WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ СИСТЕМ ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Т4 И PHIKZ И НЕКОТОРЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Рисунок 3.20 - Фурье-спектры для гидрофобной группы аминокислот в символьных последовательностях трансмембранных белков: bR, sR2, hR В спектре Фурье для последовательности bR (длиной L = 262 a.о.) (рисунок 3.20) четко проявился пик с периодом Т = 33 и относительной интенсивностью I(T) = 3.5, для которого по формуле (2.13) находим NTMD = 7, что совпадает с известным числом альфа-спиралей в структуре этого белка [178].

В спектре последовательности белка sR2 на рис. 3.20 очевиден пик с частотой n = 6, периодом T6 = L/n = 39.8 и очень большой интенсивностью I(T6) = 8.38. Но частота этого пика оказывается двукратной к частоте n = другого, менее интенсивного пика с периодом T3 = L/n = 79.7, слишком вышеприведенного замечания оба этих кратных по частоте пика можно исключить из рассмотрения. Следующим по интенсивности I(T) = 2.12 среди пиков с большим периодом 20 Т 80 является пик с периодом T = 29.7 и частотой n = L/T 8. Для него по формуле (2.13) вычисляем число NTMD = 7, что опять совпало c числом TMD в структуре белка, описанной в работе [178]. Заметим, что у этой цепи длиной L = 239 a.о. есть 7 TMD различной длины (22, 22, 22, 23, 28, 28, 33 a.о.), и 8 TPD имеют очень разные длины (3, 8, 14, 3, 4, 4, 8, 17 a.о.).

В спектре последовательности hR имеется пик с относительно большой интенсивностью I(T8) = 2.48, большим периодом Т8 = 36.4 и частотой n = 8, для которого NTMD = 7, что снова совпадает c числом TMD в предсказываемой по аналогии (“similarity” [178]) структуре этого белка. В спектре Фурье присутствует также пик, сравнимый с вышеуказанным по интенсивности I = 2.33 и периоду Т = 29.1. Это, по-видимому, обусловлено существенными нарушениями периодичности белковой последовательности hR по сравнению с bR и sR2. По данным о ее структуре длины TMD, примерно, одинаковы (26, 24, 22, 24, 23, 24, 29 a.о.), а длины TPD (30, 6, 34, 3, 3, 12, 9, 22 a.о.) очень сильно (до 10 раз) отличаются [178]. В этом состоит особенная сложность этого белка.

последовательности (bR, sR2, hR) содержат в своей структуре по 7 альфаспиралей, и метод преобразования Фурье это надежно выявляет.

В Фурье-спектре последовательности белка Cx32 (рисунок 3.21) проявился пик с периодом Т = 56.6 и очень большой относительной интенсивностью I(T) = 9.8, для которого по формуле (2.13) нашли NTMD = 4, что в точности совпало с числом альфа-спиралей в вероятной структуре данного белка. И это удалось, несмотря на то, что, по известным данным трансмембранных участков, топологические домены могут значительно различаться по длине (22, 30, 35, 38, 69 a.о.), особенно “хвостовой” домен.

Белок CNG содержит 6 TMD примерно одинаковой длины (18, 23, 20, 18, 21, 25 a.о.) [178]. Тогда как длины его TPD сильно отличаются (12, 8, 13, 0, 17, 11, 5, 145 a.о.), особенно четвертого (с длиной, равной нулю, т.е. вовсе отсутствующего) и последнего – концевого. Кроме того, между пятым и шестым TMD расположен необычный участок длиной 19 a.о., примерно, как TMD, в котором гидрофобные и гидрофильные аминокислоты представлены почти поровну.

Рисунок 3.21 - Фурье-спектры для гидрофобной группы аминокислот в символьных последовательностях трансмембранных белков: Cx32, CNG, GRM Для того, чтобы упростить расчет Фурье-спектра символьной последовательности белка CNG и повысить достоверность результата, мы сначала попробовали “отрезать” хвостовой TPD. В полученном для оставшейся части цепи (длиной L = 210 a.о.) спектре (рисунок 3.21) наблюдается пик с самой большой интенсивностью I(T) = 7.85, периодом Т 30 и частотой n = L/T = 7, для которого по формуле (2.13) число альфаспиралей NTMD = 6, что соответствует известным данным о структуре белка CNG [178].

При расчете спектра Фурье (на рисунке 3.21 не показан) для полной последовательности белка CNG (с длиной цепи L = 355 без обрезания) проявился пик с наибольшей интенсивностью I(T) = 5.23 и почти тем же, что и у обрезанной цепи, периодом Т = 29.6, но другой частотой n = 12. Откуда следует значение числа NTMD = 11. Это можно понять так: к 6-ти периодам, укладывающимся на части цепи без “хвостового” домена добавились периодов, которые могли бы уложиться на “хвостовом” TPD (145/30=4.85).

Следовательно, даже если число альфа-спиралей NTMD в сложной цепи по формуле (2.13) определено неверно, то основной период T чередования TMD, все равно вычисляется правильно. В последовательности белка CNG основной период T 30, примерно, равен общим длинам пар TMD вместе с предшествующим TPD, которые составляют (30, 31, 33,..., 30, 30 a.о.).

Отметим, что здесь пропущены особые участки цепи.

Белок GRM6 имеет особенно сложную структуру [178]. Она предположительно содержит сигнальный пептид длиной 24 a.о., очень длинный (561 а.о.) первый TPD, 7 трансмембранных участков с близкими длинами (23, 21, 19, 21, 22, 23, 26 a.о.), между которыми находятся 6 TPD и в конце цепи еще один. Эти топологические домены тоже имеют разные длины (14, 11, 24, 30, 13, 13, 32 a.о.). Сначала для упрощения расчета спектра мы “отрезали” передний кусок длиной (585 а.о.), состоящий из сигнального пептида и первого TPD. Предварительная оценка среднего периода для остальной части длиной L = 292 a.о. дала T = L/7 = 41.7. В полученном для нее спектре Фурье (рисунок 3.31) очевидно, что пик с самой большой интенсивностью I(T) = 5.84 имеет тот же период T = 41.7 и частоту n = L/T = 7. Для него по формуле (2.13) получаем число NTMD = 6, что оказалось на единицу меньше числа TMD в предполагаемой структуре. Можно сказать, что здесь метод Фурье предсказал число TMD с точностью до (минус) единицы.





Затем мы получили спектр для всей, необрезанной, цепи длиной L = 877 a.о. В спектре Фурье (на рисунке 3.31 не показан) наблюдали ряд пиков с кратными частотами и слишком большим и потому маловероятным для TMD основным периодом T 60, за что эти пики можно было сразу исключить из рассмотрения. Среди пиков, подходящих по периоду (Т 40) интересен пик достаточно большой интенсивности I(T) = 2.5 с периодом Т = 41.7, тем же, что установлен в спектре Фурье, полученном для “обрезанной” цепи. Для этого периода частота n = 21 и по формуле (2.13) получили число NTMD = n– = 20, что значительно отличается от предполагаемого числа TMD в структуре, равного 7.

Следовательно, даже для всей длинной последовательности метод Фурье позволяет правильно определить, если не число TMD, то период их следования в трансмембранной части цепи.

Таким образом, данное исследование периодичности трансмембранных белков методом Фурье показало следующее. Если некоторые элементы, части последовательности повторяются практически периодически, то и период повторения T, и число NTMD трансмембранных участков в цепи определяются верно, как для белков bR, sR2, hR и Cx32. Если же периодичность есть лишь на части последовательности, а на другой ее части трансмембранной части цепи, как “обрезанной”, так и “необрезанной”, определяется по спектру Фурье верно, а вычисленное по его значению число TMD в “необрезанной” цепи может оказаться неверным.

Чтобы преодолеть этот недостаток, был предложен и использован другой метод компьютерного анализа символьной последовательности белка, также описанный в главе 2, а именно, следующий.

Компьютерный анализ расположения трансмембранных участков белка методом многократного усреднения функции гидрофобности внутри перемещаемого вдоль цепи “окна”. На рисунке 3.22 представлены результаты усреднения функции гидрофобности для последовательности белка Cx32 по самой простой и грубой шкале H1(i) в таблице 2.1.

Очевидно, что, если исключить из рассмотрения два узких пика на краях графика функции f4(k), то оставшиеся 4 широких пика, превышающие средний уровень u = fn(k) = 0.49, как раз будут соответствовать четырем TMD в предполагаемой структуре этого белка. В графике функции f2(k) второй TMD еще не разрешен, на его месте и в других местах присутствуют несколько узких пиков.

Рисунок 3.22 - Функции гидрофобности fn(k) для Cx32 после усреднения при n = В случае последовательности белка bR обработка с тем же набором гидрофобных аминокислот не позволила правильно определить на среднем уровне f4(k) все 7 его трансмембранных участков: пара последних слилась в один, другие два (3 и 5) оказались разделенными на два участка. Чтобы обработать описанным методом функции f(k) этого белка, больше подошла предложенная в работах [154, 179] гидрофобная группа, которая включала в себя аминокислоты: C, F, I, L, M, V, W.

На рисунке 3.23 представлены результаты, полученные для bRпоследовательности с использованием этой гидрофобной группы и шкалы гидрофобности H2(i) в таблице 2.1.

Очевидно, в отличие от функции f2(k) на графике, соответствующем f4(k), выше среднего уровня u = 0.41 разрешены все 7 TMD, известные для структуры bR [178].

Рисунок 3.23 - Функции гидрофобности fn(k) для bR после усреднения при n = и n = 4 по шкале H2[i] и усреднения при n = 5 по шкале H4(i) в таблице 2. Затем функцию f(k) несколько усложнили. В соответствии с работой [179] использовали деление 20 аминокислот по величине их гидрофобности на 3 группы: гидрофобные – C, F, I, L, M, V, W – всего 7; гидрофильные – D, E, G, K, N, P, Q, R, S, T – всего 10; нейтральные – A, H, Y – всего 3.

Гидрофильным аминокислотам в шкале HN(i) присвоили значение 1, гидрофобным – значение +1, нейтральным – значение 0. Так получили грубую шкалу H3(i) в таблице 2.1. На рисунке 3.24 приведены графики рассчитанных с использованием этой шкалы функций f2(k) и f4(k) для bR. На графике, соответствующем f4(k), выше среднего уровня u = 0.01 определены все 7 TMD [178].

На рисунке 3.23 представлена также функция f5(k) после усреднения по более точной шкале гидрофобности H4(i), приведенной в работах [154, 179].

Очевидно, что на среднем уровне f(k) = 0.76 не разрешен ни один TMD, а выше некоторого уровня f5(k) = 0.83, граничного для гидрофобной и нейтральной групп аминокислот, разрешены все те же 7 TMD.

Рисунок 3.24 - Функции гидрофобности fn(k) для bR после усреднения при n = По пересечению графика функции fn(k) с прямой среднего уровня u = f(k) определяли границы трансмембранных участков (TMD) различных белков, которые приведены в таблице 3.1. В той же таблице для сравнения приведены границы TMD из работы [178]. С учетом погрешностей kd/ определения границ TMD-участков можно признать хорошим согласие результатов расчета положения границ TMD и данных работы [178].

Отметим, что обработка с многократным (45 раз) усреднением функции гидрофобности fn(k) при использовании разных шкал, грубых отличающиеся значения. Иногда эти различия незначительны, а иногда существенны. Так, для белка GRM6 применение шкал H3(i) и H4(i) выявило только 6 TMD вместо 7, как и преобразование Фурье. А применение шкал H5(i) и H6(i) определило все 7 TMD, предполагаемых в его структуре.

