WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |

«МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ИМ. Н.В.ЦИЦИНА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Бабоша Александр Валентинович

МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ

ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И

УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ

Специальность 03. 01. 05 – Физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ Основные представления о природе иммунитета растений Фитогормоны и патогенез Синтез, рецепция и транспорт цитокининов и АБК Изменение уровня цитокининов и абсцизовой кислоты при инфицировании Синтез растительных гормонов патогенами Иммуномодулирующие свойства экзогенных цитокининов и АБК Механизмы влияния цитокининов и АБК на устойчивость растений Многофазность концентрационных зависимостей физиологически активных веществ Цели и задачи исследования

ГЛАВА I. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ

МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПШЕНИЦЫ И ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ

РЕАКЦИЙ РАСТЕНИЯ КАК ВОЗМОЖНОЕ ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ

ПРОЯВЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В СОСТОЯНИИ ПАТОСИСТЕМЫ

1.1 Особенности развития возбудителя мучнистой росы пшеницы 1.1.1 Действие экзогенных цитокининов на параметры ранних этапов развития возбудителя мучнистой росы пшеницы 1.1.2 Развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса 1.2 Регуляция направления роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек главной жилки листа 1.3 Образование и вариабельность гало – ответная реакция эпидермальных клеток злаков на проникновение возбудителя мучнистой росы 1.3.1 Изменение размеров гало под действием экзогенных цитокининов 1.3.2 Изменчивость гало под действием оксидативного стресса и метаболических ингибиторов 1.3.3 Изучение гало методом сканирующей электронной микроскопии

ГЛАВА МНОГОФАЗНОСТЬ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО

II.

ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

2.1 Иммуномодулирующие свойства цитокининов в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы 2.2 Форма концентрационной кривой иммуномодулирующих свойств цитокининов и ее варьирование 2.3 Влияние иммуномодуляторов на форму концентрационной кривой иммуномодулирующей активности зеатина при совместном применении 2.4 Математическая модель концентрационной зависимости влияния цитокининов на восприимчивость листьев пшеницы к возбудителю мучнистой росы 2.5 Динамика цитокининов и абсцизовой кислоты при инфицировании мучнистой росой пшеницы в патосистемах с различным уровнем совместимости 2.6 Биологические свойства олигоаденилатов растительного происхождения 2.6.1 Действие олигоаденилатов растительного происхождения на вирусную инфекцию и рост черенков картофеля в культуре ткани in vitro 2.6.2 Олигоаденилаты растительного происхождения при оздоровлении картофеля от вирусов методом апикальной меристемы 2.6.3 Цитокининподобная активность интерферона и олигоаденилатов растительного происхождения 2.6.4 Иммуномодулирующие свойства олигоаденилатов растительного происхождения в патосистеме пшеница–возбудитель мучнистой росы и их влияние на форму концентрационной кривой зеатина при совместном 2.7 Изменение восприимчивости пшеницы к возбудителю мучнистой 2.8 Влияние медиаторов кальциевой сигнальной системы на

ГЛАВА МНОГОФАЗНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННЫХ

ЦИТОКИНИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ

3.1 Концентрационная зависимость действия цитокининов на рост корня 3.2 Многофазность концентрационной зависимости действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков томатов 3.3 Влияние цитокининов разного химического строения на длину 3.4 Суммарные концентрационные кривые томатов и рапса 3.5 Вариабельность концентрационной зависимости рострегулирующего действия цитокининов в присутствии иммуномодуляторов и цитокининов 3.5.2 Концентрационная кривая зеатина при моделировании 3.5.3 Изменение концентрационной кривой зеатина в присутствии 3.6 Многофазность концентрационной зависимости активности

ГЛАВА IV. ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ ЛЕКТИНЫ И УСТОЙЧИВОСТЬ

РАСТЕНИЙ К ПАТОГЕННЫМ ОРГАНИЗМАМ И АБИОТИЧЕСКИМ

4.1 Изменение активности лектинов при инфицировании и в растениях, 4.2 Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулированного вирусом 4.3 Влияние экзогенных моносахаридов и лектинов на активность реакции Хилла в изолированных хлоропластах здоровых и инфицированных 4.4 Изменение содержания агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) в 4.5 Роль лектинов в регуляции защитных реакций и ростовых процессов 4.5.1 Индукция лектинов при биотических и абиотических стрессах

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ

ПУБЛИКАЦИИ В МАТЕРИАЛАХ КОНФЕРЕНЦИЙ И СБОРНИКАХ

СВЕДЕНИЯ О ЛИЧНОМ УЧАСТИИ И СОАВТОРАХ

ВВЕДЕНИЕ

Особенностью многоклеточных живых организмов является наличие особой подсистемы, ответственной за адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды и предназначенной для поддержания структурной и функциональной целостности. Кроме того, иммунная система распознает и уничтожает чужеродные, измененные или потерявшие функциональность вещества и клетки, сохраняя наиболее важные признаки организма, приобретенные в процессе эволюции. Эти функции иммунной системы активируются при внедрении патогена или действии абиотических стрессоров. Основные представления о закономерностях взаимодействия растения и патогена возникли в результате бурного развития биологии в начале 20-го века и были обобщены Н.И. Вавиловым в разработанной им теории генотипического иммунитета. Им же был предложен термин для обозначения этого нового раздела биологии растений – фитоиммунологии. В связи с иммунитетом растений Н.И. Вавилов выделял две стадии развития паразитов: «проникновение паразита в растение и распространение паразита внутри тканей растения-хозяина» (Вавилов, 1935: цит. по Вавилов, 1986, с.324). Разные исследователи представляли данный процесс с разной степенью детализации. Так, по мнению К.Т. Сухорукова (1952) среди основных этапов следует выделять: развитие патогена на поверхности растения, проникновение в растительную клетку, фазу реакции растения на заражение и итоговый период, внешне проявляющийся симптомами заболевания. Более поздние этапы защитных реакций при патогенезе несут черты сходства и, по-видимому, в определенной степени имеют общую природу с адаптивными реакциями, индуцируемыми в ответ на абиотические стрессовые воздействия.

Интенсивность иммунных ответов организма можно регулировать экзогенными физиологически активными веществами, которые получили название иммуномодуляторов (Tzianabos, 2000). Использование таких веществ – одно из перспективных направлений регуляции патогенеза и защиты растений от стрессовых воздействий различной природы (Озерецковская и др., 1994; Андреев, Талиева, 1996; Тютерев, 2002). Вместе с тем их широкое применение наталкивается на трудности, связанные с нестабильностью, а подчас и неоднозначностью их действия (Озерецковская, Васюкова, 2002). Так опрыскивание растений, обладающих определенным уровнем естественной устойчивости, растворами адаптогенов снижало их адаптивный потенциал (Гудковский и др., 2002). Использование препарата способствовало повышению степени распространения твердой головни (Хайруллин и др., 2009). Достаточно стабильная устойчивость ржи к опрыскивании посевов эпином-экстра, иммуноциофитом и ЦеЦеЦе 460. В то же время использование циркона, тидиазурона, гуми 30, иммуноцитофита и цитодефа дало разнонаправленные результаты иммуномодуляции на листьях разного яруса или в отношении разных патогенов (Смолин, Савельев, 2007).

Имеются примеры, когда разнонаправленность иммуномодулирующего действия проявлялась непосредственно в экспериментах с использованием Эпибрассинолид в концентрации 10 -7– 10-6 г/л оказывал ингибирующее действие на развитие Bipolaris sorokiniana на проростках ячменя, однако меньшая концентрация 10 -8 оказывала стимулирующее действие (Смолин и др., 2010). Наоборот, превышение концентрации классического индуктора устойчивости, салициловой кислоты, выше определенного предела стимулировало восприимчивость к фитофторозу, более того индукция устойчивости у обработанных растительных тканей через определенное время сменялась индукцией восприимчивости (Васюкова и др., 1996).

Изменение физиологического состояния клубней картофеля при хранении вызывало изменения иммунизирующего диапазона концентраций данного вещества на несколько порядков (Васюкова и др., 1996). В связи с этим интересно отметить, что направление действия салициловой кислоты на флоэмную разгрузку в корнях кукурузы также изменялось в зависимости от концентрации или продолжительности экспозиции (Бурмистрова и др., 2009).

Возможно, что подобная неоднозначность имеет более общий характер и не ограничивается только защитными реакциями при патогенезе или даже только регуляцией устойчивости к неблагоприятным факторам в целом. В случае такого разнонаправленного действия физиологически активных веществ их невозможно однозначно классифицировать как ингибиторы или активаторы. При практическом применении таких соединений эффект будет варьировать в зависимости от условий применения, а если эти условия плохо изучены или их невозможно контролировать с достаточной степенью точности, результат будет неопределенным. Можно ожидать возникновения сходных проблем и в совершенно неожиданных областях применения экзогенных соединений. Например, инсектициды из класса неоникотиноидов, как оказалось, способны в качестве побочного действия индуцировать салицилат-зависимые защитные реакции, устойчивость к стрессам и увеличение продуктивности в отсутствии насекомых-вредителей (Ford et al., 2010). Однако в других экспериментах увеличение продуктивности не наблюдали (Wilde et al., 2007). Актуальность изучения данного вопроса определяется и тем, что закономерности изменения направления действия подобных физиологически активных веществ могут играть фундаментальную роль в регуляции развития растений и их взаимодействия с окружающей средой.

Приведенные выше примеры свидетельствуют о сложности механизмов устойчивости. Одним из источников неоднозначности при индукции защитных реакций на инфицирование, по-видимому, является необходимость распознавать и находить способы защиты от патогенов с противоположной стратегией питания: биотрофов и некротрофов (Thomma et al., 1998), а также фитопатогенов и фитофагов (Буров, Долженко, 2008). Другим источником, вероятно, может быть двойственный характер активных форм кислорода (АФК), как компонентов нормального метаболизма и как повреждающих агентов.

Двойственность заложена и в самом функционировании иммунной системы, активированное состояние которой в значительной степени несовместимо с нормальными процессами роста и развития. Эволюционные процессы, по-видимому, протекают в условиях необходимости компромисса между ростом и развитием, ростом и защитой (Herms, Mattson, 1992).

Необходимость метаболических изменений, увеличивающих устойчивость к внешним воздействиям, но не всегда оптимальных для роста или развития, ведет к представлениям о цене устойчивости и цене восприимчивости – обстоятельствам, не позволяющим считать наличие гена устойчивости всегда безусловным преимуществом и способствующим тем самым поддержанию полиморфизма в популяции (Brown, 2002; Tian et al., 2003; Bostock, 2005). В качестве примера можно привести обнаруженную у устойчивого к Y-вирусу картофеля сорта табака повышенную по сравнению с восприимчивым сортом чувствительность к высоким концентрациям озона (Ye et al., 2012).

На практике неоднозначность устойчивости может проявляться, например, в снижении числа семян и урожая в целом у устойчивых к мучнистой росе трансгенных линий пшеницы с повышенной экспрессией хитиназ и глюканаз (Kalinina et использовании индукторов устойчивости (Heil et al., 2000).

