WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«КОМПЛЕКСЫ АНТИТЕЛ С НАНОДИСПЕРСНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ: СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н. БАХА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ТАРАНОВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА

КОМПЛЕКСЫ АНТИТЕЛ С НАНОДИСПЕРСНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ:

СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ

03.01.04 Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев кандидат биологических наук А.В. Жердев МОСКВА

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Иммунохимические тест-методы

1.1.1 Агглютинационный иммуноанализ

1.1.2 Тест-системы, основанные на принципе иммуноферментного анализа............... 1.1.3 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

1.1.4 Методы иммуноанализа на основе резонансного переноса энергии

1.1.5 Иммунофильтрация

1.1.6 Иммуноаффинные колонки

1.1.7 Микрофлюидные тест-системы

1.1.8 Иммунохроматография

1.2. Маркеры для тест-систем: сравнительная характеристика

1.3 Мультиплексная детекция и иммунохимические тест-методы

1.4. Кинетика иммунохимических взаимодействий в тест-системах и ее математические описания

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы и оборудование

2.2 Методы

2.2.1 Синтез конъюгата хлорамфеникол-соевый ингибитор трипсина

2.2.2 Определение титров антител против антибиотиков методом твердофазного иммуноферментного анализа

2.2.3 Определение антибиотиков методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа

2.2.4 Синтез, выделение и характеристика конъюгатов квантовых точек с антителами

2.2.5 Получение наночастиц коллоидного золота

2.2.6 Получение флоккуляционной кривой для взаимодействия коллоидного золота с антителами

2.2.7 Синтез конъюгата антител с коллоидным золотом

2.2.8 Определение относительного квантового выхода свободных квантовых точек и их конъюгатов





2.2.9 Определение гидродинамических радиусов наночастиц и их конъюгатов с антителами

2.2.10 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов методом просвечивающей электронной микроскопии

2.2.11 Изготовление иммунохроматографических тест-систем

2.2.12 Проведение иммунохроматографического анализа

2.2.13 Определение аналитических характеристик тест-систем

2.2.14 Измерение констант иммунохимических реакций антител против хлорамфеникола и их конъюгата с квантовыми точками с использованием прибора Biacore X

2.2.15 Расчет констант взаимодействия антитело-антиген, полученных с использованием прибора Biacore X

2.2.16 Определение титров антител против иммуноглобулина E методом твердофазного иммуноферментного анализа

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Синтез конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами

3.1.1 Синтез конъюгата квантовых точек с антителами

3.1.2 Синтез конъюгата коллоидного золота с антителами

3.2 Сравнительная характеристика нанодисперсных маркеров и их конъюгатов........ 3.2.1 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов

3.2.2 Характеристика оптических свойств квантовых точек и их конъюгатов............. 3.2.3 Пределы детекции маркеров

3.2.4 Оценка антигенсвязывающей способности конъюгатов квантовых точек.......... 3.2.5 Характеристика состава конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами. 3.3 Разработка иммунохроматографических тест-систем на основе квантовых точек

3.3.1 Разработка и апробация иммунохроматографической тест-системы на основе квантовых точек для определения хлорамфеникола в молоке

3.3.2 Разработка и апробация иммунохроматографической тест-системы на основе КвТ для определения иммуноглобулина E

3.4 Разработка мультиплексных иммунохроматографических тест-систем............... 3.4.1 Мультиплексная иммунохроматографическая тест-система с использованием квантовых точек

3.4.2 Мультиплексная иммунохроматографическая тест-система на основе двумерного массива зон связывания

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТ – антитела ББ – боратный буфер БСА – бычий сывороточный альбумин ДМФА – N,N-диметилформамид ДРС – динамическое рассеяние света ИФА – иммуноферментный анализ ИХА – иммунохроматографический анализ КвТ – квантовые точки КЗ – коллоидное золото ОВА – овальбумин ОФЛ – офлоксацин ПрО – предел обнаружения ПФИА – поляризационный флуоресцентный иммуноанализ ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия СИТ – соевый ингибитор трипсина СТМ – стрептомицин ТМБ – 3,3',5,5'-тетраметилбензидин ФБС – фосфатный буфер солевой ФБСТ – ФБС с 0,05% Тритона Х- ХФ – хлорамфеникол CCMS – 1-циклогексил-3-(2-морфолино-этил)карбодиимидмето-п-толуол сульфонат (1-cyclohexyl-3-(2-morpholiny-(4)-ethyl)carbodiimide (me-p-tol sulfonate)) – гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид FRET– резонансный перенос энергии Форстера (Frster resonance energy transfer) IgE – иммуноглобулин Е sulfo-NHS – сульфо-N-гидроксисукцинимид натрия (sulfo-N-hydroxysuccinimide) UCP – преобразующие флуорофоры (up-converting phosphors)

ВВЕДЕНИЕ





В последние десятилетия биохимические методы активно применяются для детекции широкого круга соединений, что обусловлено уникальной специфичностью взаимодействий, характерной для многих классов биомолекул. К биохимическим относят методы анализа, основанные на процессах трансформации соединений или образовании межмолекулярных комплексов, осуществляемых с использованием рецепторных биологических молекул – ферментов, антител, нуклеиновых кислот и др.

[1]. Исходя из основных требований, предъявляемых к анализу, – чувствительности и специфичности – наиболее перспективны иммунохимические методы анализа, основанные на высокоаффинном и специфичном взаимодействии антиген–антитело.

Иммунохимические методы анализа востребованы в клинической диагностике, ветеринарии, оценке безопасности потребительской (прежде всего пищевой) продукции, экологическом мониторинге [1].

К современным иммуноаналитическим методам предъявляются следующие требования [2]: экспрессность (не более 30 мин.); простота реализации; высокая чувствительность и точность детекции; высокая производительность; возможность проведения внелабораторного анализа. Аналитические методы должны сочетать высокую чувствительность и специфичность с экспрессностью и возможностью проводить одновременное определение многих соединений (мультиплексностью) как в лабораторных, так и во внелабораторных условиях.

Этим требованиям соответствует ряд современных иммуноаналитических систем, но особое внимание привлекают тест-методы. Данное название объединяет простые аналитические методы, которые позволяют быстро и с минимальной трудоемкостью оценивать присутствие и / или содержание контролируемого соединения в пробе [1; 3].

Особое значение тест-методы имеют при проведении анализа «на месте», вне лабораторий. Такой режим тестирования исключает необходимость в дорогом стационарном оборудовании, экономит время и средства на получение результатов и принятие основывающихся на них решений.

С учетом современного состояния исследований и разработок можно выделить два наиболее перспективных направления в создании новых иммунохимических тестметодов – применение в анализе новых маркеров и реализация мультиплексного анализа.

Использование маркеров в иммуноанализе существенно снижает пределы обнаружения детектируемых соединений. Применение в качестве маркеров наночастиц обеспечивает простоту детекции, высокую воспроизводимость результатов и ускорение специфических взаимодействий, лимитирующих время анализа. Детекция наномаркеров может проводиться непосредственно на основании их оптических, электрических, магнитных или иных свойств, что исключает необходимость в дополнительных реагентах и стадиях анализа, возникающую, например, при работе с ферментными метками. С учетом вышеизложенного нанодисперсные частицы являются перспективными носителями и маркерами в системах качественного и количественного определения различных соединений.

эффективности их использования в качестве маркеров для аналитических систем.

Однако их выбор продолжает оставаться в значительной степени эмпирическим.

Доказательная сравнительная характеристика традиционных и новых аналитических маркеров имеет существенное значение для развития современных тест-методов.

Расширение знаний о молекулярных механизмах патологических процессов, разнообразии токсичных контаминант обуславливают востребованность аналитических методов, позволяющих одновременно проводить быстрое определение большого количества соединений [4-6]. Однако большинство существующих на сегодняшний день иммунохимических тест-систем предназначено для детектирования единственного соединения. Увеличение количества детектируемых соединений приводит к усложнению систем и методик проведения анализа, выводя его за рамки одновременно контролируемых веществ без потерь в экспрессности, чувствительности и достоверности определения.

С учетом вышеизложенного, целью настоящей работы является изучение свойств комплексов антител с нанодисперсными маркерами разной природы и применение полученных реагентов для разработки новых иммунохроматографических тест-систем.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:

охарактеризовать размерные и оптические свойства комплексов антител с наномаркерами разной природы, определить и сопоставить кинетические и равновесные константы взаимодействия с антигеном конъюгата антитело–флуоресцентный маркер и немодифицированных антител, изучить закономерности взаимодействия иммунореагентов, меченных нанодисперсными маркерами, в иммунохроматографических тест-системах с фото- и флуориметрической детекцией и провести сравнительную оценку этих тест-систем, разработать иммунохроматографические тест-системы с одним и несколькими флуоресцентными нанодисперсными маркерами и определить их аналитические параметры, иммунохроматографии посредством проведения анализа с двумерно упорядоченным массивом зон связывания разной специфичности.

Актуальность тематики диссертационной работы определяется получением новых данных о применении нанодисперсных маркеров для высокочувствительного иммуноанализа и разработкой иммунохроматографических тест-систем, обеспечивающих сочетание экспрессности с возможностью одновременного определения многих соединений.

Исходя из цели и задач диссертационной работы, рассмотрим современное состояние разработок экспрессных иммуноаналитических систем, способов производительности и информативности. В обзоре представлены также теоретические представления о взаимодействиях иммунореагентов, лежащих в основе аналитических систем.

Согласно [1] тест-методами (тестами) называются экспрессные, простые в реализации способы оценки присутствия и / или содержания определенного вещества в пробе. Экспрессность и простота означают, что тест-методы позволяют проводить идентификацию и определение содержания аналита за минимальное время на месте отбора проб без предварительной трудоемкой пробоподготовки; при этом проведение всех стадий анализа и регистрации результатов не требует использования стационарного оборудования. Тест-методы включают тест-системы и методики проведения анализа (инструкции).

Для определения соединений с помощью тест-систем могут быть использованы различные специфические взаимодействия – фермент-субстратные, лигандрецепторные и др. Широкий класс тест-методов составляют иммунохимические тестметоды, в основе которых лежит взаимодействие определяемого соединения с соответствующими антителами [7; 8]. Образующиеся при этом комплексы антигенантитело могут детектироваться либо по изменению физико-химических параметров среды, либо с помощью меток, связанных с одним из реагентов. Первые разработки иммунохимических тест-методов (на основе агглютинации) появились в 1950-е годы [9; 10]. Первоначально иммунохимические тест-методы применялись в рамках клинической диагностики, сейчас они получили большее распространение:

мониторинг состояния окружающей среды, ветеринария, оценка качества сырья и продуктов питания, безопасности потребительской продукции, контроль технологических процессов [11; 12].

