WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Карташов Дмитрий Дмитриевич

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

М о с к в а – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ковальчук Леонид Васильевич

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ганковская Людмила Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович доктор медицинских наук, профессор Краснопрошина Людмила Ивановна

Ведущая организация:

ФГБУ "ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России

Защита состоится «25» октября 2010 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан «24» сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Татьяна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования:

Механизмы врожденного иммунитета представляют первую филогенетически наиболее древнюю линию защиты организма от различных патогенов. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы.

В течение последнего десятилетия активно изучаются биология, структура и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета – противомикробных пептидов (ПМП).



ПМП представляют собой обширную группу небольших катионных белков, способных поражать различные микроорганизмы, среди которых вирусы, бактерии, грибы и простейшие.

Противомикробные пептиды, являясь естественными эндогенными антибиотиками, осуществляют функцию так называемого мгновенного иммунитета – «instant immunity». С другой стороны они являются сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы регуляции и активации клеток иммунной системы и репарации тканей. ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций.

Полифункциональность ПМП в значительной степени определяет эффективность иммунных процессов, протекающих при воспалении, урогенитальных инфекциях (УГИ), септическом шоке и др.

В настоящее время урогенитальная инфекция рассматривается как одна из основных причин развития хронических простатитов, бесплодия, патологии беременности, таких как внутриутробное инфицирование плода, невынашивание, неразвивающаяся беременность и др. Однако остается неясным, почему одни и те же инфекционные агенты в одних случаях вызывают реализацию внутриутробной инфекции и преждевременные роды, а в других – практически не влияют на течение беременности. Это вызывает необходимость поиска новых подходов к изучению роли механизмов врожденного иммунитета при урогенитальной инфекции, разработки новых диагностических критериев.

урогенитального тракта и -дефенсинов в плазме и в культуре нейтрофилов инфекционного генеза (урогенитальные инфекции, внутриутробное инфицирование, хронический простатит и другие) представляется актуальным так, как дает возможность понять роль противомикробных пептидов в защите репродуктивной системы от воздействия различных патогенов, широко представленных в урогенитальном тракте. Анализ дефенсинов на уровне экспрессии генов и синтеза белка позволит понять урогенитальной инфекции, сепсисе, а также определить возможные маркеры прогноза течения данных заболеваний и эффективности проводимого лечения.

Цель работы: комплексное исследование противомикробных пептидов (дефенсинов) в биологических средах организма в норме и при инфекциях.

Задачи исследования:

1. Разработать лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1.

2. Определить уровень экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой урогенитального тракта мужчин и женщин в норме и при урогенитальной инфекции.

3. Оценить экспрессию HBD-1 в слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с урогенитальной инфекцией.

4. Определить уровень нейтрофильных пептидов НNP1-3 в плазме крови здоровых женщин и при патологии беременности инфекционного генеза.

5. Исследовать динамику экспрессии гена и выработки пептида (-дефенсина урогенитальной инфекцией и у больных сепсисом в сравнении с группой здоровых доноров.

Научная новизна работы Разработан комплексный подход к оценке противомикробных пептидов у человека, основанный на изучении ПМП в различных средах организма.





Анализ -дефенсинов проведен на уровне экспрессии гена и синтеза молекулы пептида.

С помощью разработанных систем ПЦР в реальном времени исследован количественный уровень экспрессии генов -дефенсина 1 (HBD-1) и дефенсина 1 (HNP-1) у здоровых доноров и пациентов с урогенитальной инфекцией. Особую значимость представляют полученные данные об экспрессии генов ПМП в слизистой цервикального канала и в нейтрофилах крови при физиологически развивающейся беременности и при патологии беременности инфекционного генеза (внутриутробное инфицирование, неразвивающаяся беременность). При реализации внутриутробной инфекции цервикального, что свидетельствует о нарушении противомикробной защиты слизистой репродуктивного тракта. Снижение концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови при неразвивающейся беременности может служить маркером для ранней диагностики данной патологии.

иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе данных о снижении уровня экспрессии эпителиальных клетках уретры и снижения концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в секрете простаты.

Получены новые данные о нарушении экспрессии HNP-1 в нейтрофилах больных сепсисом. Высокий уровень экспрессии гена HNP-1 сопровождается резким снижением выработки этого пептида.

