительную конформационную подвижность. В ряде работ была измерена активность ВМ по гидроксилированию лауриновой кислоты в растворе, значения которой имеют большой разброс: kcat = от 80 s-1 до 2 s-1 (53 s-1[7], 46 s-1[27], 86 s-1 [20], s-1 [28] и 2 s-1 [29]), а время оборота фермента, соответственно, находится в миллисекундном-секундном диапазоне. Причем, димеры проявляли большую активность, нежели мономеры: так согласно данным [7] – kcat =50 s-1 и kcat = 10 s-1, соответственно для димеров и мономеров (25C). Также из исследований ВМ3, содержащих аминокислотные замены (мутантные формы белка), в работе был сделан вывод, что электронный перенос происходит от NADPH к FAD, затем к FMN в пределах одного мономера (мутант A264H), а от FMN к гему второго мономера (мутант G570D) в пределах димера. Было показано, что ВМ3 каталитически активен только в димерной форме, а при разбавлении теряет свою активность [30]. Перечисленные выше методы являются косвенными методами определения олигомерного состояния белка, а уточнение олигомерного состояния BM3 представляется важной задачей для понимания механизма и создания модели его функционирования.

температуры на его активность обычно исследуется для выяснения механизма функционирования фермента. Было обнаружено, что температурная зависимость каталитической активности BM3 имеет колоколообразный вид с максимумом при T25C [31]. При этом для солюбилизированного белка уменьшение активности при T25C более выражено, чем для белка, иммобилизованного в золь-гель матрице [31]. Также работа [32] посвящена вопросу температурной зависимости каталитической активности BM3, где исследовалась зависимость скорости инактивации редуктазного домена BM (BMR) от температуры (от 22C до 36C), энергия активации перехода BMR из активного состояния в неактивное составила 9,9±0,3 ккал/моль, что соответствует разрыву нескольких водородных связей. В этой же работе изучалась некаталитическая потеря активности BMR (30C), и скорость инактивации составила 0,22 мин-1. Были выдвинуты предположения, что либо активные димеры BMR диссоциируют на неактивные мономеры, либо происходит его денатурация. Добавление избытка FMN в раствор ненамного уменьшало скорость инактивации с 0,22 до 0,13 мин-1, показав, что инактивация, вероятно, не связана с потерей флавина.

В работе [33] с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии были определены температуры плавления (Tm) интактного ВМ3 и его доменов.

Для интактного ВМ3 значения Tm составили 48C и 63C. Эти значения изолированного гемового домена (Tm = 58,7C и 64,9C) и редуктазного домена (Tm = 47,5C).

термодинамике белкового фолдинга с высокой чувствительностью [34]. В BM флуорофорами могут быть внутренние ароматические группы – остатки тирозина (Tyr), триптофана (Trp), фенилаланина (Phe), а также простетические флавиновые (FAD и FMN) группы. Известно, что BM3 имеет 12 Trp, 35 Tyr остатков (по известной структуре), в том числе в гемовом домене – 5 Trp [35] и в редуктазном домене – 7 Trp (в том числе флавин-связывающий Trp 574 [36]), что делает его хорошим объектом для изучения методом флуоресцентного анализа. Наличие в BM3 как ароматических групп, так и флавиновых групп обуславливает возможность использования метода флуоресцентного анализа флуоресценции ароматических остатков зависит от диэлектрической константы окружающей их среды [33]. Поэтому, наблюдая за положением спектральных полос, можно сделать вывод об изменении микроокружения ароматических остатков, то есть об изменении структуры молекулы белка. При выходе ароматических остатков на поверхность молекулы белка, например, при денатурации они оказываются в полярном, более гидрофильном окружении, что приводит к росту интенсивности флуоресценции и сдвигу максимума в длинноволновую область [37]. При разворачивании флавопротеинов под химическим или температурным воздействием флуоресценция FAD/FMN также возрастает [38]. Было показано, что при разбавлении BM3 теряет активность [30], при этом увеличивается интенсивность флуоресценции флавиновых групп [39].

Удобным методом исследования для исследования распределения ферментов по размерам и мониторинга активности отдельных молекул является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Для изучения процессов денатурации белков – сопряжение АСМ и флуоресцентной спектроскопии, так как они позволяют проводить измерения в условиях, близких к нативным. Поэтому, эти методы были использованы нами для исследования BM3.

1.2 Энзимология единичных молекул ферментов Изучение единичных биомолекул имеет определенные преимущества перед стандартным подходом, когда в экспериментах одновременно исследуется большое число биомолекул, и наблюдаются усредненные по ансамблю свойства. Одним из таких преимуществ является возможность получения информации о распределении молекулярных свойств биомолекул [40]. Это осуществляется посредством построения гистограммы конкретной переменной для множества молекул, распределение может быть получено из статической (различия между отдельными молекулами в нативном состоянии) или из динамической гетерогенности (медленные конформационные переходы, регулирующие катализ) [1]. Например, можно напрямую наблюдать множество стадий (ан)фолдинга белка, наличие которых в стандартных экспериментах лишь предполагается. Редкие состояния при (ан)фолдинге усредняются в ансамбле, тогда как в экспериментах исследования единичных молекул они могут быть обнаружены. Взаимосвязь и кинетические константы скорости между различными состояниями системы, имеющей дискретные состояния, могут быть напрямую измерены с помощью методов исследования единичных молекул. Так, с помощью флуоресценции единичных молекул были просчитаны разные этапы фолдинга и этапы ферментативной реакции рибозимов [43].

Также при изучении единичных молекул появляется возможность следить за биохимическими процессами в режиме реального времени и обнаружить переходные промежуточные состояния (интермедиаты), что ранее могло быть получено только синхронизацией действия большого ансамбля молекул для наработки детектируемых концентраций интермедиатов. Этот аспект важен для прояснения механизмов ферментативных реакции [1].

Динамические характеристики систем обычно измеряются в равновесных условиях для единичных молекул (или небольших ансамблей). Это важно не только для исследования равновесной динамики, но и для динамики систем, которые не просто синхронизировать. Например, движение дезоксирибозимов или молекулярных моторов вдоль их траекторий может быть сложным и стохастическим, что делает невозможным синхронизацию процессов для больших расстояний.

Результатом экспериментов с единичными молекулами ферментов часто являются их траектории, статистический анализ которых дает детальную информацию о динамике объекта, а результаты можно впоследствии сравнить с физическими моделями. Также манипуляции с единичными молекулами позволяют напрямую измерять молекулярные силы, структуру и их функциональный отклик на механическое воздействие.

Наконец, преимуществом методов изучения единичных молекул является их чувствительность. Некоторые биологические молекулы склонны к агрегации при высоких концентрациях, тогда как работа с малыми концентрациями или с единичными иммобилизованными молекулами позволяет следить за свойствами мономеров и олигомеров. К тому же, многие компоненты клетки находятся лишь в нескольких (или даже в одной) копии [42, 43, 44], следовательно, такие компоненты могут быть исследованы в нативной клеточной концентрации.

1.2.1 Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов К методам изучения единичных молекул относятся оптический и магнитный пинцет, метод связанной частицы (tethered particle motion) [45], флуоресцентный анализ единичных молекул [46] и атомно-силовая микроскопия (АСМ). Эти подходы могут стать инструментальным решением таких важных биологических задач, как, например, взаимодействие белок-ДНК, фолдинг белка и активность единичных белков, в том числе работа ферментов в живой клетке.

В 1961 Ротманом [47] была измерена каталитическая активность единичного фермента -галактозидазы. Смесь сильно разбавленного раствора фермента и сильно концентрированного флуорогенного субстрата переводилась в мелкодисперсный аэрозоль, капли покрывались силиконовым маслом во избежание испарения. Диаметр образующихся капель составлял 0,1 – 40 мкм, фермент преобразовывал слабо флуоресцирующий субстрат в сильно флуоресцирующий продукт, а флуоресценция снималась с отдельных микрокапель после 10-15 часов инкубации. В этом подходе молекулы фермента случайно распределены по каплям, но при определенной концентрации большинство капель не будет содержать фермент, некоторые капли будут содержать 1 молекулу и совсем небольшое количество капель – по 2, 3 или более молекул. Прямое измерение числа оборотов проводилось по флуоресцентному продукту и составило 115 с-1. Флуоресценция капель мутантной формы фермента (в 57 р менее активен) не наблюдалась, а при использовании фермента, подвергшегося частичной термоинактивации снова наблюдалось распределение Пуассона для активности в каплях, показывая, что отдельные молекулы были как активными, так и неактивными, то есть некоторые молекулы сохраняли полную активность. Другими словами, продемонстрирована своего рода статическая гетерогенность [48].

Этот метод был трудоемким, поэтому группы [49] и [50] разработали капиллярный метод мониторинга за активностью ферментов: вместо аэрозоля, как в описанной выше работе, использовался кремниевый капилляр. После инкубации разбавленного раствора фермента с концентрированным раствором флуорогенного субстрата флуоресцентный продукт отделяли электрофорезом, который проходил через высокочувствительный лазер-индуцированный флуоресцентный детектор. Условия подбирались так, что в капилляре находилось 1-2 молекулы фермента. В этих работах была обнаружена статическая гетерогенность (рис. 1.2.1) в активности молекул фермента: на примере лактатдегидрогеназы [49] и щелочной фосфатазы [50] было продемонстрировано, что отдельные молекулы фермента имеют различные каталитические скорости, а энергия активации может отличаться в 3 раза для разных молекул [50, 51]. Yeung [49] предположили, что эти отличия от молекулы к молекуле подтверждают парадигму энергетического ландшафта в теории о структуре белков (в теории укладки белков) с его иерархической организацией.

Рисунок 1.2.1 – Энзимология единичных молекул щелочной фосфатазы.