Расширение практического использования иммунохимических тест-методов вызвано несколькими причинами [13]. Во-первых, всё большее значение приобретает оперативное получение сведений о рисках для здоровья и безопасности. Во-вторых, новые технологические решения повышают конкурентоспособность иммунохимических тестов, позволяя создавать тесты с высокой чувствительностью, автоматизацией внелабораторного анализа, совместимые с современными средствами обработки и накопления информации. Важно также, что иммунохимические тестсистемы могут быть использованы для работы с такими сложными матриксами, как биологические жидкости, продукты питания и их экстракты.

Иммунохимические тест-методы являются частью более широкого понятия «иммунохимические методы анализа». Часть иммуноаналитических методов имеет портативную автономную реализацию и может быть отнесена к тест-методам, тогда как другие варианты иммуноанализа реализуются исключительно в стационарных условиях. Это разделение не постоянно; оно зависит от развития технологий изготовления компонентов аналитических систем и средств измерений и меняется с появлением новых технологических решений. Поэтому мы рассмотрим только современные возможности создания иммунохимических тест-систем (рис. 1).

Ввиду значительного разнообразия для иммунохимических методов анализа предлагаются различные классификации [7; 14; 15]. По режиму взаимодействия их можно разделить на гомогенные и гетерогенные методы [16]. Гомогенный анализ основан на реакциях, протекающих в растворе. В случае гетерогенного анализа образование детектируемых иммунных комплексов идет с участием носителя – твердой подложки, мембраны, геля и пр.

Иммуноаналитические методы можно также разделить по способу детектирования образующихся иммунных комплексов: прямые – без использования маркеров (например, преципитация), косвенные – детектируемый сигнал формируется с помощью меток (латекс-агглютинация, иммунохроматография, иммуноферментный анализ и др.). Способ детекции результатов анализа зависит от природы маркера, он может быть оптическим, флуоресцентным, электрохимическим и др.

Как отмечалось выше, далеко не все виды иммунохимического анализа трансформируются в формат тест-методов или имеют портативные варианты реализации. Так, например, классический ИФА, капиллярный электрофорез, проточноинжекционный анализ характеризуются значительной продолжительностью, необходимостью сложного аппаратурного обеспечения и отсутствием (во всяком случае, на сегодняшний день) компактных тест-систем.

Успешно трансформируются в тест-системы следующие иммунохимические методы: агглютинация, иммуноферментный анализ в кинетическом режиме, методы на основе резонансного переноса энергии с флуоресцентной и хемилюминесцентной регистрацией, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, иммунофильтрация, иммунохроматография (см. рис. 1). Перечисленные виды анализа переходят в разряд тест-методов при условии специальной комплектации набора для проведения тестирования, включающей все необходимые реагенты в готовой к применению форме, что сокращает время и снижает трудоемкость определения. Использование тест-методов предполагает возможность быстрой нетрудоемкой фиксации получаемых результатов. Например, для оптической детекции проводится визуальная оценка или использование портативных приборов на основе фотоэлектронного умножителя, CCDкамер и др. [17; 18].

Рассмотрим более подробно существующие иммунохимические тест-методы, их сравнительные преимущества и недостатки.

Рис. 1. Классификация иммунохимических методов анализа и тест-систем: желтый цвет – гомогенные методы анализа; синий цвет – гетерогенные методы анализа ( – формирование аналитического сигнала с помощью маркеров).

1.1.1 Агглютинационный иммуноанализ В агглютинационном анализе регистрируется осаждение иммунных комплексов, образующихся в результате взаимодействия антител с содержащимися в тестируемой пробе молекулами антигена. Для того чтобы иммунный комплекс выпадал в осадок, антиген должен обладать несколькими сайтами связывания (молекулы антител всегда поливалентны). Агглютинация относится к гомогенным методам анализа и подразделяется на несколько видов: прямая агглютинация, латекс-агглютинация, гемагглютинация. Каждый из вышеперечисленных видов агглютинации может быть реализован в двух форматах: прямой – осаждение образованного комплекса аналита пробы и антител (рис. 2, А) и ингибирование (торможение) агглютинации (рис. 2, Б) [19]. Оценка результатов агглютинации осуществляется, как правило, визуально.

Рис. 2. Принципиальные схемы проведения иммуноанализа, основанного на прямой агглютинации (А) и ингибирования агглютинации (Б).

Метод прямой агглютинации используется для крупных антигенов и позволяет определять их только в высоких концентрациях [20]. В качестве дисперсного носителя антител в коммерческих тест-системах, как правило, применяются латексные или полистирольные частицы. Предел определения аналита с помощью латексагглютинации редко бывает ниже 1 нМ [21], а в большинстве случаев – находится в микромолярном диапазоне [22]. Метод латекс-агглютинации широко используется для определения многих аналитов бактериальной природы, специфических антител (см.

работу [23] как один из примеров). Применение окрашенных латексных частиц в качестве дисперсного носителя в агглютинации позволяет одновременно определять несколько аналитов с удобной визуальной детекцией [22].

Одним из методов анализа, основанных на осаждении, является гемагглютинация (осаждение эритроцитов). Для регистрации взаимодействия антиген–антитело в этом методе используются эритроциты крови с иммобилизованным на их поверхности антигеном. Гемагглютинация – сравнительно длительный (~1 час) и трудоемкий анализ [24]. Ограничения гемагглютинации заключаются в нестабильности эритроцитов при хранении и, соответственно, необходимости свежеприготовленных иммунореагентов.

Метод ингибирования (торможения) агглютинации основан на конкурентном взаимодействии свободного аналита и аналита, иммобилизованного на поверхности носителя, со специфическими антителами в растворе [25]. Аналит (обычно моновалентный) связывается с антителами, оставаясь в растворе и препятствуя осаждению комплексов антител и поливалентного антигенного препарата. Данный подход, в отличие от традиционной агглютинации, позволяет детектировать низкомолекулярные соединения. Как правило, такой анализ проводится с применением латексных носителей. Отметим, что при регистрации торможения агглютинации степень агглютинации находится в обратной зависимости от концентрации определяемого соединения [26].

Для прямой агглютинации, латекс-агглютинации и ее торможения характерны простота реализации и экспрессность, а также возможность визуальной качественной («да-нет») регистрации результатов, что позволяет отнести их к тест-методам.

Существуют коммерческие агглютинационные тест-системы, например, системы для диагностики мононуклеоза, определения С-реактивного белка, ревматоидного фактора производства фирм «Ольвекс» (Россия), «Novamed» (Израиль), «BD» (США) и др.

Количественная оценка результатов агглютинации возможна при использовании турбидиметрии, однако портативные турбидиметрические детекторы с приемлемой чувствительностью и точностью измерений на сегодняшний день не разработаны.

Таким образом, к экспресс-тестам можно отнести реакции агглютинации только в варианте с качественной детекцией.

1.1.2 Тест-системы, основанные на принципе иммуноферментного анализа Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) в микропланшетном варианте на сегодняшний день реализован для большого числа соединений и широко применяется в клинико-диагностической практике. ИФА включает несколько стадий:

предварительную иммобилизацию антител или антигена на поверхности полистиролового микропланшета; добавление пробы, содержащей аналит; введение иммунореагента, меченного ферментом; получение детектируемого продукта из субстрата в ходе ферментативной реакции. Каждая стадия анализа предусматривает инкубацию реагентов, а между стадиями проводится отмывка лунок микропланшета для отделения комплексов, иммобилизовавшихся на его поверхности, от несвязавшихся соединений. К достоинствам ИФА относится высокая чувствительность, обусловленная амплификацией сигнала с помощью ферментамаркера. Для определения низкомолекулярных соединений, как правило, используется конкурентный формат ИФА – с мечением антител (рис. 3, А) либо антигена (рис. 3, Б).

Высокомолекулярные антигены благодаря наличию на их поверхности нескольких неперекрывающихся сайтов связывания (антигенных детерминант) можно детектировать, используя не только конкурентный, но и обычно более чувствительный «сэндвич»-формат анализа (рис. 3, В).

Рис. 3. Форматы иммуноферментного анализа: А, Б – форматы, основанные на конкурентном взаимодействии; В – «сэндвич»-формат (S – субстрат, Р – продукт).

Несмотря на преимущества метода и различные способы совершенствования его методик (снижения предела обнаружения, автоматизации анализа и др.), дальнейшее расширение области применения ИФА ограничивают его два основных недостатка [27]. Во-первых, это длительное время определения (2-3 часа), вызванное необходимостью продолжительных инкубаций на каждой стадии анализа для достижения химического равновесия в гетерогенных реакциях между иммобилизованными и находящимися в растворе иммунореагентами. Второй ограничивающий фактор – приборная регистрация результатов анализа (как правило – оптической плотности продукта ферментативной реакции), необходимая для расчета содержания определяемого аналита.

Необходимость экспрессного тестирования вызвала появление модификаций ИФА, существенно сокращающих время определения. В работах [28; 29] использование полимерных или магнитных наночастиц в качестве носителей позволяет проводить реакции в гомогенной среде, что снижает продолжительность анализа примерно до 30 мин [30]. Есть ряд работ по изучению кинетики иммунохимических взаимодействий и соответствующей оптимизации методик ИФА [31; 32]. Fu J. с соавт. предлагают заменить фермент-маркер на флуоресцентный краситель, что позволяет исключить стадию развития сигнала, необходимую для меток-ферментов [33]. Все эти способы приводят к сокращению времени анализа до 10-30 мин, но сохраняют приборную регистрацию результатов.

Альтернативный подход, реализованный фирмой «Neogen» для конкурентного определения низкомолекулярных соединений (микотоксины афлатоксин и фумонизин), позволяет отнести предложенный ими ИФА к тест-методам.

Разработчики предлагают проводить реакции в двух лунках (проба и ячейка сравнения). Вспомогательные растворы реагентов входят в состав набора.

Продолжительность стадий ИФА сокращена до 2-3 мин. Промывку лунок от несвязавшихся реагентов осуществляют вручную, используя флаконы-капельницы.

Конечный результат анализа оценивается визуально (рис. 4). Таким образом, предложенный анализ удовлетворяет всем критериям тест-методов.

Рис. 4. Интерпретация результатов конкурентного определения аналита с помощью тест-системы фирмы «Neogen»; А – тестирование пробы, содержащей контролируемый (http://www.neogen.com/FoodSafety/FS_DA_Index.html/) Ramachandran S. с соавт. [34] предложили автоматизированный ИФА с использованием проточного портативного устройства (рис. 5). Уникальность разработки заключается в том, что все реагенты находятся в лиофильно-высушенном состоянии (что упрощает их хранение) и растворяются при добавлении пробы.

Внесение пробы в кассету – единственное действие, требуемое от оператора; все последующие процессы инициируются движением жидкости по компонентам тестсистемы под действием капиллярных сил. Данная тест-система успешно применена для определения биомаркера возбудителя малярии Plasmodium falciparum – белка 2, богатого гистидином. Результат анализа детектируется через 20 мин после введения пробы – либо качественно (по появлению окраски), либо количественно (с помощью сканера).

