WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И. П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

ЖУРАВЛЕВ

Александр Владимирович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

ДЕЙСТВИЯ МЕТАБОЛИТОВ КИНУРЕНИНОВОГО ПУТИ ОБМЕНА

ТРИПТОФАНА НА ГЛЮТАМАТЕРГИЧЕСКУЮ И ХОЛИНЕРГИЧЕСКУЮ

СИСТЕМЫ НЕЙРОТРАНСМИССИИ

У МУТАНТОВ ДРОЗОФИЛЫ

03.03.01 — физиология 03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики Института физиологии им. И. П. Павлова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Савватеева-Попова Елена Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Семенов Дмитрий Германович Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН доктор биологических наук, профессор Падкина Марина Владимировна Санкт-Петербургский государственный университет

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Защита диссертации состоится 20 февраля 2012 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, СанктПетербург, набережная Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П.

Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, набережная Макарова, 6 ).

Автореферат разослан « » января 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук H.Э. Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работа посвящена решению важной физиологической задачи – изучению механизмов действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) на процессы в ЦНС млекопитающих и человека. Кинурениновые метаболиты связаны с развитием ряда нейропатологий, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона и др. (Widner et al., 1999; Beal et al., 1999; Savvateeva-Popova et al., 2003). По КПОТ в организме млекопитающих и беспозвоночных метаболизируется около 90% триптофана (Лопатина и др., 2004). В литературе продукты КПОТ получили наименование «кинуренинов». С конца 80-х – начала 90-х годов большинство исследований кинуренинов было посвящено их нейродегенеративному эффекту.





Нейрофизиологоческая активность кинуренинов установлена у многих животных:

лягушек, мышей, крыс, кроликов, кошек, собак и др. (Лапин, 2004).

Особый интерес представляет изучение молекулярных механизмов активности кинуренинов у мутантов с генетически блокированными стадиями КПОТ. К их числу у насекомых относится дрозофила (D. melanogaster), пчела (A. mellifera) и др. У мутантов дрозофилы накопление тех или иных промежуточных метаболитов КПОТ оказывает модулирующее действие на уровень активности ЦНС, а также на процессы обучения и памяти (Savvateeva, 1991; Savvateeva et al., 2000; Savvateeva-Popova et al., 2003). Для мутантов vermilion (v) с блокированной первой ключевой стадией пути показано полное отсутствие продуктов КПОТ. У мутантов cinnabar (cn) с повышенным уровнем кинуреновой кислоты (KYNA) наблюдается улучшение ряда физиологических и поведенческих параметров (Savvateeva-Popova et al., 2003). Мутантам cardinal (сd) с повышенным уровнем 3-гидроксикинуренина (3НОК), напротив, свойственны функциональные нарушения в нервной системе, в том числе – прогрессивная потеря среднесрочной памяти при обучении методом условно-рефлекторного подавления ухаживания (УРПУ) (Savvateeva et al., 2000).

Механизмы нейрофизиологической активности кинуренинов весьма разнообразны и на настоящий момент исследованы в основном у млекопитающих. 3HOK в клеточных культурах нейронов индуцирует процессы cвободнорадикального окисления, вызывающие гибель клеток путем апоптоза (Okuda et al., 1998). KYNA является конкурентным антагонистом ионотропных рецепторов глутамата (iGluR), преимущественно стрихниннечувствительного глицинового сайта NR1-субъединицы NMDA-рецептора (Kessler et al., 1989), и, возможно, 7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) (Hilmas et al., 2001). KYN проявляет свойства агониста NR1-субъединицы NMDA-рецептора (Stone, 1991). NMDA-рецепторы опосредованно через систему малых GTP-аз и ключевой фермент ремоделирования актина LIM-киназу 1 (LIMK1) активируют транскрипционный фактор CREB (Yang et al, 2004). СREB регулирует множество клеточных процессов и обеспечивает формирование договременной памяти у млекопитающих и дрозофилы (Yin et al., 1995). LIMK1 также опосредованно через кофилин-зависимую регуляцию полимеризации актина модулирует процессы синаптической пластичности, лежащие в основе процессов обучения (Savvateeva-Popova et al., 2002). Дисбаланс кинуренинов у мутантов дрозофилы коррелирует с уровнем LIMK1 в мозге имаго (Лопатина и др., 2007).

Влияние кинуренинов на нейрофизиологические и когнитивные процессы у пчелы и дрозофилы носит весьма сложный характер (Savvateeva et al., 1991, Лопатина и др., 2004). Неизученными остаются механизмы сходных нарушений долговременной памяти у 13-суточных имаго v, cn и cd (Никитина и др., неопубл. данные). Моделирование кинуренин-зависимых нейродегенеративных заболеваний на дрозофиле должно опираться на точные знания механизмов физиологической активности КПОТ. Это обусловливает необходимость исследования молекулярных процессов, опосредующих действие кинуренинов на ЦНС дрозофилы, с выяснением их сходств и отличий от аналогичных процессов у млекопитающих.





Цель работы. Целью диссертационной работы являлось изучение механизмов воздействия кинурениновых продуктов на процессы в ЦНС дрозофилы на уровне регуляции активности генов рецепторов, лиганд-рецепторных взаимодействий и активности компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов.

Конкретные задачи исследования:

1. Оценить различия транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц dnr iGluR, d7 и d3 nAChR, а также гена dlimk1 у взрослых самцов кинурениновых мутантов (v, cn, cd) в возрасте 5 суток и 13 суток методом ПЦР в реальном времени.

2. Изучить влияние химической структуры лиганда и рецепторных аминокислотных остатков на специфичность формирования стэкинг-связи кинуреновой кислоты (KYNA) с субъединицами iGluR крысы и дрозофилы методами квантовохимических расчетов.

