WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 |

«РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЁННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

«РОСТОВСКИЙ-НА-ДОНУ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ»

ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ

ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

КРЕТЕНЧУК ОКСАНА ФЕДОРОВНА

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л.П. Алексеева Ростов-на-Дону 2014 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЖ – асцитическая жидкость БСА – бычий сывороточный альбумин ГАТ – селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин ДАБ – диаминобензидин ДИА – дот-иммунофементный анализ ДМСО – диметилсульфоксид ИФА – иммуноферментный анализ КББ – карбонат-бикарбонатный буфер КЖ – культуральная жидкость ЛПС - липополисахарид МКА – моноклональные антитела МФА – метод флуоресцирующих антител НАФ – неполный адъювант Фрейнда ОП – оптическая плотность ПАФ – полный адъювант Фрейнда ПЭГ – полиэтиленгликоль РА – реакция агглютинации РИФ – реакция иммунофлуоресценции РПИФ – реакция прямой иммунофлуоресценции РНИФ – реакция непрямой иммунофлуоресценции РП – реакция преципитации ТУ – технические условия ФИТЦ – флуоресцеинизотиоцианат ФСБ – фосфатно-солевой буфер - штаммы со сниженной агглютинабельностью видовой О1 сывороткой

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………….... Гибридомная технология получения МКА………………………. 1.1.

Серологические методы исследования в лабораторной 1.2.

диагностике холеры………………………………………………...

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………… Лабораторные животные…………………………………………... 2.1.

Бактериальные штаммы………………………………………….... 2.2.

Клеточные линии позвоночных…………………………………… 2.3.

Питательные среды и реактивы…………………………………… 2.4.

Гибридизация клеток…………………………………………......... 2.5.

Клонирование гибридом…………………………………………... 2.6.

Культивирование гибридом in vitro и in vivo…………………...... 2.7.

Криоконсервирование гибридом…………………

2.8.

Подъем из жидкого азота гибридом………………………………. 2.9.

2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов……………………..

ГЛАВА 3. ГИБРИДОМЫ-ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ

Подъем из азота и оптимизация условий культивирования 3.1.

гибридом-продуцентов МКА, направленных к поверхностным Получение и выведение в массовую культуру гибридом, 3.2.

Оценка продукции специфических иммуноглобулинов 3.3.

Получение и накопление в препаративных количествах МКА в 3.4.

Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов 3.5.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА МКА, НАПРАВЛЕННЫХ К

ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЭПИТОПАМ V. CHOLERAE O1 И

Определение специфичности и активности МКА из АЖ и КЖ в 4.1.

4.2.

Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных 4.3.

вибрионов при различных способах инактивации………………. Эпитопная направленность МКА О1 и О139…………………….. 4.4.

ГЛАВА 5. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ

НА ОСНОВЕ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И

ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О

Оптимизация условий получения видоспецифических 5.1.

флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. cholerae O1 и O139 ………………………………... Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих 5.2.

препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов……………… Лиофилизация флуоресцирующих МКА……………………….... 5.3.

Оценка серологической активности флуоресцирующих 5.4.

препаратов после лиофилизации и в процессе хранения………...

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ МКА ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О

СЕРОГРУПП В РЕАКЦИИ СЛАЙД-АГГЛЮТИНАЦИИ………….. Исследование агглютинабельности МКА, выделенных из АЖ и 6.1.

КЖ, в реакции слайд-агглютинации……………………………… Получение экспериментальных серий диагностических 6.2.

агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов…………………………………………………………….. Стабильность лиофилизированных диагностических 6. агглютинирующих МКА при хранении…………………………... Оценка возможности применения диагностических наборов для 6.4.

выявления холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, подвергнутых воздействию различных факторов……………….. ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………. ВЫВОДЫ…………………………………………………………………... СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………...

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Первое десятилетие ХХI века отмечено крупными эпидемиями и вспышками холеры в странах Африки и Азии, а также Северной Америки с заносами инфекции из эндемичных очагов практически ежегодно на все континенты, с тенденцией к росту мировой заболеваемости, что определяет неблагоприятный прогноз и для России [77]. Поэтому в нашей стране постоянно проводятся мероприятия, направленные на предупреждение заноса и распространения этого особо опасного заболевания. Одной из важнейших своевременная диагностика, эффективность которой зависит от наличия высокочувствительных и специфичных препаратов для серологического анализа.





Как отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, диагностических экспресс-тестов для выявления холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких тестов.

В последние годы активно развиваются инновационные технологии по созданию рекомбинантных белков, в частности антител, получаемых с помощью молекулярно-генетических манипуляций. Благодаря разработке гибридомной технологии широкое распространение в лабораторной диагностике получили и моноклональные антитела (МКА). Уже первые МКА продемонстрировали уникальные преимущества перед поликлональными сыворотками: высокая специфичность и активность, стандартность, стабильность, возможность получения в неограниченном количестве. Очевидно, что МКА в силу своей уникальной направленности к индивидуальным антигенным детерминантам диагностических наборах на моноклональные начался еще в начале 80-х годов и активно продолжается в настоящее время в направлении создания новых препаратов на основе МКА [37]. Зарубежные публикации, касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились еще в 1982 году, то есть намного раньше, чем отечественные. B. Gustafsson et al. получили МКА к коровой области ЛПС V. cholerae О1, которые выявляли в реакции слайдагглютинации антигенную детерминанту, общую для всех представителей вида V. cholerae [132]. Также этой группе авторов удалось получить МКА к A-, B- и Сантигенам О1, на основе которых были приготовлены флуоресцирующие препараты для экспресс-диагностики холерных вибрионов О1.

высокоэффективные тест-системы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г.

создали набор для выявления V. cholerae О139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции [134]. Несомненно, такие препараты эффективны и полезны как в случае ранней диагностики холеры, так и на различных этапах исследования. В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия. В отечественной практике сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28, 30].

В диссертации О.С. Бурлаковой (1993 г.) показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae О1 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов Для экспресс-диагностики токсигенных штаммов V. cholerae З.Л. Девдариани с соавторами в 1999 г.

Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae О139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. С 2000 г. в Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в иммунохроматографических (ИХ) тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11].

Результаты испытания полученных ИХ тест-систем для выявления V. cholerae О показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы О серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 108 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами (2010 г.) сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+» [22]. Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108 - 109 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. Экономически затратным является и производство ИХ полосок, так как их себестоимость в итоге получается достаточно высокой. Из современных технологий обращает на себя внимание технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами [80] описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа. Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа. Присутствие в пробах с холерным токсином молока, мясного бульона и воды из открытого водоема не снижает чувствительность методов. Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки. Однако сложная технология приготовления наряду с высокой себестоимостью анализа ограничивает возможность их использования практическими лабораториями, которым требуются высокочувствительные, специфичные и простые экспресс-методы. На сегодняшний день в лабораторной диагностике холеры согласно МУК 4.2.2870- используются лошадиные агглютинирующие О1-сыворотки, иммуноглобулины О1 флуоресцирующие и кроличья агглютинирующая О139-сыворотка производства института «Микроб». Однако существующие препараты не отвечают в полной мере современным требованиям, так как обладают рядом недостатков: разнородность и гетерогенность популяций антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов, наличие перекрестных реакций. Применение представителями холерных вибрионов не О1/не О139, среди которых увеличивается число штаммов, агглютинирующихся холерной сывороткой О1 в низком титре [70]. Проблема повышения качества диагностических препаратов и, как следствие, повышение достоверности лабораторной диагностики холеры была и остатся в центре внимания специалистов. В институте «Микроб» в последние годы разработан новый диагностический препарат для выявления холерных вибрионов О139 с помощью прямого метода иммунофлуоресценции [13, 14]. В технологии предусмотрено получение кроличьей сыворотки путем иммунизации убитыми клетками вибрионов и для удаления неспецифических антител необходима неоднократная адсорбция близкородственными микроорганизмами, что сопровождается значительными потерями специфических иммуноглобулинов и соответственно отражается на качестве препарата. Несмотря на неоднократную адсорбцию, не удается избавиться от антител, обеспечивающих перекрестную активность с V. cholerae О22. Одним из перспективных направлений является создание на основе МКА флуоресцирующих и агглютинирующих препаратов для выявления V. cholerae О1 и О139, так как в ряду других иммунодиагностических тестов, предназначенных для ранней диагностики холеры, эти методы обладают рядом преимуществ: экспрессность анализа и простота исполнения.

совершенствование и разработку новых холерных иммунодиагностикумов, не утратили своей актуальности и практической значимости.

Цель исследования – совершенствование лабораторной диагностики холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакциях прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.

Задачи исследования:

1. Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых, продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных вибрионов О1 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность, аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.

2. Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА, провести их очистку с помощью различных методов, оценить их специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции, слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.

3. Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для выявления V. сholerae О1 и О139 в реакции прямой иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов в лиофилизированном виде.

4. Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА О1, МКА О139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые агглютинирующие МКА.

5. Провести лабораторные испытания экспериментальных серий видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА О1, МКА О139, оформить нормативную документацию для их государственной регистрации.

Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми располагает лаборатория, расширен за счет получения новых, продуцирующих МКА, направленные к детерминантам О-антигена ЛПС V. сholerae О1. На основании иммунохимического анализа штаммов холерных вибрионов О1 и О серогрупп установлены диагностически значимые МКА, отличающиеся тем, что они выявляют консервативные эпитопы ЛПС с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности, пространственно расположенные так, что при взаимодействии с антителами не возникает стерических помех.

Установление эпитопов, в меньшей степени подверженных модификации и утрате при воздействии различных факторов, способствует повышению диагностической ценности препаратов.

Впервые показана возможность использования в качестве полноценного источника МКА для изготовления препаратов не только асцитической, но и культуральной жидкости, которая в больших объемах накапливается при пассировании гибридом-продуцентов in vitro.