Образец инкубировался 20 мин при комнатной температуре. Флуоресцентный субстрат начал мигрировать из капилляра к детектору через 9 мин после прикладывания электрического поля 400 В/см. Автогидролиз субстрата привел к накоплению флуоресцентного продукта внутри капилляра, что отразилось в виде 5-минутного плато флуоресцентного сигнала. На плато наблюдается набор из ~12 пиков. Каждый пик появился в результате образования флуоресцентного продукта единичной молекулой фермента. Широкое разнообразие высот пиков характеризует гетерогенность в активности от молекулы к молекуле фермента Таким образом, эти отличия возникают, потому что молекулы «пойманы»

в разных долгоживущих конформациях. С другой стороны, в [50] связывают такие отличия от молекулы к молекуле с чистотой образца эукариотического белка, на которую влияют посттрансляционные модификации белка.

Большинство эукариотических ферментов сильно модифицированы: многие ферменты гликозилированы, имеют N-концевое ацетилирование и т.д. Эти модификации и являются причиной вариаций в KM и Vmax у ферментов [52].

Проведя аналогичный эксперимент [53] с прокариотической щелочной фосфатазой определенной изоформы, группа обнаружила, что активность отдельных молекул имела более гомогенный характер, чем эукариотический фермент, а относительное отклонение значений активности составило 30%, что обусловлено главным образом точностью эксперимента с ферментом низкой активности.

В работе [54] наблюдались единичные обороты фермента миозина, катализирующего гидролиз аналога аденозинтрифосфата (АТФ), меченого Cy3, в аденозиндифосфат (АДФ). С помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения записывалось время удержания молекулы субстрата/продукта на иммобилизованном ферменте. Т.к. этап высвобождения продукта из активного центра фермента – лимитирующий по скорости, то определялась скорость диссоциации продукта гидролиза, которая составила 0,059 с-1. Это значение согласуется со скоростью реакции, определенной в объеме (0,045 с-1), поэтому был сделан вывод, что связывание/высвобождение Cy3-АТФ/АДФ, соответственно, отражает один каталитический оборот.

В работе [55] велось наблюдение за каталитическими оборотами единичной молекулы холестериноксидазы – флавопротеина, катализирующего окисление холестрина кислородом. В отличие от предыдущих экспериментов, флуоресцентными свойствами обладал активный центр фермента флавинадениндинуклеотид (FAD), который флуоресцирует в окисленной форме, а в восстановленной FADH2 – нет. Было показано, что при избытке холестерина и кислорода флуоресценция единичных молекул фермента, заключенного в агарозном геле, во временной развертке имела характер «onoff» (есть сигнал-нет сигнала). Каждый такой цикл «on-off» соответствовал обороту фермента, поэтому в режиме реального времени можно было получить траекторию состояний фермента во времени (более 500 оборотов для отдельного фермента). Помимо этого, была обнаружена корреляция между продолжительностью соседних событий «on» на траектории состояний фермента. В классической же кинетике, подчиняющейся статистике Пуассона, реакции – это стохастические процессы, то есть молекула фермента совершает оборот, не имея никакой памяти о своем состоянии в прошлом и предыдущих оборотах, с постоянной скоростью. Из траекторий состояний отдельных ферментов была вычислена средняя скорость k2, значение которой варьировалось от 3 с-1 до 14 с-1: наблюдался статический беспорядок для скоростей реакций единичных молекул ферментов, как и ранее [49, 50]. Разброс значений исследователи связали с протеолизом или окислением боковых групп аминокислот фермента. Также было обнаружено, что значение каталитической скорости единичной молекулы фермента флуктуирует, следовательно, продемонстрирована динамическая гетерогенность молекулы фермента. Такие конформационных подсостояний белковой макромолекулы: скорости реакции единичных молекул флуктуируют, так как молекула в своем окружении движется по своему энергетическому ландшафту [56].

Впоследствии в работах [57, 58] был разработан метод прямого наблюдения конформационных подсостояний отдельной молекулы флавин-редуктазы на основе Ферстеровского индуктивного резонансного переноса энергии электронного возбуждения (FRET) [59], который протекает по индуктивнорезонансному механизму и осуществляется на расстоянии до 100. В молекуле флавин-редуктазы флуоресценция флавина гасится аминокислотным остатком тирозина (Tyr35) посредством фотоиндуцированного электронного переноса.

При исследовании времени жизни флуоресценции единичного флавина была получена информацию об изменении расстояния между флавином и тирозином во времени: было обнаружено, что конформационные колебания белка происходят в широком временном диапазоне от сотен микросекунд до десятков секунд. Физическая интерпретация полученных данных следующая:

многомерный энергетический ландшафт целого белка имеет много локальных конформационному подсостоянию. Конформационные подсостояния имеют разные времена жизни, потому что значения высоты барьера свободной энергии перехода между подсостояниями имеют широкое распределение.

Акцент в работе сделан на том, что в этих экспериментах напрямую выявлены равновесные флуктуации и дана количественная оценка конформационной памяти при комнатной температуре.

Такие равновесные конформационные флуктуации были обнаружены во всех белковых системах, исследованных группой Xie X.S. [60], и наблюдались в тех же временных масштабах, что и флуктуации каталитической скорости. В работе [61] был проведен мониторинг активности -галактозидазы, используя флуорогенный субстрат resorufin--D-galactopyranoside (22°C). Поверхностная концентрация иммобилизованного на стекле фермента была 1 молекула на квадратный миллиметр: для этого биотинилированный фермент (10 нМ) пришивался к полистирольным шарикам, покрытым стрептавидином, которые в свою очередь специфично связывались с поверхность покровного стекла, покрытую биотинилированным ПЭГ.

Так как флуорофор генерировался при каждом каталитическом обороте фермента, были получены развертки изменения интенсивности флуоресценции во времени 10-20 с, удалось записать до 2*104 оборотов для отдельных молекул. Анализ этих разверток выявил эффект памяти, характеризующийся наличием кластеров оборотов (событий), разделенных периодами низкой активности. При высокой концентрации субстрата (100 мкМ), скорость реакции флуктуировала (динамическая гетерогенность) в широком временном диапазоне от 10 -3 до 10 с, что совпадает с наблюдаемыми ранее временными масштабами конформационных флуктуаций в единичной молекуле белка [57, 58]. Это свидетельствует о существовании взаимопревращающихся конформеров с широким распределением значений времени жизни. В работе также было доказано, что уравнение Михаэлиса-Ментен справедливо для единичных флуктуирующих ферментов, но имеет другую микроскопическую интерпретацию.

1.2.2 Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных ферментов В соответствии с простейшей кинетической схемой ферментативной реакции по механизму Михаэлиса-Ментен (ММ) [62], субстрат S обратимо связывается с ферментом E, формируя ферментно-субстратный комплекс ES.

ES переходит в продукт P, а E восстанавливается для следующего каталитического цикла:

каталитической реакции v от концентрации субстрата [S] для ансамбля:

где константа Михаэлиса KM=(k-1+k2)/k1, общая концентрация фермента [E]T=[E]+[ES], максимальная скорость vmax=k2[E]T при больших значениях k3, а график зависимости 1/v от 1/[S] описывается прямой.

Рассмотрим, как соотносится классическая ферментативная кинетика и кинетика для единичных молекул ферментов.

Прежде всего, следует отметить, что для единичной молекулы ферментативная реакция – это стохастическое событие, и обычно в экспериментах с единичными ферментами измеряются времена ожидания осуществления ферментативной реакции [63]. Плотность вероятности этих времен ожиданий f() может быть получена из гистограммы большого количества оборотов в течение длительного времени. Таким образом, кинетическая теория для единичных молекул ферментов не может опираться на понятие концентрации фермента, а может быть сформулирована через вероятность нахождения фермента в определенном состоянии на пути каталитической реакции (reaction pathway) [1].

Кинетику ММ для единичных молекул ферментов можно рассматривать в двух приближениях: в отсутствии и в присутствии динамического беспорядка.

Кинетика ММ в отсутствии динамического беспорядка [63]. В экспериментах по мониторингу оборотов фермента наблюдение за единичной молекулой фермента происходит непрерывно при ее цикличных переходах через состояния E, ES и E0 (1.2.2а). Время завершения первой реакции в таком случае – стохастическая переменная, которая может быть найдена из распределения времен ожидания f(). В этом случае концентрации в уравнениях (1.2.2б) заменяются вероятностями P нахождения фермента в состояниях E, ES и E0:

где должны выполняться начальные условия PE(0)=1, PES(0)=0 и PE0(0)=0 во время старта реакции t=0 и PE(t)+PES(t)+PE0(t)=1. Также предполагается, что константа скорости прямой реакции k10 имеет псевдо первый порядок k10=k1[S] и [S] принимается постоянной. E0 переходит в E либо мгновенно, либо через другую химическую реакцию с механизмом «пинг-понг» [63]. Следовательно, уравнения (1.2.2г) становятся системой дифференциальных уравнений первого порядка. Вероятность f(t)t того, что оборот произойдет в промежуток времени между t и t+t, равна вероятности того, что фермент находится в состоянии E0 в этом же интервале: PE0(t)=k2PES(t)t. А f(t)= dPE0(t)/dt= k2PES(t), с учетом этого и решения уравнения (1.2.2г):

График f(t) от t при фиксированных значениях [S] (0,005 мМ), k1 (107 М-1с-1), k (250 с-1) для разных значений k-1 (0, 50 и 2000 с-1, то есть, соответственно, когда нет диссоциации ES на E и S, скорости катализа и диссоциации сравнимы и скорость диссоциации много больше каталитической скорости) представлен на рисунке 1.2.2.

Рисунок 1.2.2 – Вероятность времени ожидания, f(t), в отсутствие динамического беспорядка, вычисленная из уравнения (1.2.2д).