3. Исследовать возможность взаимодействия ксантуреновой (XAN) и антраниловой (AA) кислот, кинуренина (KYN) и 3-гидроксикинуренина (3НОК) с субъединицами iGluR, а также взаимодействия KYNA с 7 nAChR млекопитающих и дрозофилы методом компьютерного докинга.

4. Изучить распределение pCREB в мозге 5 суточных имаго дикого типа и кинурениновых мутантов (cn, cd) методом лазерной конфокальной микроскопии до и после 5 часового обучения при условно-рефлекторном подавлении ухаживания.

5. Изучить распределение LIMK1 и p-кофилина в мозге 5 суточных самцов дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии.

Положения, выносимые на защиту:

1. KYNA и XAN способны взаимодействовать c iGluR дрозофилы в качестве антагонистов. Специфичность воздействия KYNA на рецепторные подтипы определяется, в том числе, свойствами ее стэкинг-связи с ароматическим остатком рецептора.

Хроническое воздействие KYNA на ЦНС взрослых самцов дрозофилы вызывает компенсаторное увеличение транскрипционной активности dnr1. KYNA у дрозофилы является более специфичным антагонистом NR1 iGluR, чем 7 nAChR.

2. Cродство 3НОК к NR1 в качестве агониста существенно ниже, чем у KYN.

Хроническое воздействие 3НОК на ЦНС взрослых самцов дрозофилы вызывает увеличение транскрипционной активности dnr1 и d7.

3. Локализация компонентов iGluR-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов pСREB, LIMK1 и р-кофилина в мозге взрослых дрозофил – как дикого типа Canton-S, так и мутантов КПОТ cn и cd – носит избирательный характер и связана с различными структурно-функциональными подсистемами мозга.

Научная новизна работы. Впервые показано, что хроническое воздействие KYNA и 3НОК вызывает у взрослых самцов cn и cd увеличение транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц dnr1 iGluR и d7 nAChR на временном интервале 5-13 суток.

Впервые осуществлена cравнительная оценка энергии и геометрических параметров стэкинг-cвязи в ароматических димерах, моделирующих взаимодействие KYNA с различными подтипами iGluR, с изучением механизмов специфичности связывания.

Впервые построены компьютерные модели лиганд-связывающих сайтов NR1, NR и GluR1 iGluR, а также 7 nAChR дрозофилы. Впервые построены компьютерные модели комплексов KYNA с cубъединицами NR1, NR2, GluR iGluR и 7 nAChR крысы и дрозофилы.

Впервые исследовано распределение p(Ser231)CREB в мозге имаго дрозофилы и выявлены pCREB-обогащенные нейрональные структуры. Впервые выявлена локализация LIMK1 в глиальных клетках мозга у взрослых самцов дрозофилы.

Теоретическая и практическая значимость. Изучение молекулярных механизмов действия кинуренинов на процессы в ЦНС мутантов дрозофилы – модельных объектов нейропатологических синдромов человека – важно для выяснения роли продуктов КПОТ в развитии ряда заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона.

Также оно может способствовать раскрытию механизмов регуляции продуктами КПОТ процессов памяти и обучения, общих для всех высокоразвитых организмов. Изучение биофизических особенностей стэкинг-связи ароматических лигандов с рецепторами имеет как теоретическое, так и практическое значение для разработки лекарственных средств, воздействующих на определенные подтипы рецепторов.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены на: 9th International Danube Symposium & 1st International Congress on ADHD (Wuerzburg, 2007);

Международной школе-конференции, посв. 100 летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (Санкт-Петербург, 2007); XVII WFN Word Congress on Parkinson diseases and related disorders (Amsterdam, 2007); Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008);

IX East European Conference “Simpler Nervous Systems”. Saint-Petersburg, 2009;

Международной конференции "Topical problems of biophotonics - 2009” (Нижний Новгород, 2009); Международной конференции "Topical problems of biophotonics - 2011” (Нижний Новгород, 2011); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011).

Вклад автора. Лично автором выполнена основная часть квантовохимических расчетов, построены компьютерные модели рецепторных субъединиц в комплексе с лигандами, осуществлена оценка экспрессии рецепторных субъединиц у кинурениновых мутантов методом ПЦР в реальном времени, осуществлен анализ распределения рCREB, LIMK1 и p-кофилина в мозге кинурениновых мутантов методом конфокальной микроскопии. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка литературы. Работа изложена на 212 страницах печатного текста, содержит таблиц и иллюстрирована 32 рисунками. В списке литературы приведено 235 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster. Мух линии Canton-S (CS), cinnabar (cn) и cardinal (cd) выращивали на стандартной среде для дрозофил (агар, изюм, дрожжи, сахар) в условиях постоянного цикла день/ночь (12 ч./12 ч.) при 25±0.5 °С. В опыт брали взрослых 5-суточных. и 13-суточных самцов.

Выделение РНК, проведение реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (real-time PCR). РНК из голов дрозофил выделяли с использованием реагента TRI REAGENTТМ (Sigma®) в соответствии с указаниями фирмы-производителя. Концентрацию нуклеиновых кислот в пробе измеряли спектрофотометрированием при 260 нм. После обработки ДНКазой I проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора случайных нонамеров и фермента M-MLV Reverse Transcriptase в соответствии с указаниями фирмыпроизводителя. Реакцию real-time PCR вели с использованием смеси TaqMan® Gene Expression Assays специфических флюоресцентных ДНК-зондов и праймеров к генам D. melanogater dnr1, rp49, d7, d3 и dlimk1, с использованием cистемы регистрации ПЦР «StepOnePlus» фирмы «Applied Biosystems». Содержание кДНК в пробах нормировали относительно содержания кДНК рибосомного белка rp49, уровни экспрессии генов у мутантов нормировали по отношению к таковым у CS. Оценку достоверности различий осуществляли с использованием статистического теста рандомизации (Sokal, Rohlf, 1995).