Напротив, для белка bR расчет по шкалам H2(i)H4(i) показал все 7 TMD, а по шкале H5(i) – только 6 TMD.

Таблица 3.1 - Сравнение с известными данными сайта [178] границ TMD, вычисленных при обработке функций гидрофобности fn(k) при n = 4 и n = 5** по шкалам H3(i) и H5(i) для шести различных мембранных белков Код Источник В работах [183185] метод “скользящего окна” с однократным усреднением значений плотности окружения, или гидрофобности, или заряда аминокислотных остатков в последовательностях глобулярных и “нативноразвернутых” белков применяли в программе FoldAmyloid [186] для предсказания агрегационных и амилоидогенных участков. Эти участки так же, как и трансмембранные участки в мембранных белках, обогащены гидрофобными остатками. Поэтому указанная программа может быть использована для предсказания трансмембранных -спиралей.

Попытка применить программу FoldAmyloid с окном шириной 11 a.о. к вышеуказанным шести белкам, исследованным в данной работе, оказалось отчасти удачной. В случае четырех белков (sR2, hR, Cx32, GRM6) границы трансмембранных участков определены практически правильно, почти также как в таблице 3.1. Результаты хуже для двух белков: у bR четвертый TMD участок вообще не определен, а первый и седьмой разделены на 2 части каждый, у CNG первый TMD участок не обнаружен.

В целом, границы трансмембранных участков в указанных шести белках с использованием программы FoldAmyloid определены, на наш взгляд, не лучше, чем предлагаемым методом многократного усреднения функции гидрофобности по каждый раз изменяющейся ширине скользящего окна. Заметим, что в данной работе установлена как оптимальная ширина окна 911 a.о. Поиск трансмембранных участков приводит к гораздо худшим результатам в обоих сравниваемых методах при ширине окна 5 a.о., рекомендованной для программы FoldAmyloid в работе [185].

При дополнительном тестировании и сравнении между собой методы, алгоритмы которых изложены в данной работе, кроме шести вышеописанных белков применили еще к 18 белкам (результаты в таблице 3.2), вторичная структура которых, экспериментально определенная или предсказанная другими методами, представлена также и на сайте [178]. Это белки из интересовавших нас и рассмотренных выше групп bR, sR, hR и connexin с кодами из следующего ряда: O93740, P42197, P71411, P25964, P33743, O93743, P16102, Q48314, O93741, O93742, P33742, P28230, O75712, Q6PEY0, P28235, P28234, Q96KN9, P23242.

Таблица 3.2 - Сравнение с известными данными [178] границ TMD, вычисленных при обработке функций гидрофобности fn(k) при n=4 и n=5** P02945 H3(i), 262 aa P42196 H3(i), 239 aa P08034 H3(i), 283 aa Результаты тестирования при исследовании в общей сложности белков показали, что с помощью метода с использованием преобразования Фурье число трансмембранных участков NTMD правильно определено по формуле (2.13) для 14 белков, а в 10 случаях оказалось на 12 TMD больше (или меньше), чем иными методами.

Тестирование другого предложенного в данной работе и выраженного формулой (2.14) метода (каскадного усреднения функции гидрофобности в пределах скользящего окна) показало, что из 24 исследованных этим новым методом белков число трансмембранных участков правильно определено для 19 белков (в 79% случаев), а в пяти случаях (коды белков в таблице 3. выделены серым тоном) выявлено на 1 TMD больше, чем иными методами.

Кроме того, для 19 белков, с верно определенным числом TMD, разногласие с результатами других методов в положении границ TMD не превосходит ошибок их определения (k 6) у 182 границ из 224, т.е. в 81% случаев.

Выводы о применимости предложенных компьютерных методов предсказания структуры мембранных белков по их аминокислотной последовательности.

1. Повторяемость расположения аминокислот гидрофобной (и/или гидрофильной) группы в белковых последовательностях один из признаков вторичной и третичной структуры белка. Это верно для фибриллярных, глобулярных и мембранных белков.

2. Если повторяемость периодическая, то эту периодичность можно выявить, применяя известный метод преобразования Фурье к цифровому образу символьной последовательности аминокислот белка. В данной работе этот метод применили к 24 трансмембранным белкам, для 14 из них – успешно. Число трансмембранных участков, определяемое по формуле (2.13) через основной период повторяемости аминокислот гидрофобной группы в белковой последовательности, правильно выявлено для 58% исследованных белков. Невысокое значение этой доли обусловлено отклонением от периодичности в последовательностях значительной части белков. Оценить местоположение и протяженность гидрофобных участков этим методом можно лишь очень грубо, с точностью до половины основного периода повторяемости гидрофобных аминокислот в последовательности белка.

3. Если повторяемость трансмембранных участков непериодическая, то для ее выявления можно использовать другой метод – с многократным ( раз) усреднением функции гидрофобности белка в пределах перемещаемого вдоль последовательности “окна” шириной 911 a.о. Этот новый метод применен к тем же 24 трансмембранным белкам (успешно для 19 из них) и показал большую, чем метод Фурье, пригодность для прогнозирования функциональных свойств.

предпочтительным оказался метод многократного (45 раз) усреднения функции гидрофобности f(k) белка внутри “окна” шириной 911 a.о., перемещаемого вдоль аминокислотной последовательности. Число трансмембранных участков правильно предсказано этим методом для 79% трансмембранных участков составляет 81%.

5. Шкала и функция гидрофобности могут быть заданы многими способами известно более 30. Сравнение различных шкал и функций гидрофобности, выполненное в данной работе, показало, что определяемое с их использованием число и расположение трансмембранных участков часто практически одинаковы, даже для очень простых (грубых) шкал, например, H2(i) и H3(i) (см. таблицу 2.1). Но иногда для данного белка одна из шкал может оказаться предпочтительнее из-за того, что она позволяет лучше определить близкорасположенные трансмембранные участки.

6. Сравнение результатов, полученных в данной работе путем компьютерного анализа аминокислотных последовательностей 24 белков, с известными данными об их структуре показало применимость обоих предложенных методов, как по отдельности, так и совместно, для предсказания признаков неизвестной вторичной структуры мембранных белков и обусловленных этими признаками функциональных свойств этих белков. Ценность обоих методов простота, быстрота и экономичность применения.

3.4 Экспериментальное исследование бактериородопсина (bR) и его делеционных мутантов Предпосылки и особенности экспериментального исследования белка bR из Halobacterium salinarum. Направленный делеционный мутагенез продукта гена bR. Сложная и трудоемкая технология получения мембранных белков в кристаллическом состоянии включает в себя следующие основные стадии: создание плазмидной конструкции, содержащей ген, кодирующий данный белок; экспрессию белка в клетках реципиента; разрушение клеток и отделение клеточных мембран, солюбилизацию белка в присутствии соответствующего детергента; очистку и концентрирование белка; реконституцию белка и его кристаллизацию.

Наиболее критичными для достижения конечной цели являются стадия очистки из-за значительных потерь белка (до 40% на каждом из нескольких этапов) и стадия его кристаллизации из-за неопределенности необходимых условий ее проведения для данного конкретного белка. В силу указанных трудностей структура мембранных белков установлена к настоящему времени лишь для очень ограниченной их части ( 4%).

Для достижения высокого разрешения структуры белка необходимо, чтобы кристаллы этого белка имели очень высокое качество. Качество кристаллов зависит от многих факторов, но одним из определяющих требований является наличие достаточного количества гомогенного и чистого продукта для кристаллизации.

Целью данного экспериментального исследования являлось получение достаточного количества гомогенного и, следовательно, чистого белка бактериородопсина и его делеционных мутантов путем рекомбинантной экспрессии в грамотрицательной бактерии E. coli.

Как известно, бактериоопсин (bO), апопротеин без хромофора ретиналя, синтезируется как предшественник бактериородопсина, имеющий на N-конце сигнальную последовательность (лидерный пептид), состоящую из 13 а.о. Эти аминокислотные остатки, также как один а.о. на C-конце (Asp 249), удаляются за несколько шагов во время посттрансляционного процессирования и сборки мембраны [74, 187, 188]. Причинами негомогенности bR, полученного из ПМ Halobacterium salinarum, могут являться частичное удаление сигнальной последовательности вследствие неполного процессирования предшественника и неконтролируемого дифференциального протеолиза, а также, возможно, недостаточное удаление Asp 249. Негомогенность продукта была экспериментально подтверждена наличием многополосной картины в результатах, полученных при электрофорезе и изоэлектрическом фокусировании бактериородопсина [187, 188]. Тем не менее, авторы статьи [187] сообщают, что при достаточной аэрации становится возможным получать гомогенный bR, т.к. функция и регуляция пептидаз, ответственных за процессирование предшественника, зависят от наличия кислорода. Однако, эти же авторы говорят о том, что способность клеток производить гомогенный bR является штамм-зависимой.

С учетом этих фактов и изложенной в литобзоре (п. 1.7.3 главы 1) информаци об экспрессии bR в различных системах, преставилось целесообразным использовать в качестве системы для экспрессии bR и его делеционных мутантов гетерологичную бактериальную систему на основе грамотрицательной бактерии E. coli.

Для решения проблемы негомогенности белков у bR и двух его делеционных мутантов методами генной инженерии был удалены лидерные пептиды, а также Asp 249 с C-конца. Создание делеционных мутантов бактериородопсина было обусловлено тем, что часть аминокислотных остатков у bR дикого типа (bRWT) не видна на карте электронной плотности при расшифровке структуры, а именно, 4 а.о. с N-конца белка и 15 а.о. с Cконца белка. Это может быть обусловлено тем, что они находятся в свободном состоянии, т.е. не встроены в мембрану, что отрицательно сказывается на качестве кристалла и, соответственно, на его разрешении.

Было выяснено, что у гомологов бактериоопсина bO (SG1bO, Au2bO, HhbO), а также у галоопсина (hO) и сенсорного опсина I (sOI) сигнальной пептидазой отрезается 5 аминокислотных остатков после лидерного пептида [189]. Это было проверено для бактериородопсина с помощью программы SignalP 3.0 Server, сигнальных последовательностей в различных организмах и сайты их отрезания.

Для того, чтобы отрезать аминокислотные остатки, находящиеся в свободном состоянии на C-конце белка, с помощью методов генной инженерии необходимо ввести сайты для узнавания протеазой. Из пяти вариантов набора аминокислотных остатков, остающихся на C-конце bR после отрезания четырьмя различными протеазами, были выбраны два, наилучшим образом учитывающие возможные конформационные изменения в белке, его стабильность и фолдинг, образование дополнительных водородных связей, а значит, влияющие на качество кристаллов.

функциональных белка.

1) bR дикого типа: bRWT (248 а.о.) – отсутствует лидерный пептид, Asp 249 на С-конце.

Два делеционных мутанта:

2) bR10 (234 а.о.) – отсутствует лидерный пептид, 5 а.о. (QAQIT) на N-конце, Asp 249, 10 а.о. (AGDGAAATSD) на С-конце; введен сайт для отрезания энтерокиназой – D-D-D-D-K^.

3) bR13 (231 а.о.) – отсутствует лидерный пептид, 5 а.о. (QAQIT) на N-конце, Asp 249, 13 а.о. (EPSAGDGAAATSD) на С-конце; введен сайт для отрезания протеазой Factor Xa – I-E-G-R^.