Вероятность вычислена для трех различных значений k-1 (0, 50 и 2000 с-1) при фиксированных значениях k1 = 10-7 М-1с-1, k2 = 250 c-1, а [S] = 0,005 мМ Интерес представляет промежуточный случай между двумя пределами (рис.

1.2.2). Первый момент f(t) дает среднее время ожидания ‹t› для реакции стационарных условиях. Обратную величину ‹t› можно интерпретировать как среднюю скорость реакции. Из уравнения (1.2.2д):

Из (1.2.2в) и (1.2.2е) следует, что v / vmax 1 / ( k2 t ) или v / [ E ]T 1 / t.

График 1/‹t› от [S] для параметров, заданных вторым графиком рисунка 1.2.2, представлен на рисунке 1.2.3. Видно, что зависимость от концентрации субстрата имеет характерную гиперболическую форму кривой насыщения в теории ММ. То есть имеется согласованность кинетики единичной молекулы и усредненной по ансамблю.

Рисунок 1.2.3 – Средняя скорость реакции 1/‹t› (или ее эквивалент v/[E]T), вычисленная из уравнения (1.2.2е). Уравнение ММ для единичных молекул фермента как функция концентрации субстрата [S] для KM=30 мкМ (значение, соответствующее k-1=50 с-1, k1 = 10-7 М-1с-1 и k2 = 250 c-1). Адаптировано из [63].

Однако, полученные для f(t) выражения не всегда согласуются с измерениями, полученными на некоторых ферментативных системах [64, 65], которые обнаруживают мультиэкспоненциальный характер распределения времен ожидания при высоких концентрациях субстрата. Такое поведение может быть связано с динамическим беспорядком. Один из способов смоделировать динамический беспорядок – принять допущение, что k2 или параметры, от которых она зависит, являются стохастическими переменными, которые флуктуируют в соответствии с определенными статистическими законами, как в работах [66, 67]. Примером такой кинетической схемы может быть:

где каждая из трех форм фермента E, ES и E0 может находиться в двух взаимопревращающихся конформациях. В работе [64] показано, что уравнение ММ для единичных молекул в случае большего количества конформеров будет выглядеть:

где мнимая константа каталитической скорости 2 и мнимая константа ММ CM могут быть записаны в виде:

Таким образом, видно, что даже в случае динамического беспорядка для каждой отдельной молекулы сохраняется гиперболическая зависимость 1/‹t› от концентрации, но смысл констант k2 и KM требует переосмысления. В пределе медленных взаимопревращений конформеров они оказываются средневзвешенными значениями кинетических параметров, характеризуя отдельные конформеры.

Также следует снова отметить мультиэкспоненциальный характер f(), свидетельствующий о наличии динамического беспорядка [55,68,63], который связан с флуктуациями констант скоростей реакции, вызванных переходами между различными конформерами фермента. Эти флуктуации могут возникать во временных масштабах, сравнимых или больших, чем ферментативная реакция, поэтому скорость образования продукта обуславливается не единичной константой скорости, а распределением констант скоростей [63].

В данной диссертационной исследуется активность единичных молекул фермента. Методом же исследования является АСМ, позволяющий проводить визуализацию в условиях, близких к нативным.

1.3 АСМ-визуализация с использованием стандартных и сверхтонких зондов Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) является представителем обширного семейства методов сканирующей зондовой микроскопии. Общие черты этих методов: регистрация различных параметров взаимодействия зонда с поверхностью образца и исследование поверхности в процессе сканирования.

Атомно-силовой микроскоп был изобретён Г. Биннингом, К. Куэйтом и К.

Гербером в 1986 году[69]. В основе его работы лежит регистрация силы взаимодействия АСМ-зонда (кантилевера) с поверхностью сканирования.

АСМ-зонды изготавливаются из материалов, обладающих высокой твёрдостью (таких, как кремний, нитрид кремния, и т.д.) и имеют вид чипа с упругой консолью, на конце которой создаётся игла с различными радиусами кривизны от 1 нм и более (рис. 1.3.1). Обратная сторона консоли покрывается отражающим свет материалом (золото или алюминий). При взаимодействии такого зонда с поверхностью сила, действующая на иглу со стороны поверхности, заставляет консоль изгибаться. Регистрируя величину этого изгиба, можно оценить силу взаимодействия зонда с поверхностью [70], а, следовательно, получить изображение ее рельефа (топографию).

Рисунок 1.3.1 – Электронно-микроскопическое изображение зонда АСМ.

Методики получения информации о свойствах поверхностей с помощью АСМ можно разделить на контактные квазистатические и колебательные [70].

Основной недостаток контактных методик АСМ – жесткое воздействие на образец со стороны зонда, что делает их практически неприменимыми при работе с биологическими образцами из-за их мягкости. Поэтому АСМисследования биологических объектов проводят при помощи колебательных методик.

полуконтактный или прерывисто-контактный режим (tapping и бесконтактный режимы. Общей чертой колебательных методик является то, что кантилевер при сканировании совершает вынужденные колебания на высокой частоте (как правило, от 10 до 300 кГц).

В бесконтактном режиме при подведении колеблющегося с небольшой амплитудой (порядка 1 нм) кантилевера к поверхности на него начинает действовать дополнительная сила притяжения со стороны поверхности. Это вызывает изменения амплитуды и фазы колебаний кантилевера, которые фиксируются прибором.

Регистрация изменений амплитуды и фазы колебаний кантилевера при работе в бесконтактном режиме требует высокой чувствительности и стабильности работы петли обратной связи. На практике чаще используется полуконтактный режим работы АСМ. При работе в этом режиме возбуждаются вынужденные колебания кантилевера вблизи резонансной частоты с амплитудой порядка 10-100 нм. Кантилевер подводится к поверхности таким образом, что в нижней точке колебаний зонд касается поверхности.

Основным преимуществом полуконтактного режима при исследовании биологических образцов, в частности белков, является то, что воздействие зонда на образец менее интенсивное по сравнению с контактным режимом, следовательно, при сканировании зонд не разрушает структуру белков и не нарушает их контакта с поверхностью в случае слабой иммобилизации.

Методы АСМ позволяют получить как данные по структурным особенностям белка, так и его компонентов в условиях, близких к нативным.

Этот метод находит все большее применение и позволяет визуализировать отдельные белки и их комплексы. С его помощью были визуализированы белки и их комплексы в цитохром CYP101 (P450cam), CYP11A1 (P450scc), CYP2B (P450 2B4)-содержащих системах [71, 72, 73], а также и в других системах [74, 75].

АСМ позволяет определить высоту белка с высокой точностью (~0,1 нм), сравнимой с разрешением рентгеноструктурного анализа (РСА) [76]. Это позволяет определять высоту белка с использованием стандартных зондов с радиусом кривизны иглы r~(10-20) нм. В то же время латеральное разрешение определяется уширением от АСМ-зонда и составляет порядка 20-50 нм для стандартного зонда[77] (рис. 1.3.2).

Рисунок 1.3.2 – Влияние радиуса кривизны иглы кантилевера на 1 – начальное положение острия иглы, описывающей объект; 2 – конечное положение острия иглы; 3 – исследуемый объект; d – реальный диаметр объекта; dкаж - кажущийся диаметр объекта.

В то же время информация о латеральных размерах белков имеет не меньшее значение, чем данные о высоте белковой молекулы. Проблему завышения измеряемого объема белковых молекул можно решить за счет понижения подвижности изолированных белков на подложке под действием сканирующего зонда и за счет уменьшения радиуса кривизны зонда.

Для получения качественного изображения белка обычно предлагаются разные схемы уменьшения мобильности белка на подложке, например, с использованием криотехнологии [78]. Описываются также подходы по снижению мобильности белка при организации белка в плотные упорядоченные структуры в виде пленки без использования криотехнологии [79]. Другой путь понижения подвижности белка на подложке при комнатной температуре связан с переходом измерений из жидкости в воздух. При этом качественные изображения белка удавалось получать при удалении влияния адсорбированной воды при измерениях на воздухе, которая наблюдается при влажности более 45% [80].

При использовании сверхтонкого АСМ-зонда с радиусом кривизны r~(1нм латеральное разрешение составляет порядка 2-5 нм [77], а измеряемый объем белка более близок к данным РСА по сравнению с измеренным стандартным зондом, хотя высота изображения белка существенно занижается [81]. Более точная оценка объема белка, измеренного сверхтонким зондом по сравнению со стандартным, дает представление о формируемых комплексах, в том числе и о степени олигомеризации исследуемого белка. Так, в работах был использован подход по определению олигомерного состояния белков при измерении объемов белковых комплексов при удалении слоя адсорбированной воды в вакууме.

Таким образом, с использованием стандартных зондов в различных условиях можно оценить соотношение мономеров и олигомеров белков, а с использованием сверхтонких зондов – уточнить степень олигомеризации белка.

ферментов Как было отмечено ранее, преимуществами АСМ является возможность при сканировании контролировать прикладываемые силы с высокой точностью и проводить мониторинг объектов на молекулярном уровне. Ферменты же являются многообещающей системой для наблюдения за движением отдельных молекул белка, т.к. большинство из них претерпевают конформационные изменения во время каталитической реакции. Таким образом, АСМ открывает возможность мониторинга функционирования единичных молекул фермента в жидкой среде.

Ранее такой подход использовался в работах [82-84], где проводились наблюдения за флуктуациями высоты белков в процессе их каталитической активности. В работе [82] проводилось наблюдение за флуктуациями высоты молекул белка лизоцима (17 кДа, 4,53,03,0 нм), адсорбированного на слюде, с помощью АСМ в полуконтактном режиме в буфере. Были получены зависимости изменения высоты от времени, когда АСМ игла устанавливалась на монослое лизоцима без сканирования, в различных условиях окружающей среды: в буфере, в присутствии субстрата и ингибитора. В присутствии субстрата (олигосахарида) наблюдались колебания высоты амплитудой 1 нм и периодом 50 мс. В присутствии ингибитора эти флуктуации снижались до уровня, когда субстрат еще не добавлен. Интерпретация полученных результатов состоит в том, что флуктуации высоты соответствуют конформационным изменениям лизоцима во время гидролиза. Также возможно, что флуктуации высоты частично являются результатом разницы в высоте и эластичности переходного комплекса лизоцим-субстрат.