Выработка долговременной памяти у самцов дрозофил путем условнорефлекторного подавления ухаживания (УРПУ). Долговременную память у самцов вырабатывали в соответствии с протоколом УРПУ (Sakai et al., 2004) c некоторыми модификациями. Девственного 5-суточного самца исследуемой линии выдерживали с оплодотворенной самкой CS в течение 5 ч. при 25° С в стаканах с питательной средой.

Необученных самцов той же линии использовали в качестве контроля при последующем анализе распределение рCREB в мозге методом конфокальной микроскопии.

Анализ распределения белков в мозге дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии. Мозговые ганглии 5-суточных самцов после холодовой наркотизации извлекали из головной капсулы и фиксировали в 10% параформальдегиде на буфере PBS с 0.3% Triton X-100 (PBT). После блокировки в 10% нормальной сыворотке инкубировали ганглии с первичными антителами к белкам человека (rabbit-anti-homo LIMK1, rabbit-antihomo p(Ser133)CREB; rabbit-anti-homo p(Ser3)-кофилин) в разведении 1:100 и антителами к синаптическому белку CSP дрозофилы в разведении 1:20 5 суток при 4 °С. После промывок инкубировали ганглии со вторичными антителами (mouse-anti-rabbit IgG-FITC, donkey-anti- rabbit IgG-Rhodamine) в разведении 1:100 в течение 1 суток при 4 °С. После промывок окрашивали ганглии DAPI (1,2 мг/л PBS) в течение 40 мин. при комнатной температуре, заключали в среду Vectashield (Vector®) и сканировали с использованием лазерного конфокального микроскопа «Leica TSC SP5» (иммерсионные объективы 20x и 63x). Aнализ конфокальных изображений осуществляли с помощью программы FIJI.

Квантовохимические расчеты стэкинг-связи в модельных димерах Полная градиентная оптимизация геометрии димеров и квантовохимические расчеты их энергии связи были выполнены с использованием версии PC GAMESS 7.0 (Granovsky A.A.

http://classic.chem.msu.su/gran/gamess/) программного комплекса GAMESS (Schmidt et al., 1993). Расчеты вели методом Хартри – Фока – Рутана с использованием базисного набора 6-31G** (Gordon, 1980), с учетом электронных корреляций в рамках теории возмущений Мёллера – Плессета второго порядка (МР2) (Mller, Plesset, 1934). Вычисления полной энергии с учетом вклада МР4 проводили для систем с предварительно оптимизированной геометрией. Энергию связи (EMP2/MP4) вычисляли соответственно с учетом корреляций на уровне МР2 и MP4. Коррекция энергии BSSE была выполнена для оптимизированных димеров с использованием программы GAUSSIAN 03 (Frisch et al., 2003).

Компьютерное моделирование трехмерной структуры белка и докинг лигандов в связывающие сайты рецепторов. Атомные координаты кристаллических структур рецепторных субъединиц были взяты из электронного банка RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Аминокислотные последовательности белков крысы и дрозофилы были взяты из электронного банка данных NCBI (www.ncbi.nlm.gov).

Автоматическое гомологическое моделирование структуры субъединиц iGluR дрозофилы было выполнено с помощью компьютерного сервера Swiss-Model (Arnold et al., 2006; Guex and Peitsch, 1997; Schwede et al., 2003), с использованием кристаллических структур рецепторных субъединиц крысы в качестве матрицы. Конструирование модельных димеров, ручной докинг лигандов в связывающие сайты рецепторов, оценка геометрических параметров водородных связей и модификация рецепторных субъединиц были выполнены с использованием программных пакетов VegaZZ 2.0.8 (Pedretti et al., 2004) и Swiss-PdbViewer 3.7 (Guex et al, 1997). Программы компьютерного докинга Autodock 4.2 (Goodsell, Olson, 1990; Morris et al., 1996; Morris et al., 1998) и Quantum 3.3. были использованы для автоматического докинга KYNA в связывающие сайты рецепторов. Оптимизация структуры лиганд-рецепторных комплексов путем минимизации энергии в водной ячейке была выполнена с использованием программ Quantum 3.3.0 и GROMACS 4.07 (Berendsen et al., 1995; Lindahl et al., 2001; van der Spoel et al., 2005; Hess, 2008). Графические изображения молекулярных структур подготовлены с использованием программы VMD (Humphrey et al., 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ экспрессии генов dnr1, rp49, d7, d3 и dlimk1 в тканях голов мутантов КПОТ D. melanogaster. Анализ уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени проводили для 5 сут. и 13 сут. взрослых самцов (рис. 1).

уровень экспрессии РНК в кинурениновых мутантов.

нормированы относительно CS (1.000). [x] - средние Уровень экспрессии у CS принят за 1.* - dnr1 v 5 cут.

5 cут. от dnr1 cn 13 cут., # dnr1 cd 5 cут. от dnr1 cd сd 13 cут., p0.05; & - d7 cn 5 cут. от d7 сn 13 cут, p0. рандомизации).

У v c отсутствием продуктов КПОТ в возрасте 5 сут. наблюдается более высокий уровень экспрессии dnr1 сравнительно с cn c избыточным содержанием KYNA (p0.05).

Следовательно, антагонистическое воздействие KYNA на ранней стадии имагинального периода не приводит к компенсаторному увеличению активности гена ее рецептора.

Показано увеличение уровня нормированной экспрессии dnr1 у сn (p0.05) в период с 5 по 13 сут., что может быть обусловлено продолжительным хроническим воздействием эндогенного ингибитора KYNA на транскрипционную активность гена ее рецептора.

Увеличение уровня экспрессии d7 у сn в период с 5 по 13 сут. менее значимо (p0.1).