Механизм перераспределения ресурсов между различными физиологическими программами может быть непосредственно связан с модификацией цитокининового сигналинга при запуске защитных эффектов, зависимых от R-генов (Igari et al., 2008). При этом происходит изменение содержания и активности фитогормонов. Верно и обратное: приведенные ниже данные о влиянии фитогормонов на устойчивость свидетельствуют о том, что изменения фитогормональной системы способно модифицировать протекание защитных реакций.

На метаболическом уровне одним из инструментов регуляции процессов, требующих согласования взаимоисключающих эффектов, может быть многофазная концентрационная зависимость физиологического действия у регуляторных соединений. При этом наличие иммуностимулирующей и иммуносупрессорной функции у одного и того же соединения не только более экономно с точки зрения расхода материальных ресурсов, но и должно создать более сложную конфигурацию регуляторных механизмов: при накоплении иммуномодулятора с переходом на ингибиторную ветвь концентрационной кривой химические реакции, которые приводят к его инактивации, будут способствовать усилению иммунного ответа и наоборот.

Если жизненный цикл паразита требует более длительного совместного существования, для сохранения иммуносупрессии соответствующие сопряженные и синхронизированные механизмы переключения должны существовать и у патогенного организма.

Среди физиологически активных веществ, которые, по-видимому, способны давать разнонаправленные иммуномодулирующие и рострегулирующие эффекты, в первую очередь необходимо назвать соединения с фитогормональной активностью.

Основные представления о природе иммунитета растений Распознавание микроорганизма в качестве патогена на самых ранних этапах взаимодействия является одним из основных условий включения защитных реакций и возникновения состояния устойчивости. Согласно гипотезе Флора (H.H. Flor) «ген-на-ген» для такого хода патологического процесса – несовместимости растения и патогена – необходимо наличие 2-х доминантных генов: гена авирулентности у патогена и гена устойчивости у растения (Дьяков, 1996). Продуктом гена устойчивости является специфический рецептор, способный узнавать либо собственно продукт гена авирулентности (например, специфическую глюкозил-трансферазу), либо результат его активности (уникальную гликопротеидную структуру клеточной стенки фитопатогена). Потеря фитопатогеном продукта гена авирулентности или его модификация в результате мутации делает его невидимым для рецепторов растения-хозяина. Однако совместимость и возможность развиваться в клетках растения «оплачивается» снижением жизнеспособности патогена вследствие потери или ослабления функций, которые выполнял продукт гена авирулентности (Albersheim, AndersonProuty, 1975).

Развитием этих представлений явилась разработка «сторожевой модели»:

продукты генов устойчивости (R-генов) могут связываться не напрямую с продуктами гена авирулентности, но скорее отслеживать изменения белков хозяина в результате их взаимодействия с эффекторами фитопатогена (Dangl, Jones, 2001). Таким образом, молекулы, воспринимаемые растением в качестве индикаторов чужеродного вторжения, можно разделить на две группы, а системы, обеспечивающие их рецепцию, составляют основу двух ветвей распознающей части иммунной системы растений.

Взаимодействие этих ветвей исследователи представляют в виде «зигзаг»-модели (Jones, Dangl, 2006). В этой схеме распознавание низкоспецифичных эволюционно консервативных полимеров патогена, свойственных большим группам микроорганизмов (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs), осуществляют трансмембранные рецепторы растения (pattern recognition – receptors (PRRs) (Altenbach, Robatzek, 2007).

Узнавание таких молекул включает неспецифический иммунный ответ – PTI (PAMP-triggered immunity). Во второй фазе успешный патоген подавляет или преодолевает первичные защитные реакции, что выражается в индукции восприимчивости (effector-triggered susceptibility – ETS), возникающей под действием специальных молекул – эффекторов, определяемых наличием у паразита AVR генов. Устойчивое растение способно узнавать некоторые из таких эффекторов, что индуцирует сильный иммунный ответ (effectorETI), включающий, как правило, реакцию triggered immunity сверхчувствительности. Рецепторы, соответствующие этой третьей фазе внутриклеточные белки, имеющие в своем составе нуклеотид связывающий (nucleotide binding – NB) домен и лейцинсодержащую С-концевую область (leucine rich repeat – LRR). И, наконец, в четвертой фазе может произойти потеря или модификация эффектора и возникновение расы патогена, вновь способной развиваться в тканях растения. Считается, что устойчивость растения-нехозяина в значительной мере определяется реакциями PTI (Zhang et al., 2010). Этот тип устойчивости способен сохраняться в течение более длительного периода существования растительного таксона, поскольку в отличие от расоспецифической устойчивости определяется многоуровневой защитой (Schulze-Lefert, Panstruga, 2011; Uma et al., 2011).

Способностью включать защитные реакции растения, т.е. служить элиситорами, обладают соединения различной химической природы: белки, полисахариды и гликопротеиды, липиды. Разнообразию элиситоров должно соответствовать наличие у растения возможности их распознавания (Montesano et al., 2003). Отдельным участкам генов устойчивости свойственна гипервариабельность, способствующая увеличению разнообразия рецепторных молекул (Багирова и др., 2012, с. 267, 273).

Значительное число генов устойчивости расположено не равномерно и включены в кластер сцепленных генов, сходных по структуре и выполняющих сходные функции. Образование такого семейства генов может быть связано с дупликацией и последующей модификацией полученных копий.

Гетерогенность рецепторных возможностей в популяции растенияхозяина ограничивает число растений, на которых может развиваться фитопатоген (Hamilton et al., 1990). Популяция, включающая несколько генов устойчивости, способна дольше противостоять паразиту: 1) распространение расы патогена, способной преодолевать только один из генов устойчивости, будет сильно замедленным, 2) расы, способные преодолеть несколько генов устойчивости, имеют низкую жизнеспособность, 3) наличие в составе инокулюма авирулентных рас индуцирует системную устойчивость, воздействующую и на патогенный процесс в совместимых комбинациях (Dangl, Jones, 2001). Этого оказывается достаточно для выживания в природных популяциях растений отдельных особей, обладающих даже относительно небольшим числом разновидностей рецепторов и, следовательно, бедными по сравнению с системой образования антител у животных возможностями распознавания патогена.

Часто в качестве элиситора рассматриваются мобильные или встроенные в клеточную стенку углеводные молекулы микроорганизма. Исходя из определения лектинов, как белков, специфически связывающих углеводы, именно они должны осуществлять функции специфического распознавания таких молекул как внутри, так и снаружи клетки (Peumans, Damme, 1995). В последние годы в растительных тканях обнаружена и исследована новая функциональная группа лектиновых белков: лектиноподобные рецепторные киназы (LecRK – lectin-like receptor kinase) – представители класса распространенных среди живых организмов. Особенностью, отличающей данные белки, является наличие экстрацеллюлярного домена, родственного растворимым лектинам бобовых и арабидопсиса (Herv et al., 1996; Barre et al., 2002; Andr et al.,, 2005) или хитиназе (Kim et al., 2000). Гены, сходные с LecRK, широко распространены у высших растений, однако не были обнаружены в геномных последовательностях человека и дрожжей. Хорошо исследованы LecRK арабидопсиса (Herv et al., 1996, 1999; Riou et al., 2002;

Barre et al., 2002) и Populus nigra (Nishiguchi et al., 2002). Сравнение аминокислотных последовательностей разных представителей данного класса показало высокую консервативность домена, ответственного за гидрофобные взаимодействия, и значительно большую вариабельность домена, связывающего моносахариды. Механизмом, расширяющим углеводспецифичность углеводсвязывающего центра, является взаимодействие с гидрофобными заместителями в углеводном остатке, а также модульная организация лектинов, позволяющая регулировать силу предположение, что функцией лектинов является не столько узнавание моносахаров, сколько связывание более сложных глюканов (Herv et al., 1999; Barre et al., 2002).

Исследование регуляции одного из генов лектиноподобных киназ показало увеличение экспрессии данного гена при естественном старении, поранении и обработке олигогалактуронидами (Riou et al., 2002; Nishiguchi et al., 2002). Экспрессия гена рецепторной киназы с хитиназоподобным доменом сильно возрастала при инфицировании растений табака ВТМ и Phytophthora parasitica (Kim et al., 2000). Показано, что мембранная рецепторная киназа табака, индуцируемая бактериальным элиситором харпином и играющая роль в индукции защитных реакций, содержит Nтерминальный домен, родственный лектинам бобовых (Sasabe et al., 2007).

При инфицировании и поранении, под действием олигогалактуронидов, салициловой кислоты и оксидативного стресса происходит также индукция рецепторных киназ других классов, не содержащих лектиновых доменов (Pastuglia et al., 1997; Czernic et al., 1999; He et al., 1999; Montesano et al., 2001).

Таким образом, лишенный адаптивной иммунной системы с подвижными защитными клетками, свойственной животным, иммунитет растений в значительной степени основан на сложном комплексе рецепторов врожденной иммунной системы, локализованной в каждой клетке. Вторым компонентом этой системы защиты у растений является системная передача сигнала из сайта внедрения патогена (Dangl, Jones, 2001). Механизмы и компоненты, обеспечивающие передачу и усиление сигнала, хорошо исследованы (Тарчевский, 2002). Ключевое различие устойчивых и восприимчивых растений в скорости восприятия сигнала и ответной реакции (Yang et al., 1997). При этом происходит включение метаболических программ, которые собственно и определяют невозможность развития патогена и невосприимчивость растения. Фазу ответных реакций растений, взаимоотношений» растения и паразита К.Т. Сухоруков (1952) считал наиболее интересной при изучении физиологии иммунитета.

сверхчувствительности, которая запирает внедрившегося паразита в конгломерате мертвых клеток, лишая его способности питаться и распространяться в тканях растения. Кроме того, в результате прохождения данного процесса высокую степень устойчивости приобретают не подвергшиеся атаке ткани на разном удалении от некротизируемых тканей – системная индуцированная устойчивость (Chester, 1933; Ross, 1961; Ryals et al., 1994; Sticher et al., 1997). Появление устойчивости сопровождается синтезом PR (pathogenesis related) белков и фитоалексинов, которые служат ее индикаторами, однако их роль в защите от патогенов не всегда прослеживается достаточно четко (Heil, Bostock, 2002).

Интенсивность апоптоза – программируемой гибели одной или группы клеток, которая сопровождает сверхчувствительную реакцию, и последующие защитные процессы регулируются сигналами, связанными с салициловой кислотой. Эти реакции ассоциированы с увеличением содержания активных форм кислорода – окислительным взрывом. Они эффективны против биотрофных фитопатогенов, для функционирования которых необходимы живые клетки растения-хозяина. В случае некротрофов защитные реакции, по-видимому, регулируются сигналами жасмоновой кислоты и этилена (Glazebrook, 2005). Эти изменения метаболизма имеют много общего с реакциями на поранение. Салициловая кислота с одной стороны и жасмоновая кислота и этилен с другой представляют в определенной степени взаимоисключающие метаболические программы и взаимно ингибируют друг друга (Thomma et al., 1998; Mur et al., 2013).