Практическая значимость работы Выявленные изменения в экспрессии и продукции ПМП у больных УГИ помогают уточнить патогенез данной патологии, а при беременности могут служить прогностическими маркерами течения беременности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1 и гена «домашнего хозяйства» - -актина.

2. С использованием разработанных систем были получены данные, свидетельствующие о том, что слизистая урогенитального тракта в норме защищена противомикробными пептидами. При урогенитальной инфекции происходит уменьшение экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой уретры и цервикального канала.

3. Физиологическое течение беременности сопровождается активацией системы противомикробных пептидов, что проявляется в увеличении экспрессии гена HBD-1 в слизистой цервикального канала и концентрации HNP1-3 в периферической крови.

4. Разработанные тест-системы позволили выявить нарушения в системе противомикробных пептидов: на уровне экспрессии гена HNP-1 и выработки молекулы данного пептида при урогенитальной инфекции и сепсисе.

Внедрение результатов исследования Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов противомикробных пептидов ( дефенсина 1 (HBD-1) и -дефенсина 1 (HNP-1).

С использованием разработанных систем определены маркеры развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования.

Получено положительное решение по заявке №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов»

Результаты исследования используются в практической работе родильного отделения ГКБ№8 и родильного дома №10 г. Москвы.

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр иммунологии и акушерства и гинекологии РГМУ.

Апробация.

конференции кафедры иммунологии, отдела иммунологии и кафедры эндокринологии лечебного факультета ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава» от июня 2010 года.

Материалы диссертации представлены на II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2007; Конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 2007; XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 6-10 апреля 2009 г.; III Международном конгрессе по репродуктивной медицине, 2009г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе статей в центральной печати и патент №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов»

Структура и объем диссертационной работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 93 отечественных и зарубежных источников. Работа выполнена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 37 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы Исследование проводилось в 2007-2010 гг. на кафедре иммунологии РГМУ (заведующий кафедрой д.м.н., профессор, академик РАЕН Ковальчук Л.В.) и на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (заведующий кафедрой д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ Макаров О.В.). Было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 40 беременных женщин с урогенитальной инфекцией, находящихся в родильном доме при 8-ой городской больнице. Диагностика УГИ осуществлялась с помощью ПЦР. У беременных была выявлена вирусная инфекция (цитомегаловирус, вирус герпеса простого, вирус папилломы человека), уреаплазма и микоплазма, так же С. albicans.

Критериями отбора в основную группу являлись: срок беременности (29- недели), наличие урогенитальной инфекции, отсутствие хронических инфекционных и системных аутоиммунных заболеваний.

Все пациентки основной группы были разделены на две подгруппы:

беременные с урогенитальной инфекцией, родившие здоровых детей ( пациенток) и беременные с реализацией внутриутробной инфекции ( пациенток).

Контрольную группу составили 32 женщин в возрасте 19-39 лет с физиологически протекающей беременностью (срок беременности 29- недели – 20 пациенток; срок беременности 5-13 недели гестации – пациенток).

Были обследованы 29 беременных с неразвивающейся беременностью.

Также были обследованы 20 здоровых небеременных женщин, женщины с УГИ, находящихся под наблюдением в женской консультации при 10-ом родильном доме г. Москвы.

У женщин производили забор крови и слизи цервикального канала.

бактериальным простатитом (ХБП) проводились совместно с аспирантом кафедры урологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Д.Н. Суренковым Было обследовано 15 больных ХБП и 12 здоровых мужчин (средний возраст составил 20±2,1 года).

Всего у больных ХБП было выделено и идентифицировано 19 штаммов бактерий: 68,4% грамположительных и 31,6% грамотрицательных.

Исследование экспрессии и продукции нейтрофильных пептидов HNP проведено у 5 больных сепсисом, проходивших лечение на кафедре медицины катастроф Московского государственного медикостоматологического университета.

исследования.

Исследование включало определения уровня экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала женщин и уретры мужчин, изучение экспрессии гена HNP-1 нейтрофилами периферической крови и концентрации -дефенсинов HNP1-3 в плазме крови, секрете простаты и амниотической жидкости.