Отработана и оптимизирована технология изготовления моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. сholerae О1 и О139, заключающаяся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливании диализом, выборе оптимального соотношения флуорохрома и МКА, стабилизации конъюгатов путем лиофильного высушивания.

Теоретическая и практическая значимость работы. Набор гибридом, стабильно продуцирующих видоспецифические МКА О1 и О139, является источником стандартных моноклональных иммуноглобулинов, на основе которых сконструированы диагностические препараты нового поколения.

Разработана экспериментально-производственная технология изготовления моноклональных флуоресцирующих конъюгатов для диагностики холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакции прямой иммунофлуоресценции.

Создан диагностический набор агглютинирующих МКА для идентификации и дифференциации V. сholerae О1 и О139 в реакции слайд-агглютинации. По результатам проведенных исследований оформлен комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению, справку об изделии медицинского назначения и технические условия на наборы реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ» и «Иммуноглобулины моноклональные диагностические cухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О (in vitro) методом РА «ИГ –V. cholerae О1/О139 — РА», которые в настоящее время находятся на регистрации в Росздравнадзоре.

На гибридомы, стабильно продуцирующие МКА к видоспецифическим эпитопам возбудителя холеры О1 и О139, получены два патента на изобретение №2425874 от 13.04.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы» и №2425875 от 07.06.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов О серогруппы».

Экспериментальные серии флуоресцирующих МКА О1 и МКА О139 были использованы при выполнении кандидатской диссертационной работы Куликаловой Е. С. на базе ФГУЗ «Иркутского научно-исследовательского противочумного института». Разработанные наборы используются при выполнении научно-исследовательских работ во ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, в работе СПЭБ, также для оценки качества препараты в коммерческом виде переданы в Волгоградский и Ставропольский противочумные институты, в ГНЦ ПМБ (г. Оболенск).

Методология и методы исследования. В работе использованы различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, РИФ, слайд-агглютинация, преципитация, иммуноблот), биохимические и микроскопические.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Набор гибридом-продуцентов обеспечивает получение диагностически видоспецифические эпитопы О-антигена холерных вибрионов О1 и О серогрупп, позволяет конструировать диагностические препараты нового поколения.

2. Видоспецифические МКА выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате при воздействии различных факторов, что способствует повышению диагностической ценности препаратов.

3. Для создания диагностических препаратов впервые использована культуральная жидкость, являющаяся полноценным источником иммуноглобулинов, получение которой не требует привлечения лабораторных животных.

4. Разработанная биотехнологическая схема экспериментальнопроизводственного изготовления холерных О1, О139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препараты, характеризующиеся высокой специфичностью и чувствительностью.

5. Набор диагностических агглютинирующих МКА без дополнительной постановки развернутой реакции агглютинации обеспечивает выявление холерных вибрионов О1, О139 серогрупп.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях: проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» (г. Ростов-на-Дону, 2009 - 2013 г.); научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвященная 75летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск, 2009 г.); конференция молодых ученых ФГУЗ РостНИПЧИ (г. Ростов-на-Дону, 2011 г.); Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием:

«Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения»

(г. Пермь, 2012 г.). Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы № 121-4-10 «Создание видоспецифических моноклональных препаратов для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с помощью тестов слайд-агглютинации, прямой иммунофлуоресценции и иммунохроматографии (2010 – 2014)» (номер государственной регистрации 01200907528).

Личный вклад соискателя. Основные разделы диссертационной работы выполнены О.Ф. Кретенчук самостоятельно на базе группы гибридом Ростовского-на-Дону противочумного института. Разработка идей, постановка научных задач, методическая часть работы, конструирование препаратов, получение научных результатов и их обоснование были выполнены автором под руководством д.б.н., профессора Л.П. Алексеевой.

опубликовано 17 научных работ, 5 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК. Получены 2 патента на изобретение №2425874 (13.04.2010 г.) и №2425875 (07.06.2010 г.) План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (протокол №8 от 19.06.2012 г.) Структура диссертации.

Работа изложена на 134 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 156 источников, в том числе зарубежных – 37. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 19 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

стремительного проникновения идей и методов фундаментальной науки в прикладные области исследований и производственную сферу. Гибридизация соматических клеток, зародившись как метод исследования в области клеточной биологии, становится вс более значимой областью биотехнологии.

специфичности были открыты в 1975 г. G. Kohler, C. Milstein [137]. Гибридные клетки, продуцирующие иммуноглобулины и антитела известной специфичности были описаны и ранее, например, в 1969 г. S. Sinkovics из отдела клинической вирусологии и иммунологии университета в Техасе сделал сообщение о плазматическими клетками лейкозных мышей [150]; в 1971 г. B. Mohin образованными клетками миеломы и лимфомы мышей [142]. Но ни одно из сообщений не привело к скачку в развитии этой отрасли науки [24]. Методика Келера и Мильштейна решила одну из основных проблем, которую иммунологи пытались решить на протяжении многих лет, - проблему длительного воспроизводства больших количеств гомогенных антител к разнообразным антигенам [76]. Именно они, предварительно введя в организм антиген и вызвав таким образом иммунный ответ, извлекли лимфоидные клетки, продуцирующие соответствующие антитела, и объединили их с клетками опухоли (миеломы). В результате получился непрерывно делящийся клеточный гибрид (гибридома), способный синтезировать антитела с заданной специфичностью. Гибридома унаследовала от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой – бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту [25]. Продуцировать антитела способны только единичные гибридомы, которые и отбирают после тестирования (рисунок 1).

Рисунок 1 – Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела Антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, стали называть моноклональными за их происхождение. Но понятие моноклональности существовало в иммунологии давно. Так в понимании Ф. Бернета [85], одна клетка иммунной системы продуцирует антитела только против одного антигена, то есть иммунная система клонирована по антигену. И то, что моноклональность гибридомных антител (физическая моноклональность) в подавляющем большинстве случаев совпадает с моноклональностью в понимании Бернета (антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток одинаковы), явилось блестящим экспериментальным подтверждением клонально-селекционной теории иммунитета. МКА, продуцируемые одной гибридомой, абсолютно идентичны друг другу по всем параметрам, они взаимодействуют только с одной из представленных в структуре антигена детерминантой. В клинической практике с такими антителами сталкиваются при миеломной болезни. У больных миеломой около 95 % иммуноглобулинов сыворотки крови вырабатываются одним злокачественно трансформированным клоном плазматических клеток. К МКА относят и белки Бенс-Джонса – димеры легких цепей иммуноглобулинов, часто обнаруживаемые в большом количестве в моче больных миеломой [78]. Что касается препаратов, то до гибридомной технологии в иммунологии не было специфических антител такой степени гомогенности.

После публикации известной статьи в 1975 г. метод гибридизации претерпел существенные изменения. Многочисленна и многообразна литература, посвященная способам получения МКА, что свидетельствует о важности методической части гибридомной технологии, которая состоит из следующих этапов: получение линий опухолевых клеток, иммунизация доноров селезеночных клеток, слияние клеток, селекция гибридом, выявление позитивных культур и их клонирование.

Большинство полученных к настоящему времени гибридом – мышиные по происхождению, потому что мыши являются наиболее доступным источником миеломных клеточных линий, а гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют больше антител, чем межвидовые. Также получают гибридомы крыс, а менее успешно – гибридомы человека [16, 44, 52]. Хотя если мы говорим о терапии с помощью МКА, то мышиные антитела зачастую распознаются иммунной системой человека. Развивающийся при этом иммунный ответ приводит к снижению эффективности вводимых препаратов из-за связывания их с антителами, вырабатываемыми в ходе ответной реакции. Для решения этой проблемы проводят работы по конструированию химерных и гуманизированных антител, имеющих большие преимущества в качестве терапевтических и диагностических препаратов. Для создания химерного антитела константную часть мышиных антител замещают соответствующей константной областью иммуноглобулина человека. Как известно, в константных доменах находится большая часть антигенных детерминант, с которыми связаны основные эффекторные функции (взаимодействие с Fc-рецепторами, системой комплемента и др.), поэтому использование химерных иммуноглобулинов мышь/человек обусловливает нормальное их взаимодействие с иммунной системой человека при сохранении специфичности и сродства к антигену мышиных моноклональных антител. Что касается гуманизированных антител, то для их создания в иммуноглобулинах человека заменяют только аминокислоты, образующие взаимодействующую с антигеном зону (гипервариабельные регионы), на соответствующие аминокислоты мышиного антитела [25]. Такие антитела практически не вызывают в организме человека специфического иммунного ответа.

Важный этап получения гибридом, можно сказать самый «творческий» подготовка иммунных спленоцитов. Успех иммунизации зависит от ряда факторов: свойств иммуногена, природы антигена, генотипа животного. Для получения высокого титра антител должна быть оптимизирована схема иммунизации. Если речь идет о мышах, то могут быть использованы животные в возрасте 3 – 4 месяцев любого пола. Существуют два основных способа иммунизации [91, 105, 128]:

а) короткая схема – введение антигена дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лапок (антиген+ПАФ, антиген+НАФ);

б) длинная схема – введение антигена с интервалом 2 – 4 недели внутрибрюшинно или подкожно, реже внутривенно или орально (первый этап антиген+ПАФ, последующие - антиген+НАФ) [122].

Важным моментом является то, что спустя неделю после заключительной иммунизации необходимо провести тестирование крови на наличие нужных антител. Обычно иммунизируют ряд животных и выбирают селезенки тех мышей, у которых самый высокий титр антител.

Заслуживает внимание и внутриселезеночная инъекция антигена, разработанная M. Spitz et al. Ее применяли с успехом при получении МКА к различным вирусным антигенам, но в этом случае, как правило, наблюдается образование гибридом к поверхностным антигенам и не всегда гибридизация дает высокую эффективность [127, 151].