У сd c избыточным содержанием 3НОК возрастает нормированный уровень экспрессии dnr1 и d7 (p0.05) в период с 5 по 13 сут. Возможно, это связано с компенсаторными пластическими изменениями в каликсах грибовидных тел, объем которых у 13-сут. cd cнижен сравнительно с 5-суточными (Savvateeva et al., 2000). Там же, по-видимому, экспрессируется и d7 (Su, O'Dowd, 2003). Активация экспрессии генов также может быть обусловлена воздействием продукта окисления 3НОК пероксида водорода на процессы транскрипции посредством активации стресс-зависимых сигнальных каскадов (Inoue et al, 2001). Вышеуказанные изменения активности генов могут обуславливать нарушение процессов формирования среднесрочной памяти у 13суточных cd и извлечения долговременной памяти у 13-сут. cn и cd (Захаров и др., 2011).

Уровни экспрессии прочих генов у 5 и 13 сут. v, cn и cd достоверно не отличаются.

2. Стэкинг-связь KYNA с ароматическими фрагментами аминокислот в составе iGluR.

Рис. 2. Оптимизированная структура ароматических аминокислот.

a. KYNA –бензол;

б. KYNA – фенол;

в. KYNA – имидазол-3;

г. KYNA – индол;

д. суперпозиция димеров: KYNA – бензол (серый), KYNA – фенол (синий), KYNA – индол (голубой);

e. суперпозиция димеров:

1. KYNA енол – имидазол 1, 2. KYNA оксо – имидазол 2;

3.KYNA оксо – имидазол 3; 4.KYNA оксо – имидазол 4.

Взаимодействуя с лигандсвязывающим сайтом NR1, 5,7-дихлорKYNA (DCKA) формирует стэкинг-связь с ароматическим кольцом Phe92 (Furukawa, Gouaux, 2003). По нашим данным, во всех субъединицах iGluR в данном положении присутствует ароматический остаток: Phe (бензол) – в dNR1 дрозофилы, Tyr (фенол) – в GluR крысы и dGluR дрозофилы, His (имидазол) – в NR2 крысы, Trp (индол) – в dNR дрозофилы (Zhuravlev et al., 2011).

Таблица 1: энергия и оптимальная геометрия димеров KYNA.

Фенол Tyr GluR2/Tyr dGluR1 OD -11.01 -5.98 -19.0 -10.05 0.74 -0.64 3.35 6. 1. ароматический партнер KYNA, 2. АК остаток рецепторной субъединицы, 3. EMP2, 4.

EMP4, 5. EMP2 в электронном базисе aug-cc-pVDZ, 6.EMP2 в электронном базисе aug-cc-pVDZ с BSSE-коррекцией, 7. dX, 8. dY, 9. dZ, 10. межплоскостной угол (град.). Значения энергии указаны в ккал/моль. dX, dY, dZ – параллельные смещения центроидов ароматических колец (). OD – димер с оптимизированной геометрией; МD – димер KYNA с ароматической группой после динамической минимизации энергии лиганд-рецепторного комплекса.

^ Данные рентгеноструктурного анализа (Furukawa and Gouaux, 2003). # KYNA в енольной форме, во всех иных случаях KYNA в оксо форме. NR1* - NR1 с заменой Phe92/His. Здесь и далее: буквой «d» указаны рецепторные субъединицы дрозофилы. Имидазол 1-4: различные варианты ориентации имидазола в OD относительно KYNA.

взаимодействующего с KYNA ароматического остатка и от характера протонирования полярных атомов ароматических колец (рис. 2, табл. 1). Энергия связи KYNA с ароматическими фрагментами повышается в ряду: бензол фенол имидазол индол.

Таким образом, максимальное сродство KYNA к NR1 не может объясняться более высокой энергией связи с ароматическим остатком. Различия в оптимальной геометрии стэкинг-связи могут определять специфичность взаимодействия лиганда с различными субъединицами рецептора.

Характер изменения энергии связи при параллельных и вертикальных смещениях ароматических колец определяет форму потенциальной поверхности стэкинг-связи. Из рис. 3 следует, что для димеров неполярных колец (бензол – бензол, бензол – KYNA) параллельные смещения сопровождаются меньшими изменениями энергии связи, чем для димеров полярных колец. (имидазол-имидазол, имидазол-KYNA). Потенциальная поверхность водородной связи имеет наиболее выраженный минимум. Это позволяет предположить следующую модель образования лиганд-рецепторного комплекса: 1. – формирование стэкинг-связи с относительно подвижным лигандом в связывающем сайте, 2. – формирование паттерна лиганд-рецепторных водородных связей. С ростом диэлектрической проницаемости понижается абсолютная величина энергии стэкингсвязи. Наибольшее влияние увеличение оказывает на энергию связи полярных ароматических остатков.

Рис. 3. Потенциальные поверхности EMP стэкинг-связи и водородной связи KYNAPro124.

a. бензол — бензол, dX;

б. KYNA – бензол, dX;

в. KYNA – имидазол 3, dX;

г. KYNA – имидазол 3, dY;

д. KYNA – бензол, dZ;

е. KYNA – Pro124, dX;

ж. KYNA – Pro124, dZ.

Смещения вдоль осей X, Y относительно координат димеров, оптимизированных методом МР2, вдоль оси Z – относительно координат с минимальной EMP4.

3. Компьютерный докинг KYNA в рецепторные сайты iGluR крысы и дрозофилы.

Оптимизированные димеры KYNA с ароматическими фрагментами были подставлены в лиганд-связывающие сайты субъединиц iGluR в открытой, инактивированной конформации (рис. 4). Паттерн лиганд-рецепторных взаимодействий KYNA в комплексах достаточно консервативен: это стэкинг-связь c Phe92 (Tyr, His, Trp), водородная связь группы NH (оксо форма KYNA) с С=O Pro124 (Ser), водородная связь COO с NН Thr (Met) и ионная связь COO с гуанидиновой группой Arg131.(Номера остатков указаны для NR1.) В NR2 и dNR2 возможны различные ориентации KYNA в зависимости от характера протонирования ароматических колец, что может обусловливать меньшую специфичность связывания KYNA с этими субъединицами.