Рис. 5. Портативное устройство для проведения ИФА [34].

1.1.3 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ Существует ряд аналитических методов, использующих свойства флуоресцентных маркеров. К ним относится гомогенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА). Метод основан на изменении при флуоресценции степени поляризации плоскополяризованного света, пропущенного через раствор, который содержит пробу, флуоресцентно меченное производное аналита (трейсер) и специфические антитела. Деполяризация плоскополяризованного света зависит от размеров поглощающих молекул – см. рис. 6. Малые молекулы (свободный трейсер) характеризуются быстрым вращением, что обеспечивает деполяризацию излучаемого света (флуоресценции). При связывании трейсера с антителом образуется комплекс, который медленно вращается и поэтому в момент эмиссии частично сохраняет ту же ориентацию, что и при поглощении света, а значит, частично сохраняет и поляризацию излучаемого света. Наличие аналита в пробе приводит к конкуренции с трейсером за связывание с антителами и, соответственно, к большей деполяризации излучаемого света. Регистрируемая величина поляризации флуоресценции отражает отношение связанных и свободных молекул трейсера в реакционной смеси, что позволяет на основании этого параметра рассчитывать концентрацию аналита в пробе [35].

Рис. 6. Принцип ПФИА и зависимость деполяризации от размера комплекса (http://www.glycoforum.gr.jp/).

Как следует из представленного выше описания ПФИА, данный метод может быть реализован лишь для детекции низкомолекулярных соединений. При больших размерах молекулы антигена трейсер будет сохранять поляризацию поглощаемого света и в свободном состоянии, и в комплексе с антителами. Для традиционных флуорофоров в качестве предельной молекулярной массы антигена, допускающей проведение ПФИА, рассматривается величина, равная 10 кД. В последние годы этот предел удалось преодолеть с помощью флуорофоров, характеризующихся большой временной задержкой между поглощением света и его эмиссией [35].

Иммуноанализ с регистрацией поляризации флуоресценции активно применяется в современной аналитической практике, как правило – с использованием стационарного приборного обеспечения Существует ряд компаний, специализирующихся на производстве наборов реагентов для иммуноанализа на основе поляризации флуоресценции. В ряде случаев ПФИА характеризуется высокой чувствительностью, позволяя детектировать пикомолярные концентрации аналита [38].

Гомогенная аналитическая реакция с быстрым достижением равновесия, отсутствие длительных инкубаций, появление в последние годы портативных детекторов поляризации флуоресценции (производства фирм «Diachemix» (США), «BMG Labtech» (США) и др.) позволяет проводить ПФИА во внелабораторных условиях и рассматривать соответствующие варианты анализа как тест-методы [39;

40]. Например, фирма «Diachemix» выпускает портативные детекторы для ПФИА и совместимые с ними наборы реагентов для определения микотоксинов и некоторых возбудителей заболеваний.

1.1.4 Методы иммуноанализа на основе резонансного переноса энергии Еще один вид гомогенного иммуноанализа, реализуемый как тест-метод, – иммуноанализ, основанный на резонансном переносе энергии между донором и акцептором. Резонансный перенос энергии Форстера (Frster resonance energy transfer (FRET)) – это нерадиоактивный перенос на расстояния в несколько нанометров, который происходит от возбужденного донора электронов к акцептору через дипольдипольное взаимодействие [41]. Регистрируется этот перенос по эмиссии акцептора при длине волны, не совпадающей с пиком поглощения донора. Донорно-акцепторная пара для аналитического применения подбирается таким образом, чтобы обеспечить эффективный перенос энергии (рис. 7).

Рис. 7. Схема допустимых сочетаний доноров и акцепторов для FRET-анализа. Стрелки указывают приоритетное направление потока энергии [42].

Эффективность переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния донор–акцептор [43]. Для большинства используемых пар высокая эффективность переноса достигается при сближении донора и акцептора на расстояния до 4–6 нм [44; 45], что сопоставимо с размерами антител [46]. Поэтому, пометив иммунореагенты донором и акцептором, можно регистрировать взаимодействие антиген–антитело. Если донор и акцептор в результате иммунного взаимодействия сближаются, то перенос энергии значительно возрастает. Избыточная энергия, полученная акцептором, преобразуется в детектируемую люминесценцию (рис. 8).

Рис. 8. Эффект резонансного переноса энергии [41].

Существует несколько модификаций иммуноанализа на основе FRET. Наиболее распространена конкуренция свободного и меченного акцептором антигена за связывание с антителами, меченными донором электронов. При отсутствии аналита в пробе донор передает энергию на акцептор (эффект FRET), флуоресценция донора не регистрируется (рис. 9, А). Присутствие аналита в пробе препятствует взаимодействию меченого антигена с антителом, что приводит к излучению энергии донором (рис. 9, Б). Используя градуировочную зависимость интенсивности флуоресценции, можно количественно определять содержание аналита.

Рис. 9. Принцип конкурентного иммуноанализа на основе FRET (А – в отсутствии; Б – в присутствии определяемого соединения) [43].

Детектируемый сигнал во FRET-анализе зависит от типа маркера: возможна флуоресценция, хемилюминесценция, биолюминесценция. В анализе применяются разнообразные флуоресцентные маркеры: белки, органические красители, наночастицы и др. [41; 47]. Используя два флуорофора, можно определять содержание аналита по соотношению интенсивностей флуоресценции при длинах волн, соответствующих максимумам излучения донора и акцептора [48].

В основе хемилюминесцентного FRET лежит использование энергии, выделяемой при реакции между пероксидом водорода и люминолом (либо его производными, эфирами щавелевой кислоты, акридинами, люцигенином и др.) [49; 50]. Маркер получает эту энергию, а затем выделяет ее в виде детектируемой люминесценции [51].

Описано несколько вариантов хемилюминесцентного FRET-анализа: антитела к определяемому соединению могут быть связаны с ферментом [51] или с производным люминола [52].

Отметим, что для проведения FRET-иммуноанализа достаточно смешать пробу с растворами маркеров. Иммунохимические взаимодействия осуществляются в растворе и не требуют длительных инкубаций, а их результат может непосредственно детектироваться без дополнительных стадий и вспомогательных реагентов.

Иммуноанализ на основе FRET характеризуется низким пределом обнаружения, вплоть до пикомолярных концентраций аналита, и экспрессностью – 15-20 мин [53-55].

Предложены флуоресцентные детекторы Infinite® 200 PRO Nano Quant («Tecan»), Qubit («Invitrogen»), позволяющие работать с тест-системами на основе FRET [56] (рис.

10).

Рис. 10. Портативный флуоресцентный детектор фирмы «Tecan» для регистрации результатов FRET-иммуноанализа [56].

1.1.5 Иммунофильтрация Одним из вариантов гетерогенного анализа является иммунофильтрация, основанная на использовании пористых мембран или пористого сорбента в качестве носителя, на котором иммобилизованы взаимодействующие с аналитом антитела [57].

Иммунофильтрационный анализ включает несколько стадий пропускания реагентов через мембрану, чередующихся с промывкой мембраны от несвязавшихся реагентов.

Гетерогенные взаимодействия на этих стадиях, в отличие от ИФА, происходят под давлением или действием силы тяжести, что позволяет существенно сократить их продолжительность и затрачивать на весь анализ не более 15-20 мин.

В качестве маркеров в иммунофильтрации могут использоваться ферментные маркеры либо наночастицы [58]. Применение ферментов увеличивает количество стадий и время тестирования, тогда как использование наночастиц позволяет проводить экспрессный анализ. В работах Wang C. и соавт., Thiryppathiraja C. и соавт., Дыкмана Л.А. и Богатырева В.А. [59-61] показано, что иммунофильтрация (маркер – коллоидное золото) превосходит по пределу обнаружения и скорости иммуноферментные аналоги для определения маркеров болезни Альцгеймера, возбудителей острых кишечных инфекций. Дополнительное снижение предела обнаружения в иммунофильтрационных тест-системах достигалось при использовании солей серебра [62] или золота [63], увеличивающих размеры маркерных наночастиц.

Предел детекции иммунофильтрационного анализа зависит от констант связывания реагентов и скорости пропускания растворов через мембрану. Снизить этот предел можно, используя дополнительные реагенты с высокой константой связывания, например, водорастворимые полиэлектролиты. В таких тест-системах, описанных Дзантиевым Б.Б. и соавт. [64-66], реакция между антигеном и антителом протекает в гомогенных условиях, а связанный с антителами полиэлектролит в ходе фильтрации с очень высокой скоростью взаимодействует с иммобилизованным на мембране противоионом. Иммунофильтрационные тест-системы с использованием полиэлектролитов, разработанные для определения метамфетамина, тестостерона, симазина, позволяют проводить анализ за 20 мин., включая короткую стадию трансформации ферментом-меткой субстрата с образованием на мембране осадка нерастворимого окрашенного продукта.

1.1.6 Иммуноаффинные колонки К иммунофильтрационным тест-системам по принципу работы наиболее близки колоночные тесты, в которых роль носителя (твердой фазы) выполняет гель с иммобилизованными антителами [67-69]. Анализ с использованием иммуноаффинных колонок проводится так же, как и иммунофильтрация, и включает стадии пропускания через гель пробы, специфических реагентов и промывочных растворов. Как правило, иммуноаффинная хроматография рассматривается как предварительная стадия анализа, после которой выявление контаминанта проводится с помощью хроматографии высокого давления с масс-спектрометрической идентификацией.

Однако существует и ряд разработок, в которых иммуноаффинная хроматография используется как самодостаточный аналитический метод. Маркерами в таких системах являются ферменты или наночастицы. Вывод о результате тестирования делается на основании появившегося окрашивания самой колонки или элюата (рис. 11). В работах Горячевой И.Ю. и соавт. [36; 68; 70; 71] описан ряд аналитических систем на основе аффинных колонок, на определенных участках которых расположены зоны связывания.

Рис. 11. Варианты иммуноаффинных колонок: 1 – детектирующий слой; 2 – очищающий слой; 3 – фильтр с вспомогательным конъюгатом [36].

В современной практике для тестирования с помощью иммуноаффинных колонок преобладает качественная (визуальная) регистрация. Количественная оценка результатов возможна при использовании портативных оптических детекторов [72].

Скорость пропускания растворов подбирается таким образом, чтобы обеспечить наиболее полное протекание реакций за минимальное время. Время анализа не превышает 10 мин, а предел детекции, как правило, находится в диапазоне наномолярных концентраций [31; 73].

Отметим, что для проточных методов – иммунофильтрации и иммуноаффинных колонок – существует дополнительный фактор, который, наряду с форматом анализа и аффинностью антител, влияет на предел обнаружения. В проточной системе при проведении анализа возможно концентрировать аналит из пробы. Через мембрану или колонку можно пропустить большой объем пробы – до десятков миллилитров, увеличивая количество молекул аналита, связанного с носителем. Дальнейший рост этого объема и соответствующее снижение предела обнаружения лимитируются неспецифическими взаимодействиями на носителе.