Аналогичный подход использовался и в работах [83, 84], где исследовали колебания антител IgG, а также работу фермента хитозаназы. В последней работе [84] АСМ-зонд устанавливался на вершине молекулы, и записывались траектории флуктуации вершины молекулы длительностью 0,2 с. Такие траектории были получены в чистом буфере, в присутствии субстрата (хитозан) и в присутствии двухвалентных ионов металла в качестве ингибиторов (Cu2+, Mn2+ и Zn2+). Флуктуации, полученные на слюде, не изменялись при изменении состава буферной смеси и имели величину 0,2 нм с длительность менее 3 мс, а также случайное распределение, эти значения могут быть связаны с термо- и электронным шумами установки. Траектории флуктуации неактивного фермента помимо аналогичного шума имели всплески высотой 0,2 нм и длительностью 15-20 мс. При добавлении субстрата на траекториях появлялись дополнительные всплески с амплитудой 0,4 нм и длительностью 2-8 мс, частота всплесков была 100-150 с-1. Эти события связывали с активностью фермента, так как заявленная активность, определенная стандартными методами составляла 120 с-1. После добавления Cu2+ фермент полностью терял свою активность, т.к. не наблюдалось характерных всплесков. Mn2+ и Zn2+ только частично уменьшили флуктуации фермента: в присутствии Mn 2+ высота всплесков была также 0,4 нм, но период 20-50 мс и скорость 20-25 с-1. В присутствии Zn2+ высота всплесков была 0,3 нм c периодом 20-50 мс, кроме этого, всплески были невыраженными. Также было проведено сравнение среднеквадратичного отклонения по высоте на полученных траекториях ( отдельных неактивных и 18 отдельных активных молекул фермента). Было показано, что в активном состоянии значение среднеквадратичного отклонения (RMS) составило 0,2 нм (0,12 нм на слюде) против 0,13 нм в неактивном состоянии. При добавлении двухвалентных ионов Cu2+, Mn2+ и Zn2+ значение RMS упало до 0,13, 0,15 и 0,15 нм, соответственно.

В работе [85] с помощью АСМ исследовались функциональные изменения адсорбированного на слюде фибриногена по измерению силы диссоциации антиген-антитела. Для этого проводились АСМ-измерения в режиме силовой спектроскопии АСМ-зондами, функционализированными моноклональными антителами, распознающими участок 392-411 фибриногена, тогда как фибриноген был на подложке.

Таким образом, АСМ может быть использован для непосредственного наблюдения за поведением единичных молекул фермента BM3, а не измеряя значение активности, усредненное для ансамбля большого количества молекул фермента, как это делалось в работах, где использовались спектральные и радиоактивные методы [20, 27, 28, 29]. АСМ-измерение активности BM3 в данной диссертационной работе также основывалось на мониторинге увеличения амплитуды флуктуаций высоты фермента в процессе каталитического цикла.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Использованные реактивы и материалы Для приготовления всех необходимых растворов использовалась дистиллированная вода, дополнительно очищенная на деионизующей установке Milli-Q (“Millipore”, США).

Использовались следующие реактивы: 10мМ фосфатно-солевой буфер (PBSD) pH 7,4, содержащий 8 мМ NaH2PO4, 2 мМ KH2PO4, 140 мМ NaCl, 10 мМ KCl (“Pierce”, США); натриевая соль лауриновой кислоты (“Sigma”, США);

восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH, “Sigma”);

1-фенилимидазол (“Sigma”); стандарт гидроксилауриновой кислоты чистотой 99,0% (“SynFine Research”, Канада). Для проведения масс-спектрометрических измерений, сопряженных с высокоэффективной жидкостной хроматографией использовались: ацетонитрил и изопропанол чистотой 99,9% (“Acros Organics”, США), ацетат аммония (“Sigma”, США), ледяная уксусная кислота чистотой 99,8% и гидроксид аммония (“Fluka”, США).

“мусковит” (muscovite grade V-4) в пластинах размером 25 75 мм фирмы “SPI” (США).

отфильтрованы на микрофильтраторах Amicon Ultra (“Millipore”, США) с порами, задерживающими молекулы более 3 кДа.

2.2 Характеристика исследуемого белка Рекомбинантный белок цитохром P450 BM3 был любезно предоставлен экспрессирован согласно [7]. Концентрация исходного раствора составляла 0, мМ (33,3 мг/мл) в 50 мМ калий-фосфатном буфере pH 7.4.

В экспериментах раздела 3.3 был использован рекомбинантный белок цитохром P450 BM3, любезно предоставленный д.б.н. В.Г. Згодой (ФГБУ “ИБМХ” РАМН) и экспрессированный согласно [86]. Концентрация исходного раствора составляла 39 мкМ (4,6 мг/мл) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 8,0, содержащем 1 мМ DTT, 1 мМ EDTA и 20% глицерина.

Концентрация очищенного BM3 определялась по содержанию гемового железа на спектрофотометре Agilent Model 8453 (США) при 25C в соответствии с методом, описанным Omura и Sato [87]. Активность фермента в растворе контролировалась с использованием масс-спектрометрического анализа.

2.3 Методика приготовления образцов для АСМ-измерений Иммобилизация BM3 осуществлялась за счет нековалентной адсорбции молекул на АСМ-подложку, в качестве которой использовалась свежесколотая слюда. Для этого 2 мкл 0,5 мкМ раствора BM3 в 10 мМ PBSD буфере pH 7, (температура раствора 4-10oC, если не оговорено другое) наносились на поверхность АСМ-подложки. После 3 мин инкубации образец промывали деионизованной водой.

В случае проведения дальнейших АСМ-измерений в воздухе или в вакууме образец высушивали в потоке азота, а в случае проведения АСМизмерений в жидкости его помещали в жидкостную ячейку АСМ, содержащую 2,5 мМ PBSD буфера pH 7,3-7,35. Невысокая концентрация PBSD буфера была выбрана для уменьшения влияния осаждения солей на поверхность слюды [83].

стандартных и сверхтонких зондов мультимодовом АСМ NTEGRA Aura (НТ-МДТ, Россия) и на АСМ Dimension 3100 (Bruker, США) в жидкости, воздухе и в вакууме с использованием стандартного и сверхтонкого зондов. Скорость сканирования 13 Гц. В каждом эксперименте было получено не менее 10 кадров, каждый эксперимент был проведен не менее 3 раз.

иммобилизованным белком помещалась в раствор 2,5 мМ PBSD, pH 7,4 при 22оС. АСМ-измерения в воздухе проводились в условиях относительной влажности (RH) около 60% при 22оС, при этом предполагалось, что в условиях такой влажности белок сохраняет свою нативную структуру благодаря наличию слоя адсорбированной воды [80]. Для проведения АСМ-измерений в вакууме подложка с иммобилизованным белком была помещена в вакуумную камеру АСМ. Перед проведением измерений камера вакуумировалась до остаточного давления 10-2 Торр.

АСМ-измерения в жидкости были проведены зондами DNP-S10 (радиус кривизны (r) 10–20 нм, жесткость 0,32–0,58 Н/м, Bruker, США). Для измерений в воздухе и в вакууме использовалось 2 типа зондов стандартной кривизны:

NSG10 (r ~ 10–15 нм, жесткость ~12 Н/м, НТ-МДТ, Россия) и PPP-NCH (r ~ 10 нм, жесткость ~ 42 Н/м, Nanosensors, Швейцария), а также сверхтонкие АСМ-зонды NSG01_DLC (r ~ 1–3 нм, жесткость 2,5–10 Н/м, НТ-МДТ, Россия).

Радиус кривизны зондов контролировался на электронном микроскопе Hitachi 5500 (Япония).

Контроль чистоты растворов, используемых в АСМ-экспериментах.

Чистота используемых в экспериментах растворов была проконтролирована с помощью АСМ: раствор наносился на подложку из свежесколотой слюды на несколько минут, затем капля смывалась водой, и подложка высушивалась в потоке азота и сканировалась на АСМ в воздухе в стандартном полуконтактном режиме. В таких экспериментах контроля чистоты используемых растворов размер неспецифических объектов не превышал по высоте 0,5 нм, а их число не превышало 5-10 объектов на кадр 55 мкм2.

2.4.1 Обработка АСМ-изображений Обработка АСМ-данных и измерение высот визуализированных объектов производилась при помощи программного обеспечения для обработки данных АСМ «AFMdtpr» (ФГБУ «ИБМХ» РАМН).

Обычно, в растворах белков, несмотря на высокую очистку, присутствует загрязнение, формирующее пленку на слюде. Высота этой пленки в наших экспериментах в воздухе была (1,0±0,1) нм, в вакууме (0,4±0,1) нм, а в буфере – (2,0±0,1) нм. Этот факт учитывался при получении распределений изображений объектов по высотам (или по высотам и объемам) за счет введения уровня отсечения, который составил 1,2 нм в воздухе, 0,5 нм в вакууме и 2,2 нм в соответствующих максимумов распределения (h) их изображений по размерам по соотношению:

где Nh – это число визуализированных белков с высотой h, а N – это общее зависимости (2.4.1а) проводилась с помощью функции Гауссиана:

где A, hc, w – варьируемые при аппроксимации параметры. В этом случае положение максимума распределения объектов по высотам рассчитывалось как максимум аппроксимирующей функции (2.4.1б) для каждого распределения.