Значения свободной энергии связи (EF) и IC50 (Quantum 3.3.0) были рассчитаны до и после динамической оптимизации комплексов (MD) (табл. 2). Для комплексов до MD расчетные значения IC50 (2.6 – 3.7*10-5 M) близки экспериментальному для NR1(1.5*10- M; Hilmas et al., 2001). Cродство KYNA к субъединицам iGluR крысы убывает в ряду:

NR1NR2GluR2, к субъединицам дрозофилы: dNR1dGluR1dNR2 (до MD). Комплекс dNR1-KYNA по своим свойствам (структуре связывающего сайта, значениям EF и IC50) наиболее близок к NR1-KYNA млекопитающих.

Рис. 4. KYNA в связывающих сайтах iGluR до и после МD. a. NR1; б. GluR2; в. NR2; г.

dNR2. KYNA и аминокислотные остатки до МD изображены синим цветом, после MD – голубым. В NR2 ароматическое кольцо His88 показано в катионной форме.

Оптимизированный комплекс с KYNA в енольной форме (KYNA-имидазол 1) изображен красным цветом, в оксо форме (KYNA — имидазол 2) — синим.

Таблица 2: энергии cвязывания KYNA c субъединицами iGluR (Quantum 3.3.0) NR1 (Phe Ala) NR1 (Arg /Ala) dNR NR1* NR1* (HisH+) NR1** (HisH+) GluR GluR2 (Tyr /Ala) dGluR dNR 1 – до динамический минимизации энергии комплекса (МD), 2 – после МD. $ NR1 в комплексе с DCKA (Furukawa and Gouaux, 2003). EF – свободная энергия cвязывания. NR1* (Phe92/His) и NR1** (Phe92/His, Pro124/Ser, Trp223/Tyr, Phe250/Tyr) — модели NR2 в открытой конформации.

4. Компьютерный докинг ксантуреновой кислоты (XAN), антраниловой кислоты (AA), кинуренина (KYN) и 3-гидроксикинуренина (3НОК) в лиганд-связывающий сайт iGluR. Оптимизированные димеры XAN – бензол и АА-бензол была подставлена в лиганд-связывающий сайт dNR1 в открытой конформации (Autodock 4.2). XAN может связываться с dNR1 в качестве конкурентного антагониста, подобного KYNA, с несколько меньшим сродством (EF = -7.21 и -7.43 ккал/моль для KYNA-dNR1 и XAN-dNR соответственно). AA обладает меньшим сродством к рецептору (EF = -5.19 ккал/моль). Повидимому, АА из-за ее малых размеров не может стабилизировать открытую конформацию NR1. KYN способен взаимодействовать с NR1 в качестве агониста, стабилизируя ее закрытую, активированную конформацию. Ориентация аминокислотного фрагмента KYN в рецепторе с максимальной EF (-7.58 ккал/моль) близка таковой для глицина. Сродство 3НОК к NR1 в данной ориентации существенно ниже (EF = -5. ккал/моль): 3НОК, по-видимому, не обладает свойствами специфического агониста NR1.

5. Компьютерный докинг KYNA в галантамин-связывающий сайт 7 nAChR крысы и дрозофилы. KYNA является конкуретным антагонистом связывания галантамина с 7* nAChR (Lopes et al., 2007). Компьютерная подстановка KYNA в открытый галантаминсвязывающий сайт димера 7 nAChR млекопитающих (PDB ID: 3SQ9, без агониста) была выполнена путем автоматического докинга (Autodock 4.2). Наиболее энергетически выгодной является структура I (рис. 5 а.). Группа NH KYNA формирует Т-связь c Trp (1; здесь и далее в скобках – номер субъединицы), группа COO – водородные связи с NH Leu106 (2) и Leu116 (2). Группа С=O KYNA может формировать водородную связь с NH Gln114 (2), что, возможно, отчасти определяет специфичность взаимодействия KYNA с nAChR. Динамическая минимизация I в водной ячейке (GROMACS 4.07) приводит к оптимизации водородных связей c увеличением EF комплекса. Антагонистические свойства KYNA, по-видимому, обусловлены тем, что она не формирует сильных связей с мобильными остатками (1): Tyr91, Tyr184, Cys186-187, Tyr191 - и не способна фиксировать закрытую, активированную конформацию рецептора, но препятствует взаимодействию с ним аллостерических активаторов.

Рис. 5. KYNA в галантаминовом сайте 7 nAChR млекопитающих (а.) и дрозофилы (б.) после динамической минимизации энергии комплекса (GROMACS 4.07). Линиями указаны водородные связи лиганда с рецептором.

Остаток Gln114 в 7 nAChR дрозофилы замещен на гидрофобный Leu. Моделью димеров d72 и d7d6 рецепторного сайта дрозофилы (d7 nAChR) служила структура димера 7 nAChR млекопитающих (3SQ9), в которого путем компьютерного мутагенеза были замещены остатки Leu106/Val (2), Gln114/Leu (2) и Leu116/Val (2). Компьютерный докинг KYNA в димер d7 nAChR c последующей минимизацией энергии приводит к формированию структуры, подобной I, в которой, однако, C=O KYNA образует водородную связь с ОН Tyr191 (1) (рис. 5 б.). EF в оптимизированных комплексах KYNA с соответственно, для NR1-KYNA – -7.98 ккал/моль (Autodock 4.2). В d7 nAСhR KYNA образует водородные связи с(1) и (2), что может фиксировать его закрытую конформацию.

Нами предсказано снижение или полное отсутствие антагонистических свойств KYNA в отношении 7 nAChR дрозофилы сравнительно с таковым у млекопитающих. Этим, возможно, объясняется менее достоверный характер увеличения экспрессии d7 по сравнению с dnr1 у сn при хроническом воздействии KYNA.