1.1.7 Микрофлюидные тест-системы Микрофлюидные тест-системы представляют собой подложки с нанесенными микроканалами, по которым при проведении анализа под действием капиллярных сил или давления движутся реагенты [74]. Каналы соединяют углубления (реакторы), в которых находятся молекулы антител, вспомогательных реагентов, маркеры.

Проба вносится в тест-систему и движется по каналам. Определяемые соединения связываются с антителами или антигенами, которые могут быть иммобилизованы на стенках каналов или вноситься вместе с пробой. Реагенты, связанные с носителем, затем фиксируются в определенном месте под действием электрического или магнитного поля. После этого вводится меченный маркером реагент, который связывается с образовавшимся иммунным комплексом. Содержание маркера в этой зоне связывания измеряется, и на основании полученной величины определяется содержание аналита в пробе [75; 76].

Существующие микрофлюидные тест-системы, описанные в сотнях статей (см.

обзорные публикации [77-79]), крайне разнообразны по геометрии. Различают двумерные (2-D) и трехмерные (3-D) (рис. 12) варианты тест-систем [78, 80].

Разветвленные каналы, сформированные на небольшой (несколько квадратных сантиметров) подложке, позволяют за 10-20 минут одновременно определять содержание десятков соединений в одной пробе.

Рис. 12. Виды двумерных (А) и трехмерных бумажных (Б) микрофлюидных тестсистем [78].

Пределы обнаружения в микрофлюидном иммуноанализе с фотометрической или флуоресцентной детекцией достигают наномолярных концентраций. Электрические методы детектирования в ряде случаев позволяют выявлять пикомолярные концентрации аналитов [81]. На сегодняшний день несколько фирм – «Abaxis», «Biosite», «TearLab» и др. – выпускают микрофлюидные тест-системы с колориметрической, флуоресцентной или электрохимической детекцией [77].

1.1.8 Иммунохроматография Иммунохроматографические тест-системы (тест-полоски) относятся к гетерогенным аналитическим системам. Тест-полоска представляет собой мультимембранный композит, на определенные участки которого предварительно нанесены все необходимые для анализа иммунореагенты и их комплексы с маркером (рис. 13). Контакт с жидкой пробой инициирует движение ее компонентов вдоль мембран тест-полоски под действием капиллярных сил, сопровождающееся иммунохимическими взаимодействиями с находящимися в них реагентами [82].

Результатом анализа является формирование в определенных участках тест-полоски иммунных комплексов, содержащих маркер. Исходя из наличия или отсутствия этого связывания, делается качественный вывод о присутствии в пробе аналита или о превышении им характерной для тест-системы пороговой концентрации.

Количественное определение содержания аналита проводится по интенсивности окрашивания, флуоресценции или иной характеристики связанного маркера.

Рис. 13. Схематическое изображение иммунохроматографической тест-полоски: 1 – пластиковая подложка; 2 – мембрана для пробы; 3 – мембрана для конъюгата маркера с антителами; 4 – рабочая мембрана; 5 – впитывающая мембрана; 6 –тестовая зона; 7 – контрольная зона с антивидовыми антителами [83].

Существуют варианты иммунохроматографических тест-систем, в которых принцип «все реагенты предварительно нанесены на тест-полоску» не соблюдается.

Для усиления детектируемого сигнала могут использоваться дополнительные реагенты, наносимые на тест-полоску после иммунохроматографии [84; 85]. Возможна также предварительная инкубация одного из иммунореагентов с пробой, обеспечивающая бльшую глубину протекания иммунохимической реакции по сравнению с движением иммунореагентов в потоке вдоль мембран [86]. Эти и другие подобные им приемы усложняют анализ, но и такие аналитические наборы могут быть отнесены к тест-методам [87; 88].

Пределы обнаружения для иммунохроматографических тест-систем колеблются от наномолярных до микромолярных концентраций в зависимости от свойств иммунореагентов, маркера и способа детекции [89]. Использование портативных детекторов [85] позволяет в отдельных случаях снизить эти пределы до пикомолярных концентраций. Продолжительность иммунохроматографического тестирования варьирует от 5 до 20 минут.

коммерциализованный класс тест-методов. Тест-полоски для выявления беременности, контроля употребления психоактивных соединений, диагностики инфекционных заболеваний производятся десятками фирм («Dialab», «Novamed», «Alldiag» и др.). Выпускаются иммунохроматографические тест-системы для контроля пищевых продуктов, сельскохозяйственного и экологического мониторинга («Charm Sciences», «Thermo Fisher Scientific» и др.). Ряд фирм («Qiagen», «DCN», «Optricon» и др.) предлагает портативные детекторы (преимущественно – фотометрические) для регистрации результатов иммунохроматографии. В последние годы активно ведутся разработки по использованию в качестве альтернативных иммунохроматографических детекторов серийных коммуникационных средств – смартфонов, мобильных телефонов, Google-камеры [90-92].

Как видим, иммунохимические тест-методы существенно отличаются друг от друга по сложности тестирования. Наибольший интерес представляют варианты тестсистем, в которых проведение анализа не требует каких-либо действий с реагентами.

Если все соединения, необходимые для формирования детектируемого комплекса, нанесены на тест-полоску или другое устройство, то всё, что должен сделать оператор, – обеспечить контакт тест-системы с характеризуемой пробой (например, окунуть тестполоску в пробу). К таким, наиболее эффективным с точки зрения трудозатрат тестсистемам, на сегодняшний день можно отнести иммунохроматографические и часть микрофлюидных тестов.

В подавляющем большинстве тест-систем детекция формирующихся иммунных комплексов обеспечивается использованием того или иного маркера. Фактически только агглютинация корпускулярных антигенов не требует применения маркера (и при этом характеризуется довольно высокими пределами обнаружения).

Свойства маркеров определяют параметры иммунохимических тест-систем и поэтому требуют более детального рассмотрения.

1.2. Маркеры для тест-систем: сравнительная характеристика Маркеры, используемые в биохимических методах анализа (в том числе в тестсистемах), обеспечивают формирование детектируемого сигнала, величина которого отражает содержание аналита. Регистрация специфических комплексов без использования маркера – непосредственно по изменению того или иного параметра реакционной среды – возможна лишь в крайне ограниченном числе случаев и при этом обычно характеризуется невысокой чувствительностью. Использование маркера может обеспечить амплификацию сигнала (например, для маркера-фермента, когда детектируются продукты катализируемой им реакции) или возможность использовать высокочувствительные методы детекции.

Существующее разнообразие маркеров крайне велико и классифицируется разными способами. Все маркеры можно разделить на индивидуальные молекулы (радиоактивные метки, ферменты, красители), молекулярные кластеры (наночастицы разной природы) и метки со сложной структурой (латексные или кремниевые частицы с инкапсулированными красителями). Из этого разнообразия можно выделить маркеры, удовлетворяющие требованиям современных тест-методов. Маркеры, используемые в иммунохимических тест-методах, должны обладать следующими характеристиками:

- простота детекции;

- высокая чувствительность детекции (высокое значение отношения сигнал / шум) в широком диапазоне условий;

- сохранение детектируемых свойств при работе со сложными матриксами;

- стабильность конъюгата маркер–иммунореагент при хранении.

Представленным требованиям в той или иной степени удовлетворяет лишь часть из возможных маркеров – ферменты, органические флуорофоры, липосомы и наночастицы различной природы, которые будут рассмотрены далее.

Важное значение при классификации маркеров имеют способы их детекции. В основе прямой детекции лежат непосредственно регистрируемые физические свойства маркера: поглощение света, флуоресценция, электропроводность, магнитные свойства и др. Непрямые способы основаны на детекции продуктов реакции, проведенной с участием маркера. Стоит отметить, что одни и те же маркеры могут детектироваться разными способами и, соответственно, относиться к нескольким группам.

Ферменты Фермент в качестве маркера обеспечивает эффективное усиление аналитического сигнала, трансформируя большое число молекул субстрата (для ряда ферментов число оборотов при катализе достигает нескольких тысяч в минуту) [93]. С использованием ферментов в качестве маркеров реализовано несколько видов иммунохимических тестметодов – твердофазный иммуноферментный анализ, иммунофильтрационные тесты, иммуноаффинные колонки [94; 95]. В большинстве тест-методов в качестве ферментативного маркера используется пероксидаза; это обусловлено ее высокой каталитической активностью, а также рядом детально охарактеризованных реакций окислительной трансформации хромогенов, применяемых в иммуноферментных аналитических наборах [96].

Однако детекция по продукту катализируемой реакции обуславливает и определенные недостатки применения ферментов-меток в тест-системах.

Продолжительность анализа увеличивается, т.к. после формирования специфического комплекса нужно время для его выявления. Стабильность ферментов, особенно в растворе, не очень велика. Поэтому, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов анализа, нужны дополнительные разработки.

Отметим, что в некоторых тест-методах ферменты используются не как непосредственные маркеры антител или антигенов, а как дополнительные средства усиления сигнала. Описаны тест-системы, в которых детектируемый оптический сигнал формируется с помощью двух маркеров – наночастицы и фермента [85]. После проведения стадии иммунохимического взаимодействия образовавшиеся на наночастицах комплексы отмывали от несвязавшихся реагентов и погружали в раствор субстрата пероксидазы.

Флуоресцентные органические красители В качестве флуоресцентных маркеров в биохимических исследованиях используется большое число низкомолекулярных органических красителей:

флуоресцеин, техасский красный, нильский красный, Alexa 750 и др. [97]. Описано их применение и в иммунохроматографических тест-системах [98; 99].

Недостатки органических флуорофоров как аналитических реагентов – низкая фотостабильность, сильное концентрационное тушение и снижение интенсивности флуоресценции под действием компонентов тестируемого матрикса [100]. Квантовый выход большинства органических красителей в органических растворителях высокий – 0,7–0,97, но в водной среде он не превышает 0,5 [101-103].

Чтобы увеличить интенсивность свечения, детектируемого при проведении анализа, при мечении аффинных белковых реагентов (например, антител) можно использовать высокие мольные соотношения флуорофора к белку. Однако это может вызвать изменения структуры белка и его реакционной способности [104].

Альтернативные способы увеличить нагрузку маркера без непосредственного воздействия на аналитический реагент основываются на инкапсуляции флуорофоров в латексные, полимерные или кремниевые нано- или микроструктуры [105].

Общее преимущество наночастиц как аналитических маркеров заключается в возможности использовать их большую суммарную поверхность, чтобы ускорить аналитические реакции и увеличить количество целевого продукта. В ряде систем применяются также особенности влияния размера на те или иные свойства наночастиц, например, на их окраску, взаимодействие с разными видами излучения.