Анализ аппроксимации экспериментальных распределений (h) основан на критерии 2. Если эта кривая хорошо аппроксимировалась одной экспонентой, то i=1, в другом случае кривая аппроксимировалась суммой двух экспонент, а полученные АСМ-изображения визуализированных объектов разделялись на две группы с соответствующими максимумами hmax1 и hmax2.

Сверхтонкий АСМ-зонд использовался для измерения объема белка и его агрегатов [81]. Для анализа размеров изображений BM3, полученных сверхтонким зондом, использовалось распределение по высотам и объемам (h,V):

где Nh,V – это число визуализированных белков с высотой h и объемом V.

2.5 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента АСМ-мониторинг колебаний высоты молекул BM3 был проведен в полуконтактном режиме на АСМ Dimension 3100 (Bruker, США) в жидкости зондами DNP-S10 (r ~ 10–20 нм, жесткость 0,32–0,58 Н/м, Bruker, США).

Температура в жидкостной ячейке объемом 4 мл поддерживалась за счет термостатирования окружающей среды. В экспериментах АСМ-мониторинга колебаний высоты отдельных молекул BM3 при разных температурах значения температура в жидкостной ячейке (далее – в ячейке) устанавливалась в диапазоне 16–26oC и контролировалась термопарой (точность измерений 0,1 оС). Каждый АСМ-эксперимент с полным каталитическим циклом для каждого значения температуры был проведен не менее 2 раз.

Колебания высоты отдельных молекул BM3 регистрировались на каждом этапе каталитического цикла фермента в процессе гидроксилирования лауриновой кислоты c использованием адаптированного метода, описанного в работе [82]. АСМ-измерения проводились на следующих последовательных этапах каталитического цикла: (1 этап) в буфере (2,5 мМ PBSD, pH 7,4); (2 этап) в присутствии субстрата (500 мкМ лауриновой кислоты); (3 этап) в присутствии донора электронов, который запускал реакцию гидроксилирования (200 мкМ NADPH); (4 этап) в присутствии ингибитора фермента, который останавливал реакцию (5 мМ 1-фенилимидазола). Измерения на 2-4 этапах проводились через 5- каталитической системы в ячейку. Эта временная задержка необходима для установления стабильного режима АСМ-измерений после гидродинамического возмущения среды при добавлении раствора и перемешивания.

Для проведения АСМ-мониторинга колебаний высоты отдельных молекул фермента АСМ-подложка с иммобилизованным BM3 помещалась в ячейку. Область сканирования выбиралась так, чтобы в АСМ-кадре находилось 1-3 молекулы фермента, за которыми удобно вести наблюдение. Пример такой области приведен на рисунке 2.5.1 А. Площадь кадров варьировалась от 0,20,2 мкм2 до 11 мкм2, число точек на кадре варьировалось от 128 до 256.

Затем запускалось повторное сканирование этого же кадра, и в тот момент, когда оно доходило до середины выбранной молекулы, отключалось сканирование по медленной оси Oy (рис. 2.5.1 Б). Таким образом, получалось изображение сечения выбранной молекулы во временной развертке (рис. 2.5.1 В). Частота сканирования устанавливалась максимально возможной для данного АСМ-прибора, чтобы получить качественное АСМ-изображение ( – 1,3 Гц).

Рисунок 2.5.1 – АСМ-изображения BM3 в жидкости. А) Стандартный полуконтактный режим получения топографии. Б) Режим сканирования сечений молекул «снизу-вверх» путем отключения сканирования по медленной оси Oy, стрелкой указан момент переключения в этот режим.

В) Трехмерное АСМ-изображение сечения молекул, вырезанное из кадра (Б), то есть временная развертка одной линии сечения топографии.

На каждом из четырех этапах проводилась регистрация АСМизображений сечений не менее 10 разных молекул фермента.

Обработка АСМ-изображений сечений молекул BM3. Полученные АСМкадры сечений молекул BM3 выравнивались в программном обеспечении микроскопа Nanoscope (версия V613r1) с помощью встроенной стандартной функции вычитания поверхности и экспортировались в текстовом формате ASCII для дальнейшей обработки. Для последующей обработки экспортированных таким образом изображений сечений молекул была написана программа «RMS-IBMC». В ней была реализована возможность из АСМ-изображения сечения отдельной молекулы BM3 (рис. 2.5.2 А) получить траекторию колебаний максимума высоты этой молекулы во времени hmax(t). В параметрах программы при открытии АСМ-кадра необходимо задать значение скорости сканирования (в герцах) и количество точек в кадре (по оси Ox).

Впоследствии нужно задать значение следующих диапазонов (в точках):

диапазон по оси Ox, в котором определяется максимальное значение высоты, и диапазон по оси Oy, который задает длину траектории (границы диапазонов – синие и красные линии на рисунке 2.5.2 А, соответственно). С помощью полос прокрутки выбранные диапазоны можно передвигать по изображению.

Найденная таким образом для каждой молекулы траектория hmax(t) сохраняется в текстовом файле для дальнейшей математической обработки.

Рисунок 2.5.2 – Обработка АСМ-сечений молекул BM3.

А) Окно программы «RMS-IBMC» с АСМ-изображением сечения молекулы BM3. Размеры кадра 11 мкм2, 128 точек. Желтая линия – траектория hmax(t), точки которой являются максимумами высоты в выбранном диапазоне по оси Ox (границы диапазона – синие линии). Красные линии определяют длину выбранной траектории.

Б) Пример зависимости колебаний высоты молекулы BM3 после проведения линейной аппроксимации исходной траектории hmax(t). Время наблюдения за данной молекулой t = 30 с, количество точек на траектории n=31 точка, амплитуда колебаний молекулы, вычисленная по формуле (2.5.1), Полученная траектория hmax(t) называлась также зависимостью колебаний высоты отдельной молекулы от времени. Чтобы сравнивать траектории разных молекул, для каждой из них была проведена линейная аппроксимация. После этого действия траекторию h(t) графически удобно представлять как колебания относительно оси Ox (рис. 2.5.2 Б). Из траектории h(t) вычислялась ABM3 – амплитуда колебаний высоты для отдельной молекулы BM3 за промежуток времени наблюдения за молекулой t:

где hi – колебание высоты в i-й момент времени, n – число точек на траектории. Значение t выбиралось, как усредненное значение по всему массиву записанных траекторий для удобства сравнения амплитуды колебаний разных молекул, и составляло от 15 до 30 с.

Среднее значение амплитуды колебаний молекул BM3 BM3 оценивалось усреднением значений ABM3 отдельных молекул. Значения BM3 для каждого этапа каталитического цикла фермента были получены усреднением значений ABM3 не менее 10 молекул. Разностная величина средних значений амплитуды колебаний активного фермента (BM3active, 3 этап каталитического цикла) и неактивного фермента (BM3resting, 2 этап каталитического цикла) оценивалась как:

Аналогично оценивалось значение ABM3 для единичной молекулы как ABM3 = ABM3active – BM3resting.

содержащего иммобилизованные объекты. Траектории колебаний высоты слюды hmica(t) на АСМ-изображениях сечений (пример АСМ-изображения сечений представлен на рисунке 2.5.1 Б) получали следующим образом. В программе Nanoscope рядом с целевыми молекулами фермента на АСМ-кадрах проводились сечения на слюде (по 1-3 сечения на каждый кадр), которые экспортировались в текстовом формате, а затем математически обрабатывались аналогично траекториям молекул hmax(t). Таким образом, в каждом кадре впоследствии усреднялись – mica – для данного этапа каталитического цикла. В случае объективно высоких значений Amica такой кадр исключался из дальнейшего рассмотрения.

Погрешность измерений для средних значений амплитуды колебаний t /( n( n 1)), где i – отклонение результата каждого опыта от среднего значения, n – число опытов в серии, t – коэффициент Стьюдента.

2.6 Дополнительные методы 2.6.1 Масс-спектрометрический анализ Для контроля активности нековалентно иммобилизованного на слюду BM3 проводился масс-спектрометрический (МС) анализ наличия продукта каталитической реакции BM3 в процессе АСМ-мониторинга колебаний высоты отдельных молекул фермента. После проведения АСМ-измерений (раздел 2.5) каталитической реакции гидроксилирования, то есть осуществлялась МСидентификация гидроксилауриновой кислоты [88].

Аналогично контролировалась активность BM3, свободно плавающего в растворе. В этом случае концентрация фермента составляла 10-11 М, что сравнимо с количеством фермента на подложке. Концентрация субстрата лауриновой кислоты (500 мкМ) и NADPH (200 мкМ) были такими же, как в АСМ-экспериментах. Реакция останавливалась через час ингибитором 1фенилимидазолом (5 мМ). После этого также проводился МС-анализ реакционной смеси на наличие продукта каталитической реакции.

МС-измерения были выполнены совместно с лабораторией системной биологии под руководством д.б.н. Згоды В.Г.

проводились на жидкостном хроматографе Agilent 1200, сопряженным c масс-селективным детектором на основе трех квадруполей Agilent (США) и оснащенным автоматической системой ввода пробы в режиме термостатирования при 7оС.

Образец реакционной смеси разбавлялся в 5 мМ растворе ацетата аммония в воде, рН 7,5, затем 1,5 мкл полученного раствора наносились на хроматографическую аналитическую колонку Zorbax SB C18 (Agilent), 4,6 150 мм, с размером частиц 5 мкм. Промывочный раствор содержал 5 мМ раствор ацетата аммония в воде, 50% ацетонитрила, 45% изопропанола, рН 7,5. Для смыва образца с колонки использовался линейный градиент 5этого раствора в течение 35 мин. Напряжение на капилляре составляло -1970 В, скорость осушающего газа (азота) 4,5 л/мин при температуре 280°С.