6. Распределение pCREB в мозге мутантов КПОТ D. melanogaster. Анализ распределения в мозге дрозофилы р(Ser231) CREB методом конфокальной микроскопии выявляет ряд внутримозговых структур, в которых избирательно концентрируется данный транскрипционный фактор (рис. 6, 7).

Рис. 6. Структуры мозга дрозофилы с повышенным содержанием pCREB (фронтальная проекция, без оптических ганглиев). 1. – схема мозговых структур, обогащенных pCREB, 2.распределение рСREB в мозге на уровне подглоточного ганглия. a. – Клетки, прилегающие к SEG, б. – гломерулярная структура 1, в. – гломерулярная структура 2, горизонтальные ветви, г. – проводящие тракты, связывающие горизональные ветви гломерулярной структуры с протоцеребрумом, д. – область взаимосвязи проводящих трактов с V-образной структурой протоцеребрума, е. – медиальный пучок, ж. – V-образная структура, з. – проводящие тракты сверху от CC, и. – кластеры клеток в области антенного тракта, к. –нейрональный тракт, связывающий данные кластеры. AL – антенные доли, AN – антенный нерв, ES – пищевод, MBl – медиальный пучок, SEG – подглоточный ганглий, SPb – верхний протоцеребрум.

Красным изображен маркер структур нейропиля СSP, зеленым – pCREB.

В клетках в районе подглоточного ганглия (SEG) в цитоплазме и ядрах содержание pCREB существенно более высокое сравнительно с фоновым (рис 6 а., 7 а.). В области хромоцентра ядра pCREB отсутствует (рис. 7 б.): по-видимому, он локализуется в областях транскрипционно активного хроматина. рСREB также содержится в отростках вышеуказанных клеток, в гломерулярных структурах в области пищевода (рис 6 б., в.) и в области верхнего протоцеребрума (рис 6 ж.). Количество кластеров CREB-обогащенных клеток в SEG достоверно не различается у CS, cn и cd, как до, так и после обучения методом УРПУ. Это согласуется с данными исследователей (Horiuchi et al.,. 2004), согласно которым весь пул CREB в головах дрозофил фосфорилирован по остатку Ser.

Рис. 7. pСREB в структурах мозга дрозофилы (увеличение x63).

a.– клетки в области подглоточного ганглия (SEG) и их аксоны, б. – отдельная клетка с хромоцентром в области ядра; Ядра с хромоцентрами изображены cиним цветом, pCREB – зеленым. Стрелками указано положение хромоцентра в ядре клетки.

нейрональными структурами, регулирующими поведение питания и формирование пищевой мотивации. (Melcher, Pankratz, 2005; Krashes et al., 2009). Не исключено, что данная система участвует также в процессах формирования долговременной памяти у дрозофилы методом УРПУ. Локализация CREB в отростках нейронов, аксонах и дендритах, была ранее показана и у млекопитающих (Crino et al., 1998, Сox et al., 2008).

СREB в них может выполнять функцию сигнального посредника между синаптической активностью и индукцией экспрессии генов в ядре клетки.

7. Распределение LIMK1 и р-кофилина в мозге 5-суточных самцов D. melanogaster. В мозге самцов CS, а также сn и cd LIMK1 локализуется вне обогащенных CSP структур нейропиля, концентрируясь в лежащих по их контуру клетках и в отдельных проводящих трактах (рис. 8 а, б.). Морфологически это соответствует распределению в мозге дрозофилы глиальных клеток (Hartenstein et al. 2011). p-Кофилин у самцов СS также локализован в глии, но преимущественно – в ядрах нейронов на поверхности мозга (рис. в.). Небольшое количество р-кофилина наблюдается в отдельных структур нейропиля (FB, AL, SEG и др.), в то время как в грибовидных телах и в эллипсовидном теле он практически отсутствует. Для некоторых нейроглиальных контактов показана возможность межклеточного транспорта в них белковых макромолекул (Fedorenko, Uzdensky, 2009). Не исключено, что после фосфорилирования LIMK1 р-кофилин из клеток глии аналогичным образом поступает в нервные окончания и далее – в ядра клеток.

Рис. 8. Распределение LIMK1 и р-кофилина в мозге дрозофилы (фронтальная плоскость). а.

LIMK1 в мозге на уровне каликсов грибовидных тел, б. LIMK1 в клетках глии центрального комплекса, в. – р-кофилин в мозге на уровне центрального комплекса. Са – каликс, СС – центральный комплекс, EB –эллипсовидное тело, Es – пищевод, FB – вееровидное тело, Lo – лобула, Me –медулла, PB–протоцеребральный мост. а., в. -зеленым указаны LIMK1 и р-кофилин, красным – СSP; б. – зеленым указан CSP, красным – LIMK1, синим – ядра.

У млекопитающих ферменты КПОТ преимущественно активны в клетках глии (Schwarcz and Pelliccari, 2002). Важность глии в обеспечении различных форм нейрофизиологической активности у млекопитающих и беспозвоночных находит все больше экспериментальных подтверждений. Взаимодействие нейронов и глиальных клеток в мозге дрозофилы может определять характер активности компонентов сигнальной системы: продукты КПОТ – iGluR/nAChR – LIMK – p-кофилин/рCREB.

ВЫВОДЫ

1. В тканях голов взрослых самцов D. melanogaster в период с 5 до 13 суток наблюдается увеличение нормированного относительно Canton-S уровня экспрессии гена dnr1 iGluR у линии сn, a также генов dnr1 и d7 nAChR у линии cd. В возрасте 5 суток нормированный уровень экспрессии dnr1 у сn выше, чем у v.