2) in vitro:

а) преимущества – 1) сокращение сроков иммунизации до 4 – 5 дней;

2) непосредственный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, минуя барьеры живого организма; 3) возможность контролировать эффективность иммунного ответа;

б) недостатки – 1) стерильность используемого антигена; 2) наличие качественной культуральной среды и биологически активных иммунофакторов.

Особое значение придается иммунизации in vitro при получении гибридом на основе лимфоцитов человека из-за запрета на иммунизацию in vivo.

Каждый из методов имеет недостатки, поэтому исследования по вопросу введения антигена являются актуальными и направлены в основном на сокращение сроков иммунизации при высоком выходе стабильных гибридом заданной специфичности. Следует отметить, что применяется сейчас и ДНКиммунизация, которая эффективна в тех ситуациях, когда белок оказывается малодоступным [90].

Еще одним направлением развития гибридомной технологии стало создание клеточных линий плазмоцитом, лишенных способности продуцировать иммуноглобулины и их фрагменты. Сейчас выведено множество линий плазмоцитом, наиболее широкое распространение получили мышиные миеломы в основном генотипа BALB/с. Существует ряд критериев для выбора опухолевой линии клеток в качестве партнера для слияния [24, 105]:

1. Природа клеток должна быть такова, чтобы объединение их хромосом с хромосомами лимфоцитов не приводило к нарушениям биосинтеза антител (генетически и эпигенетически родственные клетки);

пролиферировать на минимальных средах), иметь время генерации около часов;

3. Способность опухолевых клеток расти в брюшной полости сингенных животных, что даст возможность гибридным клеткам накапливать большие объемы МКА в виде асцитов;

4. Высокая гибридизуемость клеток – каждая сотая клетка из общей смеси должна давать жизнеспособный гибрид;

5. Опухолевые клетки должны быть мутантны по определенным генам, контролирующим экспрессию жизненно-необходимых ферментов (гибель на специальных селективных средах). Широко используются линии, дефектные по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе.

Одна из самых популярных мышиных миеломных линий, широко используемая для гибридизации, - линия Р3-Х63-Ag 8.653, так как она не синтезирует никаких цепей иммуноглобулинов, отличается быстрой пролиферацией и хорошей гибридизуемостью.

Линии миелом зависимы от ростовых факторов эмбриональной сыворотки.

Получение клеток-партнеров для слияния, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, на протяжении многих лет оставалось важной задачей.

Наблюдение, что культуральные среды, кондиционированные клетками, секретирующими IL-6, способны увеличивать выход гибридом-продуцентов МКА, позволило создать новый штамм миеломы - Sp2/mIL-6 (в клетки линии SPO с помощью ретровируса были введены гены, обеспечившие постоянную экспрессию мышиного IL-6). Слияние клеток Sp2/mlL-6 с иммунными Влимфоцитами позволило увеличить выход стабильных гибридом, продуцирующих МКА искомой специфичности. Другой экспериментальный подход состоял во введении в миеломные, а также в гибридомные клетки экзогенных генов Вс1-2, регулирующих апоптоз, что способствовало снижению клеточной гибели в условиях разреженной культуры, дефицита питательных веществ или увеличения кислотности среды. Эти данные могли бы указывать путь создания линий миелом, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, однако, они не нашли подтверждения в ряде независимых исследований [90].

Работы по модификации миеломных мышиных клеток продолжаются и сейчас.

Одним из важных этапов получения гибридом является слияние миеломы и спленоцитов. Отцы гибридомной технологии добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай – биологический метод. Но следует отметить, что данный метод не всегда дает положительные результаты. Некоторые авторы [76] объясняют это тем, что не все клетки миеломы имеют рецепторы для вируса. Как более удобный, эффективный и безопасный индуктор используется ПЭГ химический метод гибридизации [128]. Главное требование к нему – химическая чистота. Были предприняты попытки вызвать гибридизацию клеток воздействием электрическим или магнитным полями, так как мембраны клеток заряжены и электропроводны (физический метод гибридизации) [139].

Эффективность электрогибридизации, как правило, на один - два порядка выше, чем гибридизации биологическими и химическими методами, также возможен визуальный контроль через микроскоп, а отделение гибридных клеток от неслившихся исключает необходимость метаболической селекции. Однако высококвалифицированного персонала, поэтому наибольшее распространение в настоящее время получил относительно простой и достаточно эффективный метод гибридизации с использованием ПЭГ с молекулярной массой от 1000 до 6000. При использовании ПЭГ частота гибридизации составляет обычно один гибрид на каждые 2105 клеток селезенки. Многие исследователи пытаются повысить частоту образования гибридом путем манипулирования различных переменных (концентрация ПЭГ, значение рН при слиянии, соотношение селезеночных и миеломных клеток, использование различных типов питательных сред, различные варианты посевов). Однако до настоящего времени ни одна из вышеперечисленных попыток манипулирования переменными не привела к существенному повышению абсолютного выхода получаемых гибридом. Стоит только отметить экономичную и эффективную технологию получения МКА против белков - продуктов новых генов, для которых известна только нуклеотидная последовательность, - это использование клеточных сортеров для предварительной селекции B-лимфоцитов, несущих АГ-специфные рецепторы [90]. В общем, этап подготовки клеток к слиянию и сама процедура слияния за истекшие 37 лет не претерпели значительных изменений. Поэтому вопрос о преимуществах различных модификаций остается открытым.

Совершенствование гибридомной технологии невозможно без выяснения тонких механизмов процесса, который еще недостаточно изучен.

Предположительно, сначала происходит склеивание клеток, затем слияние клеточных мембран, потом слияние ядер и перестройка хромосомного материала.

Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления, поэтому за 24 часа до гибридизации миеломные клетки переводят в условия максимальной скорости роста клеток (повышение концентрации фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов Влимфоцитов – продуцентов специфических к антигену антител. Если мы говорим о растительных клетках, слияние протопластов происходит вследствие высокой концентрации ПЭГ, которая способствует поглощению свободной воды между протопластами, вызывая их слипание. Кроме того, дегидратация индуцирует образование пор в мембране, через которые перетекает внутриклеточное содержимое. Повреждения мембран обратимы, поэтому слипшиеся протопласты регенерируют клеточную стенку [89].

Рост гибридом и синтез ими антител зависят от физико-химических характеристик микроокружения клеток. При этом особое внимание уделяется регулированию рН, концентрации растворенного кислорода, температуре и содержанию питательных веществ. Гибридная клетка, помещенная в качественную питательную среду, размножается и вырабатывает МКА в надосадочную жидкость. Полученные антитела являются молекулярно однородными и доступными для получения в относительно больших количествах.

Следует отметить, что присутствие в культурах фидерных клеток повышает жизнеспособность гибридом и стимулирует образование колоний, так как они синтезируют факторы, увеличивающие пролиферативную активность гибридом, и утилизируют компоненты погибших клеток, оказывающие токсическое действие на гибридомы [147].

В процессе культивирования необходимо проводить постоянный контроль антителопродуцирующих гибридных культур применяют различные методы:

иммуноферментный, иммунофлуоресцентный, реакцию агглютинации, радиоиммунный и другие. Но не все методы обнаружения сывороточных антител пригодны для тестирования гибридом, так как МКА могут не вызывать преципитации или агглютинации антигена, не связывать комплемент.

Наибольшее распространение получил твердофазный иммуноферментный анализ, который пригоден как к растворимым антигенам, так и к бактериальным и соматическим. Как известно, из-за утраты в отдельных гибридомных клетках хромосом, контролирующих синтез МКА, антителообразование является нестабильным признаком в первые дни и недели после слияния [128, 149], что объясняет необходимость раннего клонирования и реклонирования для выделения устойчивых субклонов. В настоящее время на смену полужидкому агару, в котором Келер и Мильштейн культивировали гибридные клетки, пришла техника лимитирующих разведений – самый распространенный сегодня метод клонирования, позволяющий избежать проблем, связанных с технологией эффективность метода. Клонирование лучше проводить в 96-луночных плоскодонных планшетах с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лунках, в которые предварительно засеяли по одной клетке, может быть просто проконтролировано. Метод лимитирующих разведений легко воспроизводится [16].

Важным аспектом гибридомной технологии, которому уделяется большое внимание, является разработка способов массового производства МКА.

Культивирование гибридом in vivo в организме сингенных мышей сочетает в себе экономичность и достаточно высокую продуктивность: от одной мыши можно забрать до 10 мл асцитической жидкости, что в среднем составляет 50 мг МКА.

Однако при получении очень больших количеств антител использование животных уже нецелесообразно, поскольку для выделения 1 кг очищенного продукта потребуется 20000 животных, а наличие неспецифических мышиных иммуноглобулинов усложнит очистку МКА. Более того, в 1999 г. было принято решение Европейского комитета по этике - введены значительные ограничения на работу с лабораторными животными. Поэтому особого внимания заслуживает культивирование гибридом in vitro. Еще в 1933 - 1972 гг. были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику промышленного оборудования, в том числе биореакторов. Начиная с 1972 г. и по 2000 г.

проводились работы по автоматизации и компьютеризации производства биотехнологической продукции. В настоящее время для наработки МКА в промышленных масштабах используют различные приспособления (цитокультиваторы, ферментеры и др.), в которых соблюдаются необходимые условия (температура, уровень углекислого газа и влажности), а также частично супернатантов. Такая технология получения моноклональных антител in vitro имеет следующие преимущества:

1) не используются животные;

2) уменьшается риск загрязнения целевого продукта различными веществами из животных-хозяев (низкие концентрации примесных антител);

3) размеры сосудов для культивирования можно легко увеличивать без масштабирование приводит к трудозатратам и расходам на капитальное строительство);

4) высокая воспроизводимость за счет оптимизации процесса;

5) в организмах грызунов трудно культивировать клетки человеческих гибридом и лимфобластоиды, трансформированные ВЭБ.