Описано иммуноаналитическое применение наночастиц различных классов – коллоидное золото, коллоидное серебро, углеродные наночастицы, магнитные наночастицы, преобразующие флуорофоры, инфракрасные маркеры, квантовые точки, липосомы, латексные и кремниевые наночастицы и др. [7; 106]. Учитывая это разнообразие маркеров, методов получения на их основе аналитических реагентов, а также способов детекции, рассмотрим только основные классы наночастиц, чаще всего используемых в иммунохимических тест-методах.

Коллоидное золото Интенсивное применение коллоидного золота (КЗ) как маркера для иммуноанализа началось после работы 1981 года Horisberger M. [107], описывающей получение конъюгата КЗ с антителами и его использование в микроскопии. На сегодняшний день КЗ является самым распространенным маркером в мембранных системах иммуноанализа благодаря доступности, простоте получения реагентов и детектирования.

Интенсивная окраска частиц КЗ обусловлена эффектом поверхностного плазмонного резонанса. Конъюгаты наночастиц КЗ с иммунореагентами могут быть получены посредством как прямой адсорбции, так и иммобилизации тиол-содержащих реагентов с последующей ковалентной модификацией.

Варьируя условия синтеза КЗ, можно получить препараты различной формы и размера. Вопрос об оптимальном маркере для тест-систем до сих пор остается иммунохроматографии наночастиц КЗ со средним диаметром 30-40 нм, но особенности определяемого соединения и формата анализа могут существенно влиять на этот выбор [108; 109]. В иммунохроматографии могут применяться препараты КЗ как малого диаметра – 3-5 нм (с практически эквимолярным соотношением антитело : коллоид в конъюгате), так и большого диаметра – до 50 нм [110; 111]. Переход к более крупным частицам КЗ требует специальных решений по обеспечению их стабильности в растворе и предотвращению агрегации.

Оптический сигнал, генерируемый частицами КЗ в тест-системах, может быть усилен с помощью ферментов, наночастиц или солей серебра [112], либо дополнительного препарата КЗ [113; 114]. В работе Parolo C. и соавт. [85] предложена иммунохроматографическая тест-система, в которой наночастицы золота иммунохроматографии тест-полоску отмывают от несвязавшихся реагентов и погружают в раствор субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина, дающего яркосиний нерастворимый продукт окисления). Усиление окрашивания позволило снизить предел обнаружения с 5 нг/мл до 200 пг/мл. Дрыгин Ю.Ф. и соавт. предложили другой способ усиления аналитического сигнала в иммунохроматографии, который состоит в использовании наночастиц серебра (диаметр 20 нм), агрегирующих на поверхности КЗ (диаметр 20 нм) и в 10 раз увеличивающих интенсивность окрашивания [115].

Отметим, однако, что дополнительные стадии увеличивают продолжительность анализа (например, в работе [85] – с 10 до 25 мин).

Свойства наночастиц КЗ позволяют проводить их выявление (и, соответственно, регистрацию результатов иммуноанализа) не только по окрашиванию определенных зон тест-системы, как это делается в традиционной иммунохроматографии, но и по тушению флуоресценции [116; 117], изменениям электропроводности [118] либо люминесценции [119], а также по изменениям спектров поглощения при агрегации частиц КЗ, взаимодействующих с аналитом [120-122]. Однако самый простой и быстрый вариант – колориметрическая детекция с возможностью визуальной качественной оценки результатов – продолжает оставаться наиболее востребованным.

Наночастицы серебра Для наночастиц серебра, как и для КЗ, характерны интенсивное поглощение света, возможность варьирования размеров наночастиц и зависящих от размеров спектров поглощения. При использовании в тест-системах наночастицы серебра могут детектироваться колориметрическими и вольтамперометрическими способами [123], а также по изменению оптических свойств в процессе агрегации [124].

Следует учитывать, что нестабилизированные наночастицы серебра в растворах подвергаются быстрому окислению и легко агрегируют [125]. Поэтому ряд работ посвящен изучению взаимодействия коллоидного серебра с различными средами и разработке методов стабилизации таких частиц [126-128].

Углеродные наночастицы Углеродные наночастицы разнообразны по структуре: наносажа, графен, одностенные и многостенные нанотрубки, фуллерены, аморфный углерод [129]. В г. van Аmerongen А. и соавторы впервые использовали наночастицы аморфного углерода как метки для иммунохроматографических тест-систем [130]. Данный подход был успешно применен и в ряде последующих работ, преимущественно – той же научной группы [131-134]. Основные достоинства углеродного маркера – высокая стабильность и контрастность окрашивания на мембране (черные частицы на белом фоне). Высокий коэффициент экстинкции наночастиц обеспечивает крайне низкий предел их обнаружения, который для приборной регистрации достигает пикомолярных концентраций (2 пМ) [135]. Кроме оптических свойств, для регистрации углеродных наночастиц используют и их электрические характеристики, разрабатывая методы анализа с амперометрической и вольамперометрической детекцией [136-138]. В работе Munge B. и соавт. показано, что электродетекция углеродных наночастиц значительно чувствительнее оптической детекции: пределы обнаружения – 10-21 М и 2·10-19 М, соответственно [139].

Магнитные наночастицы Эффективным аналитическим реагентом являются растворы парамагнитных частиц – коллоидные препараты кластеров металлов или их оксидов, способные перемещаться в магнитном поле. Наиболее широкое распространение в аналитических системах получили ферромагнетики – смеси оксидов железа Fe2O3 и FeO. Магнитные свойства наночастиц могут быть использованы как для концентрирования аналитических реагентов, так и для выявления специфических комплексов.

Применение магнитных наночастиц в иммунохроматографии описано в ряде работ [140-142]. Маркер может детектироваться как по отклику (намагничивание) на внешнее магнитное поле, так и по окраске (ферромагнитные частицы – интенсивного коричневого цвета). Магнитные детекторы выявляют маркеры во всем объеме мембраны, без каких бы то ни было эффектов экранирования, характерных для оптических методов.

В ряде исследований, например, в работе Gao Z. и соавт. при проведении иммуноанализа простатспецифического антигена, магнитные наночастицы используются и для разделения реагентов, и для детекции образующихся комплексов [143].

Преобразующие флуорофоры Преобразующие флуорофоры (up-converting phosphors (UCP)) представляют собой комбинацию иона-донора и иона-акцептора энергии в одной субмикронной кристаллической структуре. При инфракрасном облучении ион-донор высвобождает энергию, квант энергии переходит на акцептор, который в свою очередь испускает фотон в видимой или ближней инфракрасной области в зависимости от состава кристалла [144]. При детекции маркера эти испускаемые фотоны регистрируются.

При получении преобразующих флуорофоров в качестве донора широко применяются кристаллы итрий-фторида натрия (NaYF4) с гексагональной кристаллической решеткой [145]. Роль акцептора в большинстве случаев играют комплексы трехвалентных лантанидов – самарий, иттербий и др. [146]. Благодаря эмиссии в ближней инфракрасной области тест-системы на основе лантанидных комплексов характеризуются низким фоновым сигналом, что позволяет с их помощью тестировать различные сложные матриксы, такие как кровь, слюна, экстракты пищевых продуктов [146-148].

К недостаткам преобразующих флуорофоров следует отнести низкий квантовый выход (0,01–0,1) [149] и склонность к агрегации [150]. На основе UCP реализованы иммунохроматографические тест системы для определения ряда бактериальных патогенов – Escherichia coli, Streptococcus pneumonia, Brucella sp. и др. [151; 152].

Инфракрасные маркеры В качестве инфракрасных маркеров в тест-системах используются композитные материалы Y2O3:Nd3+ или YF3: Er3+. При облучении светом в видимом диапазоне (500нм) эти соединения флуоресцируют в ближней инфракрасной области спектра (900-1100 нм) [153; 154].

Как и для преобразующих флуорофоров, для данных соединений характерно высокое соотношение сигнал : шум, обеспечиваемое благодаря низкому собственному свечению носителя [147]. Главный недостаток инфракрасных маркеров на основе лантанидов – нестабильность из-за тушения флуоресценции, которое можно снизить введением меток в латексные, полимерные или кремниевые наночастицы [155].

Квантовые точки Полупроводниковые квантовые точки (КвТ) представляют собой нанокристаллы бинарных соединений из элементов II–VI и III–V групп Периодической системы Менделеева, линейные размеры которых по всем трем направлениям меньше радиуса экситона Бора данного соединения (1–10 нм) [156-158]. Например, для CdSe радиус экситона Бора составляет 6 нм, и размер КвТ, соответственно, варьирует от 1 до 6 нм.

Малые размеры полупроводниковых нанокристаллов приводят к тому, что образующаяся при облучении пара электрон – дырка (экситон) перемещается внутри кристалла и испускает фотон: частица флуоресцирует. Квантовые точки характеризуются высокой внутренней энергией носителей заряда, а также зависимостью оптических параметров от размеров [159; 160]. Частицы такого же состава, но больших (по сравнению с радиусом экситона Бора) размеров эти свойства утрачивают.

Как правило, в состав квантовых точек, кроме ядра, входят и дополнительные компоненты – металлическая оболочка и полимерное покрытие (рис. 14). Ядро, формирующееся из таких соединений, как CdS, CdSe, InP и др., обеспечивает флуоресцентные свойства КвТ, причем спектры эмиссии в существенной степени зависят от состава ядра (рис. 15). Металлическая оболочка (ZnS, ZnSe и др.) препятствует неизлучательному переходу энергии, стабилизирует наночастицу и усиливает флуоресценцию. Кроме того, металлическая оболочка предотвращает фотоокислительную деградацию ядра, концентрирует свободные электроны в объеме [156].

Для большей стабильности, водорастворимости квантовых точек и исключения негативного влияния металлических поверхностей на биомолекулы КвТ покрывают полимерными оболочками. В состав таких покрытий вводят амино-, карбокси- или другие функциональные группы, обеспечивающие возможность конъюгирования КвТ с биомолекулами [161]. Модификация поверхности КвТ полимерами и биомолекулами практически не влияет на их оптические свойства.

КвТ как аналитические маркеры могут регистрироваться по флуоресценции (прямая детекция) [88] или электрохимическими способами (непрямая детекция) [162].

КвТ характеризуются широким спектром поглощения, возбуждением в широком диапазоне длин волн, узким симметричным пиком эмиссии (полуширина 20–30 нм для препаратов, гомогенных по размерам). Варьируя состав и размер КвТ, можно добиться любой длины волны испускаемого света (см. рис. 15). В отличие от органических красителей, которые подвергаются быстрому фотовыцветанию, КвТ могут быть использованы в нескольких повторных циклах возбуждение–испускание [163; 164].

Квантовые точки характеризуются высоким квантовым выходом флуоресценции как в органических, так и в водных средах (0,5–0,9), тогда как для органических флуорофоров квантовый выход флуоресценции в водных растворах существенно ниже (0,2–0,6) [165].