МС-регистрация наработки гидроксилауриновой кислоты проводилась в режиме отрицательной полярности. Параметры МС-измерений были оптимизированы с помощью стандарта гидроксилауриновой кислоты в режиме регистрации отдельных ионов (SIM, табл. 2.6.1). Каждое измерение проводилось в трех технических повторах.

Результаты измерений обрабатывались с использованием программного обеспечения Mass Hunter Qualitative Analysis, версия В2.0.

Таблица 2.6.1 – Параметры измерения гидроксилауриновой кислоты в режиме SIM.

2.6.2 Фотонная корреляционная спектроскопия Измерения методом фотонной корреляционной спектроскопии (PCS) проводились на корреляционном спектрометре N5 Submicron Particle Size Analyzer (Beckman Coulter, Inc) при угле рассеивания 90°. 5 мкМ раствор BM3 в 50 мМ Na-фосфатном буфере (1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 20% глицерин, pH 8) помещали в измерительную кювету PCS-анализатора. Выбор высокой концентрации белка (5 мкМ) был обусловлен тем, что интенсивность рассеянного света при этой концентрации была выше порога чувствительности, равного 5*104 единиц. Время сбора сигнала при измерениях составило 200 с.

Калибровка корреляционного спектрометра проводилась по цитохрому с диаметром 5,5 нм [89] и латексным калибраторам (Beckman Coulter, Inc) диаметром 40 нм, 50 нм, 150 нм and 500 нм. В этом диапазоне размеров измеренные характеристики соответствовали номинальным значениям калибраторов со среднеквадратичным отклонением 10%.

Для оценки размеров молекул BM3 из данных PCS-измерений использовались две следующие модели.

Модель компактного глобулярного белка (модель 1). Радиус Стокса (R) и объем (V) белка в этом случае можно представить в виде:

где Mr – молекулярная масса мономера белка в кДа [90], n – степень олигомеризации, то есть количество мономеров в олигомере белка, и Vn – объем соответствующего олигомера.

Эллиптическая модель (модель 2). В этой модели форма молекулы представляется эллипсоидом. Радиус Стокса и объем молекулы в этом случае будут выражаться следующим образом [91]:

где R – стоксовский радиус эллипсоида, a,b,c – полуоси эллипсоида (для упрощения оценочных расчетов в дальнейшем под a принималось значение большей полуоси), n – степень олигомеризации белка и Vn – объем соответствующего олигомера.

2.7 Методика АСМ-мониторинга температурной денатурации BM Растворы белка для иммобилизации, АСМ-подложка и буфер для промывки предварительно термостатировались при заданной температуре ТС (10, 17, 22, 30, 35, 48, 56, 60С) следующим образом: раствор белка и буфер выдерживались в термошейкере (20 мин, Thermomixer comfort, Eppendorf);

АСМ-подложка выдерживалась в термошейкере (для 17C Т 60C, 20мин, Thermoshake Gerhardt) или в холодильнике (только для Т=10С, Атлант, Белоруссия).

АСМ-измерения в жидкости проводились для образцов, приготовленных и визуализированных при 10, 17, 22, 30C. Для этих исследований образцы готовились следующим образом. Раствор белка (4 мкл, 0,18 мкМ, 10 мМ PBSD, pH 7,4, TC) наносился на поверхность АСМ-подложки и инкубировался (3 мин, TC). Далее поверхность АСМ-подложки промывалась буфером (10 мМ PBSD, pH 7,4, TC). Влажная АСМ-подложка с BM3 сразу помещалась в термостатируемую жидкостную ячейку АСМ, содержащую буфер (2,5 мМ PBSD, pH 7,4, ТC). АСМ-сканирование проводилось на АСМ NTEGRA Vita (НТ-МДТ, Россия) с использованием зондов DNP-S10 (r ~ 10–20 нм, жесткость 0,32–0,58 Н/м, Bruker, США).

АСМ-измерения в воздухе проводились в двух сериях экспериментов.

В первой группе экспериментов (серия 1, «нагретые в растворе») исследовались образцы белка, приготовленные и выдержанные в растворе при заданной температуре TC (30, 35, 48, 56, 60C) в течение 20 мин, после чего проводилась иммобилизация на поверхности АСМ-подложки и стандартная АСМ-визуализация при 22C и RH ~ 60%.

Во второй экспериментальной серии (серия 2, «нагретые на подложке») исследовались образцы раствора белка, приготовленные и иммобилизованные на АСМ-подложку при 10C, но далее АСМ-подложка с иммобилизованным белком нагревался в воздухе на термостолике SU045NTF (НТ-МДТ, Россия) до заданной температуры TC и выдерживался при этой температуре в течение 20 мин, после чего проводилась АСМ-визуализация при 22C и RH ~ 60%.

Для всех измерений в воздухе BM3 фиксировался на АСМ-подложке следующим образом. Раствор белка (2 мкл, 0,5 мкМ, 10 мМ PBSD, pH 7,4, TC) наносился на поверхность АСМ-подложки и инкубировался (3 мин, TC). Далее поверхность АСМ-подложки промывалась деионизованной водой (TC) и высушивалась в потоке азота.

АСМ-сканирование в воздухе проводилось на АСМ Dimension 3100 с использованием зондов PPP-NCHR (r ~ 10 нм, жесткость ~ 42 Н/м, Nanosensors, Швейцария).

АСМ-сканирование в воздухе и в жидкости, а также обработка полученных АСМ-изображений проводились аналогичными методами, описанными в разделе 2.4. В случае анализа АСМ-изображений использовалась двухэкспоненциальная функция, позволившая хорошо аппроксимировать экспериментальные зависимости (h) и разделить полученные АСМизображения на две группы с соответствующими максимумами высот hmax1 и hmax2.

2.8 Флуоресцентный анализ флуоресцентном спектрометре LS55 (Perkin Elmer, США). Длина волны возбуждения составляла 280 нм, а диапазон спектра излучения – 290-600 нм.

Спектральная ширина щелей спектрометра составила 4,5 нм для линий возбуждения и излучения.

Измерения проводились в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см и объемом 3 мл. Концентрация BM3 была C=10-7M в 10 мМ PBSD буфере, pH 7,4. Температура в кювете поддерживалась с помощью термостата Haake DC1 (Fisons Scientific Equipment, UK). Измерения проводились через 2 мин после достижения заданной температуры в термостате. Спектры были сняты в следующем температурном диапазоне: от 10C до 40C с шагом 2C, от 40C до 60C с шагом 5C. Измерения раствора BM3, нагретого до 33C, а затем нагревания», проводились следующим образом: после нагревания кювета с раствором белка охлаждалась с помощью дополнительной секции водноледяной бани, встроенной в термостат.

Анализ спектров флуоресценции. Для каждой заданной температуры на спектре флуоресценции был найден максимум в диапазонах 320-360 нм и 520нм, что соответствует излучению ароматических и флавиновых хромофорных групп BM3, соответственно. Для этого экспериментально экспоненциальной функцией:

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 АСМ-визуализация и определение олигомерного состояния BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов 3.1.1 Исследование олигомерного состояния BM3 методом фотонной корреляционной спектроскопии Фотонная корреляционная спектроскопия (PCS) относится к методам, позволяющим определять распределение биомолекул по размерам непосредственно в жидкости [92]. Данный метод основан на определении коэффициента диффузии частиц в растворе по характерной частоте флуктуаций интенсивности рассеянного на этих частицах света, далее из коэффициента диффузии рассчитывается радиус частиц.

В нашей работе метод PCS был использован как дополнительный метод для определения олигомерного состояния BM3. В результате было показано, что в растворе присутствуют объекты с характерным гидродинамическим диаметром, равным 13±7 нм (табл. 3.1.1). Белок в PCS-измерениях находился в буфере, содержащем 20% (v/v) глицерина (глицерин необходим для хранения белка при ­80°С). Вязкость такой среды в два раза больше вязкости буфера без глицерина, поэтому необходимо пересчитать гидродинамический диаметр объектов, полученный методом PCS, согласно зависимости определяемого диаметра частиц от вязкости раствора (уравнение Эйнштейна-Стокса). В результате, скорректированное значение диаметра молекул белка составило (7±4) нм. Сравним полученное значение с радиусом Стокса BM3, оцененного из модели компактного глобулярного белка и из эллиптической модели. А именно, так как трехмерная структура полноразмерного белка неизвестна, то из общих соображений форму этого белка можно представить в виде 1) сферической глобулярной структуры или 2) эллипсоида, как описано в разделе 2.6.2.

корреляционной спектроскопии: диаметр молекул BM3 и доля таких объектов в растворе. Было проведено 7 измерений для подтверждения стабильности измерений во времени. Измерения № 1-2 были проведены в начале эксперимента. Измерения № 4-6 были проведены через 1 час после начала эксперимента. Измерения №7-8 были проведены через 1,5 часа после начала эксперимента. Экспериментальные условия указаны в разделе 2.6.2.

Рассмотрим модель компактного глобулярного белка. Диаметр мономера (удвоенный радиус Стокса) белка такой формы, вычисленный из его массы по формуле (2.6.2а), составит D8 нм, а его объем, вычисленный по формуле (2.6.2б), V1265 нм3. Диаметры и объемы димеров и тримеров, рассчитанные также по формулам (2.6.2а) и (2.6.2б), составят 10 и 11,5 нм, 530 и 795 нм3, соответственно. Таким образом, диаметры объектов в PCS-измерениях, олигомерным состояния белка от мономеров до тримеров.

эллипсоида необходимо знать размеры его полуосей. Эти размеры можно последовательности ВМ3 составляет 1049 а.о. (UniProtKB: P14779), в том числе 458 а.о. гемового домена и 191 а.о. FMN-домена (PDB ID: 1BVY) [5].