2. В димерах кинуреновой кислоты (KYNA) c фрагментами ароматических аминокислот iGluR формируется стэкинг-связь, оптимальная геометрия и энергия которой в существенной мере зависят от размера плоских ароматических систем и распределения в них парциальных зарядов. Величина диэлектрической проницаемости среды оказывает значительное влияние на энергию стэкинг-связи гетероароматических колец. Различия в оптимальной геометрии стэкинга для разных субъединиц отчасти определяют специфичность формирования лиганд-рецепторных комплексов.

3. KYNA в качестве антагониста может связываться с NR1, NR2 и GluR субъединицами iGluR млекопитающих и дрозофилы. Ксантуреновая кислота может cвязываться с NR дрозофилы как антагонист, подобный KYNA, но с несколько меньшим сродством.

Kинуренин может связываться с NR1 в качестве агониста, с существенно более высоким сродством, чем 3-гидроксикинуренин. KYNA способна взаимодействовать с галантаминовым сайтом 7 nAChR млекопитающих, но со сродством, более низким, чем к NR1. Характер связывания KYNA с тем же сайтом 7 nAChR дрозофилы отличен от такового у млекопитающих, что может вызывать снижение антагонистической активности KYNA в отношении данного рецептора.

4. pCREB в мозге взрослых самцов дрозофилы избирательно концентрируется в телах клеток в области подглоточного ганглия, а также – в нейрональных структурах, образованных отростками этих клеток и отвечающих за регуляцию пищевого поведения.

В данных структурах рСREB локализуется преимущественно вне ядра. pCREB также содержится в ядрах клеток в поверхностных слоях мозга. 5-часовое обучение методом условно-рефлекторного подавления ухаживания не влияет на среднее число кластеров pCREB-обогащенных клеток в подглоточном ганглии у Canton-S и мутантов КПОТ cn и cd.

5. LIMK1 у взрослых 5-суточных самцов дрозофилы избирательно концентрируется в глиальных клетках мозга: на его поверхности, на периферии структур нейропиля и в области некоторых проводящих трактов. Пространственное распределение LIMK1 в мозге сходно у Canton-S и мутантов КПОТ cn и cd. p-Кофилин преимущественно локализуется в ядрах мозговых клеток, а также – в глиальных клетках, окружающих структуры нейропиля. В нейропиле содержание р-кофилина заметно более низкое, в грибовидных телах и в эллипсовидном теле центрального комплекса он практически отсутствует.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕТАЦИИ

Статьи:

1. Журавлев А.В., Щеголев Б.Ф., Савватеева-Попова Е.В., Попов А.В. Роль стэкингвзаимодействий в механизмах связывания кинурениновой кислоты с NR2A- и GluR2субъединицами ионотропных рецепторов глутамата // Росс. физиол. журн. им.

И.М.Сеченова.- 2007.- T. 93.- №6.- С. 609-624.

2. Zhuravlev A., Savvateeva-Popova E., Popov A., Shchegolev B., Riederer P. Stacking interactions in the control-gear binding of kynurenic acid with NR2A subunit of glutamate ionotropic receptors // J. Neural Transm.- 2007.- V. 114.- N. 7.- P. CXIV.

Zhuravlev A.V., Shchegolev B.F., Savvateeva-Popova E.V., Popov A.V. Molecular mechanisms of imidazole and benzene rings binding in protein // Biochemistry (Moscow).V. 74.- N. 8.- P. 1135-1144.

4. Захаров Г.А., Журавлев А.В., Паялина Т.Л., Камышев Н.Г., Савватеева-Попова Е.В. Влияние мутаций кинуренинового пути обмена триптофана у D. melanogaster на локомоторное поведение и экспрессию генов глутаматэргической и холинэргической системы // Экологическая генетика.- 2011.- T. IX.- №2.- С. 65-73.

Zhuravlev A.V., Zakharov G.A., Shchegolev B.F., Savvateeva-Popova E.V. Stacking interaction and its role in kynurenic acid binding to glutamate ionotropic receptors // J. Mol.

Model.- 2011. DOI: 10.1007/s00894-011-1206-1.

Основные тезисы:

1. Zhuravlev A., Zakharov G., Shchegolev B., Sharagina L., Popov A., Savvateeva-Popova E.

The possibility of kynurenine metabolites binding to ionotropic glutamate receptors and to calmodulin:

data on molecular modeling and Drosophila kynurenic mutants // XVII WFN World Congress on Parkinson diseases and related disorders.- Netherlands, Amsterdam, 2007.- P. 71.

2. Журавлев А.В, Щеголев Б.Ф. Савватеева-Попова Е.В. Роль стэкинг-взаимодействия в механизмах связывания кинуреновой кислоты с NR2A- и GluR2- субъединицами глутаматных рецепторов // Тезисы конференции «Системный контроль генетических процессов», посвященной 100-летию М.Е.Лобашева.- Санкт-Петербург, 2007.- C. 49.

3. Zhuravlev A.V., Medvedeva A.V., Savvateeva-Popova E.V. Confocal microscopy imaging of the Drosophila brain structures and Lim kinase 1 distribuion // Simpler nervous systems.- St.Petersburg, 2009.- P. 120-121.

4. Zhuravlev A.V., Petrov A.A., Savvateeva-Popova E.V. The distribution of the phosphorylated cyclic AMP-responsive element binding protein (p-CREB) in the brain structures of Drosophila melanogaster // Topical problems of biophotonics - 2011.- N. Novgorod, 2011.- P.

263-264.

5. Журавлев А.В., Савватеева-Попова Е.В. Молекулярные механизмы связывания кинурениновых метаболитов с ацетилхолиновыми и глутаматными рецепторами дрозофилы // Медицинский академический журнал: тезисы доклада.- Санкт-Петербург, 2011.- Т. 11.- C.24-25.