Известно, что лидерный пептид необходим для встраивания бактериородопсина в цитоплазматическую мембрану и предотвращения его деградации [124, 190]. Как было отмечено в литобзоре (п. 1.9.3 главы 1), использование экзогенных N-концевых последовательностей помогло при встраивании bO во внутреннюю мембрану бактерии и тем самым повысило выход и стабильность белка. Привлекательной системой для экспрессии bR в E.coli представлялся гибрид bO с MBP (Maltose Binding Protein). Белок MBP кодируется геном malE и имеет на своем N-конце собственный лидерный пептид для транслокации этого белка в периплазму бактерии. Поэтому можно было предположить, что конструкция MBP-bO способна обеспечить эффективное встраивание bO в цитоплазматическую мембрану.

Доктор Р. Гриссхаммер и его коллеги, начиная с 1993 года, изучали экспрессию крысиного нейротензинового рецептора (NTR) в E. coli [168, 191, 192]. Эти исследователи сравнили уровни экспрессии у NTR дикого типа, у NTR, соединенного с N-конца с последовательностью сигнального пептида энтеротоксина B, и у NTR, соединенного N-концом с C-концом MBP [109].

Уровень экспрессии соединения MBP-NTR в 40 раз превышал уровни экспрессии в двух других случаях, что без сомнения означает, что использование соединений с геном malE является более предпочтительным вариантом. Наиболее выгодные аспекты в работе с бактериальными системами – это относительная легкость и быстрота, с которой желаемые экспрессионные конструкции могут быть разработаны, модифицированы и оценены. Доктор Р. Гриссхаммер с коллегами систематически изменял экспрессионные конструкции для NTR, каждый раз оценивая уровни выхода белка, степень очистки и эффективность. При этом из 250 г клеток ими получено и очищено до гомогенного состояния 10 мг функционального NTR [168, 169].

Белок MBP может быть легко отделен от NTR с помощью созданного методами генной инженерии сайта узнавания протеазой, находящегося в линкерной области между двумя белками. Протеаза вируса табачной мозаики (TEV) эффективно расщепляет сайт узнавания из 8-ми аминокислотных остатков, созданный между двумя белками (рисунок 3.25) [109].

NTR является интрегральным мембранным белком и относится к характеризуются тем, что имеют 7 гидрофобных трансмембранных доменов, которые соединены петлями различной длины [169]. Как известно, bR не относится к классу GPCRs, но в своей структуре также имеет 7 гидрофобных трансмембранных доменов. С учетом этого обстоятельства, а также информации, изложенной выше, было принято решение использовать одну из плазмидных конструкций, созданных доктором Р. Гриссхаммером и его коллегами для экспрессии bRWT, bR10, bR13 в E.coli.

1 белок MBP, 2 его сигнальный пептид, 3 мембранный белок. SP – обозначение сайта, по которому природная пептидаза отрезает лидерный пептид при производстве зрелого белка. TEV – сайт для разрезания TEV-протеазой, чтобы отделить два белка Рисунок 3.25 - Схематическое изображение гибрида MBP с мембранным белком бактериородопсина и его делеционных мутантов. Подробное описание делеционных мутантов в вектор v.1233 было изложено в п. 2.3.3. В данном разделе приведена краткая схема, которая была использована для получения плазмидных конструкций pl_bOWT, pl_bO10, pl_bO13.

1) Синтез фрагментов:

2) ПЦР:

3) Лигирование ПЦР-продуктов по тупым концам (SspI):

фрагмент1233 – pUCBM20/SspI bOWT – pUCBM20/SspI bO10 – pUCBM20/SspI bO13 – pUCBM20/SspI 4) Трансформация Top10 и отбор клонов, содержащих вставки, с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в 2% агарозном геле 5) Рестрикция вставок:

bOWT/AatII-XmaI bO10/Eco47III-XmaI bO13/Eco47III-XmaI fr.1233/XmaI-HindIII 6) Выделение фрагментов NA и NE из плазмиды pUC57 с помощью рестрикции:

NA/NcoI-AatII NE/NcoI-Eco47III 7) Лигирование фрагментов по липким концам:

NA – bOWT Лигирование фрагментов по тупым концам:

NE - bO NE - bO 8) Отбор вставок нужного размера с помощью электрофореза в 1% агарозном геле клонированный в плазмиду pUCBM20 фрагмент 1233 имеет ошибку в нуклеотидной последовательности:

ПЦР-фрагмент fr.1233/ XmaI-HindIII v.1233/XmaI-HindIII 10)Трансформация Top10 и отбор клонов, содержащих fr.1233, с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в 2% агарозном геле 11) Клонирование двойных вставок NA – bOWT, NE - bO10, NE - bO13 в вектор v.1233, содержащий fr.1233:

v.1233/NcoI-HindIII 12) Электропорация и отбор клонов, содержащих нужные вставки с помощью рестрикции и электрофореза в 1% агарозном геле.

pl_bO13) для экспрессии бактериородопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli удалось получить одну конструкцию pl_bOWT, содержащую ген bOWT, рисунок 3.26.

Рисунок 3.26 - Схемы плазмидных конструкций, составленные с помощью программы APE_Plasmid Editor, для экспрессии бактериоопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli: A pl_bOWT, B pl_bO10, C pl_bO электропорации было проанализировано порядка 300 клонов, но ни в одном соответственно), что было подтверждено с помощью секвенирования.

Экспрессию гена bOWT, клонированного в плазмидный вектор pl_bOWT и находящегося под контролем lac промотора, осуществляли в штамме E. coli ER2507, дефицитном по гену malE.

После экспрессии был проведен анализ белкового комплекса (fusionprotein) MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10His, имеющего молекулярную массу MW87 кДа, в состав которого входит рекомбинатный белок bOWT (рисунок 3.27). Анализ белка осуществлялся с помощью электрофореза в 10% SDSПААГ и Western blot’а, при этом белок отбирался как из общего клеточного лизата, так и непосредственно из самих мембран.

Рисунок 3.27 - Схема белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10His (MW кДа), содержащего рекомбинантный bOWT и экспрессированного с плазмиды pl_bOWT В таблице 3.3 представлено описание проведенных опытов по очистке белкового комплекса, содержащего рекомбинантный bOWT. Разработанные протоколы процедур очистки белка были подробно рассмотрены в разделе 2.3.3. Здесь же будут изложены полученные результаты.

Для солюбилизации белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxAHis (сокращенно fp_bOWT) и последующих манипуляций с ним в первых 4-х опытах по его очистке был использован детергент DM, относящийся к рекомбинантного бактериородопсина, экспрессированного в E. coli. при концентрациях DM от 0.2% до 2%.

Таблица 3.3. Описание опытов по очистке белкового комплекса, содержащего Но белок, полученный в данной экспрессионной системе, плохо солюбилизировался. Использование большей концентрации детергента могло препятствовать связыванию белка с носителем, потому что в этом случае белок окружен, так называемой, детергентной “шубой”. Следствием неполной солюбилизации белка являлось то, что аффинный хвост, в данном случае 10-His-tag, недостаточно экспонировался для связывания с носителем.

Вероятно, поэтому белок плохо связывался с носителем, и большая его часть проскакивала через колонку.

подтверждено тем, что при анализе образцов белка после очистки по методу Western blot с использованием первичных антител на гистидиновый хвост (anti-His антител) отсутствовали соответствующие сигналы на мембране, а при использовании первичных антител на MBP (anti-MBP антител) для анализа тех же белковых фракций полосы, соответствующие целевому белку, детектировались.

На рисунке 3.28 представлены результаты очистки белка на амилозном носителе (таблица 3.3, опыт 1) с использованием для солюбилизации 0.2% DM. Согласно данным руководства фирмы-изготовителя (NEB GmbH, Германия), низкая концентрация детергента обусловлена чувствительностью амилозного носителя к различным детергентам. Как видно из рисунка 3.28, большая часть белка не связывается с носителем.

Так как в первом опыте большая часть целевого белка "проскочила" через колонку, то было принято решение дочистить белок с помощью аффинной хроматографии на носителе Ni-NTA (таблица 3.3, опыт 2). Для этого фракции проскока, промыва и элюции из первого опыта были объединены и диализированы в течение ночи против лизирующего буфера, несодержащего компоненты EDTA и DTT, которые разрушают носитель NiNTA. Оказалось, что во время очистки весь белок "проскочил" через колонку, не связываясь с носителем.

Цифрами обозначены номера дорожек для рисунков A и B, соответственно:

Рисунок 3.28 - Изображения, полученные при детектировании целевого белка fp_bOWT 2-мя методами: A – электрофорез в 10% SDS-ПААГ; B по методу Western blot (опыт 1) В опыте 3, как видно на рисунке 3.29, белок плохо связывался с носителем, вероятно, из-за недостаточной солюбилизации в 1.5% DM.

1. Клетки после French press до солюбилизации 2. После солюбилизации, супернатант 3. После солюбилизации, осадок (мембраны) 4. Проскок (после загрузки супернатанта на колонку с Ni-NTA) 15. Белковый маркер Рисунок 3.29 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT с помощью электрофореза в 10% SDS-ПААГ, опыт солюбилизирован из общего клеточного лизата, т.е. без выделения клеточных мембран.

В опыте 4 выделение белка осуществлялось непосредственно из мембран с использованием 2% DM. А, именно, осадки, полученные (недосолюбилизированные мембраны) в опыте 3, были гомогенизированы в лизирующем буфере и солюбилизированы в 2% DM. После солюбилизации и ультрацентрифугирования супернатант был нанесен на колонку с Ni-NTA.

Как можно видеть из рисунка 3.30, больше всего белка находится в первой дорожке, соответствующей белку до солюбилизации. Но сравнимое количество белка присутствует и во второй дорожке, соответствующей супернатанту после солюбилизации в 1.5% DM.

Клетки после French press до солюбилизации (опыт 3) После солюбилизации, супернатант (опыт 3) После солюбилизации, осадок (мембраны) (опыт 3) Проскок (после загрузки супернатанта на колонку с Ni-NTA) (опыт 3) После солюбилизации, супернатант После солюбилизации, осадок (мембраны) 10. Белковый маркер Рисунок 3.30 - Изображение, полученное при детектировании целевого В проскоке после нанесения супернатанта (дорожка 4) белок есть, но его меньше, чем до нанесения. Кроме того, на дорожках 11-12 также видны слабые полосы, соответствующие элюированному белку. Значит, какая-то часть белка все-таки связывается с носителем, но плохо элюируется 200 mM имидазола, который был использован в элюирующем буфере в 4-х описанных экспериментах. Поэтому было принято решение увеличить концентрацию имидазола в элюирующем буфере до 500 mM.

Также стоит отметить, что, судя по множественным полосам в дорожках, белок во время солюбилизации и очистки подвергается сильной протеолитической деградации, несмотря на добавление ингибиторов протеаз.

В супернатанте после повторной солюбилизации в 2% DM белка значительно меньше, чем было до этого. Однако, это может быть связано с погрешностью переноса. Тем не менее, белок все еще есть в осадках мембран (дорожка 7).

Из описанных выше экспериментов был сделан вывод, что детергент DM плохо подходит для солюбилизации белкового комплекса MBP-TevbOWT-Tev-TrxA-10His и последующих манипуляций с ним. Поэтому нами был проведен скрининг семи детергентов для выявления наиболее подходящего детергента для солюбилизации и очистки бактериородопсина, полученного в данной экспрессионной системе. Результаты скрининга представлены в таблице 3.3 (опыт 5) и на рисунке 3.31.