препятствующие нормальному развертыванию соответствующих защитных реакций, обычно сопровождаются потерей устойчивости к биотрофным фитопатогенам, но не затрагивают устойчивость к некротрофам и наоборот.

В некоторых патосистемах эта достаточно изящная схема регуляции сверхчувствительности гормональными веществами, вероятно, требует существенного уточнения. В частности, сверхчувствительная реакция у салициловой кислоты и не индуцирует повышения ее концентрации (Hckelhoven et al., 1999). Вместе с тем, обработка аналогом салициловой кислоты 2,6-дихлоризоникотиновой кислотой способна увеличивать сверхчувствительной реакции (Kogel et al., 1994).

Указанный путь защиты должен строго регулироваться, поскольку неконтролируемое включение реакции сверхчувствительности представляет возникающие как результат дефектов в системе распространения сигнала, стохастически образуют зоны реакции сверхчувствительности, как бы постоянно находясь под атакой патогена (Багирова и др., 2012, с. 301).

Индуцированная устойчивость сопровождается дополнительными энергетическими затратами, ставящими вопрос о цене устойчивости для растения (Herms, Mattson, 1992; Heil, 2002) и часто приводящими к снижению урожая в сельском хозяйстве при обработке индукторами устойчивости (Heil et al., 2000). Кроме того, при индукции устойчивости могут происходить изменения химического состава растительных тканей, в частности, накопления фитоалексинов, не всегда положительно влияющие на качество сельскохозяйственной продукции. Таким образом, аргументы в пользу того, что защитные реакции должны быть сведены к необходимому минимуму, достаточно существенны. В связи с этим определенные надежды вызывает явление сенсибилизации, заключающееся в индукции достаточно локальных изменений в метаболизме, экспрессии небольшого числа генов, которые, тем не менее, впоследствии способствуют более быстрой реакции на инфицирование (Озерецковская и др., 1994; Goellner, Conrath, 2008).

Сверхчувствительная реакция, вероятно, достаточно эффективна в определенных случаях, однако не всегда развивается при несовместимом взаимодействии растения и патогена, а, следовательно, не всегда ясно, что же конкретно способствует прекращению роста патогена (Jones, Dangl, 2006).

Образование активных форм кислорода (АФК) сопровождает реакцию сверхчувствительности и возникновение индуцированной устойчивости и является одной из наиболее ранних реакций растения на заражение (Lamb, Dixon, 1997). С генерацией АФК связаны ответные реакции нехозяина, например, у арабидопсиса (Soylu et al., 2005; Bindschedler et al., 2006). Время существенного повышения уровня АФК, т.е. время реакции растения на инфицирование, на начальных стадиях патогенеза определяют момент включения активных защитных реакций растения. У проростков пшеницы уровень АФК возрастает уже через 2 ч после заражения мучнистой росой (Hurkman, Tanaka, 1996). Такое же время потребовалось для реакции на элиситор из Aspergillus niger в культуре клеток Taxus chinensis (Qin et al., 2005). А гипокотили огурца, обработанные элиситором, показали максимум синтеза перекиси водорода уже через 30 мин (Kauss, Jeblick, 1996). У растений, несущих R-гены, наблюдали двухфазную кинетику появления АФК при инфицировании с дополнительным более поздним и более высоким пиком, отсутствующим у восприимчивых растений (Lamb, Dixon, 1997).

Кинетические показатели играют важную роль в проявлении реакции сверхчувствительности также в связи с тем, что регуляция данного процесса осуществляется балансом между содержанием АФК и NO, нарушение которого препятствует сверхчувствительной гибели клеток (Delledonne et al., 2002; Mur et al., 2006).

последовательного восстановления молекулярного кислорода 1– активированного кислорода являются синглетный кислород (1O2), гидроксилрадикал (HO•), гидропероксил-радикал (HO2·), супероксид-анионрадикал (O2•–) и перекись водорода (H2O2) (Shetty at al., 2008). Большинство АФК являются очень нестабильными короткоживущими соединениями, в силу чего проявляют активность только вблизи от мест их синтеза. Наоборот, перекись водорода – достаточно стабильное химическое соединение, легко проникающее через клеточные мембраны и способное транспортироваться на достаточно большие расстояния (Ли и др., 2004; Vranova et al., 2002; Gapper, Dolan, 2006). В норме небольшое количество АФК синтезируется неэнзиматическим путем в хлоропластах и митохондриях (Desikan et al., 2005). Транзитное увеличение продукции АФК под действием биотических и абиотических стрессов получило название окислительного взрыва (Averyanov, 2009; Foyer, Noctor, 2011). Наряду с электронным транспортом в указанных выше органеллах важными источниками этих соединений являются пероксидаза клеточной стенки, мембранная НАДФН-оксидаза, амино-оксидаза и оксалат-оксидаза (Zhang et al., 1995; Allan, Fluhr, 1997;

Lamb, Dixon, 1997; Grant et al., 2000; Bolwell et al., 2002; Torres et al., 2002;

Torres et al., 2006).

Важная роль АФК в метаболизме аэробных организмов определяется их уникальными свойствами. В первую очередь, необходимо отметить высокую токсичность этих соединений, обусловленную действием в качестве сильных окислителей, способностью к инициации реакций перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот и повреждением клеточных мембран (Аверьянов, Лапикова, 1988; Турпаев, 2002). Это обусловило выдвижение гипотезы об их защитной роли в качестве антимикробных агентов (Аверьянов и др., 1978; Погосян и др., 1978). Добавление в среду культивирования микро - и миллимолярных концентраций перекиси водорода ингибировало прорастание и рост ряда бактериальных и грибных фитопатогенов (Peng, Kuc, 1992; Wu et al., 1995; Aver'yanov et al., 2007).

Больший синтез перекиси водорода в устойчивом сорте пшеницы на раннем этапе взаимодействия с гемибиотрофом Septoria tritici соответствовал ингибированию роста патогена (Shetty et al., 2003). Показано, что более раннее накопление перекиси водорода и обусловленное им укрепление клеточной стенки способствует устойчивости растения к некоторым фитопатогенным грибам, включая возбудителей мучнисторосяных грибов (von Rpenack et al., 1998; Mlckova et al., 2004). Второму пику содержания перекиси водорода в восприимчивом сорте соответствовала высокая толерантность фитопатогена к данному соединению на этапе его репродукции (Shetty et al., 2007).

Однако АФК токсичны не только для фитопатогенов, но и для самого растения-хозяина. Структурные и функциональные нарушения фотосинтеза и дыхания под действием неблагоприятных факторов внешней среды могут усиливать их токсичность (Аверьянов, 1991), что собственно и является причиной повреждений при действии стрессоров (Лукаткин, 2002; Kuzniak, 2002). Таким образом, действие АФК имеет двойственный характер (Dat et al., 2000; Hckelhoven, Kogel, 2003). В связи с этим их содержание в тканях растения строго регулируется при участии антиоксидантов (Аверьянов, 1991;

Kuzniak, 2002; Feierabend, 2005; Grace, 2005; Foyer et al., 2005; Mittler, Poulos, 2005; Smirnoff, 2005; Полесская, 2007; Foyer, Noctor, 2011). Процессы адаптации к абиотическим стрессам обычно сопровождаются увеличением количества и активности антиоксидантов (Dat et al., 1998; Burritt, Mackenzie, 2003; Larkindale, Huang, 2004; Sunkar et al., 2006). Нарушения связей в регуляторной системе, поддерживающей уровень свободнорадикальных канцерогенезе и лучевом поражении (Бурлакова, 2007).

Некоторые аналогии указанной выше двойственности можно найти в фитопатогенов. Содержание перекиси водорода при сверхчувствительной реакции положительно коррелировало с ростом некротрофа Botrytis cinerea и отрицательно с – биотрофа Pseudomonas syringae (Govrin, Levine, 2000). Для рассматриваться в качестве фактора вирулентности, а толерантность к окислительному взрыву способствует устойчивости растения. Аналогичные взаимоотношения между растением-хозяином и некротрофным патогеном наблюдали в патосистеме Prunus persica–Monilinia fructicola (Liu et al., 2013).

Наоборот, успешный биотрофный патоген, в частности, Erysiphe graminis, должен препятствовать накоплению перекиси водорода и способствовать (Hckelhoven, Kogel, 2003).

Помимо непосредственного воздействия на патогенные микроорганизмы АФК играют роль сигнальных молекул, участвуя в комплексной сети сигналов, участвующей в регуляции защитных реакций (Тарчевский, 2002).

В функционировании перекиси водорода в качестве сигнальной молекулы осуществляется при участии аквапоринов (Bienert et al., 2007). Построены модели передачи сигнала амплитудно - и частотно-модулируемыми колебаниями внутриклеточной концентрации перекиси водорода аналогично тому, как это происходит при образовании кальциевых волн (Vestergaard et al., 2012).

Сигнальная роль АФК отражена в ряде экспериментальных и обзорных работ (Levine et al., 1994; Desikan et al., 2005; Shetty et al., 2007; Harir, Mittler, 2009). Так, перекись водорода опосредует действие АБК на увеличение активности кальциевых каналов в замыкающих клетках устьиц, ведущее к их закрытию (Pei et al., 2000). Основную роль в синтезе супероксид-аниона, медиатора супероксидсинтазной сигнальной системы, играет растительная НАДФН-оксидаза (Тарчевский, 2000), имеющая гомологию с аналогичным ферментом фагоцитов млекопитающих (Torres, Dangl, 2005). АФК принимают участие в регуляции процессов роста и развития (Jones, Smirnoff, 2005; Mori et al., 2009). В частности, рост корневых волосков сопровождался увеличением количества АФК, продуцируемых НАДФН-оксидазой (Foreman et al., 2003). Концентрации тиоредоксина и компонентов аскорбат-глютатионового цикла изменяются при действии факторов внешней среды и могут оказывать влияние на интенсивность регуляторных сигналов, генерируемых фитогормональной системой, в частности ауксинами (Bashandy et al., 2010; Foyer, Noctor, 2011). Следует отметить, что соотношение окисленной и восстановленной форм глютатиона предшествующем сверхчувствительной гибели клеток (Vanacker et al., 2000).

Появление в результате ответных реакций растения на инфицирование физического барьера для проникновения паразита в виде утолщения клеточной стенки также связано с синтезом АФК. В этом случае эти химического агента, непосредственно участвующего в синтезе лигнина из низкомолекулярных предшественников (Mader, Amberg-Fischer, 1982; Lamb, гидроксипролином, с образованием каркаса для отложения лигнина (Kumudini, Shetty, 2002). При поражении ржавчинными и мучнисторосяными грибами наблюдали повышение активности эндоплазматического приобретала извилистый характер вследствие активного встраивания секреторных пузырьков (Сережкина и др., 1990). Показано, что перекись проявляется в виде автофлуоресценции в желтой области, устойчивой к обработке щелочью (von Ropenackt al., 1998; Hckelhoven et al., 1999), а об иммобилизации белков свидетельствует уменьшение их растворимости при обработке детергентами (Thordal-Christensen et al., 1997).