Определенного внимания заслуживают два подхода к культивированию клеток:

I. Первый подход - иммобилизация и включение клеток в твердую матрицу (перфузия в пористые волокна, применение микрокапсул, агарозных микрошариков или керамических кассет).

II. Второй подход - культивирование клеток в гомогенной суспензии.

Выбор одного из этих двух методов накопления МКА определяется особенностями производственного процесса, важно чтобы система получения иммуноглобулинов соответствовала следующим требованиям:

1) сравнительно простая и легкая в управлении;

2) воспроизводимая для обеспечения высокого качества продуктов;

3) легко стерилизуемая и способная работать асептически в течение длительного периода времени;

4) просто и эффективно масштабируемая.

В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы выделения и очистки МКА из культуральной и асцитической жидкости. Для диагностических целей часто достаточно иметь препараты антител 70 - 95%-ной степени чистоты. С другой стороны, при применении антител in vivo их чистота должна быть намного выше.

В сывороточных средах содержание специфических антител не превышает 10% от общего количества белка. Поэтому не прекращаются работы по подбору добавок к базальным средами (RPMI-1640, DMEM), которые бы поддерживали пролиферацию и антителопродукцию гибридом, и были бы дешевле эмбриональной сыворотки. Кроме снижения себестоимости МКА, разработка бессывороточных сред имеет важную цель – упростить очистку антител [24].

Хотя проведение процесса на таких средах и облегчает очистку, на практике относительно легко достичь 90%-й и даже более высокой степени чистоты независимо от содержания сывороточных белков. При очистке антител для их использования in vivo на последних стадиях очистки приходится решать одни и те же проблемы независимо от природы питательной среды. Ранее для очистки МКА широко применяли фракционирование сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией [128]. Использование этих методов осложняется тем, что различные МКА имеют разные изоэлектрические точки. Кроме того, после ионообменной хроматографии чистота антител не превышает 90%, поэтому для дальнейшей очистки необходимы другие методы, например гель-фильтрация [50, 93]. В настоящее время разработаны адсорбционные концентраторы, которые представляют собой исключительно простое в использовании оборудование для концентрирования и/или очистки МКА из разбавленных растворов. В зависимости от конфигурации и объема резервуара стартовый объем может варьировать от 0.5 до 20 мл, при этом достигается 750-кратную степень концентрирования. В таких концентраторах используются гидрофильные мембраны, обладающие низкой степенью связывания белка и обеспечивающие высокую скорость фильтрации. Также применяют ультрафильтрационные системы, отличающиеся простотой и экономичностью в сочетании с высокой производительностью: 1 литр концентрируется в 50 раз менее чем за полчаса.

Кроме того, для такого оборудования характерна уникальная конструкция модулей и наличие специальных коннекторов для масштабирования процесса.

Таким образом, получение МКА направленной специфичности является достаточно сложным, длительным и трудоемким процессом, эффективность которого зависит от ряда факторов. В каждом случае необходим индивидуальный подход к решению поставленных задач [89, 98, 102, 108]. На сегодняшний день далеко не все теоретические и технические проблемы создания гибридом решены.

Гибридомная технология, ставшая основой получения МКА, буквально пропитала теоретическую и прикладную иммунологию, проникла во многие разделы микробиологии, вирусологии и медицины. Можно сказать, создана гибридомная промышленность, и на рынок поступают сотни вариантов МКА. Она является не только примером быстрого внедрения науки в практику, но и примером продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований на качественно новом уровне, так как гибридомы – наиболее эффективный и мощный инструмент современной биологической науки.

Так, МКА являются уникальной моделью в изучении биологии рецепции.

Исследование природы рецепторов с помощью антител не является новым, такие работы проводились и до создания МКА. Однако достаточно часто сталкивались с тем, что не могли получать сведения об их природе. Обходной путь в решении этого вопроса сводится к следующему: на первом этапе получают МКА к лиганду, связывающемуся с искомым рецептором, на втором этапе получают МКА к антигенсвязывающей области первых антител. Эти вторые МКА и будут антителами к неизвестному рецептору. По такой же схеме были получены антитела к Р-адренергическому рецептору. Можно изучать и функции рецепторов с помощью МКА, которые, обладая «мимикрирующим» действием, способны запускать те же реакции в клетке, что и лиганд, связывающийся с рецептором.

Вместе с тем, существуют и такие МКА, которые, связываясь с рецептором, не изменяют его функции, что позволяет изучить механизмы регуляции функциональной активности рецепторов [53]. Интересным направлением является исследование эпитопов ВИЧ-1 с использованием МКА и фаговых пептидных библиотек. J.R. Mascola и D.C. Montefiori (2010 г.) обнаружили у ВИЧинфицированных долгожителей особые антитела, которые назвали нейтрализующими антителами широкого спектра действия [140]. Среди них особый интерес представляют МКА: Z13E1, VRC03 и VRC01 (нейтрализуют 91 % штаммов ВИЧ-1), которые Ильичев с соавторами (2013 г.) использовали для получения пептидов-имитаторов эпитопов ВИЧ-1 [49]. Секвенирование и последующий компьютерный анализ позволили исследователям выявить уникальные аминокислотные последовательности специфичных к МКА пептидов, что очередной раз доказывает необходимость применения достижений гибридомной технологии, позволяющей ответить на вопросы, которые не всегда удается решить с помощью других методов.

С появлением МКА в биологии и медицине начата эпоха современных исследований высочайшей точности. Специфичность антител делает их мощными диагностическими инструментами, которые позволяют определить наличие минимального количества искомых субстанций. Область возможного применения МКА весьма широка [23]. В настоящее время МКА используют для:

1) обнаружения загрязнений окружающей среды;

2) проверки пищевых продуктов на наличие опасных микроорганизмов [35, 80];

3) распознавания злокачественных клеток среди нормальных [1, 56];

4) аналитических целей – как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением [34];

5) диагностики заболеваний человека, животных и растений, а также в биотехнологии в качестве лигандов для аффинной хроматографии [32, 69, 115].

Следует отметить, что современная диагностика злокачественных новообразований не мыслима без МКА, их применяют [25]:

1) для определения иммунного статуса пациентов;

2) для диагностики и контроля эффективности лечения онкологических заболеваний [55];

3) для исследования локализации злокачественного новообразования и степени метастазирования (вводят МКА, связанные с радиоактивными изотопами);

4) для избирательной доставки химиотерапевтических агентов, противоопухолевых лекарств к клеткам опухоли, не затрагивая при этом здоровые клетки [51].

Продолжаются работы по получению новых МКА в целях создания на их основе диагностических и лекарственных средств [27, 31, 40, 47, 54, 84, 117]. За последние годы появился целый ряд протеомных методов исследования, среди которых важное место занимают белковые микрочипы на основе МКА. Так, в НИИ гриппа Минздрава России (г. Санкт-Петербург) разработали биочип для выявления вирусов гриппа А и В с помощью тип-специфических МКА, направленных к нуклеопротеину NP и конъюгированных с флуоресцентным красителем Cy3 (для флуоресцентной детекции) и пероксидазой хрена (для колориметрической детекции) [59]. В НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН (г. Москва) использовали метод проточной цитометрии с применением МКА для изучения особенностей экспрессии TLRs у больных мигрирующей эритемой (патогномоничный маркер болезни Лайма) [94] и хронической крапивницей [95]. Понимание ранних событий иммунного ответа, связанных с активацией клеток иммунной системы через TLRs, и в динамике в ходе проведения терапии способствует повышению эффективности элиминации патогена и лечения в целом.

Использование МКА в качестве терапевтических агентов привело к смене концепции лечения: переход от неспецифической к специфической терапии («таргетная терапия»). На сегодняшний день моноклональные препараты активно используются в онкогематологии и лечении солидных опухолей и аутоиммунных заболеваний. Примерами терапевтических МКА, разрешенных FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов, США), являются следующие [46]:

Erbitux (химерное) – взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста, применяют при колоректальном раке;

Simulect (химерное) и Zenapax (гуманизированное) – связываются с рецепторами IL-2 а, используют при отторжении трансплантата;

ReoPro (химерное) – действует на рецептор гликопротеида IIb/IIIa, применяют при остром коронарном синдроме;

Humira и Remicade (гуманизированные антитела) - ингибиторы фактора некроза опухоли-, применяют при аутоиммунных заболеваниях;

Raptiva (гуманизированное) – действует на адгезивный рецептор, препарат против псориаза;

Tysabri (гуманизированное) – блокатор адгезивного рецептора VLA- предотвращает адгезию иммуновоспалительных клеток и их перемещение через гематоэнцефалический барьер и стенку кишечника, применяется при лечении рассеянного склероза и болезни Крона;

Campath (гуманизированное) – мишенью является CD52, используется при хроническом лимфоцитарном лейкозе;

Avastin (гуманизированное) – блокатор фактора роста эндотелия сосудов, применяют при колоректальном раке;

Soliris (гуманизированное) – действуя на систему комплимента С 5, применяется при воспалительных заболеваниях, в том числе и при параксизмальной гемоглобинурии;

Xolair (гуманизированное) – мишенью являются иммуноглобулины Е, применяют при иммуновоспалительных заболеваниях (при астме);

И др.

высокоспецифичное взаимодействие с клеточными мишенями или сигнальными путями, что в итоге приводит к гибели клеток. Кроме этого, МКА способствуют активации опухолеспецифического иммунного ответа. Но, несмотря на привлекательность терапии моноклональными препаратами, только комплексный подход (вакцины, химиотерапия, МКА и др.) способен обеспечить желаемый эффект с минимальным риском для пациента.

Таким образом, производство МКА – развивающийся сегмент мировой индустрии: к 2014 г. количество белковых препаратов увеличится до 50%, причем большая часть прийдется на МКА – продукт гибридомной технологии.