Для изучения экспрессии генов клеточный материал (клетки слизистой цервикального канала, уретры, нейтрофилы периферической крови) подвергались лизису в специальном буфере. Затем из лизата выделяли общую РНК и в реакции обратной транскрипции на ее матрице синтезировали кДНК. Для количественного определения кДНК использовали полимеразную цепную реакцию в реальном времени. Олигонуклеотидные праймеры и зонды для ПЦР-РВ подбирали с помощью компьютерной программы VectorNTI 8.0. Проведение ПЦР-РВ осуществлялось на базе ГУ НИИ Вакцин и Сывороток им. И.И. Мечникова в лаборатории диагностики вирусных инфекций при поддержке к.м.н., с.н.с. Ганковской О.А.

Определение концентрации HNP1-3 в биологических жидкостях методикам, предлагаемым производителями тест-систем (HyCult Biotechnology, Нидерланды).

Изучение динамики экспрессии гена HNP-1 и продукции белкового периферической крови.

Статистический анализ изменений числовых результатов проведен с непараметрического критерия Манна-Уитни.

Для критерия Манна-Уитни достоверным считали уровень значимости 5% (вероятность ошибочной оценки р0,05).

Результаты и обсуждение определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов человека: HBD-1 и HNP-1.

Для постановки реакции использовались «наборы для проведения ПЦРРВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» фирмы Синтол.

С помощью программы Vector NTI были подобраны праймеры для HBD-1, HNP-1 и -актина и затем синтезированы фирмой Синтол.

Оптимальные условия протекания реакции отработаны на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). При этом была подобрана температура отжига праймеров, равная 60С.

Для регистрации флуоресценции специфического продукта в реакционную смесь добавлялись зонды. Подбор зондов также осуществлялся с помощью программы анализа нуклеотидных последовательностей Vector Выбор последовательности зонда определялся следующими NTI.

критериями: комплементарность участку определяемого гена между прямым и обратным праймером, так же зонды не должны образовывать шпилек, димеров и взаимодействовать с праймерами. Кроме того, было необходимо подобрать оптимальную концентрацию зонда. По стандартным протоколам рекомендованы концентрации 10 пМ (2,7 оптических единицы для HNP-1;

2,8 оптических единицы – HBD-1; 2,5 оптических единицы – -актин).

двух концентрациях зонда для двух исследуемых образцов (1 и 2). К- отрицательный контроль.

Флуоресценцию в пробе 1 отражают бирюзовая (3 оптических единицы зонда) и фиолетовая (5,9 оптических единицы) кривые. Флуоресценция в пробе 2 описывается синей (3 оптических единицы) и сиреневой (5, оптических единицы) кривыми. Из данного графика видно, что нет существенных различий в значении порогового цикла амплификации и скорости нарастания флуоресценции между различными концентрациями зона. Аналогичные данные были получены для концентрации зонда оптическая единица и зондов для HBD-1 и -актина.

Так, для уменьшения расхода зондов в качестве рабочей концентрации была выбрана концентрация в 1 оптическую единицу/мл.

Для оптимизации условий ПЦР-РВ, связанной с недостаточным количеством выделяемой РНК из небольших объемов клинического материала, был использован метод, позволяющий объединить реакцию обратной транскрипции и ПЦР-РВ. Такая модификация позволяет использовать всю кДНК, получаемую в реакции обратной транскрипции, а также снижает риск контаминации образцов. На рисунке 2 представлены графики, демонстрирующие преимущество такой модификации.

Рис. 2. Зависимость флуоресценции зонда для HNP-1 от количества циклов амплификации. А - при отдельном проведении обратной транскрипции, Б при совмещении обратной транскрипции и ПЦР-РВ.

С помощью разработанной системы полимеразной цепной реакции в реальном времени был исследован количественный уровень экспрессии гена HBD-1 в слизистой цервикального канала у женщин с УГИ по сравнению с группой здоровых женщин. У женщин с урогенитальной инфекцией было выявлено снижение в 3 раза уровня экспрессии гена -дефенсина 1, который выполняет важные защитные функции (Рис.3). Возможно, именно уменьшение экспрессии этого гена влечет за собой ослабление локальных защитных механизмов и развитие инфекционного процесса.

При беременности возрастает роль врожденного иммунитета в защите от патогенов. Происходящее при беременности снижение активности адаптивного иммунитета компенсируется за счет активации факторов врожденного иммунитета, осуществляющих противомикробную защиту матери и плода. При этом увеличивается экспрессия распознающих сигнальных рецепторов системы врожденного иммунитета, относящихся к семейству Toll-подобных рецепторов, которые распознают консервативные элементы патогенных микроорганизмов и активируют выработку провоспалительных цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов и др. Так в работах, выполненных на кафедре иммунологии показано, что у женщин с физиологически протекающей беременностью статистически достоверно возрастает в слизистой цервикального канала экспрессия генов TLR1, TLR2 и TLR6 по сравнению со здоровыми небеременными женщинами (Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., 2006).