Из рис. 3.31 (A) видно, что белок лучше всего солюбилизировался в соответствующих осадкам, полученным после солюбилизации мембран в этих детергентах, осадки визуально кажутся более чистыми – содержат меньшее количество неспецифики.

На рисунке 3.31 (B, C) показаны результаты очистки белка на носителе изображении B видны полосы в элюатах для 3-х детергентов - DDM, FOS-12, NLS. Визуально представляется, что в 10-11 дорожках, соответствующих детергенту NLS, белок – наиболее чистый.

суп. супернатант после солюбилизации и ультрацентрифугирования, ос. – гомогенизированный осадок (мембраны) после солюбилизации и Цифрами обозначены номера дорожек для рис. A (колонка слева), B и C (колонка справа):

Рисунок 3.31 - Изображения, полученные при детектировании целевого белка fp_bOWT двумя методами: A, C по методу Western blot, Изображение C получено при детектировании белка по методу Western blot с использованием первичных антител на гистидиновый хвост - anti-His антител. На этот раз после добавления субстрата впервые были получены исследуемом белковом комплексе. Как было сказано выше, до этого сигналы проявлялись только при использовании первичных антител на MBP (antiMBP антител). Отсюда можно сделать вывод, что детергенты DDM, NLS, FOS-12 лучше солюбилизируют белок, тем самым делая гистидиновый хвост более доступным для связывания с носителем. Судя по изображению C, нам представляется, что детергенты NLS и DDM наилучшим образом подходят для солюбилизации и очистки белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-TevTrxA-10His.

В опыте 6 белковый комплекс MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10His, полученный из мембран солюбилизацией в 1% NLS, подвергался очистке на носителе Ni-NTA. Часть белка связывалась с носителем, что было детектировано с помощью электрофореза в SDS-ПААГ и Western blotанализа с использованием anti-His антител. Оценка выхода чистого белка дала значение, примерно, 50 µg/L, что сравнимо по порядку величины с выходом белка 84 µg/L, достигнутым при экспрессии рекомбинантного bR в E.coli и его очистке на колонке Ni-NTA авторами работы [193]. Все фракции после элюирования, содержащие искомый белок, были объединены, сконцентрированы и диализированы для понижения концентрации NLS (до 0.2%) и избавления от имидазола для последующего разрезания TEVпротеазой.

Параллельно с предыдущим проводился опыт 7, направленный на проверку действия TEV-протеазы в трех детергентах, отобранных в опыте (DDM, NLS, FOS-12). Результаты, полученные в ходе этого опыта, показывают, что TEV-протеаза, несмотря на свою чувствительность к действиям детергентов, функционирует во всех трех детергентах. Как и следовало ожидать, наиболее эффективный протеолиз наблюдается в неионном детергенте DDM. Это видно на рисунке 3.27, полученном при детектировании белка с помощью электрофореза в SDS-ПААГ: на дорожке визуально наблюдается меньше всего исходного белка. Однако, на той же дорожке присутствуют полосы, которые, возможно, соответствуют неспецифичному протеолизу.

На рисунке 3.32 представлены результаты, полученные при обработке белка TEV-протеазой, очищавшегося в опыте 6, и результаты, полученные после скрининга действия TEV-протеазы в различных детергентах.

1. Белок после очистки (опыт 6) и до разрезания TEV-протеазой 2. Белок после очистки (опыт 6) и после разрезания TEV-протеазой 3. Белок после разрезания TEV-протеазой, DDM 4. Белок после разрезания TEV-протеазой, FOS- 5. Белок после разрезания TEV-протеазой, NLS Рисунок 3.32 - Изображение, полученное при детектировании целевых белков fp_bOWT и bOWT с помощью электрофореза в 10% SDS-ПААГ, опыт На рисунке 3.32 также видно, что TEV-протеаза в детергенте NLS “порезала” белок лишь частично: во 2-й и 5-ой дорожках наблюдается полоса, соответствующая по молекулярному весу исходному белковому комплексу MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10His. Однако, в дорожке 3 можно После обработки исходного белкового комплекса TEV-протеазой были измерены максимумы поглощения белка на длинах волн 280 нм и 558 нм. На 558 нм пик отсутствовал, что говорит о том, что во время экспрессии ретиналь не встроился в bO. Но это некритично, т.к. существуют методики по ренатурации bO с помощью ретиналя после экспрессии [130].

Затем была проведена очистка соответствующей дорожке 2 (рисунок 3.32) белковой смеси на колонке с носителем Ni-NTA, направленная на удаление TEV-протеазы, которая на своем N-конце имеет HQ-tag, предназначенный для связывания с Ni-носителем. При детектировании белка после очистки с помощью электрофореза в SDS-ПААГ было обнаружено, что в элюате присутствовуют TEV-протеаза и недорезанный ею белковый комплекс, который тоже связался с носителем и элюировался с помощью mM имидазола. Однако, в проскоке на уровне, соответствующем bOWT ( kDa), белок не детектировался ни с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, ни по методу Western blot. Вероятно, после протеолиза в опыте 6 белка было настолько мало, что он весь терялся в процессе очистки.

Для очистки белка, осуществленной в опытах 8 и 9 (таблица 3.3), была наработана биомасса, условия получения которой были немного изменены, а именно: после индукции экспрессии с помощью IPTG инкубацию клеток проводили при 25оС в течение 16 час, а не при 22оС. Как выяснилось с помощью электрофореза в SDS-ПААГ и анализа по методу Western blot, увеличение температуры на 3 градуса привело к тому, что основная часть белка не встроилась в мембрану, а, предположительно, осталась в цитоплазме (рисунок 3.33, дорожки 1 и 2).

На рисунке 3.33 представлены результаты очистки белка, экспрессированного при 25оС и солюбилизированного из мембран с помощью 1% NLS. Как видно из рисунка, количество белка, находящего в супернатанте (дорожка 1), т.е. не встроившегося в мембрану, значительно превышает количество белка, солюбилизированного из мембран (дорожка 2).

Кроме того, большая часть белка из мембран проскакивает через колонку, не садясь: при детектировании белка с помощью электрофореза в 10% SDSПААГ элюаты практически не видны, и детектируются по методу Western blot только при использовании первичных anti-MBP антител, но не при использовании первичных anti-His антител. Это может свидетельствовать о том, что гистидиновый хвост практически недоступен для связывания с антителами и носителем Ni-NTA.

1. Супернатант после ультрацентрифугирования при выделении мембран 2. Супернатант после солюбилизации в 1% NLS и ультрацентрифугирования 3. Проскок после загрузки супернатанта (того же, что на дорожке 2) на колонку с NiNTA 4. Промыв 5-14. Элюции 1 – 15. Белковый маркер Рисунок 3.33 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT по методу Western blot, опыт На рисунке 3.34 показаны результаты очистки белка, находившегося в цитоплазме и не встроившегося в мембрану (рисунок 3.33, дорожка 1).

После этой очистки были сделаны те же выводы, что и при анализе рисунка 3.33.

Таким образом, несмотря на то, что количество цитоплазматической фракции белка MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10His, экспрессированного при температуре 25оС в опытах 8 и 9, значительно превышает количество белка, экспрессированного при температуре 22оС и встроившегося в мембрану, белок по-прежнему плохо сорбируется на колонке Ni-NTA, что затрудняет его очистку.

Нельзя ничего определенного сказать о функциональности фракции бактериоопсина, находившегося в цитоплазме и не встроившегося в мембрану. В обзоре [194] указывалось, что экспрессия функционального белка зависит от эффективности встраивания природного полипептида в мембрану. А в статье [195] было показано, что бактериоопсин, являющийся гетерологичным мембранным белком в E.coli, встраивается в мембрану E.coli по пути, используемому нативными мембранными белками этой бактерии, т.е. направляется в мембрану с помощью signal recognition particle (SRP) и встраивается в мембрану во время трансляции.

1. Супернатант после ультрацентрифугирования при выделении мембран (рисунок 3.28, дорожка 1) 2. Проскок после загрузки супернатанта (того же, что на дорожке 1) на колонку с Ni-NTA 3. Промыв 4-13. Элюции 3 – 14. Элюция после ночи в элюирующем буфере с 500 mM имидазола 15. Белковый маркер Рисунок 3.34 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT по методу Western blot, опыт С другой стороны, авторы работ [128, 196] показали, что белковый комплекс MBP-bO может быть экспрессирован в виде телец включения, а также молекулы MBP-bO могут образовывать водорастворимые олигомеры, так называемые “белковые мицеллы”, в которых гидрофильные глобулы “белковых мицелл” в данном случае является то, что в таких мицеллах сайтспецифическое расщепление становится недоступным для протеаз, и Histag также практически не доступен для связывания с носителем, как было упомянуто выше.

Кроме того, как видно на рисунках 3.28, 3.30, 3.33, 3.34, полученных при детектировании белка по методу Western blot, белок подвергается сильной протеолитической деградации, которая также наблюдалась авторами работы [193] при экспрессии bO в E.coli.

Таким образом, выбранная экспрессионная система оказалась не оптимальной для экспрессии bR в E.coli из-за малого выхода целевого белка и трудностей, возникающих в процессе его очистки, которые приводят к практически полной потере белка. Возможные посттрансляционные гетерологичной системе, и сильная протеолитическая деградация, которой повергается белок, также могут нарушить функциональность белка, что отмечалось и в работе [193].

бактериородопсина и его делеционных мутантов.

1. Для экспрессии бактериородопсина в E. coli удалось получить одну конструкцию pl_bOWT, содержащую ген bOWT, что было подтверждено с помощью секвенирования.

2. Для двух других конструкций (pl_bO10 и pl_bO13) после электропорации было проанализировано порядка 300 клонов, но ни в одном из них не было обнаружено нужных вставок bO10 и bO13.

3. Экспрессию гена bO, клонированного в плазмидный вектор pl_bOWT, осуществляли в 5-ти различных штаммах E. coli и в 3-х различных питательных средах 2хTY, TB, LB; штамм компетентных клеток E. coli ER2507 и среда 2хTY оказались наиболее благоприятными для экспрессии бактериородопсина.

4. Проведен скрининг 7 различных детергентов (DM, DDM, CHAPS, SDS, FOS-12, NLS, LDAO) для выявления наиболее подходящего их них для солюбилизации бактериородопсина, экспрессированного в системе pl_bOWT;

при этом выяснилось, что детергент DM плохо подходит для солюбилизации белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10His и последующих солюбилизируют белок, тем самым делая гистидиновый хвост более доступным для связывания с носителем.

5. Проведен сравнительный анализ протеолитического действия TEVпротеазы в 3-х различных детергентах (NLS, DDM, FOS-12), которые лучше других подошли для солюбилизации и очистки бактериоопсина; TEVпротеаза, несмотря на свою чувствительность к действиям детергентов, функционирует во всех трех детергентах.

6. Выбранная экспрессионная система не является оптимальной для экспрессии bR в E.coli из-за объективных трудностей, возникающих в процессе очистки белка и последующего его протеолиза, которые приводят к практически полной потере белка.

Кроме того, по результатам описанного в данной главе эксперимента можно сделать ряд общих и важных выводов.