1.2. Серологические методы исследования в лабораторной диагностике эпидемиологические данные, которые позволяют установить вероятность контакта с возбудителем холеры, и клинические данные (характерные симптомы холеры). Однако не менее важными являются данные лабораторной диагностики, позволяющие подтвердить диагноз. Одно из ведущих мест в лабораторной диагностике холеры принадлежит бактериологическому методу с выделением чистой культуры вибриона и определением его основных таксономических признаков, необходимых для идентификации. Являясь традиционным, этот метод вс же совершенствуется путем автоматизации: в центрах ГСЭН применяется микробиологический анализатор "Бак Трак 4100", который позволяет повысить оперативность и эффективность эпидемиологического надзора [26].

Несмотря на приоритет бактериологического метода, серологические также важны, так как одним из специфических признаков, на которых базируется в настоящее время идентификация возбудителя холеры, является способность вибрионов вступать в реакцию с видо- и серовароспецифическими сыворотками.

Проблема усовершенствования диагностикумов и разработка новых препаратов постоянно находятся в центре внимания исследователей, потому что периодический анализ кроличьих сывороток по заданию ВОЗ показал, что диагностические лаборатории нуждаются в обеспечении высокоактивными и специфическими реагентами.

В настоящее время для серологической диагностики холеры официально рекомендован к использованию набор препаратов, включающий поликлональные сыворотки лошадиного происхождения для V. cholerae О1 и кроличьи антитела для V. cholerae О139. Основной недостаток указанных препаратов – невысокий титр специфических иммуноглобулинов, что является следствием неоднократной адсорбции сывороток близкородственными микроорганизмами, и наличие перекрестных реакций. Как следствие неспецифичности лошадиных сывороток из-за низкой концентрации специфических Ig и перекрестной реактивности в отечественной практике предусмотрена постановка развернутой реакции агглютинации. Это занимает дополнительное время и требует дополнительных экономических затрат. Если говорить о препаратах для выявления холерных вибрионов О139, то на сегодняшний день единственным в РФ лицензированным является кроличья сыворотка для РА на стекле.

За рубежом многие проблемы были решены путем привлечения в лабораторную диагностику возбудителя холеры МКА, которые поддаются стандартизации, а при наличии гибридом-продуцентов их можно получать по мере необходимости и работать постоянно с одними и теми же антителами.

Процесс замены поликлональных антител в диагностических наборах на моноклональные начался в 1982 г. с работы B. Gustafsson et al. [132], которые предложили выявлять холерные вибрионы в реакции слайд-агглютинации с помощью МКА к коровой области ЛПС V. cholerae О1. Поскольку полученные антитела относились к классу IgG, их недостаточно высокая агглютинирующая способность была увеличена путем коагглютинации антител с белком А Staphilococcus aureus. Также этой группе авторов удалось получить МКА к A-, Bи С-антигенам V. cholerae О1, специфичность (отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными микроорганизмами) и чувствительность которых была проверена в ИФА (5106 - 5107 м.к./мл) и реакции слайд-агглютинации. На основе этих МКА также были получены флуоресцирующие препараты для ускоренной диагностики холерных вибрионов О1 серогруппы [129, 130, 131, 133].

Позже другие зарубежные авторы сконструировали высокоэффективные тестсистемы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г. [134] создали набор для выявления V. cholerae О139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции. Препараты МКА, меченные ФИТЦ, отличались высокой специфичностью и чувствительностью: могли выявлять холерные вибрионы О139 серогруппы в низкой концентрации. С целью идентификации V. cholerae О139 другими исследователями (F. Qadri et al., 1994) был разработан моноклональный диагностикум для реакции коагглютинации, чувствительность этого теста составила 92%, а специфичность - 100% [145]. Ими же в 1995 году был предложен Бенгал-СМАРТ тест, предназначенный для быстрого обнаружения холерных вибрионов О139 в стуле больных, и повышена его чувствительность до 100% [144]. В 1996 г. T. Ramamurthy et al. [146] предприняли попытку одновременного применения моно- и поликлональных антител в ИФА для выявления в клинических образцах холерного токсина (ХТ) V. cholerae O139, что обеспечило существенное повышение точности и скорости серологического анализа. Этот принцип для постановки ИФА был использован в 2007 г. U. Tuteja et al. [154], которые разработали простой, специфичный и быстрый двухщуповый ИФА на основе кроличьих поликлональных сывороток к двум рекомбинантным антигенам (r-белкам - субъединице В холерного токсина) и мышиных МКА к r-белкам и белку внешней мембраны W (OmpW). Кроличьи поликлональные сыворотки наносили раздельно на кончики нитроцеллюлозных мембран с двух сторон нитроцеллюзной полоски в качестве связывающихся с антигеном антител и смесь двух МКА использовали для выявления этих антител.

Тест был специфичным для штаммов V. cholerae O1, V. cholerae O139, V. cholerae не О1/не О139 и не давал перекрстных реакций со штаммами близкородственных бактерий. Сделан вывод, что двухщуповый ИФА с МКА может использоваться для одновременного выявления токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae в клинических образцах и пробах воды.

В настоящее время в зарубежных публикациях описаны биосенсоры прямого действия на основе МКА к ЛПС с латеральным потоком для одновременной детекции V. cholerae О1 и О139 серогрупп в щелочной пептонной воде [156]. Анализ основан на иммунохроматографическом принципе, в соответствии с которым реакция антиген-антитело должна приводить к скоплению золотых наночастиц и к появлению красной линии на тестируемой полоске. Использование в биосенсоре сухого реагента и принципа "дипстик" обеспечивает простоту применения, быстрое получение результатов, которые можно увидеть невооруженным глазом, а также хранение, не требующее холодовой цепочки.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что за рубежом моноклональные реагенты положительно зарекомендовали себя, не уступают поликлональным по чувствительности, а по специфичности и активности превосходят в несколько раз.

В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридомпродуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия.

Сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28]. В начале 90-х годов С.Н. Бабицын в диссертационной работе [20] описал получение эритроцитарного диагностикума и ИФА тест-системы на основе МКА, направленных к различным эпитопам холерного энтеротоксина.

Высокая чувствительность (20 нг/мл для эритроцитарного диагностикума и 0,1 – 10 нг/мл для ИФА) и специфичность препаратов позволяла обнаружить токсин в различных объектах и оценивать эпидемическую значимость штаммов холерного вибриона. О.С. Бурлаковой [29, 30] показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae О1 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов. Сотрудники института «Микроб» ( г.) для экспресс-диагностики токсигенных штаммов V. cholerae предложили использовать МКА к В-субъединице ХТ в дот-иммуноанализе, который показал высокую чувствительность (2,4106 – 4,9106 микробных клеток/мл, что соответствует 16 нг/мл ХТ), оперативность и простоту технического исполнения.

Специфичность ДИА была подтверждена отрицательной реакцией при изучении цельных клеток, лизатов, а также культуральной жидкости 35 штаммов гетерогенных микроорганизмов и 6 vct- штаммов V. cholerae не О1 группы [38, 39]. Но сложившаяся в науке ситуация (1995 – 2002 г.) в силу объективных и субъективных причин отодвинула на многие годы работы по конструированию и внедрению в практическое здравоохранение препаратов на основе МКА.

Однако работы продолжались по пути улучшения диагностических препаратов за счет оптимизации получения поликлональных сывороток. Так, с целью исключения этапа адсорбции, снижающего титр специфических иммуноглобулинов, Б.Л. Мазрухо и Е.В. Ишина (1998 г.) использовали в качестве иммуногена химически изолированные антигены. Ими были получены сыворотки к клеточным оболочкам штамма О139, на основе которых разработали коагглютинирующий диагностикум [71]. В работе В.А. Федоровой с соавторами (2001 г.) [106] использованы следующие методики выделения О-антигена V. cholerae О139: 1) метод A. Boivin et al. (1933 г.) – экстрагирование с помощью ТХУ - О-AgB; 2) метод М.Н. Джапаридзе с соавт. (1996 г.) - высаливание 25 - 50% сульфатом аммония из бесклеточных культуральных супернатантов, обработанных формальдегидом – О-AgD; 3) термическое выделение антигена – ОAgН. Ими установлено, что антитела к первым двум антигенам были абсолютно специфичны к холерным вибрионам О139 серогруппы в отличие от сыворотки к О-AgН. Е.Г. Абрамова с соавт. (2002 г.) разработали диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины для идентификации V. cholerae О139 на основе кроличьей сыворотки, полученной иммунизацией препаратом О-антигена из культуральной жидкости (КЖ) [4]. Позже авторами (2004 г.) было показано, что этот диагностикум можно успешно использовать и в других методах: в прямом и непрямом вариантах ДИА, ТИФА и в слайд-агглютинации [2, 3]. В частности, активность флуоресцирующих иммуноглобулинов О139 в непрямом применяли в прямом варианте ДИА, что позволило значительно ускорить вариантов ИФА активность "двойного" конъюгата составила 1:4000 - 1:8000, а чувствительность 1109 - 5108 м.к./мл. Перекрстные реакции отмечены только в низких титрах (1:16). Проведенные исследования свидетельствуют о возможности использования флуоресцирующих иммуноглобулинов О139 для детекции холерных вибрионов "Бенгал" не только методом иммунофлуоресценции, но и в непрямых вариантах ИФА, ДИА и в реакции слайд-агглютинации [3].

Т.В.Аленкина с соавторами (2007 г.) предложили схему получения сыворотки в раза короче той, что была предложена ранее разработчиками поликлональных флуоресцирующих препаратов. Затем эту схему авторы рекомендовали для серийного производства иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных О139 адсорбированных кроличьих сухих. В настоящее время этот препарат прошел все этапы Государственных приемочных испытаний и может быть применен в практическом здравоохранении [13, 14], но следует иметь в виду, что удаление неспецифических антител путем неоднократной адсорбции близкородственными микроорганизмами сопровождается значительными потерями специфических Ig и соответственно отражается на качестве препарата.