Исследование количественного уровня экспрессии гена HBD-1 в слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью в сравнении со здоровыми небеременными женщинами показало увеличение экспрессии этого гена при беременности в 3 раза (Рис.

3).

Следующим этапом работы было изучение экспрессии гена HBD-1 в слизистой цервикального канала у беременных женщин с урогенитальной инфекцией. В результате выявлено снижение в 2,5 экспрессии гена HBD-1 по сравнению со здоровыми беременными (Рис.3).

Можно предположить, что развитие урогенитальной инфекции у беременных спровоцировано изначально сниженной выработкой противомикробных пептидов клетками слизистой. Одной из объяснений этого может быть полиморфизм генов молекул врожденного иммунитета (TLR, цитокинов, противомикробных пептидов, ферментов и др.). Описан полиморфизм промоторной области гена HBD-1, мутации в которой могут снижать экспрессию гена на 40-50%.

противомикробной защиты на уровне слизистой цервикального канала, следствием чего и является распространение инфекции.

данным ретроспективного анализа имела место реализация внутриутробной инфицирования, наблюдалось наиболее выраженное угнетение экспрессии гена НBD-1 (в 10 раз и более) по сравнению с группой беременных с урогенитальной инфекцией без реализации ВУИ (Рис. 3).

Количество копий кДНК HBD- Рис. 3. Экспрессия гена HBD-1 клетками цервикального канала в исследуемых группах. По оси абсцисс представлены исследуемые группы, по оси ординат - количество копий х103 кДНК HBD-1 (относительно экспрессии гена актина).

цервикального канала у женщин с неразвивающейся беременностью, однако, статистически значимых отличий от здоровых беременных выявлено не было.

Следующей задачей нашего исследования было определение уровня экспрессии гена HBD-1 в слизистой уретры мужчин в норме и при бактериальном хроническом простатите. Средний уровень экспрессии гена HBD-1 в группе здоровых мужчин составил 288,4±25,3 х 103 копий кДНК (Рис.4).

Рис.4. Экспрессия гена HBD-1 клетками слизистой уретры здоровых мужчин и мужчин с хроническим простатитом. По оси ординат представлено количество копий х103 кДНК HBD-1 (относительно экспрессии гена актина).

Обращает на себя внимание тот факт, что в клетках слизистой уретры здоровых добровольцев экспрессируются паттерн-распознающие рецепторы TLR2, TLR4, TLR9 (Ганковская и др. 2009). Можно заключить, что слизистая уретры защищена как рецепторными компонентами врожденного иммунитета, так и эффекторными молекулами.

У больных с ХБП наблюдалось снижение экспрессии гена HBDкопий кДНК) (Рис. 4).

Как было показано ранее, уровень TLR2 у этих пациентов был снижен в 13,5 раза относительно показателя в группе здоровых добровольцев.

Выраженное снижение уровня экспрессии гена TLR2 наблюдалось у больных ХБП с инфекцией, вызванной энтерококком или гемолитическим стрептококком. Известно, что патогены имеют механизмы ускользания от иммунной системы.

мочеиспускательном канале к противомикробным пептидам. Эта резистентность коррелирует с тяжестью течения ХБП (Ivanov IB., 2005).

Наряду с этим был обнаружен внеклеточный стафилококковый продукт, названный secretory inhibitor of platelet microbicidal protein (SIPMP). Данный фактор вызывает локальное ингибирование антимикробного действия ПМП.

(Ivanov IB., 2006).

Таким образом, по результатам проведенных исследований можно сказать, что при урогенитальной инфекции уровень экспрессии HBD- снижается как в слизистой цервикального канала женщин, так и в слизистой инфекционного процесса в хроническую форму.

клетками слизистой, -дефенсины (HNP1-3) выделяются из азурофильных гранул нейтрофилов при инфекции и определяют в основном развитие системного воспалительного ответа. Показано, что эти катионные пептиды стимулируют в тучных клетках высвобождение гистамина, увеличивают проницаемость сосудов секрецию ИЛ-8 клетками эндотелия.

В наших исследованиях не выявлено статистически значимых различий в концентрации HNP1-3 в плазме крови здоровых доноров и больных с УГИ.