Рис. 14. Структура квантовых точек.

Рис. 15. Зависимость длины волны эмиссии квантовых точек от состава и размера их ядра [166].

Липосомы формирующие в результате самосборки оболочку и внутреннюю полость. Во внутреннем слое оболочки находятся гидрофобные части молекул, образующих липосому, тогда как гидрофильные части выходят на ее поверхность (наружную либо внутреннюю). Для аналитических целей используются липосомы размером от 50 до 800 нм. В аналитических системах липосомы используются для концентрирования маркера и его присоединения к селективному реагенту (обычно – антителу, инкапсулированными внутри липосомы, могут быть цветные красители, флуоресцентные красители, ферменты, электроактивные компоненты и др. Включение в липосому значительного числа молекул маркера позволяет снизить предел обнаружения на 2-3 порядка по сравнению с непосредственным мечением иммунных комплексов [168; 169].

Главным недостатком липосом является низкая стабильность при хранении и работе в сложных матриксах. Липосомы легко подвергаются лизису при добавлении поверхностно-активных веществ и разрушаются при использовании стандартных протоколов высушивания.

Латексные наночастицы Латексные наночастицы представляют собой частицы из полистирола, полиметилметакрилата и других полимерных материалов диаметром от 50 до 500 нм (т.е. находятся у верхней границы нанодиапазона, а порой – и за ее пределами).

Существуют методы синтеза цельных и полых латексных частиц [170; 171]. Основная область аналитического использования латексов – агглютинация [21].

В состав латексных частиц могут входить маркеры разных типов – красители, флуорофоры, магнитные наночастицы и др. При этом возможна как иммобилизация маркеров на поверхности частицы, так и их включение в объем частицы при синтезе и диспергировании. Имеется ряд коммерчески доступных латекстных частиц, меченных флуорофорами [172]. Некоторые красители и флуорофоры сложно ковалентно присоединить к антителам или антигенам, так как у них отсутствуют активные группы, а модификация ухудшает флуоресценцию. Применение латексов решает эту проблему, позволяя включить маркер в частицу в немодифицированном виде. Латексы, как и липосомы, могут концентрировать большое число маркеров, амплифицируя аналитический сигнал. Еще одним преимуществом является возможность сочетания в латексной частице маркеров разных цветов (что позволяет одновременно идентифицировать до сотни соединений) или объединения в ее составе маркера и средства разделения детектируемых комплексов (например, флуорофоров и магнитных частиц) [146]. Наконец, важное достоинство латексных частиц – доступность и низкая стоимость.

Ультрадисперсные частицы диоксида кремния Кремниевые наночастицы могут детектироваться за счет собственных флуоресцентных свойств (зависящих от размера) или инкапсулированных реагентов.

[173; 174]. Инкапсуляция разнообразных маркеров позволяет детектировать получаемые комплексы по окраске, флуоресценции или электропроводности [175;

176]. Концентрирование красителей в кремниевых наночастицах (как и для рассмотренных выше липосом и латексов) обеспечивает низкий предел обнаружения аналита [155; 177; 178].

Инкапсулированные красители характеризуются высокой фотостабильностью, устойчивостью к компонентам среды. Стабильна и собственная флуоресценция наночастиц диоксида кремния.

Сравнение тест-методов с разными маркерами является сложной задачей, не сводящейся к оценке возможностей детектирования маркеров как таковых. На характеристики анализа существенное влияние оказывают аффинность иммунореагентов, состав тестируемых проб, особенности проведения анализа.

Поэтому сравнительная оценка маркеров возможна только для конкретных форматов тест-систем и лишь при наличии достаточного числа экспериментальных данных, относящихся к разным иммунореагентам.

Хотя комплексное сравнение широкого ряда маркеров в одной и той же тестсистеме не проводилось, на сегодняшний день известно несколько работ, посвященных попарному сопоставлению маркеров (табл. 1). Большинство исследователей проводит сравнение КЗ и КвТ с другими маркерами.

Таблица 1. Результаты экспериментального сопоставления маркеров для тест-систем Из представленных в таблице 1 данных следует, что флуоресцентные наночастицы обеспечивают самые низкие пределы обнаружения – в 5–1000 раз ниже, чем при использовании колориметрических маркеров. Таким образом, флуоресцентные КвТ являются перспективными реагентами для иммуноанализа.

1.3 Мультиплексная детекция и иммунохимические тест-методы С расширением знаний о соединениях, участвующих в патологических процессах, о потенциально опасных контаминантах окружающей среды и потребительской продукции всё в большем числе случаев возникает необходимость контроля наличия и/или уровня не одного, а нескольких соединений за минимальные сроки [4-6].

Высокопроизводительные тест-системы необходимы для детекции экотоксикантов, патогенных микроорганизмов и аллергенов в продуктах питания, специфических антител, гормонов и других регуляторных соединений в крови, при решении ряда других задач.

Простое одновременное определение нескольких целевых соединений, проводимое по существующим методикам для монопараметрического анализа, не является оптимальным решением, т.к. оно предполагает пропорциональное увеличение трудоемкости, а в ряде случаев – еще и рост продолжительности тестирования.

Практически востребованы мультиплексные методы, позволяющие с помощью одной тест-системы определять несколько соединений. Одновременность выявления разных соединений обеспечивается либо применением в анализе ряда маркеров с разными свойствами, либо разделением в пространстве зон связывания разных аналитов (рис.

16) [181-183]. Эти подходы легко применяются для стационарного приборного обеспечения, тогда как их реализация в тест-системах требует дополнительных методических решений.

Рис. 16. Два варианта реализации мультиплексного иммуноанализа [184].

Рассмотрим известные на сегодняшний день варианты мультиплексных иммунохимических тест-систем.

Использование разнообразия маркеров в мультиплексном анализе Как отмечалось в разделе 1.2, исследователи располагают большим числом маркеров для иммуноанализа. Отличия в свойствах этих маркеров могут послужить основой для создания мультиплексных тест-систем. Например, для коллоидного золота и квантовых точек варьирование размеров позволяет получать маркеры с разной окраской или флуоресценцией. При получении латексных и кремниевых наночастиц возможно инкапсулирование различных низкомолекулярных красителей, обеспечивающее формирование панели маркеров с разными оптическими свойствами.

На основе латексных частиц с инкапсулированными флуорофорами реализованы коммерческие мультиплексные системы Luminex (США), позволяющие определять до 500 аналитов.

Мультиплексный иммуноанализ с использованием нескольких маркеров возможен в таких форматах, как агглютинация, FRET-анализ, ПФИА и ИФА.

Например, в работе Aoki K. и соавт. [22] предложен метод латексной агглютинации для одновременного определения трех психоактивных соединений. В качестве маркеров использованы три вида наночастиц окрашенного латекса. Квантовые точки с разными пиками флуоресценции использованы в ИФА для определения четырех микотоксинов [185]. Мультиплексный FRET-анализ комплексов каннабиноида, допамина и аденозина с клеточными рецепторами описан Carriba P. и соавт. [186]. В работе Tian J.

и соавт. [187] предложено одновременное определение двух раковых маркеров методом ПФИА.

Существуют варианты мультиплексных тест-систем, в которых несколько маркеров используются для гомогенного микрофлюидного анализа. Schroeder H. и соавт. [188] применили такой формат анализа с конъюгатами различных наночастиц КЗ для одновременного определения четырех онкомаркеров.

Как видим, все реализованные на сегодняшний день варианты мультиплексных тест-систем с несколькими маркерами предполагают оптическую (визуальную или приборную) детекцию. При этом необходимость корректной идентификации каждого маркера обуславливает использование разных источников света, светофильтров и фотоприемников, усложняя комплектацию тест-системы.

Использование пространственного разделения зон связывания в мультиплексных тест-системах Обеспечение мультиплексности за счет пространственного разделения предполагает усложнение взаимного расположения элементов тест-системы. На рис.

17 представлена общая тенденция развития таких тест-систем – переход к многомерной упорядоченности зон связывания. Рассмотрим примеры реализации мультиплексного анализа с пространственным разделением в разных видах тест-систем.

Рис. 17. Варианты реализации мультиплексного иммунохроматографического анализа [7].

Производительность иммуноаффинных колонок как аналитических устройств может быть повышена за счет расположенных друг над другом слоев носителя с иммобилизованными антителами разной специфичности [189]. При пропускании пробы через колонку каждый аналит связывается в определенном слое и детектируется с помощью маркера. Сходный принцип реализован в мультиплексных микрофлюидных тест-системах, предложенных Zhang H. и соавт. для определения онкомаркеров [190].

Для иммунохроматографических тест-системах также возможно нанесение нескольких последовательно расположенных аналитических зон, содержащих реагенты разной специфичности. Однако размеры тест-полосок, производимых с использованием серийного оборудования, позволяют разместить лишь ограниченное число таких зон – не более 10, а в коммерческих тест-системах, предполагающих простоту и однозначность идентификации каждой окрашенной полосы, – не более четырех [191; 192]. Увеличение количества аналитических зон вызывает их размытие и перекрывание при нанесении и формировании окраски.

Простой вариант перехода к мультиплексной иммунохроматографии состоит в объединении (например, в общей кассете) нескольких тест-полосок, каждая из которых обеспечивает определение одного соединения (рис. 17). В работе Hong W. и соавт. [193] предложено располагать тест-полоски в виде круга, в центр которого вносится проба (рис. 17). Однако количество расходных материалов для изготовления таких тестов увеличивается и, соответственно, стоимость анализа возрастает пропорционально числу определяемых параметров. Кроме того, работа с кассетой требует большего объема тестируемой пробы, что не всегда возможно (например, при анализе крови).

Для анализа в стационарных условиях успешно применяются мультиплексные иммунохимические чипы. На их твердую (обычно стеклянную) подложку наносится двумерный упорядоченный массив зон связывания небольших размеров, в каждой из которых при последующих инкубациях формируется иммунный комплекс определенной специфичности. Иммуночипы позволяют одновременно характеризовать наличие и содержание сотен и даже тысяч соединений [194]. Однако, кроме необходимости сложных и дорогостоящих стационарных устройств для проведения анализа и регистрации его результатов, использование микрочипов предполагает высокую квалификацию оператора и значительную продолжительность тестирования (2–4 ч.) [195-197].

Одним из примеров микрочипового мультиплексного иммуноанализа является разработанная Fall B.I. и соавт. [198] методика определения иммуноглобулинов Е человека, специфичных к 24 аллергенам (рис. 18). Зона связывания формируется на стекле нанесением реагентов из малых (5-15 нл) объемов. В качестве маркеров используются органические флуорофоры.

Рис. 18. Одновременное определение иммуноглобулинов Е человека, специфичных к разным аллергенам, с помощью иммуночипа [198].