С целью привлечения ИФА тест-систем в диагностику холеры Т.Л. Захарова с соавторами в 2008 г. [45] предложили многокомпонентную тест-систему, представляющую собой модифицированный вариант ДИА и состоящую из набора шести очищенных протективных антигенов (холерный токсин, его Всубъединица, токсин-корегулируемые пили адгезии (ТКПА), антигены О поликлональных антисывороток к ним. Несмотря на специфичность (отсутствие перекрестных реакций) и достаточную чувствительность (ТКПА, ХТ, Всубъединица – 0,3 мкг/мл; О1- и О139-антиген – 0,14 - 0,16 мкг/мл), вопрос о ее широком применении остается открытым.

серологических методах, отличающихся высокой специфичностью, чувствительностью, эксрессностью, простотой выполнения. Начиная с 2000 г.

исследования в этом направлении были продолжены путем привлечения достижений гибридомной технологии. В лаборатории гибридом Ростовского противочумного института были выведены стабильные гибридомы, продуцирующие МКА к V. cholerae О139 (2002 г.). Оценка их активности в реакциях агглютинации, ИФА, дот-ИФА, РНИФ на всей коллекции штаммов холерного вибриона О139, имеющейся в институте, показала их строгую специфичность и отсутствие перекрестных реакций с антигенно-близкими микроорганизмами [9, 10]. Также в РостНИПЧИ (2003 г.) для выявления V.сholerae О139 были получены экспериментальные образцы люминесцирующих моноклональных иммуноглобулинов, отличающихся строгой специфичностью и отсутствием перекрестных реакций с представителями гетерологичных микроорганизмов. Содержание холерных вибрионов в пробах, подлежащих тестированию, должно быть не ниже 1105 – 106 м.к./мл. [12]. В диссертации О.С.Чемисовой (2006 г.) описаны МКА к ЛПС V. cholerae О139, на основе которых были начаты работы по созданию экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов [112].

иммуноферментных тест-систем с использованием МКА. Так, в диссертации Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae О139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. Н.А. Сырова в своей работе (2005 г.) показала преимущества применения разработанных высокочувствительных ТИФА (0,3 – 0,5 мкг/мл), включая ДИА (0,06 – 0, мг/мл), на основе мышиных МКА к типоспецифическим О-антигенам V. cholerae О1, выделенным химическим путем, для контроля их биосинтеза при производстве бивалентной химической вакцины [98]. В работе В.А. Федоровой с соавторами (2007 г.) описано конструирование экспериментальных иммуноферментных тест-систем с использованием МКА к V. cholerae О139, их чувствительность составила 2,3106 (непрямой вариант ТИФА) и 1,5105 - 1, (прямой вариант ТИФА) [107]. В Ростовском противочумном институте О.В. Маркина (2008 г.) отработала и оптимизировала на основе МКА к холерному токсину иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ), который позволяет оценить токсинопродукцию штаммов холерных вибрионов О1 и О серогрупп с чувствительностью метода 50 нг/мл [72]. В институте «Микроб»

Е.А.Михеева с соавторами (2012 г.) применили МКА для обнаружения холерного токсина в ДИА на ацетатцеллюлозной мембране [75]. В настоящее время в РостНИПЧИ проводятся работы по конструированию моноклональных пероксидазных конъюгатов для детекции V. cholerae О1 и О139 в прямом варианте ИФА [61].

Имеющиеся на сегодняшний день данные в отношении прямых и непрямых вариантов ИФА свидетельствуют об их перспективности и возможности включения в схему лабораторной диагностики холеры, разработки в этом направлении, безусловно, отвечают интересам практических лабораторий.

Начиная с 2000 г. в Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических (ИХ) тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в ИХ тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11, Результаты испытания полученных диагностикумов для выявления 21].

V. cholerae О1 показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы О1 серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 108 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами [22] сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+». Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108 - 109 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. И.В. Шиленко с соавторами (2007 г.) увеличили чувствительность ИХ анализа, заменив подложку, пропитанную конъюгатом антител с коллоидным золотом, на подложку, содержащую конъюгат антител с люминесцирующими латексами. Разработанные таким методом индикаторные иммунохроматографические элементы (ИИХЭ) с люминесцентной детекцией для выявления холерного экзотоксина имели чувствительность, в 5 - раз превышающую чувствительность ИИХЭ на основе коллоидного золота [116, 118]. Однако набор реагентов для иммунохроматографической идентификации возбудителя холеры пока не внедрен в лабораторную диагностику. При этом ИХ тест-системы не могут быть использованы для исследования нативного материала.

Из современных технологий обращает на себя внимание и технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами (2009 г.) описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа [80].

Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа. Присутствие в пробах с холерным токсином чувствительность методов. На основе биочип-технологии ФОСФАН (планшет с «напечатанными» на дне лунок иммуночипами) в «ГосНИИ биологического приборостроения» разработан комплект индикаторных средств для одновременного выявления в пробах возбудителей опасных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы, а также ряда токсинов. Высокая чувствительность (не более 1000 молекул с микроплощадки 1000 квадратных микрон) и специфичность мультиплексного анализа позволяет обнаружить отдельные клетки микроорганизмов [33]. Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки. Однако фактор достаточной сложности и высокой себестоимости анализа не позволяет использовать его практическими лабораториями, которым требуются высокочувствительные, специфичные и простые экспресс-методы.

Новым направлением по повышению диагностической значимости латексной агглютинации является система видеоцифровой регистрации, которую апробировали в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (г. Москва) [96]. При помощи сканерных систем (аппаратно-програмный комплекс «Эксперт-ЛабАгглютинация-Микро») получают точные количественные характеристики реакций, автоматическую интерпретацию результатов, а сохранение изображения аналитического объекта в памяти компьютера способствует формированию баз данных.

Перечисленные выше серологические реакции направлены на определение родовой, видовой и типовой принадлежности возбудителя холеры или его антигенов. Не менее важным с диагностической точки зрения является выявление в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфических антител (агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела) при наличии набора известных антигенов. Такие серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение и лишь в отдельных случаях, при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа, их результаты могут быть решающими. На сегодняшний день остаются нерешенными вопросы, касающиеся оценки состояния антибактериального и антитоксического иммунитета.

Необходимо отметить, что коммерческие эритроцитарные диагностикумы выпускает «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева», поэтому применение их в отечественной практике ограничено. Препараты, которые позволяют составить представление об антитоксическом иммунитете, в настоящее время в России не выпускаются, хотя работы в этом направлении проводились в 2002 г. в Ставропольском противочумном институте И.В. Савельевой. Для фиксации холерного энтеротоксина ею использовались ганглиозидсодержащие липосомы. С помощью такого препарата (ЛХЭД) можно выявлять холерные антиэнтеротоксические антитела в реакции связывания комплимента начиная с 5 дня заболевания и в последующие 2 – 3 месяца [86, 87]. Полученная липосомальная диагностическая тест-система позволяет выявлять антитоксические антитела в титре 1:3200 – 1:6400 [88]. В Ростовском-на-Дону противочумном институте проводятся работы по созданию антигенного полимерного О1 и О139 холерного диагностикума для ретроспективной серологической диагностики холеры, выявления контактных с больными холерой в очагах инфекции и проведения эпидемиологического расследования [64, 65, 100]. Для сенсибилизации авторы использовали полиакролеиновые микросферы, применение которых более предпочтительно по сравнению с биологическими носителями. Разработчики отмечают, что аналогов подобных диагностикумов для обнаружения противохолерных антител за рубежом нет.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что серологические методы исследования широко применяются в лабораторной диагностике холеры. Они позволяют выявлять возбудителя, фиксируя реакцию специфического взаимодействия антиген-антитело. Однако актуальным остается потребность практического здравоохранения в доступных методах. Если принять во внимание схему лабораторных исследований (МУК 4.2.2218-07), то наиболее востребованные в широкой лабораторной практике такие методы, как РА и МФА.

Отсюда очевидно, что приоритетными являются исследования, направленные на их усовершенствование или создание новых высокоспецифичных препаратов, доступных каждому звену лабораторной службы при эпиднадзоре и в случае возникновения эпидемического очага холеры.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения перитонеальных макрофагов, иммунных спленоцитов и асцитических жидкостей использовали инбредных мышей линии Balb/c и беспородных белых мышей массой 16 - 20 грамм в возрасте 6 – 10 недель.

В работе были использованы 90 штаммов V. cholerae О1, 40 штаммов V. cholerae О139, 100 штаммов V. cholerae не О1/не О139, 10 штаммов V. cholerae RO. С целью контроля специфичности препаратов МКА также использовали штаммов V. parahaemolyticus, 4 – E. coli, 4 – Brucella spp., 4 – Salmonella spp., – Aeromonas, 7 – Plesiomonas, 30 – Comamonas, 1 - V. mimicus, 1 - V. vulnificus.

Взвеси холерных вибрионов и гетерологичных микроорганизмов готовили в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича 5 единиц (ОСО 42-28-86П) и 10 единиц (ОСО 42-28П), соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1109м.к./мл. Далее из 1 млрд. взвеси готовили мазки на тщательно обезжиренных стеклах по общепринятой методике. Для постановки ТИФА, ДИА, РП и иммунизации животных использовали бактериальные взвеси, обеззараженные кипячением в течение 30 минут.

агглютинирующих препаратов были использованы штаммы холерных вибрионов, выращенные в анаэробных условиях, в присутствии желчи (1% и 5%) и глицерина (10% и 15%).

В работе использовали препараты ЛПС V. cholerae О1 5879 (ЛПС О1) и V. cholerae О139 Р-16064 (ЛПС О139), которые разводили в ФСБ до концентрации 1 мг/мл. Отрицательным контролем являлся коммерческий препарат ЛПС E. coli 055:В5 (Fluka, Израиль).