 
Похожие работы:

«Никанова Людмила Анатольевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОБИОНТОВ И ПРИРОДНЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК В ПРОФИЛАКТИКЕ НАРУШЕНИЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, ПОВЫШЕНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ СВИНЕЙ 03.01.04 – биохимия 03.03.01 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук - п. Дубровицы – 2011 г. Работа выполнена в отделе биохимических и химико-аналитических исследований Государственного научного учреждения...»

«ПОПОВ БОРИС ВАЛЕНТИНОВИЧ КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, РОЛЬ СЕМЕЙСТВА ПРОДУКТА ГЕНА РЕТИНОБЛАСТОМЫ 03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2014 EA Работа выполнена в 1991-2013 гг. в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург Официальные оппоненты :...»

«САВЕЛЬЕВА Анна Владимировна УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ГАМЕТОГЕНЕЗА И ЛИЧИНОЧНОГО РАЗВИТИЯ АППЕНДИКУЛЯРИИ OIKOPLEURA GRACILIS (CHORDATA, TUNICATA) 03.03.05 – биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2013 Работа выполнена в лаборатории эмбриологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии...»

«ФИРСАНОВ Денис Владимирович ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ И ЭЛИМИНАЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАННОГО ГИСТОНА Н2АХ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПОСЛЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Научные руководители: кандидат биологических наук Кропотов...»

«Абушик Полина Александровна МЕХАНИЗМЫ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ, ВЫЗВАННОЙ АКТИВАЦИЕЙ РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА В ЦЕНТРАЛЬНЫХ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ КРЫС Специальность 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии мозжечка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской...»

«ПРОСЕКОВА Елена Александровна РОСТ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ БРОЙЛЕРОВ, ВЫРАЩЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОБИОТИКОВ 03.03.01 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре морфологии и физиологии животных ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Панов Валерий...»

«Попов Сергей Геннадьевич УСТОЙЧИВОСТЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ ГЕМОДИНАМИКИ К ОРТОСТАТИЧЕСКОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ У СПОРТСМЕНОВ ПОСЛЕ АЭРОБНОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Архангельск – 2014 2 Работа выполнена на кафедре физического воспитания ФГБОУ ВПО Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского доктор биологических наук, профессор, Научный заведующий...»

«МАНУЙЛОВ Илья Владимирович ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КАРДИОРЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ У ЛЫЖНИКОВ МАССОВЫХ СПОРТИВНЫХ РАЗРЯДОВ В ГОДОВОМ ЦИКЛЕ НА ЕВРОПЕЙСКОМ СЕВЕРЕ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Архангельск – 2014 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Северный государственный медицинский университет Министерства...»

«Буряков Николай Петрович Физиологическое обоснование эффективности использования кормов с повышенным уровнем нитратов в рационах крупного рогатого скота 03.03.01 – Физиология 06.02.08 – Кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Дубровицы – 2010 Работа выполнена на кафедре кормления животных зооинженерного факультета ФГОУ ВПО Российского государственного...»

«Челноков Андрей Алексеевич ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ СПИНАЛЬНОГО ТОРМОЖЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 - Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Краснодар – 2014 2 Диссертация выполнена в Великолукской государственной академии физической культуры и спорта Городничев Руслан Михайлович, заслуженный работник Научный физической культуры России, доктор биологических наук, консультант: профессор Официальные Фомина Елена Валентиновна,...»

«ИЛАТОВСКАЯ Дарья Викторовна РОЛЬ АКТИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА КОРТАКТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (ENaC) 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук и Медицинском колледже Висконсина, Милуоки, США Научные руководители: доктор...»

«АКИМОЧКИНА ТАТЬЯНА ИВАНОВНА ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СПЕРМИЕВ ЦЕННЫХ ВИДОВ РЫБ ВОЛГО-КАСПИЙСКОГО БАССЕЙНА И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КРИОКОНСЕРВАЦИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология и гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань – 2010 1 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Астраханский...»

«ДОМНИНА Алиса Павловна ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ ЭНДОМЕТРИЯ КРЫС 03.03.04. – Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт – Петербург 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : Никольский Николай Николаевич д. б. н., академик,...»

«Хряпенкова Татьяна Геннадьевна Межклеточные взаимодействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных клеток сердца и почки 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 2010 3 Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова. Доктор...»

«ИВАНОВА ГАЛИНА ВИКТОРОВНА Процессы пищеварения и обмена веществ у крупного рогатого скота при скармливании добавок с L - карнитином 03.03.01 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Дубровицы – 2012г 2 Работа выполнена в отделе кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии...»

«ГОРЕЛИК Виктор Владимирович СИСТЕМА ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА ШКОЛЬНИКОВ 03.03.01 – Физиология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2013 1 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования города Москвы Московский городской педагогический университет. Научный консультант : Беляев Василий...»

«КИПРЮШИНА Юлия Олеговна ФАКТОРЫ РОСТА ИЗ СЕМЕЙСТВ ФАКТОРОВ РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ И ФАКТОРОВ РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ, Si-VEGF2 И Si-FGF, И ИХ РЕЦЕПТОРЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ МОРСКОГО ЕЖА STRONGYLOCENTROTUS INTERMEDIUS 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ВЛАДИВОСТОК – 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского...»

«АЛЕКСЕЕНКО Лариса Леонидовна РЕАКЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА НА ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук (ИНЦ РАН), Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор биологических наук, академик РАН Никольский Николай Николаевич...»

«ЧИЖОВ АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ Особенности рубцового пищеварения и обмена веществ у бычков при скармливании силоса, приготовленного с различными консервантами 03.03.01 - Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Дубровицы - 2011г. 2 Работа выполнена в отделе кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской...»

«СТОЛЯРОВА Марина Владимировна СРАВНИТЕЛЬНАЯ МОРФОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РЕАКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ СИСТЕМ У ЖИВОТНЫХ РАЗНЫХ УРОВНЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ЧЕЛОВЕКА: ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АСПЕКТ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2012 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.