7. Чтобы получить большое количество гомогенных функциональных мембранных белков для структурных исследований, необходимо ясно понимать процессы, которые происходят в клетках-хозяевах при рекомбинантной экспрессии этих белков. Различные клетки-хозяева имеют индивидуальные биологические свойства, поэтому экспрессируемые в них мембранные белки могут отличаться последовательностью аминокислотных остатков, стабильностью и уровнем выхода.

8. Для разработки будущих экспериментов по экспрессии необходим переход от описательных исследований (с концентрацией внимания на сообщениях об уровнях экспрессии) к пониманию основных механизмов. Это поможет в решении проблемы, как соединить специфический мембранный белок с определенным вектором для экспрессии, клеткой-хозяином и условиями культивирования.

9. Дальнейший прогресс в совершенствовании использования шкалы биологической гидрофобности в математических моделях, например, в предложенном нами новом методе предсказания TMDs, может позволить рассчитывать эффективность встраивания природных полипептидов в мембрану. И таким образом мембранные белки для экспериментальных исследований с целью достижения наилучшей функциональной экспрессии могут быть выбраны на основе их последовательностей, как ранее отмечалось доктором Р. Гриссхаммером в работе [194].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Проведенное сравнение различных способов преобразования Фурье для анализа периодичности аминокислотных последовательностей в различных белках позволило выбрать дискретное преобразование рядом Фурье в качестве наиболее оптимального варианта по наибольшей достоверности частотного спектра Фурье, простоте алгоритма и экономичности вычислений.

2. При исследовании выбранным методом периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 были получены данные, позволившие выровнять аминокислотные последовательности с учетом установленных малых и больших периодов.

Оптимальный метод преобразования Фурье был также применен к трансмембранным белкам, для 14 из них – успешно.

3. Проведенный анализ аминокислотной последовательности литического фермента бактериофага phiKZ - белка gp181 - показал наличие периодичности в его С-концевой части с тем же периодом Т = 8, что и в Сконцевой части литического фермента бактериофага Т4 - белка gp5.

С учетом выявленной аналогии этих белков было выдвинуто предположение о том, что С-концевой домен белка gp181 играет роль бактериофагом phiKZ клетки, которое затем получило экспериментальное обоснование.

4. В качестве альтернативы методу Фурье в данной работе предложен новый метод компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков, основанный на применении функции и шкалы гидрофобности. Его особенность заключается в многократном усреднении функции гидрофобности внутри “окна”, перемещаемого вдоль полипептидной цепи.

Этот новый метод был применен к тем же 24 трансмембранным белкам, что и метод Фурье, для 19 из них успешно. Он показал большую, чем метод Фурье, пригодность для прогнозирования вторичной структуры такого рода белков и соответствующих ей функциональных свойств.

5. Сравнение результатов, полученных путем компьютерного анализа аминокислотных последовательностей 24 трансмембранных белков, с известными данными об их структуре показало применимость обоих предложенных методов, как по отдельности, так и совместно, для предсказания признаков неизвестной вторичной структуры мембранных белков и обусловленных этими признаками функциональных свойств этих белков.

6. Экспериментальные исследования фаговых и мембранных белков, полученных путем рекомбинантной экспрессии с использованием созданных в работе плазмид, позволило установить для них ряд структурных особенностей и свойств и сопоставить их с теоретическими предсказаниями.

В частности, белок gp181MA фага phiKZ экспрессировался полностью в растворимой форме. Белок gp181E, экспрессированный при пониженной температуре, становился растворимым в присутствии детергента и сахара.

Он оказался гидрофобным и взаимодействовал с различными штаммами клеток Pseudomonas aeruginosa, но не лизировал их, в отличие от gp181MA. Путем гель-фильтрации установлено, что белок gp181E – не мономер, а димер или тример. Спектры КД для белков gp181E и gp181MA показывают, что их вторичная структура примерно на 70% состоит из спиралей длиной около 8 а. о.

Экспериментальные данные свидетельствуют о различиях во вторичной структуре С-концевого домена белка gp181 бактериофага phiKZ и -спирали белка gp5 бактериофага Т4, что может определять различие механизмов их взаимодействия с клетками.

Благодарности. Автор благодарен д.б.н., профессору Месянжинову В.В. за предоставленную возможность выполнить часть данной работы в Лаборатории молекулярной биоинженерии ИБХ РАН.

Автор благодарит своего научного руководителя д.х.н., зав.

Лабораторией молекулярной биоинженерии ИБХ РАН Мирошникова К.А за постановку научных задач и продуктивное обсуждение результатов работы.

Автор благодарен к.ф-м.н., профессору Университета Аахена (г. Аахен, Германия), зав. Лабораторией клеточной и молекулярной биофизики Института Комплексных систем Научно-исследовательского Центра (г.

Юлих, Германия) Горделию В.И. за предоставленную возможность выполнить часть данной работы в указанной лаборатории и в Институте Структурной Биологии (г. Гренобль, Франция) и за постановку научных задач.

Автор выражает слова благодарности к.б.н. Бегуновой Е.А. за помощь в проведении биологических экспериментов, за обучение биохимическим методам эксперимента, за консультации и участие в обсуждениях исследований, дружескую поддержку и внимание.

Автор признателен к.б.н. Эдельвейс Э.Ф. за ценные советы, обсуждение молекулярно-биологических аспектов исследований и соучастие в них.

Автор искренне благодарит своего отца д.ф-м.н., профессора Симакова Н.Н. за продуктивное обсуждение результатов работы и формирование новых идей, за помощь в разработке алгоритмов численного моделирования, за ценные замечания и полезные советы при выполнении работы, а также при ее написании и оформлении, за доброту, внимание и неизменную моральную поддержку.

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

kDa - килодальтон (кДа) ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция EDTA - этилендиаминтетраацетат натрия SDS - додецил сульфат натрия (ДСН) IPTG - изопропил-1-тио--D-галактопиранозид PMSF - фенилметилсульфонилфторид Tris - гидроксиметиламинометан gp - gene product (продукт гена) п.н. - пар нуклеотидов а.о. - аминокислотный остаток о.е. - оптическая единица bR - bacteriorhodopsin (бактериородопсин) MBP - Maltose Binding Protein NTR - нейротензиновый рецептор GPCRs - G-protein-coupled receptors His-tag - гистидиновый хвост TrxA - тиоредоксин А dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат SAP - Shrimp Alkaline Phosphatase PEG - полиэтиленгликоль ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин NLS (Sarkosyl) - N-lauroylsarcosine sodium salt DM - n-Decyl--D-maltopyranoside DDM - n-Dodecyl--D-maltopyranoside FOS-12 - n-Dodecylphosphocholine LDAO - Lauryldimethylamine-N-oxide CHAPS - 3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate DTT - дитиотреитол TEV - tobacco etch virus (вирус табачной мозаики) MetOH - метанол Taq - полимераза - Thermophilus aquaticus полимераза AcONa - ацетат натрия EtOH - этанол ATP - Adenosine-5'-triphosphate NaCl - хлорид натрия Coomassie - краситель на основе трифенилметана mQ – вода Milli-Q Tween 20 – полярный неионный детергент NaN3 – азид натрия TBST - Tris-buffered saline with Tween NBT-BCIP – субстрат 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate-Nitro blue tetrazolium glycerol – глицерин Complete – ингибитор протеаз CMC - critical micelle concentration Ni-NTA - nickel-nitrilotriacetic acid TMD - трансмембранный участок-домен TPD - топологический домен

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Geidushek E.P. Regulation of expression of the late genes of bacteriophage T4 // Annu Rev Genet. 1991. Vol. 25, pp. 437-60.

2. Wood W.B. Undelivered summary remark for the 1974 Squaw Valley meeting on assembly mechanisms // J Supramol Struct. 1974. Vol. 2. No. 2-4, pp. 512Hohn B., Wutz M., Klein B., Lusting A., Hohn T. Phage lambda DNA packaging in vitro // J. Supramol.Struct. 1974. Vol. 2. No. 2-4, pp. 302-317.

4. Kaiser A.D., Syvanen M., Mazuda T. Processing and assembly of the head of bacteriophage lambda // J. Supramol. Struct. 1974. Vol. 2. No. 2-4, pp. 318-328.

5. Voyles B.A.: The biology of viruses. 1993. Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO, pp. 8-9.

6. Kikuchi Y., King J. Genetic control of bacteriophage T4 baseplate and morphogenesis. III. Formation of the central plug and overall assembly pathway // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 99. No. 4, pp. 695-716.

7. Kikuchi Y., King J. Assembly of the tail of bacteriophage T4 // J Supramol Struct. 1975. Vol. 3. No. 1, pp. 24-38.

8. Eiserling F.A. & Black L.W. Pathways in T4 morphogenesis. In Molecular Biology of Bacteriophage T4. 1994. (Karam J.D., ed.). ASM Press, Washington, DC, pp. 209-213.

9. E. Kutter, G. Mosiz et al. Genomic map of bacteriophage T4. 1993. S.J. O’Brien (Ed.), Genomic Maps, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 1-27.

10. Kostyuchenko V.A., Navruzbekov G.A., Kurochkina L.P., Strelkov S.V., Mesyanzhinov V.V., Rossmann M.G. The structure of bacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction // Structure. 1999. Vol. 7. No. 10, pp.

1213-1222.

11. Goldberg E., Grinius L. & Letteler L. Recognition, attachment and injection. In the Molecular biology of bacteriophage T4. 1994. (Karam J.D., ed.). ASM Press, Washington, DC, pp. 347-356.

12. Crowter R.A., Lenk E.V., Kikuchi Y. & King J. Molecular reorganization in the hexagon to star transition of the baseplate of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol.

1977. Vol. 116. No. 3, pp. 489-523.

13. Kanamaru S., Leiman P.G., Kostyuchenko V.A., Chipman P.R., Mesyanzhinov V.V., Arisaka F. and Rossmann M.G. Structure of the cell-puncturing device of bacteriophage T4 // Nature. 2002. Vol. 415. No. 6871, pp. 553-557.

14. Nakagawa H., Arisaka F., Ishii S. Isolation and characterisation of the bacteriophage T4 tail-associated lysozyme // J. Virol. 1985. Vol. 54. No. 2, pp.

460-466.

15. Kanamaru S., Gassner N.C., Ye N., Takeda S. and Arisaka F. The C-terminal fragment of the precursor tail lysozyme of bacteriophage T4 stays as a structural component of the baseplate after cleavage // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. No. 9, pp. 2739-2744.

16. Simon L.D., Anderson T.F. The infection of Escherichia coli by T2 and T bacteriophages as seen in electron microscope. I. Attachment and generation // Virology. 1967. Vol. 32. No. 2, pp. 279-297.

17. Yamamoto M., Uchida H. Organization and function of the tail of bacteriophage T4. II. Structural control of the tail contraction // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 92. No.

2, pp. 207-223.

18. Simon L.D., Swan J.G., Flatgaart J.E. Functional defects in T4 bacteriophage lacking the gene 11 and gene 12 products // Virology. 1970. Vol. 41. No. 1, pp.

77-90.

19. Dawes J. Characterization of the bacteriophage T4 receptor site // Nature. 1975.

Vol. 256. No. 5513, pp. 127-128.

20. Crowter R.A., Lenk E.V., Kikuchi Y., King J. Molecular reorganization in the hexagon to star transition of the baseplate of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol.