Для получения гибридом использовали мышиные миеломные линии NS0 и P3-X63/Ag8.653, которые не синтезируют собственные иммуноглобулины или их цепи, дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ), резистентны к 8-азагуанину и погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда) [74]. В качестве продуцентов специфических иммуноглобулинов дополнительно использовали «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (г. Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 386Д, и набор гибридом-продуцентов МКА О139, имеющийся в криохранилище Ростовского-на-Дону противочумного института.

Миеломные и гибридомные клетки выращивали в CO2-инкубаторе (Nuaire) на среде RPMI-1640 («Sigma») и DMEM («Sigma») с добавлением 10 - 15 % сыворотки плода коровы («HyClone»), 2 мМ глутамина («Serva»), 120 мкг/мл гентамицина. Среды готовили из сухого порошка на деионизированной воде по инструкции изготовителя. Стерилизацию сред проводили фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм [74].

В работе использовали химические реактивы отечественного и импортного производства со степенью очистки – «х.ч.», «rein», «analytical grade» (таблица 1).

Таблица 1– Основные реактивы, использованные в работе Полиэтиленгликоль 1500, «Fluka» «Sigma-aldrich», США 19 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12- ЗАО «ЭКОлаб», Росссия 20 Калий фосфорнокислый 1-замещенный ЗАО «ЭКОлаб», Росссия 21 Флуоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТЦ) «Sigma», США 23 Масло иммерсионное (нефлуоресцирующее) ЗАО «ЭКОлаб», Россия Получение гибридных клеток в соответствии с методикой Fazekas de St. et al. (1980) включает несколько этапов [74, 126]:

1. За 24 часа до слияния на 96-луночные планшеты рассевали перитонеальные макрофаги в дозе 10000 клеток на лунку в 50 мкл селективной среды, инкубировали при 37C в CO2-инкубаторе («Nuaire»).

2. Получение иммунных спленоцитов:

Мышей иммунизировали внутрибрюшинно трехкратно с интервалом 2.1.

дней бактериальной взвесью холерных вибрионов, прогретой 30 минут при температуре 100 C в дозе 108 – 109 микробных клеток на животного.

Бустерную инъекцию антигена проводили за 3 - 4 дня до гибридизации, чтобы привести максимальное количество специфически активированных В-клеток в состояние, оптимальное для гибридизации.

В стерильных условиях извлекали селезенку иммунизированных мышей и 2.2.

измельчали ее с помощью гомогенизатора. Взвесь клеток переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при 1000 об./мин.

суспендировали в 5 мл среды без сыворотки и подсчитывали концентрацию в камере Горяева.

3. Подготовка миеломных клеток. Миеломные клетки в логарифмической фазе роста переносили из культуральных сосудов в центрифужные пробирки, центрифугировали 10 минут при 1000 об./мин. Осадок суспендировали в 5 мл среды без сыворотки и подсчитывали концентрацию в камере Горяева.

4. Проведение гибридизации:

Клетки миеломы ((10 – 12)106) смешивали с иммунными спленоцитами 4.1.

((30 – 60)106) в соотношении от 1:3 до 1:5. Суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 минут.

Смесь клеток отмывали один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке.

Супернатант декантировали, полученный осадок осторожно встряхивали и 4.2.

медленно по каплям в течение 2 минут добавляли 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (1500; «Fluka»), следя за равномерным смешиванием жидкостей. Для разведения избытка ПЭГ к смеси прибавляли с интервалом в минуты 1, 2, 4 и 8 мл бессывороточной среды RPMI-1640, добиваясь равномерного распределения клеток во всем объеме жидкости. Взвесь клеток центрифугировали 10 минут при 1000 об./мин.

4.3.

суспендировали в 40 мл полной ростовой среды (RPMI-1640 или ДМЕМ с добавлением 20% сыворотки плода коровы («HyClone»), 2 мМ глутамина («Serva»), 0,1 М пирувата натрия, 50х НАТ («Gibco»)).

5. Культивирование гибридом.

5.1. Суспензию слившихся клеток в полной ростовой среде разливали по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных планшета на фидерный слой предварительно высеянных перитонеальных макрофагов мышей и инкубировали при 37оС в СО2-инкубаторе.

5.2. Наблюдение за ростом клонов осуществляли с помощью инвертированного микроскопа. Видимые колонии гибридных клеток появлялись на 7 – 10 день.

Гибридомы культивировали 14 дней на среде с НАТ («Gibco»), затем 7 – 10 дней на среде с НТ («Gibco»). После чего переводили на ростовую среду без селективных компонентов.

6. Скрининг гибридом. Культуральные жидкости гибридом отбирали для тестирования в ИФА - определение антителопродукции.

Клонирование и реклонирование гибридных культур осуществляли методом предельных разведений [155], который на сегодняшний день является самым распространенным. Смысл его состоит в том, чтобы суспензию клеток развести в ростовой среде до такой концентрации, чтобы при пересеве клеток на планшет в каждой лунке оказалась бы одна гибридомная клетка. На практике этого достичь сложно: в одни лунки попадает две или более клеток, в другие не попадает вовсе.

Поэтому делали несколько разных разведений клеток, в первом из них брали клеток на лунку, во втором – 5 клеток на лунку, в третьем – 1 клетка на лунку.

Затем приготовленные суспензии разливали по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета с фидерными клетками, панель помещали в СО2-инкубатор.

Образование клонов контролировали при помощи инвертированного микроскопа.

Лунки с одним растущим клоном осматривали особенно тщательно на предмет отсутствия в них вторых мелких и малозаметных клонов. Затем, когда клоны достигали достаточного для тестирования размера, проводили скрининг их супернатантов методом ИФА. Среди клонов, давших при тестировании положительный результат, отбирали самые продуктивные и здоровые на вид и повторяли процедуру клонирования. После второго клонирования все оттестированные клоны давали положительный результат, лучшие из них по антителопродукции и ростовым свойствам отбирали для дальнейшей работы (накопление, заморозка и т.д.). В случае обнаружения несекретирующих клонов, что говорит о неустойчивости секреции антител, необходимо повторять клонирование, либо отказаться от дальнейшего использования этого клона.

Обычные условия культивирования гибридомных клеток - 37C и 5% СО (CO2-инкубатор «Nuaire»). Основа и состав питательных сред описаны в пункте 2.4. Культивирование клеток необходимо проводить в условиях, максимально приближенных к стерильным. Попавшие в культуру клеток бактерии и грибы, опережая гибридомы в скорости роста, быстро исчерпают питательные вещества ростовой среды и насытят ее своими токсинами, что приведет к гибели гибридомных клеток. Во избежание инфицирования пользовались стерильными средами и стерильной культуральной посудой, применяли антибиотики, а все манипуляции с клетками проводили в ламинарном боксе с принудительной подачей стерильного воздуха.

Массовая наработка гибридомных клеток после отбора позитивных клонов включала следующие этапы культивирования in vitro:

1. После покрытия клетками 2/3 поверхности дна 96-луночного планшета их аккуратно суспендировали и переносили в лунки объемом 2 мл, в которые предварительно за 24 ч были внесены перитонеальные макрофаги.

2. После разрастания гибридом их пересевали в чашки Петри и культуральные флаконы емкостью 50 - 100 мл (посевная доза 150 – 200 тыс. кл./мл).

Гибридомы необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегать повышения концентрации клеток выше 800 – 900 тыс. кл./мл. Замену ростовой среды проводили по мере ее закисления в результате роста клеток (каждые 2 - 3 дня).

Культивирование гибридных клеток in vivo проводили в организме беспородных и линейных мышей Balb/c, предварительно за 14 дней до введения гибридом праймированных пристаном (Sigma») в дозе 0,5 мл/мышь. Гибридомы вводили в культуральной среде внутрибрюшинно в количестве 10 7 клеток на мышь [74]. Иммунную асцитическую жидкость собирали по мере формирования опухолей через 2 – 4 недели.

Гибридные клетки суспендировали в культуральной среде, определяли их концентрацию в тесте с трипановым синим и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали до концентрации 107 м.к./мл в охлажденной среде для замораживания, содержащей 95 % сыворотки плода коровы («HyClone») и 5 % ДМСО. Суспензию клеток разливали по 1 мл в полипропиленовые ампулы, охлаждали на 1оС в минуту до –70оС и переносили в жидкий азот [16].

При размораживании клеток ампулу помещали в водяную баню при 37оС, добавляли 10-кратный объем теплой культуральной среды, аккуратно перемешивали и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 минут.

Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в среде, содержащей 15% сыворотки плода коровы («HyClone»), определяли их жизнеспособность и концентрацию в тесте с трипановым синим, разносили в лунки культуральных панелей [16].

2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатантов гибридом и асцитических жидкостей мышей осуществляли преципитацией сульфатом аммония [16, 50, 148]. К охлажденным супернатантам медленно, постоянно перемешивая, добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до конечной концентрации 50%. Пробы оставляли на магнитной мешалке в холодильнике на 2 часа, после чего центрифугировали при скорости 4,5тыс.об/мин и +4C в течение 15 минут на центрифуге серии Allegra X- компании Beckman Coulter. Осадок иммуноглобулинов суспендировали в минимальном объеме, равном 1/10 исходного объема супернатанта, фосфатносолевого буфера (ФСБ) и диализовали против 500 - 1000 объемов ФСБ с трехкратной сменой в течение 18 - 24 часов. Очищенные препараты иммуноглобулинов консервировали добавлением мертиолата или азида натрия до конечной концентрации 0,01%. После проверки титра антител препараты разливали по аликвотам и хранили при температуре –20оС.

Конъюгацию специфических иммуноглобулинов с ФИТЦ осуществляли по методу [17, 50, 66] с некоторыми модификациями: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 5 мг на 100 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9, (достигалась предварительным диализом раствора иммуноглобулинов против КББ). Процесс конъюгирования происходил при температуре 6 ± 2 °C в течение 18 ч или при комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.