Существенно увеличивает количество соединений, одновременно определяемых с помощью иммунохроматографического теста, переход от одномерной геометрии зон связывания (последовательность полос) к двумерной (точки, расположенные в виде упорядоченного массива – несколько рядов в длину и в ширину) [199]. В иммунофильтрационных тестах также возможно сформировать зону связывания в виде массива точек с реагентами разной специфичности и благодаря этому одновременно определять большое количество аналитов [200]. Для детекции флуоресценции необходимы мощные источники возбуждения (например, лазер) и чувствительные фотоприемники, что препятствует переходу иммуночипового анализа к портативным вариантам.

Двумерное упорядочение аналитических зон на тест-полоске совмещает преимущества иммуночипов и традиционной иммунохроматографии. Первая тестполоска с двумерной зоной связывания была разработана Gordon J. и соавт. [201], использовавшими олигонуклеотиды в качестве рецепторных реагентов. Carry R. и соавт. [202] реализовали двумерную иммунохроматографию для определения вирусов цитрусовых (с объединением в тест-системе до 90 зон связывания).

Hong S. и соавт. [203] разработали иммунохроматографическую тест-систему с двумерным массивом зон связывания (расположенных в шахматном порядке моноклональных антител), но реализовали ее для определения одного соединения – хрящевого олигомерного тканевого белка (COMP). Позднее мультиплексные системы иммунохроматографического анализа были реализованы в работах Gantelius J. и соавт.

[204; 205] для определения высокомолекулярных антигенов – бактерий и антител.

В работе Corstjens P.L. и соавт. [206] отмечается, что в многозонных иммунохроматографических тест-системах движение детектирующего конъюгата через ряды иммобилизованных реагентов сопровождается его истощением, вызывающим систематическую погрешность анализа.

Рассмотренные примеры позволяют заключить, что мультиплексные тестсистемы существенно повышают производительность определения, тогда как расход реагентов и, соответственно, стоимость анализа (из расчета на одно соединение) снижаются.

перспективных методических решений для мультиплексных тест-систем. В литературе описано несколько вариантов таких тест-систем, но все они находятся на стадии лабораторных образцов и не реализованы как коммерческая продукция. Все известные разработки относятся к определению индивидуальных высокомолекулярных соединений с использованием однокомпонентных конъюгатов антитело–маркер.

1.4. Кинетика иммунохимических взаимодействий в тест-системах и ее Наиболее часто для внелабораторного анализа применяются различные виды неравновесных тест-систем, содержащие иммобилизованные на твердой фазе реагенты. Изучение кинетики биохимических процессов в этих системах позволяет выявить закономерности реакций, протекающих при проведении анализа, и их зависимости от концентраций реагентов, продолжительности и условий взаимодействия. Использование этих закономерностей дает возможность прогнозировать аналитические характеристики тест-систем, оценивать влияние на них различных факторов.

иммуноаналитических системах.

Все иммуноаналитические методы основаны на реакциях между детектируемыми соединениями (лигандами или антигенами) и рецепторными молекулами (антителами).

Реакция образования иммунного комплекса может быть описана кинетическими и взаимодействия [16].

рецептора может быть представлено в виде уравнения:

где L – лиганд; R – рецептор; ka – константа связывания; kd – константа диссоциации.

Данный тип взаимодействий можно описать, используя систему трех нелинейных дифференциальных уравнений [207]:

Эта система не решается в общем виде, но с учетом соотношения начальных концентраций лигандов и рецепторов могут быть приняты те или иные допущения, позволяющие охарактеризовать особенности комплексообразования.

Однако данная модель описывает лишь простейшую пару иммунореагентов – взаимодействие моновалентного рецептора (Fab-фрагмент антител) и моновалентного антигена [208; 209]. В структуре нативных антител содержится несколько антигенсвязывающих центров (от двух у IgG до десяти у IgM); многие антигены характеризуются поливалентностью. Это приводит к большому разнообразию иммунохимических взаимодействий. Поливалентные взаимодействия, их роль в иммунных реакциях рассматриваются в ряде работ [210-215]. Однако общие многостадийность формирования иммунных комплексов, на сегодняшний день не предложены.

Рассмотренная выше модель взаимодействия моновалентного лиганда и моновалентного рецептора может быть применена к описанию тест-систем на основе ПФИА [38] и FRET [216]. В этих случаях все реагенты находятся в растворе, а определяемый низкомолекулярный антиген моновалентен.

Однако модель анализа должна дополнительно учитывать процессы, связанные с появлением молекул-конкурентов. Такие работы были начаты исследованиями Rodbard D.

иммунорадиометрического анализа [217; 218]:

где P – концентрация антигена; Q – концентрация меченых антител; R – концентрация иммобилизованного реагента.

Данная модель конкурентного иммуноанализа переносится и на другие аналитические системы с гомогенными взаимодействиями. При этом, как отмечают Surovtsev I.V. и соавт, математическое описание реакций, лежащих в основе метода агглютинации, осложнено образованием продуктов разного состава [219].

Большинство иммунохимических тест-методов (ИХА, иммунофильтрация, иммуноаффинные колонки, ИФА) относятся к гетерогенному иммуноанализу.

распределением реагентов в пространстве требует привлечения более сложного математического аппарата [220]. Перенос «эффективных констант», определенных для гомогенного варианта анализа, в гетерогенную систему весьма условен, как и рассмотрение количества иммобилизованных реагентов в терминах объемных концентраций.

Работы по моделированию методов ИФА ведутся наиболее интенсивно по сравнению с другими гетерогенными иммуноаналитическими методами. Предложен ряд математических моделей, описывающих взаимодействия для разных форматов ИФА и основывающихся на разных допущениях [8; 221-223]. Рассмотрим некоторые из них.

Choi D.H. и соавт. разработали и исследовали модель прямого конкурентного формата ИФА, которая позволяет оптимизировать методику проведения анализа расчетным путем, исключая длительный экспериментальный подбор условий [224]. В данном формате ИФА свободный антиген пробы и антиген, меченный ферментом, конкурируют за связывание с иммобилизованными на поверхности микропланшета антителами. Изменения концентраций комплексов антиген – антитело и антитело – антиген–фермент отражают следующие дифференциальные уравнения:

где С1, СА и СЕ – концентрации антигенсвязывающих сайтов, свободного антигена и свободного антигена, меченного ферментом; konA и koffA – кажущиеся константы ассоциации и диссоциации антигена; konЕ и koffЕ – кажущиеся константы ассоциации и диссоциации антигена, меченного ферментом.

Моделирование проводилось для равновесных условий проведения анализа. Для концентрацию меченного ферментом антигена и используя кинетическую модель ИФА, авторы показали зависимость предела обнаружения от концентрации маркера (рис. 19).

Рис. 19. Влияние концентрации меченого антигена на предел обнаружения (правая ось ординат, сплошная кривая) и на концентрацию комплекса антитело-антиген-фермент (левая ось ординат, пунктирная кривая) при проведении ИФА. Заштрихованная область показывает диапазон концентраций меченого антигена, оптимальных для проведения высокочувствительного и достоверного анализа [224].

Показано влияние концентрации конъюгата антиген–маркер на предел обнаружения и амплитуду детектируемого сигнала (оптической плотности при колориметрической детекции). Имеется узкий диапазон значений этой концентрации, обеспечивающих одновременно и низкий предел обнаружения, и высокую оптическую плотность (заштрихованная область на рис. 19). Представленные авторами результаты моделирования согласуются с экспериментальными данными [224].

В работе Kuznezow W. и соавт. [225] проводилась оценка времени, необходимого для достижения максимального аналитического сигнала, при реализации гетерогенного иммуноанализа для трех геометрически различных вариантов твердой фазы: лунка микропланшета, пластина и ячейка. Эксперименты проводились при постоянном перемешивании и без перемешивания. Установлено, что реакция в лунке проходила быстрее в 2 раза, чем в ячейке, где для достижения максимального сигнала требовалась инкубация в течение не менее чем 20 часов. Авторами предложена математическая модель, описывающая систему ИФА в условиях ограниченного массопереноса. В данной модели твердая фаза рассматривается как полностью впитывающий диск на отражающей плоской поверхности. Используя теоретическое описание двухстадийных взаимодействий, авторы предлагают для диффузионноограниченного иммуноанализа следующее модифицированное уравнение, которое описывает развитие сигнала (S(t)):

где Da - число Дамкёлера, определяющее отношение скорости химической реакции к скорости других одновременно протекающих в системе процессов; k+ – константа ассоциации; L0 – начальная концентрация аналита; D – коэффициент диффузии аналита; Smax – максимальный аналитический сигнал; – поверхностная плотность сайтов связывания антител.

Время, после которого реакция входит в режим стационарного потока с постоянным массопереносом в зоне связывания, вычисляется по формуле:

Предложенные Kuznezow W. и соавт. теоретические описания согласуются с интерферона- с помощью иммуночипа. Подставив экспериментально установленные величины коэффициента диффузии и количества сайтов связывания, авторы определили, что время выхода в режим стационарного потока варьирует от нескольких секунд до 15 минут.

Особый интерес вызывают теоретические описания миниатюризированных характеризуется изменением кинетики массопереноса и особенностями распределения связывающегося соединения в пространстве [226]. Кроме того, поверхностная плотность иммобилизованных реагентов может сильно варьировать от участка к участку, что при малых размерах зон связывания ухудшает воспроизводимость результатов иммуноанализа.

В работе Zhao M. и соавт. [227] описаны ограничения массопереноса в проточных иммуноаналитических системах, вызываемые уменьшением зон связывания. Скорость потока влияет на время контакта антигена и антитела, а соответственно – и на эффективность образования иммунного комплекса. Максимальная степень связывания аналита на фронтальной границе микрозон отмечается при низкой скорости потока, что вызвано концентрационным истощением реагента при движении вдоль зоны связывания. С ростом скорости потока увеличивается ширина окрашенной части зоны.

Иммунореагент, иммобилизуемый на мембране, распределяется неравномерно и концентрируется по периметру зоны. Это неравномерное распределение при низкой скорости потока вызывает еще большую неравномерность связывания и отклонения от теоретической модели [227].

Рассмотрим математические описания иммунохроматографических тест-систем.

Особенностью гетерогенных тестов является отличие иммунохимических свойств реагентов в растворе и в иммобилизованном состоянии. Рассмотрение процессов, происходящих при проведении ИХА, требует учета свойств мембранных носителей [228; 229]. В работе [228] проводилось сравнение мембран трех производителей: Grace Bio-Labs (США), GE Whatman (Великобритания) и Sartorius (Германия). Несмотря на одинаковый химический состав, мембраны отличаются по размерам пор и их взаимному расположению, что влияет на распределение иммобилизованного иммунореагента и, как следствие, может вызывать неравномерное окрашивание зон связывания.