1977. Vol. 116. No. 3, pp. 489-523.

21. Watts N.R. & Coombs D.H. Structure of the bacteriophage T4 baseplate as determined by chemical cross-linking // J. Virol. 1990. Vol. 64. No. 1, pp. 143Brenner S., Streisinger G., Horne W., Champe S. P., Barnett L., Benzer S., Rees M. W. Structural components of bacteriophage // J. Mol. Biol. 1959. Vol. 1, pp.

281-292.

23. Голицына Н.Л., Селиванов Н.А., Рустамбеков О.С., Месянжинов В.В.

Выделение биологически активных половинок длинных хвостовых фибрилл и бакенбард бактериофага Т4 // Биол. Науки. 1983. №. 4. С. 27-32.

24. Селиванов Н.А., Беньяминов С.Ю., Голицина Н.Л., Николаева Л.И., Месянжинов В.В. Структура и регуляция сборки фибриллярных белков бактериофага Т4. Выделение и спектральные свойства длинных хвостовых фибрилл // Молек. Биология. 1987. Т. 21. С. 1258-1267.

25. Yamamoto M., Uchida H. Organization and function of bacteriophage T4 tail. I.

Isolation of heat-sensitive T4 tail mutants // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 52. No. 1, pp. 234-245.

26. Oliver D.B., Crowther R.A. DNA sequence of the tail fibre genes 36 and 37 of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol. 1981. Vol. 153. No. 3, pp. 545-568.

27. Dickson R.C. Assembly of bacteriophage T4 tail fibers. IV. Subunit composition of tail fibers and fiber precursors // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 79. No. 4, pp. 633Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. No. 5259, pp. 680-685.

29. King J., Laemmli U.K. Polypeptides of tail fibres of bacteriophage T4 // J. Mol.

Biol. 1971. Vol. 62. No. 3, pp. 465-472.

30. Cerritelli M.E., Wall J.S., Simon M.N., Conway J.F., Steven A.C. Stoichiometry and domainal organization of the long tail-fiber of bacteriophage T4: a hinged viral adhesin // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 260. No. 5, pp. 767-780.

31. Makhov A.M., Trus B.L., Conway J.F., Simon M.N., Zurabishvili T.G., Mesyanzhinov V.V., Steven A.C. The short tail fiber of bacteriophage T4:

Molecular structure and a mechanism for its conformational transition // Virology. 1993. Vol. 194. No. 1, p. 117- 127.

32. Earnshaw W.G., Goldberg E.B., Crowther E.A. The distal half of the tail fibre of the bacteriophage T4. Rigidly linked domains and cross-beta structure // J. Mol.

Biol. 1979. Vol. 132. No. 1, pp. 101-113.

33. Zandmeier H., Iida S., Arber W. DNA inversion regions Min of plasmid p15B and Cin of bacteriophage P1: evolution of bacteriophage tail fiber genes // J.

Bacteriol. 1992. Vol. 174. No. 12, pp. 3936-3944.

34. Michel C.J., Jacq B., Arques D.G., Bickle T.A. A remarkable amino acid sequence homology between a phage T4 tail fibre protein and ORF314 of phage lambda located in the tail operon // Gene. 1986. Vol. 44. No. 1, pp. 147-150.

35. Follansbee S.E., Vanderslice R.W., Chavez L.G., Yegian C.D. A new set of adsorption mutants of bacteriophage T4D: identification of a new gene // Virology. 1974. Vol. 58. No. 1, pp. 180-199.

36. Engel J., Prockop D.J. The zipper-like folding of collagen triple helices and the effects of mutations that disrupt the zipper // Annu. Rev. Biophys. Biophys.

Chem. 1991. Vol. 20, pp. 137-152.

37. Montag D., Riede I., Eschbach M.L., Degen M., Henning U. Receptorrecognizing proteins of T-even type bacteriophages. Constant and hypervariable regions and an unusual case of evolution // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 196. No. 1, pp. 165-174.

38. Kells S.S., Haselkorn R. Bacteriophage T4 short tail fibers are the product of gene 12 // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 83, No. 4, pp. 473-485.

39. Mason W.S., Haselkorn R. Product of T4 gene 12 // J. Mol. Biol. 1972. Vol. 66.

No. 3, pp. 445-469.

40. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Efimov V.P., Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V.

Cascade of overlapping late genes in bacteriophage T4 // Biomed Sci. 1990. Vol.

1. No. 1, pp. 55-62.

41. Zorzopulos J., Kozloff L.M., Chapman V., DeLong S. Bacteriophage T4D receptors and Escherichia coli cell wall structure: role of spherical particles and protein b of the cell wall in bacteriophage infection // J. Bacteriol. 1979. Vol.

137. No. 1, pp. 545-555.

Функциональная активность коротких фибрилл бактериофага Т4 // Докл.

АН СССР. 1982. Т. 267. С. 974-977.

43. Zorzopulos J., Kozloff L.M. Identification of T4D bacteriophage gene product 12 as the baseplate zinc metalloprotein // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253. No. 15, pp. 5543-5547.

молекулярной организации коротких фибрилл бактериофага Т4 // Докл.

АН СССР. 1984. Т. 274. С. 448-452.

45. Тяглов Б.В., Крылов В.Н., Плотникова Т.Г., Минаев И.Е., Пермогоров В.И.

Молекулярная биология. 1980. Т. 14. № 5. С. 1019-1022.

46. Mesyanzhinov V.V., Robben J., Grymonprez B., Kostyuchenko V.A., Bourkaltseva M.V., Sykilinda N.N., Krylov V.N., Volckaert G. The genome of bacteriophage phiKZ of Pseudomonas aeruginosa // J. Mol. Biol. 2002. Vol.

317. No. 1, pp. 1-19.

47. Krylov V.N., Smirnova T.A., Minenkova I.B., Plotnikova T.G., Zhazikov I.Z., Khrenova E.A. Pseudomonas bacteriophage phiKZ contains an inner body in its capsid // Can. J. Microbiol. 1984. Vol. 30. No. 6, pp. 758-762.

48. Ahearn D.G., Borazjani R.N., Simmons R.B., Gabriel M.M. Primary adhesion of Pseudomonas aeruginosa to inanimate surfaces including biomaterials // Methods Enzymol. 1999. Vol. 310, pp. 551-557.

49. Giamarellou H. Therapeutic guidelines for Pseudomonas aeruginosa infections // Int. J. Antimicrob. Agents. 2000. Vol. 16. No. 2, pp. 103-106.

50. Carlton R.M. Phage therapy: past history and future prospects // Arch. Immunol.

Ther. Exp. 1999. Vol. 47. No. 5, pp. 267-274.

51. Summers W.C. Bacteriophage therapy // Annu. Rev. Microbiol. 2001. Vol. 55, pp. 437-451.

52. Nelson D., Loomis L., Fishetti V.A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteiophage lytic enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. No. 7, pp. 4107-4112.

53. Loeffler J.M., Nelson D. and Fischetti V.A. Rapid killing of Streptococcus pneumonia with bacteriophage cell wall hydrolase // Science. 2001. Vol. 294.

No. 5549, pp. 2170-2172.

54. Loeffler J.M., Fischetti V.A. Synergistic lethal effect of a combination of phage lytic enzymes with different activities on penicillin-sensitive and -resistant Streptococcus pneumonae strains // Antimicrob. Agents Chemoter. 2003. Vol.

47. No. 1, pp. 375-377.

55. Jado I., Lopez R., Garcia E., Fenoll A., Casal J., Garcia P. Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic-resistant Streptococcus pneumonae infection in a murine sepsis model // J. Antimicrob. Chemoter. 2003. Vol. 52. No. 6, pp. 967Schuch R., Nelson D., Fischetti V.A. Bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis // Nature. 2002. Vol. 418. No. 6900, pp. 884-889.

57. Kendrew J., Bodo G., Dintzis H., Parrish R., Wyckoff H., Phillips D. A threedimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis // Nature. 1958. Vol. 181. No. 4610, pp. 662-666.

58. Deisenhofer J., Epp O., Miki K., Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 resolution // Nature. 1985. Vol. 318. No. 6047, pp. 618-624.

59. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium // Nat New Biol. 1971. Vol. 233. No. 39, pp. 149-52.

60. Haupts U., Tittor J., Oesterhelt D. Сlosing in on bacteriorhodopsin: Progress in Understanding the Molecule // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1999. Vol. 28.

No. 1, pp. 367-399.

61. Findlay J. B. and Pappin D. J. The opsin family of proteins // Biochem J. 1986.

Vol. 238. No. 3, pp. 625-42.

62. Dannon A., Stoeckenius W. Photophosphorylation in Halobacterium halobium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 71. No. 4, pp. 1234-1238.

63. Oesterhelt D. Light-energy transformation in halobacteria – a second path to the nature of photosynthesis // Nova Acta Leopoldina. 1982. NF 55, Nr. 246, 21-28.

64. Oesterhelt D., Hess B. Reversible photolysis of the purple complex in the purple membrane of Halobacterium halobium // Eur J Biochem. 1973. Vol. 37. No. 2, pp. 316-26.

65. Lanyi J. K. Light energy conversion in Halobacterium halobium // Microbiol Rev. 1978. Vol. 42. No. 4, pp. 682-706.

66. Hampp N. Bacteriorhodopsin as a photochromic retinal protein for optical memories // Chem Rev. 2000. Vol. 100. No. 5, pp. 1755-1776.

67. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism // Microbiol Mol Biol Rev. 1999.

Vol. 63. No. 2, pp. 334-348.

68. Stark M., Moeller C., Mueller D.J., Guckenberger R. From images to interactions: high-resolution phase imaging in tapping-mode atomic force microscopy // Biophys J. 2001. Vol. 80. No. 6, pp. 3009-3018.

69. Henderson R. The structure of the purple membrane from Halobacterium halobium: analysis of the X-ray diffraction pattern // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 93, No. 2, pp. 123-138.

70. Corcelli A., Lattanzio V.M., Mascolo G., Papadia P., Fanizzi F. Lipid-protein stoichiometries in a crystalline biological membrane: NMR quantitative analysis of the lipid extract of the purple membrane // J Lipid Res. 2002. Vol. 43. No. 1, pp. 132-140.

71. Shen Y., Safinya C.R., Liang K.S., Ruppert A.F., Rothschild K.J. Stabilization of the membrane protien bacteriorhodospin to 140 C in two dimensional films // Nature. 1993. Vol. 366, pp. 48-50.

72. Eisenbach M., Caplan S.R. Interaction of purple membrane with solvents. II.

Mode of interaction // Biochim Biophys Acta. 1979. Vol. 554, No. 2, pp. 281Ovchinnikov Y.A., Abdulaev N.G., Feigina M.Y., Kiselev A.V., Lobanov N.A.

The structural basis of the functioning of bacteriorhodopsin: An overview // FEBS Lett. 1979. Vol. 100. No. 2, pp. 219-224.

74. Dunn R., McCoy J., Simsek M., Majumdar A., Chang S.H., Rajbhandary U.L., Khorana H.G. The bacteriorhodopsin gene // Proc Natl Acad Sci USA.

1981. Vol. 78. No. 11, pp. 6744-6748.

75. Scherrer P., Mathew M.K., Sperling W., Stoeckenius W. Retinal isomer ratio in dark-adapted purple membrane and bacteriorhodopsin monomers // Biochemistry. 1989. Vol. 28. No. 2, pp. 829-834.

76. Hirai T., Subramaniam S. Structural insights into the mechanism of proton pumping by bacteriorhodopsin // FEBS Letters. 2003. Vol. 545. No. 1, pp. 2-8.