Для удаления химически несвязанного белка от флуорохрома раствор флуоресцирующих антител диализовали против ФСБ с трехкратной сменой буфера в течение 24 часов или пропускали через колонку с сефадексом G-50, предварительно промытую ФСБ. На колонку сверху осторожно наслаивали флуоресцирующий конъюгат, подлежащий очистке от непрореагировавшего с белком флуорохрома. Для элюирования меченого белка из колонки применялся ФСБ. В процессе фильтрации в колонке появлялись 2 интенсивно окрашенные зоны: верхняя зона - непрореагировавший с белком свободный флуорохром, а нижняя - белок, связанный с ФИТЦ. На выходе из колонки белковую фракцию собирали с момента появления первых окрашенных капель и прекращали после прохождения через колонку всей интенсивно окрашенной нижней зоны.

Различают прямую (РПИФ) и непрямую иммунофлуоресценцию (РНИФ) [50]. В основе прямой иммунофлуоресценции лежит реакция взаимодействия искомого антигена и видоспецифических флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Непрямая иммунофлуоресценция позволяет обнаружить комплексы антигенов с предварительно нанесенными немечеными антителами с помощью антиглобулиновых конъюгатов.

РПИФ. На фиксированные мазки холерных вибрионов микропипеткой наносили по 30 мкл раствора флуоресцирующих моноклональных антител.

Препараты помещали во влажную камеру (чашку Петри с увлажненной ватой) при температуре 37C, не допуская высыхания нанесенного раствора антител.

Через 30 минут мазки промывали 2 раза по 5 минут в промывающем растворе (ФСБ) и 1 раз ополаскивали дистиллированной водой. Препараты высушивали на воздухе и просматривали под люминесцентным микроскопом с применением иммерсионного нефлуоресцирующего масла.

РНИФ. На первом этапе на фиксированные мазки холерных вибрионов микропипеткой наносили по 30 мкл раствора МКА. Препараты помещали во влажную камеру при температуре 37C, не допуская высыхания нанесенного раствора антител. Через 30 минут мазки промывали 2 раза по 5 минут в промывающем растворе (ФСБ) и 1 раз ополаскивали дистиллированной водой.

Препараты высушивали на воздухе. Второй этап – окраска специфического комплекса антиген–антитело люминесцирующей сывороткой против глобулинов мыши производства института им. Н.Ф. Гамалеи в течение 30 мин при 37C.

Затем окрашенные мазки так же промывали в ФСБ и в дистиллированной воде, высушивали и просматривали под люминесцентным микроскопом.

Результаты реакции в зависимости от степени яркости флуоресценции бактерий, «окрашенных» люминесцирующими иммуноглобулинами, оценивали по четырехкрестовой системе:

«4+» - сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки;

«3+» - яркая флуоресценция по периферии микробной клетки;

«2+» - слабое свечение всей клетки;

«1+» - едва заметные контуры клетки.

Специфическим считается свечение с яркостью на «4+» и «3+», свечение с яркостью на «2+» или «1+» принято считать неспецифическим. Обнаружение светящегося ореола на 3+/4+ хотя бы у единичных клеток свидетельствует о наличии в исследуемом материале холерного вибриона [50].

Благодаря методической простоте, специфичности и высокой чувствительности широкое распространение получил твердофазный вариант ИФА (ТИФА). Его несложно модифицировать в «дот»-ИФА.

Постановку ТИФА осуществляли общепринятым методом [101] в 96луночных плоскодонных планшетах («Costar»). Процедура включала в себя следующие основные этапы:

1. Сенсибилизация микропланшетов антигеном (2 часа при 37C или 24 часа при 6 ± 2 °C), использовали миллиардную взвесь холерных вибрионов в дозе 10 7 – 108 микробных клеток на лунку.

2. Отмывка планшетов от не связавшегося с пластиком антигена ФСБ (рН 7,4) с добавлением 0,1 % Твин-20 (ФСБ - Т).

3. Внесение в лунки исследуемых антител, инкубация в течение 1 часа при 37 С.

4. Отмывка ФСБ – Т.

5. Внесение в лунки антимышиного пероксидазного конъюгата производства института им. Н.Ф. Гамалеи, инкубация 1 час при 37 С.

6. Отмывка ФСБ.



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:

«НОВИКОВ Сергей Геннадьевич ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ТЯЖЁЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ПОЧВ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ПО КАТЕГОРИЯМ ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ (НА ПРИМЕРЕ Г. ПЕТРОЗАВОДСКА) Специальность 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Федорец Наталия Глебовна...»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВНУТРИУТРОБНЫХ ПНЕВМОНИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ИСХОДОМ 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц, доктор медицинских наук, профессор Г.Г. Фрейнд Пермь – ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....»

«ПОПОВ АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ ТАМНО – И ДЕНДРОБИОНТНЫХ ПИЛИЛЬЩИКОВ (HYMENOPTERA, SYMPHYTA) ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук Н.Н. Винокуров Якутск – ОГЛАВЛЕНИЕ Введение. Глава 1. История исследований пилильщиков...»

«Кузьменко Александр Анатольевич РАСТИТЕЛЬНОСТЬ МОРЕННЫХ И ВОДНО-ЛЕДНИКОВЫХ РАВНИН ЮЖНОЙ ОКРАИНЫ СМОЛЕНСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ Специальность 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор...»

«ЧИКИНА ЕЛЕНА ЭНГЕЛЬСОВНА ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНЫХ СИНУСИТОВ 03.00.02 - биофизика 14.00.04 – болезни уха, горла и носа Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор О.В. Мареев кандидат физико-математических наук А.Н. Башкатов Саратов - 2005 г....»

«МИХЕЕВ ВЯЧЕСЛАВ АРКАДЬЕВИЧ ЭКОЛОГИЯ СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ CARASSIUS AURATUS GIBELIO Bloch ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ КУЙБЫШЕВСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА 03.00.16. – Экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н., профессор В.А. НАЗАРЕНКО Ульяновск, ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ... Глава I. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКОЛОГИИ СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ. Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.. Глава...»

«УДК 612.821.6; 612.825 НОВИКОВА Маргарита Робертовна РОЛЬ ОРБИТО-ФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ И ГИППОКАМПА В АДАПТИВНО-КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТВОЛА МОЗГА КРЫС Специальность 03.00.13 Физиология Биологические наук и Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Д.б.н., проф. В.П.Подачин Д.б.н. Е.В.Шарова Москва – СОДЕРЖАНИЕ: Стр. ОГЛАВЛЕНИЕ.. ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1....»

«Захаров Алексей Борисович Дендроиндикация загрязненности окружающей среды урбанизированных территорий на примере искусственных популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) Балахнинской низменности 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель :...»

«Семёнов Михаил Александрович Экологические механизмы формирования экосистемного биоразнообразия при искусственном лесовосстановлении (на примере Цнинского лесного массива) Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени Кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ДЖАМБЕТОВА ПЕТИМАТ МАХМУДОВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ В ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Сычева Л.П.; доктор биологических наук Рубанович А.В. Грозный –  ...»

«МАКСИМОВ ДАНИИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗЛИЧИЯ В ХРОМОСОМНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКА SUUR В РАЗВИТИИ DROSOPHILA MELANOGASTER КОРРЕЛИРУЮТ С АКТИВНОСТЬЮ ГЕНОВ И СОСТОЯНИЕМ ХРОМАТИНА Молекулярная генетика – 03.01.07 Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : к.б.н. Белякин Степан Николаевич Новосибирск...»

«ЧУДНОВСКАЯ ГАЛИНА ВАЛЕРЬЕВНА БИОЭКОЛОГИЯ И РЕСУРСЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант : Чхенкели Вера Александровна, доктор биологических наук, профессор Иркутск – СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1. Обзор литературы по состоянию проблемы исследований ресурсов лекарственных растений.. 1.1...»

«КОЗЛОВА Юлия Олеговна РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРЕ- И ПОСТНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРУППЫ СИНДРОМОВ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ МИКРОДЕЛЕЦИЕЙ 22q11.2 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Т.В. Золотухина Москва 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования...»

«АНДРЕЙЧЕВ Виталий Васильевич ДИСБИОТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ В РЕПРОДУКТИВНОМ ТРАКТЕ У МУЖЧИН С ХРОНИЧЕСКИМ ТРИХОМОНИАЗОМ 14.00.11 – Кожные и венерические болезни 03.02.03 – Микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор В.А. Гриценко доктор медицинских наук М.А. Захарова Оренбург-...»

«Бабоша Александр Валентинович МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ Специальность 03. 01. 05 – Физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Основные представления о природе...»

«Баканев Сергей Викторович Динамика популяции камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) в Баренцевом море (опыт моделирования) Специальность 03.00.18 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор А. В. Коросов Мурманск – 2009 Содержание Введение... Глава 1....»

«Дулепова Наталья Алексеевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ РАЗВЕВАЕМЫХ ПЕСКОВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., c.н.с., А.Ю. Королюк Новосибирск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 1.1. Район и объект исследования 1.2....»

«МИЛАНОВСКИЙ Евгений Юрьевич ГУМУСОВЫЕ ВЕЩЕСТВА КАК СИСТЕМА ГИДРОФОБНОГИДРОФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Специальность 03.00.27 - почвоведение Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2006 Работа выполнена на кафедре физики и мелиорации почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Официальные оппоненты :...»

«БУРДУКОВСКИЙ МАКСИМ ЛЕОНИДОВИЧ ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ХИМИЗАЦИИ ПОЧВ ЮГА ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА НА БИОЛОГИЧЕСКИЙ КРУГОВОРОТ И СОДЕРЖАНИЕ МАКРО– И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Голов Владимир Иванович...»

«Орлова Ольга Геннадьевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА Специальность 03.00.07 - микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.т.н. Медведева Н.Г. Научный консультант : к.б.н.Зайцева Т.Б. Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. Обзор литературы.....»





 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.