дефенсинов в плазме была достоверно выше, чем в группе небеременных женщин и составила 6,7+2,4 нг/мл (рис.5). Полученный результат можно объяснить активацией нейтрофилов - основных клеток, высвобождающих HNP1-3. При беременности происходит увеличение количества нейтрофилов в периферической крови и их активация (Okazaki T., 2007). Ганковская Л.В.

с соавторами показали, что в нейтрофилах периферической крови беременных увеличивается экспрессия TLR4 на уровне гена и на уровне молекулы белка (Ганковская, 2007). Известно, что передача сигнала с этого рецептора активирует секрецию биологически активных факторов большей степени, чем с их количеством.

HNP1- урогенитальной инфекцией. Это исследование представляется актуальным так, как дает возможность понять роль противомикробных пептидов, действующих на системном уровне в защите репродуктивной системы женщины от воздействия различных патогенов, широко представленных в урогенитальном тракте.

HNP1-3 в плазме крови (Рис. 5). Это говорит о снижении гуморальных беременности, осложненной УГИ.

Концентрация HNP1-3 в плазме крови (нг/мл) Рис. 5. Концентрация HNP1-3 в плазме крови. По оси абсцисс представлены исследуемые группы, по оси ординат – концентрации.

концентрация HNP1-3 в плазме крови. Средние показатели HNP1-3 у пациенток с неразвивающейся беременностью были достоверно ниже и составили 0,018+0,012 нг/мл.

«нулевые» значения HNP1-3 в плазме женщин с неразвивающейся беременностью встречались у 40% пациенток, концентрация нейтрофильных пептидов до 0,1 нг/ мл – у 30% и более 0,1 нг/мл – лишь у 30% пациенток. В то время как у здоровых беременных HNP1-3 определялись всегда, причем у 70% пациенток концентрация нейтрофильных пептидов была в диапазоне от 0,1нг/мл до 1,0нг/мл, а у 25% пациенток - выше 1,0 нг/мл беременных уровень нейтрофильных противомикробных пептидов в 300 раз превышает их концентрацию в плазме крови.

раза (рис. 6), что свидетельствует о снижении защитных механизмов врожденного иммунитета в амниотической полости Концентрация HNP1-3 (нг/мл) Рис. 6. Концентрация HNP1-3 в амниотической жидкости. По оси абсцисс представлены исследуемые группы, по оси ординат – концентрация HNP1-3, нг/мл.

содержанию HNP1-3 в секрете простаты как здоровых мужчин, так и мужчин с хроническим простатитом можно разделить на две группы: менее 300 пг/мл и более 1000 пг/мл. У 44% здоровых мужчин концентрация HNP1-3 в секрете простаты составляла 232,6±54,9 пк/мл и у 56% - 1044,4±157,6 пг/мл. У больных хроническим простатитом это соотношение отличалось: у 29% концентрация HNP1-3 определялась на уровне 290,2±123,9 пг/мл и у 71% пг/мл.

У больных с ХБП чаще определяются высокие уровни HNP1-3 в секрете простаты (более 1000 пг/мл) по сравнению со здоровыми донорами.

Следующей задачей исследования явилось изучение динамики уровня периферической крови здоровых беременных женщин и беременных с концентрацию секретируемых HNP1 -3.

При изучении динамики уровня спонтанной экспрессии гена HNP-1 в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых беременных женщин и беременных с урогенитальной инфекцией показано, что уровень спонтанной экспрессии данного гена существенно не отличается у этих двух групп и поддерживается на одном уровне независимо от времени тенденция к снижению экспрессии дефенсина (Рис. 7).

Рис.7. Динамика спонтанной экспрессии гена (А) и выработки белка (Б) HNPнейтрофилами периферической крови здоровых беременных и беременных с урогенитальной инфекцией. По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – (А) lg (число кДНК HNP-1) относительно lg (1000 копий кДНК -актина), (Б) концентрация HNP-1 в нг/мл.

- беременные с физиологически протекающей беременностью - беременные с урогенитальной инфекцией Особый интерес представляют данные по экспрессии нейтрофильных пептидов при системной воспалительной реакции в результате полиорганной травмы. На рисунке 8 представлена динамика экспрессии гена HNP-1 в культуре нейтрофилов больных сепсисом и здоровых доноров. Через 3 часа культивирования экспрессия гена HNP-1 нейтрофилами здоровых доноров резко снижалась (приблизительно в 100 раз) и сохранялась на таком уровне до окончания эксперимента.