Следовательно, длина аминокислотной последовательности FAD-домена составляет 400 а.о. То есть линейные размеры FAD-домена приблизительно равны линейным размерам гемового домена (6,2 х 6,9 х 4,0 нм), найденными из модели базы PDB. Из [5] оценим размеры гемового домена, связанного с FMNдоменом: (6,2 6,9 8,5) нм. Если добавить к нему FAD-домен, то линейные (6,2 6,9 (4,0+8,5~12,0)) нм, которые и будут использованы в дальнейших расчетах оценки радиуса Стокса по формуле (2.6.2в). Для упрощения оценочных расчетов возьмем 2а=12 нм, 2b=2c=(6,2+6,9)/2=6,6 нм. В этом случае диаметр мономера, рассчитанный по формуле (2.6.2в), должен составлять ~ 8 нм, как и в случае модели глобулярного белка, а объем мономера, рассчитанный по формуле (2.6.2г) – 274 нм3. Диаметры и объемы димеров (а=6,6 нм, b=3,3 нм, c=6 нм) и тримеров (а=7,1 нм, b=7,1 нм, c=6 нм), рассчитанные по формулам (2.6.2в) и (2.6.2г), составят 9,8 и 13,3 нм, 547 и нм3, соответственно. Диаметр тримера соответствует значению ~14 нм.

Следовательно, измеренные методом PCS диаметры объектов, лежащие в диапазоне от (7-4=3) нм до (7+4=11) нм, соответствуют объектам от мономеров до тримеров.

Таким образом, значение (7±4) нм гидродинамического диаметра BM3, измеренного методом PCS, соответствует состоянию белка от мономеров до тримеров с максимумом, соответствующим мономеру. Но разрешение этого метода не позволяет определить стехиометрическое соотношение между мономерами, димерами и тримерами. Поэтому для уточнения олигомерного состояния BM3 был использован метод АСМ.

3.1.2 АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов Качественные АСМ-изображения белков можно получить при условии их хорошей адгезии на АСМ-подложке [80], которая сильно зависит от того в каких условиях – в вакууме, в воздухе или в жидкости – проводятся измерения.

Это особенно критично при определении олигомерного состояния белков.

Поэтому АСМ-эксперименты по визуализации BM3, нековалентно адсорбированного на слюде, были проведены в жидкости, в воздухе и в вакууме для сравнения. АСМ-изображения BM3 были получены стандартными зондами в жидкости (рис. 3.1.1 A), в воздухе (рис. 3.1.1 Б; рис. 3.1.2 A) и в вакууме (рис. 3.1.2 Б). Так как Dimension 3100 АСМ не позволяет проводить измерения в вакууме в отличие от NTEGRA Aura АСМ, поэтому АСМвизуализация в воздухе была взята как точка пересечения между двумя приборами, а на рисунках 3.1.1 Б и 3.1.2 A приведены оба АСМ-изображения BM3, полученные стандартными зондами в воздухе на этих АСМ.

Соответствующие перечисленным условиям визуализации плотности распределения BM3 на АСМ-изображениях по высотам (h) представлены на рисунках 3.1.1 В и 3.1.2 В.

Рисунок 3.1.1 – АСМ-изображения адсорбированного на слюде BM3, полученные с использованием стандартных зондов, (A) в буфере и (Б) в воздухе; и (В) плотности распределений BM3 по высотам (h), полученные в данных условиях измерений. Экспериментальные условия: полуконтактный режим, Dimension 3100 АСМ, 22oC, (A) 2,5 мМ PBSD буфер, pH 7,4, (Б) воздух, Затем была проведена аппроксимация экспериментальных зависимостей плотностей распределения АСМ-изображений объектов по высотам (h) суммой двух экспонент, представленных функцией (2.4.1б). В таблице 3.1. приведены вклады каждой экспоненты в (h) распределение. Видно, что полученное в буфере распределение (h) (рис. 3.1.1 В) характеризуется суммой двух распределений: распределения 1(h) с высотой hmax1(buf)=2,7±0,1 нм (с полной шириной на полувысоте, Full Width at Half Maximum, FWHM1 =0,7±0, нм), соответствующей максимуму количества визуализированных объектов с этой высотой, и распределения 2(h) с высотой hmax2(buf)=3,5±0,3 нм (FWHM =1,8±0,3 нм), соответствующей максимуму количества визуализированных объектов с такой высотой. Логично предположить, что распределение первого изображений мономеров BM3 по высотам, а второе 2(h) с большим значением высоты hmax2 соответствует распределению олигомеров.

Таблица 3.1.2 – Значения максимума высоты визуализированных объектов hmax, вычисленные по кривым аппроксимации (h) АСМ-изображений BM3, полученными стандартным зондом.

Буфер/Dimension Воздух/ Dimension Воздух/NTEGRA Aura Вакуум/NTEGRA Aura Рисунок 3.1.2 – АСМ-изображения адсорбированного на слюде BM3, полученные с использованием стандартных зондов, (A) в воздухе и (Б) в вакууме; и (В) плотности распределений BM3 по высотам (h), полученные в данных условиях измерений. Экспериментальные условия: полуконтактный режим, АСМ NTEGRA Aura, 22oC, (A) воздух, RH 60%, (Б) вакуум при остаточном давлении в АСМ-камере ~10-2 Торр. (В) () – (h) в воздухе, (– • – АСМ-визуализация с использованием стандартных зондов с радиусом кривизны r ~ 10-15 нм было показано, что белок может находиться как в мономерном, так и в олигомерном состоянии, что согласуется с литературными данными [6]. Но во всех перечисленных выше условиях не удается разрешить, в каких именно олигомерных состояниях находится белок. Для решения этой задачи были использованы сверхтонкие зонды с r ~ 1-3 нм.

3.1.3 АСМ-визуализация BM3 в воздухе и в вакууме с использованием сверхтонких зондов изображения нековалентно адсорбированного BM3 в воздухе и в вакууме. В буфере получить изображения BM3 удовлетворительного качества не удалось, так как под действием сверхтонкого зонда молекулы белка значительно смещаются по поверхности АСМ-подложки. Такой же эффект наблюдался в жидкости и для путидаредоксинредуктазы, адсорбированной на слюде [81].

Подходы, используемые для получения качественного изображения белка, обсуждались в разделе 1.3. В нашей работе олигомерное состояние BM определялось посредством удаления слоя адсорбированной воды в вакууме.

Была проведена АСМ-визуализация BM3 в воздухе и в вакууме с использованием сверхтонких зондов. На рисунке 3.1.3 представлены изображения BM3, полученные такими зондами в воздухе в условиях относительной влажности 60% и в вакууме. Как видно, получено качественное изображение адсорбированных объектов в обоих случаях.

Рисунок 3.1.3 – АСМ-изображения адсорбированного на слюде BM3, полученные с использованием сверхтонких зондов, (A) в воздухе и (Б) в вакууме. Экспериментальные условия были: полуконтактный режим, АСМ NTEGRA Aura, 22oC, (A) воздух, RH 60%, (Б) вакуум, при остаточном Так как по сравнению со стандартными зондами (r~10 нм) латеральное разрешение изображений, полученных сверхтонкими зондами (r~1-2 нм), выше, то появляется возможность рассчитать объемы изображений объектов, соответствующих разным олигомерным состояниям белка. На рисунке 3.1.4 A представлены распределения АСМ-изображений BM3 по высотам (h), полученные в воздухе и вакууме, а на рисунке 3.1.4 Б-В – распределения изображений по высотам и объемам (h, V). Из рисунка 3.1.4 A видно, что в пределах погрешности определения высоты (±0,1 нм) значения высот объектов в воздухе и в вакууме совпадают. В то же время объекты, соответствующие распределениям по высотам и объемам (h, V), рассчитанные с использованием (2.4.1в), условно можно разбить на 4 группы (табл. 3.1.3):

1) объекты с минимальным объемом 50±10 нм3 и максимумом высоты hmax1= 0,7±0,1 нм соответствуют мономерам;

2) объекты с удвоенным значением объема 100±10 нм3 и максимумом высоты hmax2= 0,9±0,1 нм – димерам;

3) объекты с утроенным значением объема 150±20 нм3 и максимумом высоты hmax3= 1,0±0,1 нм – тримерам;

4) объекты с большими объемами – агрегатам более высокого порядка и т.д.

Таблица 3.1.3 – Значения максимума высоты визуализированных объектов hmax и соответствующие объемы V, вычисленные по кривым аппроксимации (h,V) АСМ-изображений BM3, полученными с использованием сверхтонкого зонда.

Рисунок 3.1.4 – Плотность распределения АСМ-изображений BM3 (А) по высотам (h) и (Б, В) по высотам и объемам (h,V). (A) () – (h) в воздухе, RH (Б) (h,V) в воздухе, RH 60%. (В) (h,V) в вакууме, P~10-2 Торр.

3.1.4 Определение олигомерного состояния BM3 из данных АСМэкспериментов Рассмотрим результаты АСМ-визуализации стандартными зондами, просуммированные в таблице 3.1.2. Соотношение между мономерами и олигомерами в растворе, измеренное на АСМ Dimension 3100, составило = (0,5±0,1):(0,5±0,1). При измерении в воздухе на том же приборе получено = (0,4±0,1):(0,6±0,1). Как уже было отмечено ранее, АСМ Dimension 3100 не позволяет проводить измерения в вакууме, поэтому для получения изображения в этих условиях использовали АСМ NTEGRA Aura. Значения, полученные на АСМ NTEGRA Aura в воздухе и вакууме, составили = (0,6±0,1):(0,4±0,1) и = (0,7±0,1):(0,3±0,1), соответственно.

Таким образом, молекулы белка в растворе находятся, как в виде мономеров, так и в виде олигомеров примерно в одинаковом соотношении. Из сравнения высот мономеров видно, что высоты белка незначительно изменяются при переходе измерений из воздуха в вакуум, что может свидетельствовать о стабильности структуры белка в этих условиях (табл. 3.1.2).