77. Henderson R., Baldwin J. M., Ceska T. A., Zemlin F., Beckmann E., Downing K. H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 213. No. 4, pp. 899-929.

78. Grigorieff N., Ceska T.A., Downing K.H., Baldwin J.M., Henderson R.

Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin // J.

Mol. Biol. 1996. Vol. 259, No. 3, pp. 393-421.

79. Kimura Y., Vassylyev D.G., Miyazawa A., Kidera A., Matsushima M., Mitsuoka K., Murata K., Hirai T., Fujiyoshi Y. Surface of bacteriorhodopsin revealed by high-resolution electron crystallography // Nature. 1997. Vol. 389.

No. 6647, pp. 206-211.

80. Mathies R., Lin S., Ames J., Pollard W. From femtoseconds to biology:

mechanism of bacteriorhodopsin’s light-driven proton pump // Annu. Rev Biophys Biophys Chem. 1991. Vol. 20, pp. 491–518.

81. Ebrey T.G. Light energy transduction in bacteriorhodopsin. In Thermodynamics of membranes, receptors and channels. 1993. Ed. M. Jackson, Boca Raton, Fla:

CRC Press, pp. 353-387.

82. Lanyi J.K. Proton translocation mechanism and energetics in the light driven pump bacteriorhodopsin // Biochim Biophys Acta. 1993. Vol. 1183, pp. 241-61.

83. Oesterhelt D. The structure and mechanism of the family of retinal proteins from halophilic archaea // Curr Opin Struct. Biol. 1998. Vol. 8, pp. 489-500.

84. Lanyi J. Bacteriorhodopsin //Annu Rev Physiol. 2004. Vol. 66, pp. 665-688.

85. Dancshazy Z., Groma G., Oesterhelt D., Tittor, J. The photochemical cycle of bacteriorhodopsin has no refractory period // FEBS Letters. 1986. Vol. 196, pp.

198-202.

86. Herzfeld J., Tounge B. NMR probes of vectoriality in the proton-motive photocycle of bacteriorhodopsin: evidence for an “electrostatic steering” mechanism // Biochim Biophys Acta. 2000. Vol. 1460. No. 1, pp. 95-105.

87. Herzfeld J., Lansing J. Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycle //Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2002. Vol. 31, pp. 73-95.

88. Dioumaev A.K. Infrared methods for monitoring the protonation state of carboxylic amino acids in the photocycle of bacteriorhodopsin // Biochemistry (Mosc). 2001. Vol. 66. No. 11, pp. 1269-1276.

89. Maeda A. Internal water molecules as mobile polar groups for light-induced proton translocation in bacteriorhodopsin and rhodopsin as studied by difference FTIR spectroscopy // Biochemistry (Mosc). 2001. Vol. 66. No. 11, pp. 1256Landau E.M., Rosenbusch J.P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins // Proc Natl Acad Sci. USA. 1996. Vol. 93.

No. 25, pp. 14532-35.

91. Pebay-Peyroula E., Rummel G., Rosenbusch J.P., Landau E.M. X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases // Science. 1997. Vol. 277. No. 5332, pp. 1676-81.

92. Luecke H., Richter H.T., Lanyi J.K. Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution // Science. 1998. Vol. 280. No.

5371, pp. 1934-1937.

93. Belrhali H., Nollert P., Royant A., Menzel C., Rosenbusch J.P, Landau E.M., Pebay-Peyroula E. Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: a molecular view of the purple membrane at 1.9 resolution // Structure. 1999. Vol. 7. No. 8, pp. 909-917.

94. Luecke H., Schobert B., Richter H.T., Cartailler J.P., Lanyi J.K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 resolution // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 291. No. 4, pp.

899-911.

95. Schobert B., Cupp-Vickery J., Hornak V., Smith S., Lanyi J. Crystallographic structure of the K intermediate of bacteriorhodopsin: conservation of free energy after photoisomerization of the retinal // J. Mol. Biol. 2002.Vol. 321. No. 4, pp.

715-726.

96. Edman K., Nollert P., Royant A., Belrhali H., Pebay-Peyroula E., Hajdu J., Neutze R., Landau E.M. High-resolution X-ray structure of an early intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle // Nature. 1999. Vol. 401. No. 6755, pp.

822-826.

97. Royant A., Edman K., Ursby T., Pebay-Peyroula E., Landau E. M., Neutze R.

Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in the photocycle of bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406. No. 6796, pp. 645-648.

98. Luecke H., Schobert B., Richter H.T., Cartailler J.P., Lanyi J.K. Structural changes in bacteriorhodopsin during ion transport at 2 resolution // Science.

1999. Vol. 286. No. 5438, pp. 255-261.

99. Luecke H., Schobert B., Richter H. T., Cartailler J., Rosengarth A., Needleman R., Lanyi J.K. Coupling photoisomerization of the retinal in bacteriorhodopsin to directional transport // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 300. No. 5, pp. 1237-1255.

100. Sass H. J., Bueldt G., Gessenich R., Hehn D., Neff D., Schlesinger R. et al.

Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406. No. 6796, pp. 649-653.

101. Facciotti M.T., Rouhani S., Burkard F.T., Betancourt F.M. et al. Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocycle // Biophys. J. 2001. Vol. 81. No. 6, pp. 3442-3455.

102. Vonck J. Structure of the bacteriorhodopsin mutant F219L N intermediate revealed by electron crystallography // EMBO J. 2000. Vol. 19. No. 10, pp.

2152-2160.

103. Subramaniam S., Henderson R. Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406. No. 6796, pp.

653-657.

104. Subramaniam S., Lindahl M., Bullough P., Faruqi A. R., Tittor J., Oesterhelt D.

et al. Protein conformational changes in the bacteriorhodopsin photocycle // J.

Mol. Biol. 1999. Vol. 287. No. 1, pp. 145-161.

105. Rouhani S., Cartailler J., Facciotti M., Walian P., Needleman R., Lanyi J. et al.

Crystal structure of the D85S mutant of bacteriorhodopsin: a model of an O-like photocycle intermediate // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 313, No. 3, pp. 615-628.

106. Lanyi J.K., Luecke H. Bacteriorhodopsin: Review // Curr Opin Struct Biol.

2001.Vol. 11. No. 4, pp. 415-419.

107. Lanyi J., Schobert B. Crystallographic structure of the retinal and the protein after deprotonation of the Schiff base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 321. No. 4, pp. 727-737.

108. Schertler G. Overproduction of membrane proteins // Curr Opin Struct Biol.

1992. No. 2, pp. 534-544.

109. Mancia F., Hendrickson W.A. Expression of recombinant G-Protein Coupled Receptors for structural biology // Mol BioSyst. 2007. Vol. 3. No. 10, pp. 723Bernaudat F., Frelet-Barrand A. et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host // PLoS One. 2011. 6(12):e29191, DOI:

10.1371/journal.pone. 111. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Isolation of the cell membrane of Halobacterium halobium and its fractionation into red and purple membranes // Methods Enzymol. 1974. Vol. 31, pp. 667-678.

112. Happe M., Overath P. Bacteriorhodopsin depleted of purple membrane lipids // Biochem Biophys Res Commun. 1976. Vol. 72. No. 4, pp. 1504-1511.

113. Ovchinnikov Yu.A. Bioorganic chemistry of rhodopsins // Pure Appl. Chem.

1986. Vol. 58. No. 5, pp. 725-736.

114. Овчинников Ю.А., Абдулаев Н.Г., Фейгина М.Ю., Киселев А.В., Лобанов Н.А., Назимов И.В. Первичная структура бактериородопсина // Биоорган.

Химия. 1978. Т. 4. № 11. С. 1573-1574.

115. Dunn R.J., Hackett N.R., McCoy J.M., Chao B.H., Kimura K., Khorana H.G.

Structure-function studies on bacteriorhodopsin. I. Expression of the bacterioopsin gene in E. coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9246-9254.

116. Karnik S., Nassal M., Doi T., Jay E., Sgaramella V., Khorana H.G. Structurefunction studies on bacteriorhodopsin. II. Improved expression of the bacterioopsin gene in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp.

9255-9263.

117. Nassal M., Mogi T., Karnik S., Khorana H. G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. III. Total synthesis of a gene for bacterio-opsin and its expression in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp.

9264-9270.

118. Hackett N.R., Stern L.J., Chao B.H., Kronis K.A., Khorana H.G. Structurefunction studies on bacteriorhodopsin. V. Effects of amino acid substitutions in the putative helix F // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9277-9284.

119. Hildebrandt V., Ramezani-Rad M., Swida U., Wrede P., Grzesiek S., Primke M., Bueldt G. Genetic transfer of the pigment bacteriorhodopsin into the eukaryote Schizosaccharomyces pombe // FEBS Letters. 1989. Vol. 243. No. 2, pp. 137-140.

120. Soppa J., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin mutants of Halobacterium sp. GRB. I.

The 5-bromo-2'-deoxyuridine selection as a method to isolate point mutants in halobacteria // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. No. 22, pp. 13043-8.

121. Ni B., Chang M., Duschl A., Lanyi J., Needleman R. An efficient system for the synthesis of bacteriorhodopsin in Halobacterium halobium // Gene. 1990. Vol.

90. No. 1, pp. 169-172.

122. Hampp N., Oesterhelt D. Chapter 11. Bacteriorhodopsin and its potential in technical applications. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. 2005. DOI: 10.1002/3527602453.ch11.

123. Khorana H.G. Two light-transducing membrane proteins: bacteriorhodopsin and the mammalian rhodopsin // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. Vol. 90. No. 4, pp.

1166-1171.

124. Karnik S., Doi T., Molday R., Khorana H.G. Expression of the archaebacterial bacterio-opsin gene with and without signal sequences in Escherichia coli: the expressed proteins are located in the membrane but bind retinal poorly // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. Vol. 87. No. 22, pp. 8955-8959.

125. Braiman M.S., Stern L.J., Chao B.H., Khorana H.G. Structure–function studies on bacteriorhodopsin. IV. Purification and renaturation of bacterio-opsin polypeptide expressed in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No.

19, pp. 9271-9276.

126. Shand R.F., Miercke L.J., Mitra A.K., Fong S.K. Stroud R.M., Betlach M.C.

Wild-type and mutant bacterioopsins D85N, D96N, and R82Q: high-level expression in Escherichia coli // Biochemistry. 1991. Vol. 30. No. 12, pp. 3082Miercke L.J., Betlach M.C., Mitra A.K., Shand R.F., Fong S.K., Stroud R.M.

Wild-type and mutant bacteriorhodopsins D85N, D96N, and R82Q: purification to homogeneity, pH dependence of pumping, and electron diffraction // Biochemistry. 1991. Vol. 30. No. 12, pp. 3088-3098.

128. Chen G.Q., Gouaux J.E. Overexpression of bacterio-opsin in Escherichia coli as a water-soluble fusion to maltose binding protein: efficient regeneration of the fusion protein and selective cleavage with trypsin // Protein Sci. 1996. Vol. 5.

No. 3, pp. 456-467.

129. Pompejus M., Friedrich K., Teufel M., Fritz H.J. High-yield production of bacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli // Eur J Biochem. 1993. Vol. 211. No. 1-2, pp. 27-35.

130. Nekrasova O. et al. A new hybrid protein for production of recombinant bacteriorhodopsin in Escherichia coli // J Biotechnol. 2010. Vol. 147. No. 3-4, pp. 145-150.