Экзогенное применение перекиси водорода подтверждает ее важную роль в регуляции защитных реакций растения. Обработка растений перекисью водорода способствовала усилению устойчивости к грибному (Hafez, Kirly, 2003) и вирусному фитопатогенам (Bacs et al., 2011), к холоду (Prasad et al., 1994; Feng et al., 2008), засухе (Ishibashi et al., 2011), засолению (Azevedo et al., 2005). Перекись водорода стимулировала синтез фитоалексинов и салициловой кислоты (Apostol et al., 1989; Leon et al., 1995). Появление PR- устойчивости) при действии перекиси водорода или при окислительном взрыве было опосредовано салициловой кислотой (Neuenschwander et al., 1995), а его индукция под действием салициловой кислоты в свою очередь ингибировалась антиоксидантами (Wendehenneet al., 1998). Наоборот, обработка экзогенной каталазой увеличивала частоту проникновения Uromyces vignae и Erysiphe cichoracearum в клетку растения-нехозяина (Mellersh et al., 2002).

специфичности, индуцируя различные процессы, и в зависимости от их концентрации и распределения в тканях могут оказывать противоположный эффект на процессы патогенеза (Hckelhoven, Kogel, 2003). Важным источником подобной специфичности, по-видимому, являются высокие различия между величинами констант взаимодействия разных антиоксидантов с разными биологически активными радикалами (Бурлакова, 2007). По мнению некоторых исследователей (Mller, Sweetlove, 2010), при протеолизе белков, поврежденных АФК, возникают специфические наборы пептидов, которые могут играть роль вторичных месенджеров в передаче АФК-зависимого сигнала.

Несмотря на способность к взаимному превращению и методические трудности идентификации разных химических форм АФК, в патосистеме мучнистая роса–ячмень удалось проследить пространственно-временные закономерности появления перекиси водорода и супероксид-аниона (Hckelhoven, Kogel, 2003). Наблюдали 3 относительно независимые друг от друга фазы накопления АФК, наиболее ранней из которых является локальное увеличение концентрации перекиси водорода в сайте контакта с эпидермисом первичной ростковой трубки мучнисторосяного гриба (4 ч после инокуляции). За ним следует увеличение продукции перекиси в области аппрессория при попытке проникновения фитопатогена через 14 ч.

Наконец, 3-я фаза наступает при индукции сверхчувствительности, в этом случае специфическое окрашивание охватывает весь объем атакованной клетки. В противоположность перекиси водорода динамика и локализация супероксид-аниона ассоциированы с восприимчивостью: супероксид-анион отсутствует в зоне эффективных папилл и в некротизируемых клетках, но при успешном проникновении патогена обнаруживается в живых клетках, окружающих некроз (Hckelhoven, Kogel, 1998; Hckelhoven et al., 1999;

Vanacker et al., 2000; Trujillo et al., 2004). В образовании супероксида в данной патосистеме определенную роль играет НАДФН-оксидаза, имеющая гомологию с соответствующим ферментом фагоцитов человека и количество которой транзитно возрастает при инфицировании. Специфическое ингибирование соответствующего гена вело к уменьшению эффективности проникновения и восприимчивости, но не влияло на содержание перекиси водорода в зоне папиллы (Trujillo et al., 2006). Аналогичное выключение данного гена в растениях Nicotiana benthamiana приводило к индукции восприимчивости и уменьшению сверхчувствительной реакции к Phytophthora infestans в несовместимой комбинации патоген–растениехозяин (Yoshioka et al., 2003). Ингибитор флавинсодержащих ферментов дифенилен-иодониум в концентрации 200 мкМ ингибировал этапы проникновения и созревания гаусторий возбудителя мучнистой росы у восприимчивых растений ячменя (Hckelhoven et al., 1999), а также внешние проявления реакции сверхчувствительности при несовместимой комбинации, но не стимулировал развития патогена (Hckelhoven, Kogel, 1998).

Известна роль супероксид и гидроксил-радикала в разрушении полимеров, приводящем к размягчению клеточной стенки при росте клетки растяжением (Foreman et al., 2003; Liszkay et al., 2004). Ингибирование синтеза гидроксил-радикала в этих экспериментах приводило к ингибированию роста корня. Предполагается, что функции супероксида как фактора, способствующего восприимчивости, связаны с аналогичным, но локальным размягчением клеточной стенки, которое происходит при внедрении мучнисторосяного патогена в клетку растения-хозяина (Trujillo et al., 2006). Супероксид-анионрадикал, а также перекись водорода служат субстратами при синтезе гидроксил-радикала в реакциях Фентона и ХабераВейсса. Эти процессы происходят при участии ионов Fe 2+ и Cu+. В связи с этим большой интерес представляет наличие железа в зоне гало и папиллы, но в виде иона Fe3+ (Liu et al., 2007). Накопление последнего в клеточной стенке происходило в результате его активного АТФ-зависимого транспорта из внутриклеточных компартментов в ответ на попытку внедрения патогена и увеличения содержания перекиси водорода. Можно предположить, что регуляция соотношения Fe2+/Fe3+ также вносит вклад в создание сложных метаболических связей, которые иногда проявляются в неоднозначности и разнонаправленности действия АФК в больном и здоровом растении.

При взаимодействии Uromyces vignae и Erysiphe cichoracearum с растениями-нехозяевами образование перекиси водорода клеточной стенке не зависело от транскрипции и трансляции, однако применение ингибитора актинового цитоскелета цитохалазина Е существенно уменьшало ее концентрацию (Mellersh et al., 2002). Активация НАДФН-оксидазы в фагоцитах также происходила при участии актинового цитоскелета (el Benna et al., 1994).

В настоящее время накоплен большой массив информации о роли цитоскелета при патогенезе у растений и животных, а также при взаимодействии с симбиотическими микроорганизмами. Считается, что основные принципы регуляции цитоскелетных функций консервативны у эукариотических клеток (Burridge, Wennerberg, 2004). Поскольку для успешного инфицирования требуется регуляция процессов адсорбции, внедрения в клетку хозяина, фагоцитоза, внутри- и межклеточные перемещения и другие функции, наличие у патогена белков, взаимодействующих с регуляторными элементами цитоскелета хозяина, – одно из необходимых условий успешного патогенеза (Gruenheid, Finlay, 2003).

Как при совместимой, так и несовместимой комбинации важную роль играет актиновый цитоскелет, от функционирования которого зависят потоки секреторных везикул (Takemoto et al., 2003) и таксис ядер к местам инфицирования (Gross et al., 1993). Направленная аккумуляция защитных веществ при взаимодействии патогена с растением-нехозяином коррелировала с реорганизацией актинового цитоскелета (McLusky et al., 1999; Schmelzer, 2002; Lipka, Panstruga, 2005; Kwon et al., 2008).

Ингибирование полимеризации актина цитохалазином приводило к увеличению числа случаев проникновения фитопатогенных грибов в клетки растений-нехозяев (Kobayashi et al., 1997). В частности, Erysiphe pisi формировал гаустории в клетках ячменя, пшеницы, огурца и табака, однако дальнейшего развития болезни не происходило в результате реакции сверхчувствительности. При инфицировании происходила концентрическая реорганизация актинового и тубулинового цитоскелета в месте контакта растения и патогена. Одновременное применение ингибиторов сборки микротрубочек и микрофиламентов давало аддитивный эффект. При сверхчувствительной реакции на инфицирование ржавчиной актиновые микрофиламенты были направлены к мертвым клеткам (Kobayashi et al., 1994), а использование цитохалазина приводило к снижению интенсивности реакции (kalamera, Heath, 1998). Накопление флуоресцирующих соединений в клеточной стенке растения в местах контакта с Botrytis allii происходило с одновременной поляризацией цитоскелета (McLusky et al., 1999). В патосистеме возбудитель мучнистой росы–растения ячменя реорганизацию цитоскелета в устойчивых растениях наблюдали вокруг мест проникновения, а в восприимчивых – вокруг гаусторий (Opalski et al., 2005). Очевидно, что в последнем случае реорганизация цитоскелета при инфицировании происходила так, чтобы обеспечить транспорт веществ для питания патогена, а, значит, воздействие ингибиторов при определенных условиях может иметь совершенно разные последствия. Интересно, что соединения, стабилизирующие или дестабилизирующие микротрубочки, т.е.

противоположные по своей активности, могли давать одинаковый эффект (Escuin et al., 1999).

Таким образом, иммунитет растений представляет собой сложную и многоуровневую систему защитных процессов, каждый из которых может играть основную роль в защите от одних фитопатогенов и успешно преодолеваться другими. Благодаря этому обстоятельству устойчивость и восприимчивость не являются бинарной альтернативой, но представляют собой континуум, включающий все возможные промежуточные состояния (Glazebrook, 2005). Мультикомпонентная природа иммунитета у растений (Дьяков и др., 2001, с.206), по-видимому, предполагает отсутствие общего решения задачи как защиты от патогенов, отсутствие универсального лекарства – панацеи, так и способа нападения, всегда гарантирующего успех.

Проявление патогенеза как совокупности частных случаев, способов защиты и нападения, вероятно, наряду с другими подобными обстоятельствами придает устойчивость системе растение–паразит, не позволяя осуществиться окончательной «победе» одного из компонентов патосистемы.

Несомненное сходство таких явлений, как защитные реакции при распознавании патогена в устойчивом растении, индуцированная устойчивость и закаливание, дающие неспецифическую защиту против многих патогенов или даже противоположно направленных стрессовых воздействий (например, холод и жара), является основой представлений о переходе в процессе адаптации в особое физиологическое состояние, дающее известную степень устойчивости к биотическим и абиотическим стрессорам.

Состоянию стресса противопоставлено физиологическое состояние, обозначенное как «гомеостаз» или «норма», в котором для компенсации давления внешней среды оказывается достаточно гомеостатических механизмов (Веселова и др., 1993, с. 82, 131). Источником дополнительной устойчивости в состоянии «стресс», по предположению этих авторов, могут быть перестройки цитоскелетно-мембранной системы (Веселова и др., 1993, с. 130). Сущность физиологических состояний при этом определяется в терминах биофизики как стационарных (или квазистационарных) состояний биологической системы, при которых поддерживается относительное постоянство ее элементов, а скорости изменения концентраций метаболитов равны нулю. Соответственно для перехода из одного дискретного физиологического состояния в другое требуется дестабилизация системы (скорости изменения концентраций метаболитов положительные или отрицательные, но не равны нулю).

Одной из особенностей состояния устойчивости при адаптации к холодовому стрессу, по-видимому, является появление более стабильных, но менее активных элементов цитоскелета, вследствие чего происходит угнетение роста (Хохлова, Олиневич, 2003). Представленные выше данные свидетельствуют о том, что реорганизации цитоскелета в той или иной роли оказываются вовлеченными и в инфекционный процесс. В этом случае существуют цитоскелет-зависимые и цитоскелет-независимые защитные реакции (Miklis et al., 2007). По-видимому, при этом происходит усиление катаболизма, которое, по мнению И.Г.Тарчевского, создает условия для быстрой замены одних биополимеров другими (Тарчевский, 1993, с.6).