Рис.8. Экспрессия гена HNP-1 в культуре нейтрофилов больных сепсисом и здоровых доноров. По оси абсцисс – время культивирования, по оси ординат – десятичный логарифм числа копий кДНК HNP- Уровень экспрессии гена HNP-1 нейтрофилами при сепсисе на момент начала культивирования на 10 раз превышал таковой в группе здоровых доноров. В процессе 24-часового культивирования экспрессия гена уменьшалась в 10 раз, оставаясь выше аналогичного показателя в норме.

У больных сепсисом наблюдалось отличие в динамике выработки HNP1-3, которое заключалось в сниженной продукции (в 5-10 раз) HNP1- нейтрофилами больных сепсисом на 3-6 час культивирования. Можно предположить, что происходит истощение резервных потенциалов нейтрофилах при сепсисе. Однако при дальнейшем культивировании происходит восполнение пула HNP за счет достаточно высокого уровня экспрессии гена HNP.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1.

2. По сравнению со здоровыми донорами при урогенитальной инфекции происходит снижение в 2-3 раза экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала и в клетках слизистой уретры мужчин.

3. Физиологическое течение беременности сопровождается увеличением цервикального канала и возрастанием концентрации нейтрофильных -дефенсинов - HNP1-3 в периферической крови.

4. У беременных с урогенитальной инфекцией выявлено уменьшение экспрессии гена НBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и снижение концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме и амниотической жидкости.

5. При неразвивающейся беременности концентрация нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови резко снижается, у 40% HNP1-3 не определяются.

6. В культуре in vitro изучена динамика экспрессии нейтрофилами дефенсина HNP-1 на уровне мРНК и белка. Спонтанная экспрессия гена не отличается у здоровых беременных и беременных женщин с урогенитальной инфекцией. Тогда как, секреция этого пептида у беременных с урогенитальной инфекцией происходит на 6 часов позднее, чем у здоровых беременных.

7. У беременных с урогенитальной инфекцией стимуляция нейтрофилов ЛПС в низкой дозе вызывала более выраженный рост экспрессии гена HNP-1, что может быть обусловлено праймингом клеток при урогенитальной инфекции.


8. Уровень экспрессии гена HNP-1 нейтрофилами при сепсисе в 10 раз превышал таковой в группе здоровых доноров, в то время, как выработка -дефенсинов (HNP1-3) нейтрофилами в течение 6-ти часов культивирования была снижена более, чем в 15 раз по сравнению со здоровыми донорами.

Практические рекомендации Предложенный способ оценки экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала целесообразно включать при оценке показателей врожденного иммунитета для своевременного прогнозирования внутриутробной инфекции и преждевременных родов у беременных с урогенитальной инфекцией.

Снижение концентрации HNP1-3 в плазме крови ниже 30 пг/мл позволяет с высокой точностью отнести данных пациенток к группе высокого риска по развитию неразвивающейся беременности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Фензелева В.А., Карташов Д.Д., Романовская В.В. Экспрессия мРНК Tollподобного рецептора 2 и бета-дефенсина человека 1 при урогенитальной Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2. Gankovskaya O.A., Pomanovskaya V.V.,Kusnecov P.A., Fenzeleva V.A., Kartashov D.D. TLR and antimicrobial peptide genes expression during prenatal infection //

Abstract

from Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics 20 - 22 of September 2007, Kyiv, Ukraine, 20-22 september, 2007, P. 3. Ганковская Л.В. Ковальчук Л.В. Ганковская О.А. Макаров О.В. Лавров В.Ф. Карташов Д.Д. Кузнецов А.П. Экспрессия противомикробных пептидов клетками слизистой оболочки цервикального канала и нейтрофилами периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией // Вестник РГМУ, №5, 2008, с. 26- 4. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Фензелева В.А., Карташов Д.Д., Ганковская О.А. Активация экспрессии генов Toll-подобных рецепторов и дефензинов клетками слизистой цервикального канала при беременности // Российский иммунологический журнал, т. 2(11), №2-3, 2008, стр. 286 – 5. Ганковская О.А., Ковальчук Л. В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Романовская В.В., Карташов Д.Д., Фензелева В.А. Роль Toll-подобных рецепторов и дефенсинов в противомикробной защите урогенитального иммунобиологии, №1, 2008, с. 46- 6. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Карташов Д.Д. Современные методы лечения при преждевременных родах // Российский вестник акушера – гинеколога, №2, 2009, с.29- 7. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская О.А., Романовская В.В., Карташов Д.Д., Макаров О.В.

Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности // Вестник РГМУ, №4, 2009, с. 34- Романовская В.В., Щукина А.В., Ганковская О.А., Карташов Д.Д.

цервикального канала при беременности и воспалительных заболеваниях национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 6-10 апреля 9. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская О.А., Карташов Д.Д. Показатели врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при беременности // Проблемы репродукции, специальный выпуск «Материалы III международного конгресса по репродуктивной медицине», с. Карташов Д.Д., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Ганковская О.А, Щукина А.В., Дворецкая Е.В. Анализ противомикробных пептидов человека в биологических жидкостях // Российский аллергологический журнал, №3, выпуск 1, 2009, с. Патенты Получено положительное решение по заявке №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов» авторов Л.В. Ганковской, О.В.

Макарова, Л.В. Ковальчука, П.В. Кузнецова, Д.Д. Карташова ВУИ - внутриутробная инфекция ВПГ - вирус простого герпеса ИФА - иммуноферментный анализ ЛПС - липополисахарид ПМП - пртивомикробные пептиды ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени УГИ - урогенитальная инфекция ХБП - хронический бактериальный простатит ЦМВ - цитомегаловирус HBD (human beta defensine) - -дефенсин человека HNP (human neutrophil peptide) - нейтрофильный пептид человека (дефенсин) TLR (Toll like receptor) - Toll-подобный рецептор

 


Похожие работы:

«БЕРЕЗИКОВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И НЕЙРОГОРМОНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ, АПОПТОЗА МИОКАРДА И СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ: ИННОВАЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ 14.01.05 – кардиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Томск-2014 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт кардиологии...»

«Акбашева Марьяна Тохтаровна Рентгеноэндоваскулярная диагностика и лечение поражений незащищенного ствола левой коронарной артерии у больных ишемической болезнью сердца. (14.01.26 – сердечно–сосудистая хирургия) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2010 Работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева Российской Академии медицинских наук. Научные руководители: Л.А. Бокерия Доктор медицинских...»

«Черкасская Елена Фдоровна ОПТИМИЗАЦИЯ АКУШЕРСКО-ГИНЕКОЛОГИЧЕСКОЙ ТАКТИКИ У БОЛЬНЫХ С ПОЛИОРГАННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ В ПОСЛЕРОДОВОМ ПЕРИОДЕ 14.01.01 – Акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск - 2013 2 Работа выполнена в отделении антенатальной охраны плода Федерального государственного бюджетного учреждения Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Министерства...»

«ДМИТРИЕВ Анатолий Николаевич МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СИНДРОМ: МАРКЕРЫ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ, ДИАГНОСТИКА ДОКЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИИ, ОБОСНОВАНИЕ ТАКТИКИ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ 14.01.04 – внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Екатеринбург – 2011 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по...»

«Клюйкова Елена Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ МЕЖВЕДОМСТВЕННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПО ПРОТИВОДЕЙСТВИЮ РАСПРОСТРАНЕНИЮ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМОЙ ПАТОЛОГИИ НА УРОВНЕ СУБЪЕКТА ФЕДЕРАЦИИ 14.00.33 - Общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2007 г. Работа выполнена в ФГУ Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения Федерального агентства по...»

«Зияева Джамиля Муминовна ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКИ, ТЕЧЕНИЯ И ТЕРАПИИ ТРОПИЧЕСКОЙ МАЛЯРИИ У ДЕТЕЙ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ (НА ПРИМЕРЕ РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН) 14.00.10 – Инфекционные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2009 Работа выполнена в Таджикском государственном медицинском университете им Абуали ибни Сино, ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора РФ Научный руководитель : доктор...»

«Капсаргин Федор Петрович КЛИНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА МЕТОДА ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ 14.01.17 – хирургия 14.01.23 – урология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Красноярск – 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, на базе кафедры общей хирургии в урологическом отделении НУЗ Дорожная клиническая больница на ст. Красноярск ОАО РЖД Научные консультанты: доктор медицинских наук,...»