При использовании сверхтонких зондов видно, что высоты всех объектов находятся в пределах 0,6–1,1 нм (табл. 3.1.3), то есть гораздо меньше линейных размеров белка BM3, рассчитанных в разделе 3.1.1: (6,2 6,9 12) нм. Это связано с существенным сжатием молекулы белка под давлением сверхтонкого зонда, что обусловлено высокой локальной эластичностью молекулы. Ранее в работах уже было показано, что для корректного измерения высоты необходимо учитывать взаимоотношение размеров зонда и молекулы белка, а уменьшение размеров зонда приводит к уменьшению взаимодействия между зондом и образцом [93,94]. Поэтому фактически занижение реальной высоты в случае использования сверхтонкого зонда может быть даже больше. В то же время объем молекулы белка также занижен относительно ожидаемого из данных РСА (раздел 3.1.1). Для выяснения причины получения меньших объемов оценим систематическую погрешность измерения объема из-за влияния сверхтонкого зонда. Можно выделить два существенных эффекта, возникающих при использовании сверхтонкого зонда:

а) уменьшение высоты h изображения белка под действием сверхтонкого зонда по сравнению с данными РСА. В случае BM3 это уменьшение составляет hРСА/hАСМ ~ (6/0,7) нм = 8,6 раз;

б) увеличение диаметра молекулы за счет латерального уширения при радиусе кривизны сверхтонкого зонда ~ 2 нм. В нашем случае диаметр (2b+d)/2b = [(6,6+4)/6,6] нм = 1,6 раз и (2a+d)/2a = [(12+4)/12] нм = 1,3 раза, где 2a и 2b – оси эллипсоида. Таким образом, общее занижение объема составляет:

где площади можно вычислить, как SРСА = 2a*2b, SАСМ = (2a+d)*(2b+d), откуда следует, что V = (hРСА/hАСМ)*2b/(2b+d)*2a/(2a+d) = 8,6/1,6/1,3=4. То есть ожидаемый измеренный на АСМ объем мономера BM3 должен быть в раза меньше рассчитанного из данных РСА.

Сравним измеренный объем АСМ-изображений объектов группы (1) – мономеров, представленных в таблице 3.1.3, с объемом мономеров, рассчитанным из данных РСА, 270 нм3. Это сравнение показывает, что объекты группы (1), характеризующиеся объемом 50 нм3 действительно в 5 раз меньше теоретического объема, соответствующего мономерам BM3. Таким образом, можно сделать вывод, что наблюдаемое 5-кратное уменьшение объема белка соответствует предполагаемому значению V. Занижение измеренного объема может быть связано с большим локальным сжатием молекулы белка сверхтонким зондом в ее локальной области, даже не смотря на наблюдаемый эффект латерального уширения, как следует из выражения (3.1.4).

В таблице 3.1.3 представлена степень олигомеризации BM3 в условиях измерений в воздухе и вакууме. Соответствующее соотношение (мономеры:димеры:тримеры:агрегаты более высокого порядка), полученное в воздухе, составило (воздух) = 0,86:0,10:0,04, интегральная доля олигомеров 14%, а в вакууме (вакуум) = 0,53:0,27:0,13:0,07, интегральная доля олигомеров 47%. Интересно сравнить эти данные по соотношению мономеров и олигомеров, полученные сверхтонкой иглой в воздухе и вакууме. Как видно, в воздухе доля мономеров составляет (86 ± 10) %, то есть практически все объекты наблюдаются в виде мономеров. Это может быть связано с тем, что при АСМ-измерении сверхтонким зондом сила, действующая на объекты визуализации в воздухе на порядок больше силы в вакууме при одинаковой амплитуде вынужденных колебаний кантилевера A (что было реализовано в условиях эксперимента). Это может приводить к разбиванию олигомеров на мономеры. Действительно, силу воздействия со стороны сверхтонкого зонда можно оценить по формуле: F ( k A0 A2 ) / 2Q, где k – коэффициент жесткости кантилевера, A0 и A – свободная и вынужденные амплитуды колебаний кантилевера, Q – добротность. Добротность кантилевера в воздухе приблизительно в 10 раз меньше, чем в вакууме, то отсюда следует, что значения силы на порядок больше в воздухе, чем в вакууме при условии одинаковых амплитуд свободных и вынужденных колебаний [95,96].

Из таблиц 3.1.2 и 3.1.3 видно, что доля мономеров, измеренная сверхтонкой иглой в вакууме (53 ± 11) %, примерно равна доле мономеров, измеренной стандартной иглой в жидкости (50 ± 10) % и в воздухе (40 ± 10) %, (60 ± 10) %, то есть можно сделать два вывода.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«УДК 632. 954: 631.417 Анисимова Марина Анатольевна ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ПОЧВ И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ОТНОШЕНИЮ К ГЕРБИЦИДАМ (Специальность 03.00.27-почвоведение) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева кандидат химических наук, старший научный сотрудник И.В. Перминова...»

«Орлова Ольга Геннадьевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА Специальность 03.00.07 - микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.т.н. Медведева Н.Г. Научный консультант : к.б.н.Зайцева Т.Б. Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. Обзор литературы.....»

«Баканев Сергей Викторович Динамика популяции камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) в Баренцевом море (опыт моделирования) Специальность 03.00.18 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор А. В. Коросов Мурманск – 2009 Содержание Введение... Глава 1....»

«КОЗЛОВА Юлия Олеговна РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРЕ- И ПОСТНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРУППЫ СИНДРОМОВ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ МИКРОДЕЛЕЦИЕЙ 22q11.2 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Т.В. Золотухина Москва 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования...»

«Робенкова Татьяна Викторовна ПСИХОТИПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АДАПТАЦИИ СТУДЕНТОВ КОЛЛЕДЖА 03.00.13 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.Н. Васильев Томск - 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ. ВВЕДЕНИЕ..7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 1.1.Современный подход к проблеме адаптации студентов. 1.1.1. Роль стресса в...»

«УДК: 579.846.2[063+22+26](043) НАМСАРАЕВ Зоригто Баирович МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМ. Специальность 03.00.07. – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.М. Горленко МОСКВА – 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика основных типов щелочных гидротерм 1.1.1. Основные типы щелочных гидротерм...»

«Шевченко Сергей Михайлович ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА CERASUS L. В УСЛОВИЯХ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 03.02.01 - ботаника ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор...»

«Лыкшитова Людмила Станиславовна ЭКОЛОГО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ MALUS BACCATA (L ), ULMUS PUMILA (L ), SYRINGA VULGARIS( L. ) К ВОЗДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.01 – ботаника (биологические науки) 03.02.08 – экология (биологические науки) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«БУХАРЕВА ОЛЬГА АНДРЕЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ НОРНЫХ СИСТЕМ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В РАЗНЫХ ПРИРОДНЫХ ЗОНАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ТЕРРИТОРИИ РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук А.В. Быков Москва 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ ПОНЯТИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛАВА 1 СРЕДООБРАЗУЮЩАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ НОРНЫХ СИСТЕМ 1.1....»

«Жданова Оксана Леонидовна Математическое моделирование естественной эволюции структурированных биологических популяций и эволюционных последствий промысла Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Научный консультант чл.-корр. РАН, профессор Фрисман Е.Я....»

«Цатурян Людмила Дмитриевна Функциональное состояние сердечно-сосудистой системы организма детей с учетом их конституциональных особенностей 03.00.13 – физиология 14.00.09 – педиатрия диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Бутова О.А. доктор медицинских наук, профессор Калмыкова А.С. Ставрополь – ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Список сокращений Введение Глава 1....»

«Багдасарян Александр Сергеевич БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПОЧВ ТЕХНОГЕННЫХ ЗОН ГОРОДСКИХ ТЕРРИТОРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ 03.00.16 экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, профессор И.М. Мануйлов Ставрополь 2005 1 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 1.1 Почва как депонирующая среда техногенных загрязнителей. 1.1.1 Химическое...»

«УДК 575.174.015.3:616.12.008.331.1 БУЛГАКОВА ИРИНА ВИКТОРОВНА ВОВЛЕЧЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА АРИЛГИДРОКАРБОНОВОГО РЕЦЕПТОРА И БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В РАЗВИТИЕ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ И ЕЕ ОСЛОЖНЕНИЙ Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских...»

«ПОЛЬШАКОВ Владимир Иванович СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ В ИЗУЧЕНИИ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ. 03.00.04 – биохимия Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук Москва - 2000 Официальные оппоненты : Доктор химических наук, профессор В.Г. Граник Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор С.Н. Кочетков Доктор химических наук,...»

«Сафиуллина Регина Ринатовна ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО ПОД РАСТЕНИЯМИ-ФИТОМЕЛИОРАНТАМИ В ЗАУРАЛЬЕ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 03.02.13 – Почвоведение 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«Блащинская Оксана Николаевна БАРЬЕРНЫЕ СВОЙСТВА ДРЕВЕСНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА (сосна обыкновенная и береза повислая) УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (на примере города Ангарска Иркутской области) Специальность 03.02.08. – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – доктор биологических наук, доцент...»

«Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ...»

«Богоутдинов Наиль Шамильевич БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ АКТИНОМИКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор...»

«ЧУДНОВСКАЯ ГАЛИНА ВАЛЕРЬЕВНА БИОЭКОЛОГИЯ И РЕСУРСЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант : Чхенкели Вера Александровна, доктор биологических наук, профессор Иркутск – СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1. Обзор литературы по состоянию проблемы исследований ресурсов лекарственных растений.. 1.1...»

«КРЕТЕНЧУК ОКСАНА ФЕДОРОВНА РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.