Процессы адаптации, включение «стрессовых программ» и переход метаболизма в новый режим, по всей вероятности, связаны с изменением гормонального баланса (Пахомова, Чернов, 1996; Jackson, 1997; Шакирова, 2001).

Фитогормональная регуляция играет важную роль при взаимодействии растения и патогена. В патосистемах с участием биотрофных патогенов для успешного паразитизма на регуляторные системы растения-хозяина должно быть оказано такое воздействие, которое в краткосрочной перспективе не приводит к гибели или заметному нарушению жизнедеятельности клеток растения, однако позволяет использовать питательные вещества растенияхозяина для прохождения жизненного цикла патогена. Все известные фитогормоны в той или иной степени оказывают влияние на процессы патогенеза. Здесь будут представлены в основном данные, касающиеся цитокининов и абсцизовой кислоты (АБК) – активность которых во многих модельных системах направлена противоположным образом.

Синтез, рецепция и транспорт цитокининов и АБК изопреноидной или ароматической боковой цепью в N6-положении. Эта группа фитогормонов была идентифицирована и получила свое название благодаря способности инициировать совместно с ауксинами клеточные деления в культуре клеток (Miller et al., 1955). Показано их участие в самых разных процессах роста и развития растений. Цитокинины стимулируют переход из фазы G2 в M в клеточном цикле (Zhang et al., 1996; Laureys et al., 1998; den Boer, Murray, 2000). Кроме того, экспрессия циклина CycD3, участвующего в G1/S переходе также индуцируется цитокининами (RiouKhamlichi et al., 1999).

Ключевым ферментом синтеза цитокининов является аденозинфосфатизопентенил трансфераза (ИПТ, IPT), которая катализирует перенос изопентенилового остатка с диметилаллилдифосфата в положение N соответствующих изопентениладенин нуклеотидов (Kakimoto, 2001). При этом если ИПТ фитопатогенных бактерий используют АМФ, ферменты AtIPT1 и AtIPT4 арабидопсиса предпочитают АДФ и АТФ (Kakimoto, 2001). Поскольку сверхпродукция AtIPT1 и ее гомологов в растениях ведет к увеличенной продукции цитокининов и появлению соответствующего фенотипа, был сделан вывод о том, что именно этот фермент является скорость лимитирующим звеном в синтезе цитокининов растениями (Miyawaki et al., 2004). У арабидопсиса изопентениладенин нуклеотиды монооксигеназами CYP735A1 и CYP735A2 (Takei et al., 2004). Нуклеозид 5’монофосфат фосфорибогидролаза (LOG) катализирует освобождение основания, обладающего цитокининовой активностью (Kurakawa et al., 2007).

Другим источником цитокининов является реакция изопентенилирования тРНК, осуществляемая в растениях арабидопсиса изоферментами AtIPT2 и AtIPT9 (Golovko et al., 2002). Аналогичным образом синтезируются цитокинины некоторых бактерий, однако у растений этот путь считается имеющим второстепенное значение (Gray et al., 1996; Koenig et al., 2002).

Основным ферментом, который осуществляет разрушение цитокининов, является цитокинин-оксидаза (EC 1.4.3.18/1.5.99.12). Индукция данного фермента осуществляется цитокининами и АБК, а также абиотическими стрессами (Brugire et al., 2003). Изменения его активности при различных воздействиях, по-видимому, один из решающих факторов, определяющих концентрацию цитокининов (Высоцкая и др., 2010). Индукция в присутствии цитокининов приводит к появлению корреляции между активностью фермента и содержанием данных фитогормонов (Ananieva et al., 2008).

Рецепторами цитокининов у арабидопсиса, хорошо исследованного модельного растения, являются 3 гистидиновые протеинкиназы высокогомологичных трансмембранных белков, названную CRE-семейством (Mahonen et al., 2000; Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001; Higuchi et al., 2004).

преимущественной локализации цитокининовых рецепторов данного семейства у арабидопсиса, кукурузы и Nicotiana benthamiana не в плазмалемме, как считалось ранее, а в мембранах эндоплазматического ретикулума (Caesar et al., 2011; Lomin et al., 2011; Wulfetange et al., 2011).

Молекулярный механизм сигналинга цитокининов достаточно хорошо известен (Ломин и др., 2012). Он имеет двухкомпонентную систему передачи сигнала. У арабидопсиса помимо 3-х вышеупомянутых рецепторов она включает 5 фосфотрансмиттеров (AHP), перемещающихся между ядром и цитоплазмой, и 22 регулятора транскрипции ядерной локализации (ARR), часть из которых являются стимуляторами (тип B), а другие ингибиторами (тип A). Функции рецепторов CRE-семейства перекрываются: некоторые мутанты арабидопсиса, в которых неактивен только один из 3-х вышеназванных цитокининовых рецепторов, имеют фенотип, близкий к дикой форме, и только тройной мутант, хотя и сохраняет способность к формированию основных органов, имеет заметные нарушения развития фосфотрансмиттеров и регуляторов ответа также в значительной степени аддитивны.

Транспорт – один из факторов, который наряду с биосинтезом и деградацией, оказывает влияние на концентрацию фитогормона в клеточных компартментах. Цитокинины способны перемещаться из корней в побег по ксилеме и обратно по флоэме (Weiler, Ziegler, 1981; Letham, Palni, 1983;

Emery et al., 2000). Синтезированные в корнях цитокинины перемещаются в наземные органы с транспирационным током и накапливаются в зонах интенсивной транспирации (Aloni et al., 2005; Boonman et al., 2007).

Акропетальный транспорт цитокининов наряду с локальными сигналами играет важную роль в пробуждении боковых почек и ветвлении стебля (Foo et al., 2007; Ongaro, Leyser, 2008). Это свидетельствует о выполнении ими регуляторной функции в органах и тканях, удаленных от места синтеза (Weiler, Ziegler, 1981; Beveridge et al., 1997; Emery et al., 2000). С другой стороны большое число сайтов экспрессии генов биосинтеза (Miyawaki et al., 2004; Takei et al., 2004) и сигналинга цитокининов (Ishida et al., 2008) указывает на достаточно локальное функционирование цитокининов (Cedzich et al., 2008).

Прививка побега дикого типа на подвой табака с повышенной экспрессией гена ИПТ и, соответственно, повышенным содержанием цитокинина не приводила к пробуждению у привоя боковых почек или замедлению процессов старения (Faiss et al., 1997). Несмотря на увеличение концентрации цитокининов в ксилемном соке, содержание цитокининов у привоя незначительно увеличивалось только в тканях, прилежащих к месту прививки. Прививка побега дикого типа на подвой ветвящегося мутантного гороха также не приводила к появлению мутантного фенотипа (Beveridge et al., 1996). При реципрокных прививках генотип побега определял нормальное у дикого типа или пониженное у мутанта содержание цитокининов в ксилемном соке и, следовательно, оказывал влияние на синтез цитокининов в корнях (Beveridge et al., 1997; Foo et al., 2007). Синтез цитокининов в тканях трансгенного растения с геном ИПТ под контролем промотора, активируемого тетрациклином, также как и индуцируемое цитокинином пробуждение боковых почек происходили локально в местах применения индуктора (Faiss et al., 1997). И, наоборот, локальное ингибирование экспрессии ИПТ гена в месте расположения боковой почки предотвращало ее пробуждение (Bhner, Gatz, 2001). Эти данные находятся в согласии с локальной задержкой старения ткани листа под действием патогенных микроорганизмов, которое сопровождается увеличением содержания цитокининов и образованием так называемых зеленых островков (Walters, McRoberts, 2008).

В отличие от животных, у которых хорошо развита система передачи электрического сигнала, в передаче сигнала на дальние расстояния у растений основную роль играют мобильные химические вещества, примером которых могут служить цитокинины, поступающие в побег из корней (Beveridge et al., 1997; Emery et al., 2000; Weiler, Ziegler, 1981). Добавление нитрата к голодающим растениям кукурузы стимулирует синтез цитокинина в корнях растения и его перемещение в побег (Takei et al., 2001). При обработке корней проростков кукурузы азотом в нитратной или аммонийной форме цитокинины опосредуют повышение в листьях активности фосфоэнолпируваткарбоксилазы (Sakakibara 1998). Обработка отделенных листьев цитокининами вызывает такую же реакцию, а вот азотсодержащие соединения увеличения активности данного фермента не индуцированных изменением доступности азота, что служит координации метаболизма и ростовых процессов в корне и побеге (Takei et al., 2002; Dodd, Beveridge, 2006).

Ключевым моментом в увеличении синтеза цитокининов под действием нитратов является повышенная экспрессия в тканях флоэмы корня изопентенил трансферазы AtIPT3 (Takei et al., 2004). Это приводит к увеличению в составе ксилемного сока сначала ИПА-рибозида, затем в больших количествах появляются зеатин-рибозид и зеатин (Takei et al., 2001). Повышение концентрации углекислого газа также способствует повышению поглощения азота, ускорению роста и увеличения концентрации цитокининов в ксилемном экссудате (Yong et al., 2000). Однако корреляция между содержанием цитокинина в ксилемном экссудате и тканях листьев отсутствует (Yong et al., 2000). Не было соответствия и в составе цитокининов: в ксилемном соке преобладал зеатин, а в листьях зеатин, дигидрозеатин и ИПА были представлены примерно в равном соотношении.

В большой степени это, по-видимому, обусловлено участием тканей стебля в депонировании и трансформации ксилемных цитокининов (Zhang et al., 2002). В другом исследовании в основаниях листьев сои были обнаружены зеатин и в меньшем количестве зеатин-рибозид. Основными цитокининами ксилемного сока были рибозиды зеатина и дигидрозеатина (Nooden, Letham, 1993). Примерно 80 % меченого зеатин рибозида, поступающего в листья сои через ксилему, уже через 1 ч инкубации превращалось в другие соединения (Nooden, Letham, 1993). Основными продуктами были аденин и его рибозид.

При обработке корней проростков редиса и кукурузы мечеными зеатином и зеатин-рибозидом заметная доля метки перемещалась в побег, но большая часть оставалась в корне (Gordon et al., 1974; Hocart et al., 1990). Через 1 сут после помещения корней проростков пшеницы в раствор зеатина данное вещество накапливалось в центральном цилиндре корня и окружающих паренхимных клетках. Его содержание в корнях увеличивалось в 6 раз по сравнению с необработанными растениями, однако в побеге количество зеатина возрастало только в 2 раза (Ахиярова, Архипова, 2010). При этом концентрация цитокинина в ксилемном соке оставалась в 5 раз ниже, чем в питательном растворе, что, по мнению авторов, свидетельствует о существовании механизмов, ограничивающих загрузку цитокининов в ксилему. Наоборот, при обработке семядолей редиса меченый зеатин практически полностью оставался в семядолях, и только следы были обнаружены в корне (Gordon et al., 1974). Экзогенный цитокинин в обработанном корне в значительной степени метаболизировался до аденина, аденозина и адениннуклеотида. Другая его часть конвертировалась в зеатинрибозидмонофосфат, затем метку обнаруживали во фракции зеатингликозидов (Gordon et al., 1974; Hocart et al., 1990). Меченый зеатин-рибозид найден в ксилемном соке, свободное основание и гликозид – в семядолях обработанных проростков (Gordon et al., 1974). При погружении корня Lupinus angustifolius или побега без корней в раствор меченого зеатинрибозида цитокинин передвигался по ксилеме в вышележащие ткани, уровень накопления метки и состав продуктов трансформации были тканеспецифичны (Jameson et al., 1987). В растениях арабидопсиса экзогенный меченый БАП очень быстро превращался в промежуточное соединение – соответствующий нуклеотидмонофосфат, а затем накапливался в форме 7- и 9-гликозидов (Moffatt et al., 1991).