Qian S. и Bau H.H. предложили модели, описывающие процессы в иммунохроматографических тестах при проведении конкурентного и сэндвич анализа [230; 231]. Модели рассматривают реакции первого порядка с предварительной инкубацией образца и конъюгата маркер-антитело, т.е. детектирующий конъюгат не наносится предварительно на тест-полоску, а добавляется в виде раствора к пробе. Это упрощение позволяет считать, что весь аналит пробы связывается с конъюгатом и попадает на мембрану. При создании моделей были приняты следующие приближения:

- иммобилизованный иммунореагент не изменяет структуру мембраны и ее проницаемость для жидкости;

- частицы маркера движутся вместе с потоком жидкости и не остаются внутри пористой матрицы мембраны.

Для конкурентного формата анализа модель устанавливает следующую зависимость равновесной концентрации комплекса антиген – антитело ([PAe]) от параметров системы:

где [А0] – исходная концентрация аналита в пробе; [Р0] – исходная концентрация антител в конъюгате с маркером; kd1 и ka1 – константы диссоциации и ассоциации для реакции A+PPA.

Скорость образования комплекса антиген – антитело (PA) пропорциональна концентрациям свободных антигена и конъюгата. В аналитической зоне образуется комплекс конъюгата антитело-маркер (A) с иммобилизованным на мембране антигеном (RT). Скорость образования этого комплекса (FRTP) описывается формулой:

где kd2 – кинетическая константа диссоциации комплекса антиген – антитело; ka2– иммобилизованного антигена.

Используя начальные концентрации реагентов и кинетические константы ассоциации и диссоциации иммунохимического взаимодействия, авторы предложили следующую формулу для теоретического расчета величины аналитического сигнала – связывания маркера в аналитической зоне иммунохроматографической тест-полоски:

Исходя из аналогичных приближений, в работе [231] Qian S. и Bau H.H.

предложили математическое описание «сэндвич»-формата ИХА. Для данной модели концентрация комплекса маркер-антитело – антиген – антитело (RPA), образующегося и детектируемого в аналитической зоне, определяется в соответствии с формулой.

где kd2 – кинетическая константа диссоциации комплекса антигена и антител, иммобилизованных на мембране; kd3 – кинетическая константа диссоциации комплекса RPA; ka2 – кинетическая константа ассоциации комплекса антигена и антител, иммобилизованных на мембране; ka3 – кинетическая константа ассоциации комплекса RPA; [P0] – начальная концентрация антител в конъюгате антитело–маркер; [R0] – начальная концентрация иммобилизованных антител; [A0] – начальная концентрация свободного аналита.

Полученные математические описания конкурентного и «сэндвич»-определения аналитов согласуются с экспериментальными результатами [230; 231].

Влияние расположения аналитических зон на предел обнаружения в «сэндвич»формате иммунохроматографического анализа рассмотрено Ragavendar M.S. и Anmol C.M. [232]. Авторами предложены математические описания процессов, протекающих до попадания реагентов в аналитическую зону и непосредственно в аналитической зоне. Моделирование в работе [232] основывается на предположении об одинаковой скорости движения всех реагентов по мембране. До попадания в аналитическую зону конъюгат маркер-антитело образует комплекс с аналитом (РА).

Аналитическая зона должна быть расположена на таком расстоянии от мембраны с конъюгатом, которое позволяет концентрации комплекса РА достигнуть максимального значения. С использованием расчетных значений концентрации комплекса РА в статье определено, что это расстояние зависит от скорости капиллярного потока и для разных типов мембран варьирует от 2,4 до 12,1 см.

Показано, что аналитическую зону, расположенную на оптимальном расстоянии, фронт жидкости достигает в среднем за 240 с.

Кроме того, по мнению Ragavendar M.S. и Anmol C.M., необходим выбор оптимальной ширины аналитической зоны, которая регулируется скоростью и объемом нанесения реагентов на мембрану при изготовлении тест-системы. Ширина аналитической зоны влияет на время анализа и объем пробы, необходимые для достижения минимального предела обнаружения.

При прохождении реагентов через аналитическую зону смещается равновесие иммунохимической реакции в растворе. Степень этого смещения зависит как от концентрации иммобилизованного реагента, так и от скорости потока. Чем больше время прохождения, тем существеннее изменяются концентрации реагентов. Для поддержания этих концентраций на постоянном уровне необходимо увеличение объема пробы, проходящего через аналитическую зону.

Представленные результаты моделирования позволяют утверждать, что возможности существующего теоретического аппарата как средства прогнозирования свойств гетерогенных иммунохимических тест-систем весьма ограничены.

Аналитические характеристики разрабатываемых тест-систем и условия, необходимые для достижения анализом минимального предела обнаружения, должны определяться экспериментально. Тем не менее, значения констант связывания иммунохимической реакции в существенной степени влияют на возможности иммуноанализа и в связи с этим должны учитываться при его разработке.

Как следует из представленного рассмотрения литературы, на сегодняшний день успешно реализован ряд подходов для экспрессного определения аналитов с помощью иммунохимических тест-методов. Однако необходимость одновременного определения нескольких соединений требует разработки новых тест-систем, перспективными методическими решениями для которых являются пространственное разделение аналитических зон и использование маркеров с разными оптическими свойствами.

Поэтому целью данной диссертационной работы является изучение свойств комплексов антител с нанодисперсными носителями и их применение в разработке новых иммунохроматографических тест-систем.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:

охарактеризовать размерные и оптические свойства комплексов антител с наномаркерами разной природы, определить и сопоставить кинетические и равновесные константы взаимодействия с антигеном конъюгата антитело–флуоресцентный маркер и немодифицированных антител, изучить закономерности взаимодействия иммунореагентов, меченных нанодисперсными маркерами, в иммунохроматографических тест-системах с фото- и флуориметрической детекцией и провести сравнительную оценку этих тест-систем, разработать иммунохроматографические тест-системы с одним и несколькими флуоресцентными нанодисперсными маркерами и определить их аналитические параметры, иммунохроматографии посредством проведения анализа с двумерно упорядоченным массивом зон связывания разной специфичности.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 
Похожие работы:

«Лыкшитова Людмила Станиславовна ЭКОЛОГО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ MALUS BACCATA (L ), ULMUS PUMILA (L ), SYRINGA VULGARIS( L. ) К ВОЗДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.01 – ботаника (биологические науки) 03.02.08 – экология (биологические науки) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ...»

«ЧУДНОВСКАЯ ГАЛИНА ВАЛЕРЬЕВНА БИОЭКОЛОГИЯ И РЕСУРСЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант : Чхенкели Вера Александровна, доктор биологических наук, профессор Иркутск – СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1. Обзор литературы по состоянию проблемы исследований ресурсов лекарственных растений.. 1.1...»

«Сафиуллина Регина Ринатовна ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО ПОД РАСТЕНИЯМИ-ФИТОМЕЛИОРАНТАМИ В ЗАУРАЛЬЕ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 03.02.13 – Почвоведение 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«МИЛАНОВСКИЙ Евгений Юрьевич ГУМУСОВЫЕ ВЕЩЕСТВА КАК СИСТЕМА ГИДРОФОБНОГИДРОФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Специальность 03.00.27 - почвоведение Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2006 Работа выполнена на кафедре физики и мелиорации почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Официальные оппоненты :...»

«Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и в отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук...»

«Дулепова Наталья Алексеевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ РАЗВЕВАЕМЫХ ПЕСКОВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., c.н.с., А.Ю. Королюк Новосибирск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 1.1. Район и объект исследования 1.2....»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВНУТРИУТРОБНЫХ ПНЕВМОНИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ИСХОДОМ 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц, доктор медицинских наук, профессор Г.Г. Фрейнд Пермь – ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....»

«ЧИКИНА ЕЛЕНА ЭНГЕЛЬСОВНА ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНЫХ СИНУСИТОВ 03.00.02 - биофизика 14.00.04 – болезни уха, горла и носа Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор О.В. Мареев кандидат физико-математических наук А.Н. Башкатов Саратов - 2005 г....»

«ПОПОВ АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ ТАМНО – И ДЕНДРОБИОНТНЫХ ПИЛИЛЬЩИКОВ (HYMENOPTERA, SYMPHYTA) ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук Н.Н. Винокуров Якутск – ОГЛАВЛЕНИЕ Введение. Глава 1. История исследований пилильщиков...»

«Жданова Оксана Леонидовна Математическое моделирование естественной эволюции структурированных биологических популяций и эволюционных последствий промысла Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Научный консультант чл.-корр. РАН, профессор Фрисман Е.Я....»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.б.н., с.н.с. Картавцева Ирина Васильевна Владивосток –...»

«МИХЕЕВ ВЯЧЕСЛАВ АРКАДЬЕВИЧ ЭКОЛОГИЯ СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ CARASSIUS AURATUS GIBELIO Bloch ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ КУЙБЫШЕВСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА 03.00.16. – Экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н., профессор В.А. НАЗАРЕНКО Ульяновск, ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ... Глава I. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКОЛОГИИ СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ. Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.. Глава...»

«Гегерь Эмилия Владимировна ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ТЕХНОГЕННЫХ НАГРУЗОК ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – Экология...»

«МАКСИМОВ ДАНИИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗЛИЧИЯ В ХРОМОСОМНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКА SUUR В РАЗВИТИИ DROSOPHILA MELANOGASTER КОРРЕЛИРУЮТ С АКТИВНОСТЬЮ ГЕНОВ И СОСТОЯНИЕМ ХРОМАТИНА Молекулярная генетика – 03.01.07 Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н. Белякин Степан Николаевич Новосибирск...»

«НОВИКОВ Сергей Геннадьевич ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ТЯЖЁЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ПОЧВ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ПО КАТЕГОРИЯМ ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ (НА ПРИМЕРЕ Г. ПЕТРОЗАВОДСКА) Специальность 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Федорец Наталия Глебовна...»

«Захаров Алексей Борисович Дендроиндикация загрязненности окружающей среды урбанизированных территорий на примере искусственных популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) Балахнинской низменности 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель :...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 - экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1. Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1...»

«ДЖАМБЕТОВА ПЕТИМАТ МАХМУДОВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ В ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Сычева Л.П.; доктор биологических наук Рубанович А.В. Грозный –  ...»

«Юсупов Ильдар Равилевич ЕСТЕСТВЕННОЕ ВОЗОБНОВЛЕНИЕ ЕЛИ СИБИРСКОЙ (PICEA OBOVATA LEDEB.) И ПИХТЫ СИБИРСКОЙ (ABIES SIBIRICA LEDEB.) В ПРОВИНЦИИ ШИРОКОЛИСТВЕННО-ТЕМНОХВОЙНЫХ ЛЕСОВ ЮЖНОГО УРАЛА (НА ПРИМЕРЕ ЮЖНО-УРАЛЬСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО ЗАПОВЕДНИКА) Специальность 03.02.01 – ботаника диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.