«Фомина Ксения Владимировна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ АТЕРОСКЛЕРОЗА У КРЫС, ВЫЗВАННОГО ИММУНИЗАЦИЕЙ НАТИВНЫМИ ЛИПОПРОТЕИНАМИ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ ЧЕЛОВЕКА 14.03.09 –клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург - 2013 2 Работа выполнена на кафедре иммунологии и клеточной биологии ФГБОУ ВПО государственный университет Министерства Удмуртский образования и науки РФ Научный руководитель : доктор...»

«БАЗАРОВА НАДЕЖДА ЦЫРЕНОВНА НООТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА НООФИТ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Улан-Удэ – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук Научный руководитель : Николаев Сергей Матвеевич – доктор медицинских наук, профессор...»

«ЗАЛЯЛОВ Юрий Ринатович РОЛЬ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТИМОЦИТАРНЫХ ГЛОБУЛИНОВ В ПОВЫШЕНИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИЙ АЛЛОГЕННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В КЛИНИКЕ 14.01.21 – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный медицинский университет...»

«ХОВАЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗРАБОТКА ИНФОРМАЦИОННОГО И НОРМАТИВНО-МЕТОДИЧЕСКОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ СИСТЕМЫ ГИГИЕНИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 14.02.01 – Гигиена Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научноисследовательском институте эпидемиологии и микробиологии...»

«ФЕДОТОВА ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА ТРАНСКРАНИАЛЬНАЯ СОНОГРАФИЯ В ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 14.01.11 – нервные болезни 14.01.13 – лучевая диагностика, лучевая терапия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2010     Работа выполнена в Научном центре неврологии Российской академии медицинских наук НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Доктор медицинских наук, профессор С.Н. Иллариошкин Кандидат медицинских наук А.О. Чечеткин ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:...»

«ВИШНЕВСКАЯ Оксана Александровна ОСОБЕННОСТИ ДЕПРЕССИИ В ПЕРИОД РЕМИССИИ ШИЗОФРЕНИИ И СОЦИАЛЬНОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ БОЛЬНЫХ Специальность 14.01.06 – психиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Петрова Наталия Николаевна Официальные оппоненты : Иванов Михаил Владимирович доктор медицинских...»

«БЕЛОУСОВА НАТАЛЬЯ ЛЬВОВНА ПРОПОЛИС В КОМПЛЕКСНОЙ ЭРАДИКАЦИОННОЙ ТЕРАПИИ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА 14.01.28 – гастроэнтерология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 2 Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г. Москвы (директор – доктор медицинских наук, профессор Л.Б.Лазебник) Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Михеева Ольга Михайловна...»

«БЕЛЯЕВА Надежда Анатольевна РЕАЛИЗАЦИЯ ПРОГРАММЫ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОВ С МИКРОДЕЛЕЦИЕЙ AZF ЛОКУСА ХРОМОСОМЫ Y 14.01.01 – акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 2 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации...»

«БОБРОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА СОСТОЯНИЕ МЛАДЕНЧЕСКОЙ СМЕРТНОСТИ И ПУТИ ЕЕ СНИЖЕНИЯ В СУБЪЕКТЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре общественного здоровья и здравоохранения №2 ГОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития РФ Научный руководитель : доктор медицинских...»

«УДК 616.613-003.7-089.879:615.849.19 ФАТИХОВ РАМИС РАФИСОВИЧ ТРАНСУРЕТРАЛЬНАЯ КОНТАКТНАЯ ЛИТОТРИПСИЯ В ЛЕЧЕНИИ КАМНЕЙ ПОЧЕК. 14.00.40 – Урология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении НаучноИсследовательском Институте Урологии Росмедтехнологий. Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Мартов Алексей Георгиевич Официальные оппоненты : доктор...»

«БАЛАЯН МАРИНА МУРАДОВНА ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ У БОЛЬНЫХ ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНЬЮ 14.01.04 – внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Владикавказ – 2013 1 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения...»

«Чернявская Галина Михайловна ПОРАЖЕНИЕ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ (КЛИНИЧЕСКИЕ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ) 14.00.05 – внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Томск – 2004. 2 Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете МЗ РФ, в ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН. Научный консультант : доктор медицинских наук, профессор Белобородова Э.И. Официальные...»

«Калиновская Ирина Ивановна Оптимизация организации родовспоможения в условиях мегаполиса 14.01.01 акушерство и гинекология 14.02.03 общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре организации здравоохранения с курсом медицинской статистики и информатики Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России и...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.