Экзогенная обработка кинетином части корней растения, голодающего по фосфору, ингибировала экспрессию маркерного гена только в обработанной части корня, в необработанной части корня ингибирования не наблюдали (Franco-Zorrilla et al., 2002). Это свидетельствует об отсутствии достаточной для проявления активности транслокации цитокинина в необработанную часть корня через ксилему и флоэму побега и о необходимости локального восприятия цитокининового сигнала (Franco-Zorrilla et al., 2005).

В локализации разных химических форм цитокининов и их рецепторов отмечена специфичность (Hirose et al., 2008). В ксилеме, как правило, преобладают производные транс-зеатина (Lejeune et al., 1994; Takei et al., 2001), однако другие типы цитокининов также встречаются (Boonman et al., 2007; Foo et al., 2007). Наоборот, во флоэме преобладают производные ИПА и цис-зеатина, а транс-зеатин и его рибозид или не обнаруживается или встречается в незначительных количествах (Corbesier et al., 2003; Hirose et al., 2008). Высказано предположение, что подобные различия могут служить для дифференциации клеткой акропетального и базипетального цитокининового сигнала (Hirose et al., 2008). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о преимущественной экспрессии цитохром P монооксигеназы CYP735A2, катализирующей гидроксилирование метильной группы боковой цепи с образованием транс-зеатинов, в корневой системе (Takei et al., 2004). Определенная специфичность в локализации наблюдается и для рецепторов цитокининов: AHK3 больше связан с побегом, а экспрессию AHK4/CRE1/WOL наблюдали большей частью в корне растений (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004). Следует отметить, что при экспрессии в клетках Escherichia coli эти рецепторы отличаются по своему лигандному спектру. Оба рецептора с высокой эффективностью связывают транс-зеатин, однако по отношению к ИПА AHK4/CRE1/WOL обладает более высокой аффинностью по сравнению с AHK3 (Spchal et al., 2004;

Romanov et al., 2006). Это согласуется с преимущественной корневой локализацией AHK4/CRE1/WOL и, вероятно, может иметь отношение к восприятию ИПА, приходящего из побега по флоэме.

Все, сказанное выше о локальном и системном в регуляции концентрации и биологической активности цитокининов, свидетельствует о достаточно сложном характере регуляции метаболизма цитокининами. Цитокининовый сигнал (в том числе и при экзогенной обработке) не передается в целевые ткани пропорционально примененной концентрации, а претерпевает более или менее существенные преобразования, что, вероятно, может приводить к противоречивым и подчас неожиданным результатам в эксперименте.

Очевидно, транспортные процессы играют важную роль в детерминации физиологической активности цитокининов. Имеющиеся в настоящий момент сведения о механизме транспорта цитокининов малочисленны и фрагментарны. Относительно недавно в арабидопсисе были найдены транспортные белки для цитокининовых оснований семейства пурин пермеаз (PUP) (Gillissen et al., 2000; Burkle et al., 2003) и нуклеозидов семейства равновесных нуклеозидных транспортеров (ENT) в арабидопсисе и рисе (Hirose et al., 2005, 2008).

PUP семейство арабидопсиса включает 21 ген, часть из которых экспрессируется во всех частях растения (PUP11, PUP14, PUP18), другие только в корнях (PUP4, PUP11, PUP14, PUP18) (Zimmermann et al., 2005).

AtPUP1 найдена в листьях и стеблях, но не в корнях. AtPUP2 обнаружена во флоэме (но не ксилеме) листьев и корней, но не стеблей. Выдвинута гипотеза о том, что AtPUP1, локализованная в эритеме гидатод, утилизирует цитокинины и аденин из гуттационной жидкости, а флоэмная AtPUP листьев участвует в их загрузке во флоэму (Burkle et al., 2003). AtPUP найдена только в пыльце (Burkle et al., 2003).

Белки, способные транспортировать нуклеозиды, в соответствии с механизмом действия подразделяются на ENT(equilibrative nucleoside transporters, равновесные транспортные белки нуклеозидов), которые осуществляют транспорт в направлении градиента концентрации, и CNT (concentrative nucleoside transporters, концентрирующие транспортные белки нуклеозидов), осуществляющие транспорт против градиента концентрации путем симпорта с ионом натрия или протоном (Hyde et al., 2001; Cabrita et al., 2002). Транспортные белки семейства CNT в растениях не обнаружены.

Однако оказалось, что некоторые белки семейства ENT простейших способны осуществлять протон-зависимый транспорт нуклеозидов против градиента их концентрации (Hyde et al., 2001). Белки семейства ENT найдены в растениях. Растительные белки этого семейства также транспортируют нуклеозиды против градиента концентрации (Mohlmann et al., 2001). ENT так же, как и соответствующие белки других систематических групп имеют специфичность в отношении широкого круга соединений в отличие от узкоспецифичных CNT (Hyde et al., 2001).

У арабидопсиса обнаружены 8 гомологичных генов (AtENT1–AtENT8, Li et al., 2003), у риса – 4 (OsENT1–OsENT4; Hirose et al., 2005). Продукт гена OsENT2 был активен в качестве транспортера нуклеозидов в клетках дрожжей. Поглощение рибозидов ИПА и зеатина в этой экспериментальной системе происходило с существенно меньшей эффективностью, чем аденозина и тимидина, однако значение полученных кинетических констант были сравнимы со значениями для ряда ферментов цитокининового обмена.

Различие сродства к рибозидам ИПА и зеатина указывает на возможное участие данного транспортера в селективном транспорте цитокининов.

Транскрипты 5-ти хорошо изученных ENT арабидопсиса (AtENT1, AtENT3, AtENT4, AtENT6 и AtENT8) накапливаются под влиянием азотного голодания и обработки ингибиторами синтеза нуклеотидов (Li et al., 2003).

OsENT накапливаются преимущественно в корнях, в меньшей степени в побегах риса (Hirose et al., 2005). OsENT2 накапливается в наибольшем количестве среди всех остальных форм. Экспрессия OsENT2 возрастает в процессе прорастания семени и обнаруживается в скутеллуме, корне и кончике колеоптиля. У взрослых растений OsENT2 экспрессируется в корнях (центральный цилиндр, боковые корни, но не в коре, экзодерме или эпидермисе), в листьях во флоэме. Экспрессия гена AtENT6 происходила в сосудах корней, листьев и цветков, а также в устьицах арабидопсиса (Hirose et al., 2008).

Абсцизовая кислота (АБК) – фитогормон терпеноидной природы, который играет важную роль как в регуляции устойчивости растений при стрессах, так и процессов развития и покоя и прорастания семян. Синтез АБК происходит в разных органах растения (Hartung et al., 2002). Почвенная засуха способствует усилению транспорта АБК из корней в наземную часть (Jiang, Hartung, 2008). Предполагается, что при этом происходит также транслокация сигнала, способствующего усилению ее синтеза в тканях сосудистых пучков листьев. АБК может накапливаться в вакуолях и апопласте в виде неактивного конъюгата с глюкозой (Dietz et al., 2000), который может снова расщепляться, освобождая активный фитогормон, с участием бета-глюкозидазы. Активность последней сильно увеличивается в условиях водного дефицита (Lee et al., 2006). Вопросы биосинтеза и транспорта АБК освещены в ряде обзоров (Milborrow, 2001; Hartung et al., 2002; Nambara, Marion-Poll, 2005; Marion-Poll, Leung, 2006) Основные пути восприятия и передачи регуляторных сигналов, связанных с действием АБК, по современным представлениям включают 4 компонента (Hubbard et al., 2010; Kingler et al., 2010; Umesawa et al., 2010). Рецепторами АБК являются белки семейства PYR/PYL/RCAR, которое в свою очередь включается в суперсемейство, в состав которого входят некоторые белки, связывающие цитокинины и брассиностероиды и даже связанный с патогенезом белок PR10 (Liu, Ekramoddoullah, 2006). Название рецептора связано с тем, он был обнаружен при изучении мутантных растений, нечувствительных к действию ингибитора пиробактина (pyrabactin), который индуцирует экспрессию спектра белков, сходного с белками, индуцируемыми АБК. Важными компонентами являются серин-треониновая белокфосфатаза PP2C (type 2C protein phosphatase), выполняющая функции ингибитора прохождения сигнала, и положительный регулятор, протеинкиназа SnRK2. В отсутствии АБК рецептор представляет собой конформации, распаду димера с образованием поверхности, обладающей активированного рецептора с PP2C приводит к освобождению активной протеинкиназы SnRK2, который фосфорилирует регулятор транскрипции ABF и тем самым запускает экспрессию специфических генов. Помимо ABF другие белки также могут быть субстратами протеинкиназы SnRK2. В частности, это компоненты ионных каналов, фосфорилирование которых приводит к изменению транспорта ионов - ответа на АБК, не связанного с синтезом новых белков. Другим объектом фосфорилирования является НАДФН-оксидаза, активирование которой приводит к увеличению содержания АФК и окислительному взрыву (Ogasawara et al., 2008;

Ogasawara et al., 2009).

Каждый из указанных белков может кодироваться несколькими генами (Ma et al., 2009; Park et al., 2009). Так у растений арабидопсиса известно разновидностей белка рецептора, 9 протеин фосфатазы HH2C, протеинкиназы SnRK2, 9 регулятора транскрипции ABF. Число возможных комбинаций состава сигналосомы в этом случае достигает достаточно больших величин. Синтез отдельных компонентов тканеспецифичен.

Известно, что состав комплекса в ядре клетки и цитозоле также отличается.

Взаимодействие всех вышеописанных компонентов позволяют представить АБК-сигналинг в виде достаточно простой и стройной схемы, что не исключает существования альтернативных путей регуляции метаболизма данным фитогормоном при участии других компонентов (Hubbard et al., 2010).

Различие мест синтеза и восприятия АБК требует участия механизмов транспорта фитогормона. В листьях арабидопсиса трансмембранный АТФзависимый транспорт АБК, по-видимому, происходит при участии 2-х белков: AtABCG25 и AtABCG40, первый из которых осуществляет перенос молекулы АБК из клеток тканей сосуда в апопласт, а второй – из апопласта в замыкающие клетки устьиц (Kang et al., 2010; Kuromori et al., 2010).