131. Ramachandran S., Lu H., Prabhu U., Ruoho A.E. Purification and characterization of the guinea pig sigma-1 receptor functionally expressed in Escherichia coli // Protein Expr Purif. 2007. Vol. 51. No. 2, pp. 283-292.

132. Roosild T.P., Greenwald J., Vega M., Castronovo S., Riek R., Choe S. NMR structure of Mistic, a membrane-integrating protein for membrane protein expression // Science. 2005. Vol. 307. No. 5713, pp. 1317-1321.

133. Neophytou I., Harvey R., Lawrence J., Marsh P., Panaretou B., Barlow D.

Eukaryotic integral membrane protein expression utilizing the E. coli glycerolconducting channel protein (GlpF) // Appl Microbiol Biotechnol. 2007. Vol. 77.

No. 2, pp. 375-381.

134. Ang P.G.P., Sammells A.F. Conversion of solar energy to chemical and electrical energy. U.S. Patent No. 4,215,182, July 29, 1980.

135. Bouas-Laurent H., Duerr H. Organic photochromism (IUPAC Technical report) // Pure Appl Chem. 2001. Vol. 73. Iss. 4, pp. 639-665.

136. Braeuchle C., Hammp N., Oesterhelt D. Optical application of bacteriorhodopsin and its mutated variants // Adv. Mater. 1991. Vol. 3. No. 9, pp. 420-428.

137. Birge R.R., et al. Biomolecular electronics: protein-based associative processors and volumetric memories // J Phys Chem. B. 1999. Vol. 103. No. 49, pp.

10746-10766.

138. Всеволодов Н.Н., Полторацкий В.А. Голограммы на биологическом ФХМ -биохроме // ЖТФ. 1985. Т. 55. № 10. С. 2093-2094.

139. Hampp N., Braeuchle C., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin wildtype and variant aspartate-96 aspargine as reversible holographic media // Biophys J. 1990.

Vol. 58. No. 1, pp. 83-93.

140. Birge R.R. Protein-based computers // Sci. Am. 1995. Vol. 272. No. 3, pp. 90Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino-acids sequence // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1978. Vol.

47, pp. 45-148.

142. Thornton J. M., Taylor, W. R. Structure prediction // Protein sequencing: a practical approach (Findlay, J. B. C. and Geisgow, M. J., eds.). 1989. IRL Press/Oxford University Press, Oxford, pp. 147-190.

143. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями // 2-е изд., исп. и доп. М.:

Книжный дом “Университет”, 2002. 376 c.

144. Karam J.D. Molecular biology of bacteriophage T4 // Washington, D.C.:

American Society of Microbiology. 1994, pp. 161-175.

145. Коротков Е.В., Короткова М.А., Френкель Ф.Е., Кудряшов Н.А.

Информационная концепция поиска периодичности в символьных последовательностях // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37, № 3, С. 436-451.

146. McLachlan A.D., Stewart M. The 14-fold periodicity in -tropomyosin and the interaction with actin // J. Mol. Biol. 1976. Vol. 103. No. 2, pp. 271-298.

147. Турыгин А.Ю., Чечеткин В.Р. О критериях беспорядка в апериодических последовательностях // ЖЭТФ. 1994. Т. 106. С. 335-354.

148. Макеев В.Ю., Туманян В.Г. О связи методов внутренних гомологий, корреляционных функций и Фурье-анализа при поиске периодичностей в первичных структурах биополимеров // Биофизика. 1994. Т. 39. С. 294-297.

149. Макеев В.Ю., Франк Г.К., Туманян В.Г. Статистика периодических закономерностей в последовательностях интронов человека // Биофизика.

1996. Т. 41. С. 241-246.

150. Лобзин В.В., Чечеткин В.Р. Порядок и корреляции в геномных последовательностях ДНК. Спектральный подход // Успехи физических наук. 2000. Т. 170. № 1. С. 57-81.

151. Kyte J., Doolittle R.F. A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein // J. Mol. Biol. 1982. Vol. 157. No.1, pp. 105-132.

152. Froemmel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy // J Theor Biol. 1984.Vol. 111. No. 2, 247-260.

153. Engelman D.M., Steitz T.A., Goldman A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins // Annu Rev Biophys Biophys Chem. 1986. Vol. 15, pp. 321-353.

154. Rose G.D., Geselowitz A.R., Lesser G.J., Lee R.H., Zehfus M.H.

Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins // Science. 1985.

Vol. 229. No. 4716, pp. 834-838.

155. Eisenberg D., Schwarz E., Komaromy M., Wall R. Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot // J. Mol. Biol.

1984. Vol. 179. No. 1, pp. 125-142.

156. Fraser R.D.B., MacRae T.P. Conformation in fibrous proteins and related synthetic polypeptides // Academic Press, London, New York. 1973. 628 pp.

157. Pauling L., Corey R.B. Compound helical configurations of polypeptide chains:

structure of proteins of the alpha-keratin type // Nature. 1953. Vol. 171. No.

4341, pp. 59-61.

158. Crick F.N.C. The packing of -helices: simple coiled-coil // Acta. Crystallogr.

1953. Vol. 6, pp. 689-697.

159. Efimov V.P., Engel J., Malashkevich V.N. Crystallization and preliminary crystallographic study of the pentamerizing domain from cartilage oligomeric matrix protein: a five-stranded -helical bundle // Proteins. 1996. Vol. 24. Iss. 2, pp. 259-262.

160. Cohen C., Parry D.A. -helical coiled-coiles and bundles: how to design an helical protein // Proteins. 1990. Vol. 7. No. 1, pp. 1-15.

161. Stouten P.F., Sander C., Rugrok R.W., Cusack S. New triple-helical model for the shaft of the adenovirus fiber // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 226. No. 4, pp.

1073-1084.

162. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L. et al. Molecular Cell Biology. 4th edition // New York: W.H. Freeman. 2000.

163. Lomize A.L., Pogozheva I.D., Lomize M.A., Mosberg H.I. The role of hydrophobic interactions in positioning of peripheral proteins in membranes // BMC Struct Biol. 2007. Vol. 7, pp. 44.

164. Johnson J.E., Cornell R.B. Amphitropic proteins: regulation by reversible membrane interactions // Mol Membr Biol. 1999. Vol. 16. No. 3, pp. 217-235.

165. Goni F.M. Non-permanent proteins in membranes: when proteins come as visitors // Mol Membr Biol. 2002.Vol. 19. No. 4, pp. 237-245.

166. Cho W., Stahelin R.V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005. Vol. 34, pp.

119-151.

167. Kalmbach R., Chizhov I., Schumacher M.C., Friedrich T., Bamberg E., Engelhard M. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes // J. Mol. Biol.

2007. Vol. 371. No. 3, pp. 639-648.

168. White J.F., Trinh L.B., Shiloach J., Grisshammer R. Automated large-scale purification of a G protein-coupled receptor for neurotensin // FEBS Letters.

2004. Vol. 564. No. 3, pp. 289-293.

169. Grisshammer R., White J.F., Trinh L.B., Shiloach J. Large-scale expression and purification of a G-protein-coupled receptor for structure determination – an overview // J Struct. Funct Genomics. 2005. Vol. 6, No. 2-3, pp. 159-163.

170. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning // A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Laboratory Press. N.Y. 1989, pp.1.53-1.56.

171. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning // A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratory Press. N.Y. 1989, pp. 1.34Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 189.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Похожие работы:

«ЧИКИНА ЕЛЕНА ЭНГЕЛЬСОВНА ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНЫХ СИНУСИТОВ 03.00.02 - биофизика 14.00.04 – болезни уха, горла и носа Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор О.В. Мареев кандидат физико-математических наук А.Н. Башкатов Саратов - 2005 г....»

«Кузьменко Александр Анатольевич РАСТИТЕЛЬНОСТЬ МОРЕННЫХ И ВОДНО-ЛЕДНИКОВЫХ РАВНИН ЮЖНОЙ ОКРАИНЫ СМОЛЕНСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ Специальность 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор...»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВНУТРИУТРОБНЫХ ПНЕВМОНИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ИСХОДОМ 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц, доктор медицинских наук, профессор Г.Г. Фрейнд Пермь – ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.б.н., с.н.с. Картавцева Ирина Васильевна Владивосток –...»

«МИХЕЕВ ВЯЧЕСЛАВ АРКАДЬЕВИЧ ЭКОЛОГИЯ СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ CARASSIUS AURATUS GIBELIO Bloch ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ КУЙБЫШЕВСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА 03.00.16. – Экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н., профессор В.А. НАЗАРЕНКО Ульяновск, ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ... Глава I. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКОЛОГИИ СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ. Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.. Глава...»

«Пильганчук Оксана Александровна ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА НЕРКИ, ONCORHYNCHUS NERKA (WALBAUM), ПОЛУОСТРОВА КАМЧАТКА 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Н.Ю. Шпигальская Петропавловск-Камчатский – ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....»

«Баканев Сергей Викторович Динамика популяции камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) в Баренцевом море (опыт моделирования) Специальность 03.00.18 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор А. В. Коросов Мурманск – 2009 Содержание Введение... Глава 1....»

«Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ...»

«Кулаков Сергей Сергеевич Очаговое усыхание Pinus sylvstris на юге Красноярского края в результате воздействия корневых патогенов Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.08 – Экология Научный руководитель, доктор биологических наук, профессор И.Н. Павлов Красноярск 2014 1 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. 1 Современное...»

«Орлова Ольга Геннадьевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА Специальность 03.00.07 - микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.т.н. Медведева Н.Г. Научный консультант : к.б.н.Зайцева Т.Б. Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. Обзор литературы.....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант :...»

«БУРДУКОВСКИЙ МАКСИМ ЛЕОНИДОВИЧ ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ХИМИЗАЦИИ ПОЧВ ЮГА ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА НА БИОЛОГИЧЕСКИЙ КРУГОВОРОТ И СОДЕРЖАНИЕ МАКРО– И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Голов Владимир Иванович...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«НОВИКОВ Сергей Геннадьевич ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ТЯЖЁЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ПОЧВ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ПО КАТЕГОРИЯМ ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ (НА ПРИМЕРЕ Г. ПЕТРОЗАВОДСКА) Специальность 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Федорец Наталия Глебовна...»

«Вознийчук Ольга Петровна ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО АЛТАЯ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ю.С. Равкин Горно-Алтайск – ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ...»

«ПОПОВ АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ ТАМНО – И ДЕНДРОБИОНТНЫХ ПИЛИЛЬЩИКОВ (HYMENOPTERA, SYMPHYTA) ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук Н.Н. Винокуров Якутск – ОГЛАВЛЕНИЕ Введение. Глава 1. История исследований пилильщиков...»

«Жданова Оксана Леонидовна Математическое моделирование естественной эволюции структурированных биологических популяций и эволюционных последствий промысла Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Научный консультант чл.-корр. РАН, профессор Фрисман Е.Я....»

«ДЖАМБЕТОВА ПЕТИМАТ МАХМУДОВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ В ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Сычева Л.П.; доктор биологических наук Рубанович А.В. Грозный –  ...»

«Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и в отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук...»

«Робенкова Татьяна Викторовна ПСИХОТИПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АДАПТАЦИИ СТУДЕНТОВ КОЛЛЕДЖА 03.00.13 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.Н. Васильев Томск - 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ. ВВЕДЕНИЕ..7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 1.1.Современный подход к проблеме адаптации студентов. 1.1.1. Роль стресса в...»





 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.