Ингибирование транспорта в мутантных растениях приводит к более позднему появлению белков, индуцируемых АБК, и уменьшению засухоустойчивости.

Таким образом, фитогормональная регуляция метаболизма при участии цитокининов и АБК осуществляется достаточно сложным и разветвленным механизмом. Преобразование гормональных сигналов может быть осуществлено при участии достаточно большого числа ферментных и транспортных белков, обладающих специфичной локализацией в тканях и органах растения, различиями в аффинности взаимодействия с разными химическими формами фитогормонов. Перемещение цитокининов и, вероятно, АБК из одного органа в другой, в т.ч. при экзогенной обработке, не является чисто механическим процессом и может сопровождаться изменением количества и качественного состава фитогормонов.

инфицировании Фитогормональная система достаточно быстро реагирует на внешние воздействия. Экспрессия генов синтеза АБК происходит уже через 15–30 мин после обезвоживания или отрезания листа (Qin, Zeevaart, 1999). Под действием изменения температуры, влажности воздуха и освещенности концентрация и соотношение эндогенных фитогормонов в суточном ритме изменяются в десятки раз (Cahill et al., 1986; Курапов и др., 2000; Novakova et al., 2005). При этом максимальное содержание дигидрозеатина было в утренние часы, а зеатина и ИПА, а также ауксинов – в послеполуденные часы. Основной пик содержания АБК наблюдали после наступления темнового периода, минорные совпадали с началом светового периода, а также с пиком цитокининов и ауксинов в полуденное время. В регуляции уровня эндогенных фитогормонов играют роль как процессы биосинтеза, так и активность ферментов: цитокининоксидазы и гликозидазы (Novakova et al., 2005). Поскольку концентрация цитокининов изменяется уже через несколько часов после действия стрессового фактора или индуктора, очевидно, что изменения уровня фитогормонов, регистрируемые через 1– нед после инфицирования, связаны скорее с глубокими нарушениями метаболизма, чем с защитными реакциями растения. Величина изменений концентрации фитогормонов в этом случае часто коррелирует с симптомами заболевания и у устойчивых растений мало отличается от контрольного уровня (Попова, Тютерев, 1988; Vizarova, 1987). Вместе с тем суточные колебания фитогормонов, вероятно, могут играть важную роль на начальных этапах инфекционного процесса, поскольку известна приуроченность к суточному ритму процесса образования вторичных гаусторий возбудителя мучнистой росы (Hirata, 1967). В определенном смысле верно и обратное, поскольку фотопериод оказывает влияние на темпы уменьшения содержания цитокининов при тепловом стрессе (Wang et al., 2004).

От способности фитогормональной системы растения адекватно реагировать на биотические стрессы, по-видимому, в значительной степени зависит характер взаимодействия с патогеном. В качестве фитогормонов и гормоноподобных соединений, играющих наибольшую роль в регуляции патогенеза и устойчивости растений, наиболее часто называют салициловую, жасмоновую, абсцизовую (АБК) кислоты и этилен (Audenaert at al., 2002; van Loon et al., 2006; Pozo et al., 2005). Растущее число публикаций посвящено брассиностероидам и ауксинам (Krishna, 2003; Fu, Wang, 2011), а также взаимодействию фитогормонов в регуляции патогенеза (Jameson, 2000; Rojo et al., 2003; Glazebrook, 2005; Fu, Wang, 2011). При участии фитогормонов цитокининового типа происходит регуляция самых разных процессов в растительном организме (в том числе и его устойчивости к стрессам) (Кулаева, 1973). Роли цитокининов в биотрофном патогенезе и при азотфиксирующими бактериями также посвящен ряд обзорных работ (Ashby, 2000; Walters, McRoberts, 2006; Frugier et al., 2008).

На участие фитогормонов в регуляции взаимодействия растения и патогена и защитных реакций при действии абиотических стрессоров указывают, прежде всего, данные о какого-либо рода корреляции между инфицированием, и содержанием фитогормонов.

Повышение содержания цитокининов отмечено при инфицировании ржавчинными (Музыкантов и др., 1991; Музыкантов и др., 1992; Фурсова и др., 1991; Попова, Тютерев, 1988; Kiraly et al., 1967), мучнисторосяными (Никитина, Талиева, 1999; Талиева и др., 2001; Талиева, Кондратьева, 2002), головневыми грибами (Максимов и др., 2002), а также вирусами (Sziraki, Gaborjanyi, 1974). Как правило, у более устойчивых растений максимум содержания цитокининов менее выражен и (или) наблюдается позднее, чем у восприимчивых (Талиева и др., 2001; Никитина, Талиева, 1999; Музыкантов и др., 1991; Попова, Тютерев, 1988; Vizarova, 1987). Однако имеются данные и о более высоком в устойчивых растениях по сравнению с восприимчивыми индуцированном инфекцией уровне цитокининов (Эйдельнант и др., 1985;

Cahill et al., 1986; Vizarova, 1975). В ряде опытов при инфицировании патогенами различной природы отмечено уменьшение цитокининовой активности, что противоречит вышеприведенным данным (Мазин и др., 1980;

Kuriger, Agrios, 1977; Cahill et al., 1986; Clarke et al., 1999). Системная вирусная инфекция может приводить как к повышению, так и понижению уровня цитокининов в растении (Малиновский, 1981; Pennazio, Roggero, 1998).

По всей вероятности, в динамике инфицирования содержание цитокининов имеет два максимума, первый из которых соответствует начальным ответным реакциям, а второй – этапу четкого проявления симптомов болезни, спороношению грибных патогенов или системному распространению вирусов. Так при инфицировании пшеницы бурой ржавчиной первый пик цитокининовой активности наблюдали в период 1– сут после инфицирования, а второй на 34-е сут (Попова, Тютерев, 1988).

Необходимо отметить, что при исследовании белков – компонентов цепи передачи цитокининового сигнала – при инфицировании арабидопсиса биотрофными, гемибиотрофными и некротрофными фитопатогенами также наблюдали достаточно пеструю и изменяющуюся в динамике картину с увеличением одних компонентов и уменьшением других (Argueso et al., 2012).

Содержание АБК увеличивалось в инокулированных ВТМ листьях табака (Whenham et al., 1985; 1986). Повышение уровня АБК при инфицировании мучнисторосяными грибами наблюдали Талиева и соавторы (2001), причем большая концентрация была достигнута в устойчивом растении. Вместе с тем патогенный процесс не всегда приводит к однозначному и стойкому увеличению содержания АБК. При инфицировании твердой головней (Tiletia caries) происходило транзитное повышение АБК и ИУК (Максимов и др., 2000). В зависимости от уровня устойчивости и времени после инокуляции патогена часто можно наблюдать как положительные, так и отрицательные изменения концентрации свободной и связанной форм АБК в тканях инфицированных растений (Талиева и др., 2001).

Действие абиотических стрессоров также вызывает изменения гормонального баланса и содержания отдельных фитогормонов. Например, увеличение концентрации цитокининов наблюдали при тепловом шоке (Ефремов и др., 1992). Повышение количества АБК в растении происходило при воздействии засухи, засоления, теплового и холодового стресса (Кулаева, 1994). При холодовом закаливании растения пшеницы более устойчивых сортов накапливали большее количество данного гормона (Veisz et al., 1996), а растения, обработанные АБК, обладали повышенной морозоустойчивостью (Irving, 1969; Robertson et al., 1987; Сопина и др., 1994).

Поскольку цитокинины и АБК во многих физиологических процессах являются гормонами антагонистами, их содержание в растении обратно коррелирует (Cheikh, Jones, 1994). Обработка кинетином ведет к снижению концентрации АБК (Талиева, Филимонова, 1991). Индукцию же цитокининоксидазы под действием АБК называют одной из основных причин снижения уровня цитокининов при стрессах (Cheikh, Jones, 1994;

Brugire et al., 2003). Как было показано (Талиева и др., 1999), изменение содержания зеатин-рибозида и АБК в онтогенезе растений флокса носит согласованный характер: точка снижения концентрации АБК соответствует начальной точке повышения уровня цитокининов.

Вместе с тем, воздействие теплового стресса приводило к исчезновению характерной для обычных физиологических условий высокой отрицательной корреляции между уровнем АБК и цитокининов в незрелых зерновках кукурузы (Cheikh, Jones, 1994). При действии теплового шока максимум в повышении уровня АБК в корнях пшеницы был достигнут через 24 ч после обработки, через 48 ч наблюдали повышение содержания цитокининов, которое происходило уже на фоне сохранения высокой концентрации АБК (Ефремов и др., 1992). Сходная динамика имела место и в листьях пшеницы, но с опозданием на 1 сут. Резкое повышение количества АБК, а затем цитокининов наблюдали в пестиках петунии при отторжении пыльцы при самонесовместимом, но не при совместимом опылении (Ковалева и др., 2002). Следует отметить особое состояние гормональной регуляции в условиях стресса, при котором иногда происходит повышение уровня одновременно для цитокининов и АБК с нарушением их обычного антагонизма. Следующие примеры характеризуют взаимную индукцию этих фитогормонов. Так, повышенный уровень цитокининов наблюдали в листьях пшеницы через 48 ч после обработки АБК, причем цитокининовый спектр имел сходство с таковым у больного растения (Музыкантов и др., 1992). С другой стороны обработка экзогенным зеатином корней кукурузы увеличивала содержание АБК и ИУК, что способствовало ингибированию роста корней (Bourquin, Pilet, 1990).

В процессе закаливания растений высокими или низкими температурами транзитное повышение концентрации АБК и ИУК, иногда в виде 2-х пиков накопления данных веществ, наблюдали в начальный период с уменьшением их содержания после достижения максимальной устойчивости (Титов и др., 2006, с.90). В присутствии экзогенного синтетического цитокинина 6-БАП величина пика АБК возрастала. Транзитные, сменяющие друг друга максимумы концентрации АБК и цитокининов – вероятно, характерная картина ответа растения на тепловой шок (Ефремов и др., 1992).

Синтез растительных гормонов патогенами Определенный интерес представляет выяснение вопроса об источнике дополнительных фитогормонов при патогенезе. В ряде патосистем дополнительные фитогормоны синтезируются клетками патогена (Greene, 1980). Многие патогенные грибы выделяют синтезированные фитогормоны прямо в питательную среду (Талиева, Филимонова, 1992). В настоящее время в растениях обнаружены ферменты, которые обеспечивают собственный синтез основных гормональных веществ, что завершило многолетние дискуссии об источниках фитогормонов в тканях растений. Тем не менее, фитогормоны микробиального происхождения, вероятно, на многих стадиях жизни растений составляют существенную часть общего пула. Так микроорганизмы ризосферы, по-видимому, играют важную роль в регуляции гормонального баланса растений, в частности, зеатин рибозид был обнаружен в заметных количествах в культуральной среде Bacillus subtilis, а обработка бактериальным препаратом растений салата существенно повышала содержание цитокининов в тканях растения (Arkhipova et al., 2005).

Взаимодействие фитопатогена с растением часто служит триггером синтеза фитогормонов, в частности, растение может стимулировать синтез грибной АБК (Kettner, Drffling, 1995). Некоторые из эффекторов патогена имитируют действие растительных гормонов. Коронатин Pseudomonas syringae имитирует действие жасмоновой кислоты, ингибирующей защитные реакции, связанные с салициловой кислотой (Brooks et al., 2005). Многие штаммы P. syringae являются продуцентами ИУК, а обработка растений этим фитогормоном увеличивает восприимчивость. При этом включение защитных реакций при взаимодействии с рецепторами растения бактериальных PAMP способствует ингибированию ауксинового сигналинга (Navarro et al., 2006). Наоборот, бактериальный эффектор AvrRpt дестабилизирует негативный регулятор ауксинового сигналинга, усиливая чувствительность к бактериальному ауксину (Cui et al., 2013).

Цитокинины предотвращают старение инфицированной ткани (Jones, 2006). В пользу участия цитокининов в регуляции патогенеза Dangl, свидетельствует и наличие у значительного числа фитопатогенов активности -глюкозидазы, способной использовать в качестве субстрата зеатин-Оглюкозиды с освобождением активного цитокинина (Cooper, Ashby, 1998).

Возможной функцией этого фермента при патогенезе может быть активирование запасов неактивных зеатин-О-глюкозидов растительного и глюкозилирования цитокининов ферментами растения-хозяина (Cooper, Ashby, 1998).

Наиболее яркими примерами участия фитогормонов, в т.ч. цитокининов, в патогенезе является галлообразование, индуцированное Agrobacterium tumefaciens и Rhodococcus fascians (Akiyoshi et al., 1983; Depuydt et al., 2008;

Pertry et al., 2010). R. fascians синтезирует целый набор различных цитокининовых оснований (Pertry et al., 2010). В появлении симптомов заболевания этом случае важную роль играет индуцированное патогеном увеличение чувствительности растения к цитокининам путем увеличения экспрессии рецептора цитокининов АНК4 (Depuydt et al., 2008).

Особый интерес представляет выяснение роли фитогормональных использование патогеном регуляторных систем растения-хозяина, повидимому, является важным фактором совместимости. Показано, что конидии и мицелий мучнисторосяных грибов (Vizarova, 1987; Талиева и др., 1991), а также прорастающие уредоспоры Puccinia graminis и P. recondita (Жигалкина, 1986; Музыкантов и др., 1991), накапливают цитокининовые вещества в количествах, во много раз превышающих содержание данных гормонов в растительных тканях. Значительное число патогенных и микоризных грибов синтезируют АБК (Талиева, Филимонова, 1992; Assante et al., 1977; Oritani et al., 1982; Drffling et al., 1984; Hirai et al., 1986;

Okamoto et al., 1988; Crocoll et al., 1991; Danneberg et al., 1993; Siewers et al., 2004). Полупаразит Rhinanthus minor выделяет синтезируемую им АБК в почву, что приводит к увеличению ее содержания в корнях растений (Jiang et al., 2004). Споры некоторых облигатных патогенов содержат гиббереллины (Гуревич, 1975) и ИУК (Умнов и др., 1984).

Способность синтезировать фитогормоны, вероятно, играет важную роль специализацией патогена. Показано, что инфекционный материал возбудителя мучнистой росы, содержащий меньшее количество цитокининов, обладал также и меньшей жизнеспособностью (Фурсова и др., 1991). Высокоагрессивные штаммы Verticillium dahliae при культивировании на жидкой среде обладали способностью к синтезу большего количества ауксинов и гиббереллинов по сравнению с менее агрессивными формами (Шилина, 1979). Предполагаемая роль фитогормонов патогена в регуляции инфекционного процесса хорошо согласуется с экспериментальными данными, свидетельствующими о временной организации их синтеза. У грибов рода Botrytis, способных синтезировать как цитокинины, так и АБК, преимущественный синтез цитокининов на ранней фазе культивирования на питательной среде сменяется затем синтезом АБК. Адаптация патогена к фитогормональному статусу конкретного хозяина в ряде случаев определяет его паразитическую специализацию. Интересно, что при увеличении уровня специализации в ряду от Botrytis cinerea к B. anthophila и усилении симбиотической компоненты взаимодействия с растением-хозяином способность к образованию растительных гормонов уменьшается, причем синтез АБК подвергается значительно большей редукции по сравнению с синтезом цитокининов (Талиева, Филимонова, 1992).

Более высокую продукцию цитокининов гемибиотрофами Venturia inaequalis и Pyrenopeziza brassicae при культивировании in vitro наблюдали на более бедных питательных средах (Murphy et al., 1997; Cooper, Ashby, 1998). При этом отсутствие цитокининов у другого гемибиотрофа Leptosphaeria maculans авторы объясняли его способностью к системному распространению в растении, а, значит, и большей доступностью для него питательных веществ по сравнению с V. inaequalis и P. brassicae, развитие которых происходит в более ограниченном пространстве, и требует постоянного притока питательных веществ (Cooper, Ashby, 1998).

сопровождается изменением состава цитокининов (Музыкантов и др., 1991;

Vizarova et al., 1987; Vizarova, 1987; Талиева, Филимонова, 1991). В инфицированных возбудителями мучнистой росы восприимчивых растениях пшеницы и ячменя, а также уредоспорах Uromyces caryophyllinus обнаружен дополнительный цитокинин, идентифицированный как ИПА (Фурсова и др., цитокининовой активностью у восприимчивых растений, в отличие от устойчивых, соответствует составу цитокининов патогена (Музыкантов и др., 1991). В клетках гриба цитокинины локализованы в цитоплазме межклеточных гифальных клеток, материнской гаусториальной клетки, гаусториальных телах, а также в экстрагаусториальном матриксе (Hu, Rijkenberg, 1998). По-видимому, на определенных стадиях инфекционного процесса цитокинины патогена составляют существенную часть цитокининового пула больного растения.

Изменение качественного состава растительных цитокининов отмечено и при вирусном патогенезе. При системном инфицировании табака вирусом табачной мозаики распределение зеатина, его рибозида и о-гликозида различно в темно-зеленых и светло-зеленых участках инфицированных листьев (Whenham, 1989). По данным Кларка и соавторов (Clarke et al., 1999), вирусная инфекция восприимчивого сорта фасоли сопровождается снижением содержания свободных оснований, рибозидов и О-глюкозидов цитокининов с параллельным и коррелирующим с кинетикой вирусной репродукции увеличением содержания неактивных 9-глюкозидов и нуклеотидных производных. При этом суммарное количество цитокининов практически не изменялось. Активные взаимопревращения цитокининов при патогенезе дают основание предположить, что различное сродство к глюкозилтрансферазам и оксидазам, а также различная способность к транспорту у разных цитокининов могут оказаться свойствами, существенными для регуляции метаболизма больного растения.

В тканях арабидопсиса инфицирование биотрофным актиномицетом Rhodococcus fascians приводило к существенным сдвигам цитокининового метаболизма, в частности, индукции цитокининоксидазы и ингибирования синтеза собственных цитокининов (Depuydt et al., 2008). Благодаря этому увеличение количества ИПА происходило только в 1–2 сут после инфицирования за счет цитокинина патогенного происхождения, в дальнейшем количество цитокининов уменьшалось ниже уровня незараженных растений.

Следует отметить, что фитогормоны патогенного происхождения в определенном смысле являются экзогенными для растения. Наличие большого числа микроорганизмов, синтезирующих фитогормоны, дает гормональными препаратами способны моделировать естественные процессы, которые происходят при инфицировании или контакте с непатогенами.

Иммуномодулирующие свойства экзогенных цитокининов и АБК Данные о влиянии экзогенных цитокининов на инфекционный процесс противоречивы. В случае грибной инфекции обработка цитокининами в одних экспериментах способствовала повышению устойчивости растения (Эйдельнант и др., 1985; Dekker, 1963; Cole et al., 1970; Edwards, 1983;

Vizarova, 1987; Clarke et al., 1998; Mishra et al., 2008). Кинетин не влиял на проникновение в ткани хозяина, однако на стадии образования первичной гаустории развитие гриба в присутствии данного вещества сильно замедлялось или вовсе останавливалось (Dekker, 1963; Liu, Bushnell, 1986).

Вместе с тем в ряде работ применение кинетина способствовало стимуляции развития патогена, при этом АБК оказывала ингибирующее действие (Левин, 1984; Ларина и др., 1991).

Ингибирующее действие на число вирусиндуцированных некрозов и размножение вируса оказывал кинетин при применении до инфицирования и в момент инфицирования (Реунов и др., 1976), обработка листьев растения через 24 ч после инфицирования не была эффективной. Предельное время применения кинетина после инфицирования листовых дисков Х-вирусом картофеля, оказывающее ингибирующий эффект, составляло примерно 12 ч (Schuster, Huber, применения ингибитора синтеза РНК (2-тиоурацил). В то же время использование ингибитора синтеза белка циклогексимида в данной патосистеме ингибировало размножение вируса даже через 36 ч после инфицирования. Кинетин снижал содержание РНК вируса табачной мозаики в инфицированных листовых дисках табака (Каплан и др., 1988).

Дигидрозеатин существенно ингибировал репродукцию вируса мозаики клевера в растениях фасоли, ингибируя как синтез вирусной мРНК, так и белка-капсида (Clarke et al., 1999; Galis et al., 2004). Однако фитогормон не предотвращал системное распространение вируса и в отличие от салициловой кислоты не индуцировал PR-белки. Некоторые другие примеры ингибирования и стимулирования вирусной инфекции приведены в обзоре В.И.Малиновского (1981).

В модельных патосистемах, включающих каллусные культуры табака, инокулированные разными представителями рода Phytophthora, кинетин в оптимальных концентрациях и в присутствии ауксина способствовал повышению восприимчивости в несовместимых комбинациях, не оказывая влияния на развитие патогена на каллусах восприимчивых растений (Haberlach et al., 1978; Miller et al., 1984). Увеличение концентрации в среде культивирования как ауксинов (Haberlach et al., 1978), так и кинетина (Miller et al., 1984) приводило к исчезновению данного эффекта, был сделан вывод о важной роли баланса фитогормонов в контроле степени проявления устойчивости.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |
 


Похожие работы:

«Робенкова Татьяна Викторовна ПСИХОТИПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АДАПТАЦИИ СТУДЕНТОВ КОЛЛЕДЖА 03.00.13 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор В.Н. Васильев Томск - 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ. ВВЕДЕНИЕ..7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 1.1.Современный подход к проблеме адаптации студентов. 1.1.1. Роль стресса в...»

«УДК 612.821.6; 612.825 НОВИКОВА Маргарита Робертовна РОЛЬ ОРБИТО-ФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ И ГИППОКАМПА В АДАПТИВНО-КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТВОЛА МОЗГА КРЫС Специальность 03.00.13 Физиология Биологические наук и Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Д.б.н., проф. В.П.Подачин Д.б.н. Е.В.Шарова Москва – СОДЕРЖАНИЕ: Стр. ОГЛАВЛЕНИЕ.. ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1....»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.