WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Кидрасова Елена Николаевна

ИММУНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНОГО

ИНТЕРЛЕЙКИНА -2 (РОНКОЛЕЙКИНА) И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА

ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ).

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск – 2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и в лаборатории иммунофармакологии и иммунотоксикологии Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович доктор биологических наук, профессор Вахитов Венер Абсатарович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Зарудий Ф.А.

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Теплова С.Н.

Ведущая организация: Российский Государственный медицинский Университет

Защита состоится в “_“_ 2007 года на заседании диссертационного совета при Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования “Челябинская государственная медицинская академия” Росздрав РФ по адресу, 450092, г. Челябинск, ул.

Воровского, д. 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Челябинская государственная медицинская академия” Росздрав РФ

Автореферат разослан “_“_ 2007 год

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор медицинских наук, профессор Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы В настоящее время значительно возрос интерес исследователей и врачей клинической практики к препаратам рекомбинантных цитокинов. Это обусловлено углублением понимания регуляторной роли цитокинов не только в рамках функционирования иммунной системы, но и всего организма, а также прогрессом в области получения рекомбинантных цитокинов и высокой эффективностью цитокинотерапии при лечении злокачественных опухолей, вирусных инфекций, иммунодефицитных состояний [Симбирцев, 2002; Rouveix et al., 2000; Jonasch et al., 2001].

Участие цитокинов в сложной цепи нейро-иммуно-эндокринной регуляции гомеостаза, плейотропность биологической активности обусловливает то, что их введение, помимо основного иммунотропного фармакологического эффекта, сопровождается побочным действием, - изменением функциональной активности других систем организма (нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой и пр.) [Симбирцев, 2002; Черешнев и соавт., 2002]. Одним из свойств цитокинов является способность изменять (как правило, угнетать) экспрессию и активности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени и других тканей, - ключевой ферментной системы, участвующей в биотрансформации и детоксикации низкомолекулярных чужеродных соединений (ксенобиотиков), а также в биотрансформации липофильных эндогенных соединений [Сибиряк и соавт., 2003, 2006; Morgan, 1999]. В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что введение рекомбинантных ИЛ-1, ФНО, интерферонов I типа, приводит к угнетению окислительной биотрансформации, изменению фармакокинетики совместно вводимых лекарственных средств и, как следствие, изменению их фармакодинамики и токсичности [Сибиряк и соавт., 1990; 1995; Okuno et al., 1990; Craig et al., 1993;

Rouveix et al., 2000; Sibiryak et al., 2004]. В отношении цитокинов Т-хелперных клонов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН, ИЛ-10) в литературе представлены довольно противоречивые результаты. В частности, это касается ИЛ-2: ряд авторов отмечают способность рекомбинантного ИЛ-2 угнетать монооксигеназы при введении экспериментальным животным, или в процессе цитокинотерапии [Abdel-Razzak et al., 1993; Thal et al., 1994; Elkahwaji et al., 1999], другие исследователи отрицают влияние ИЛ-2 на монооксигеназы [Sunman et al., 2004]. В отличие от провоспалительных цитокинов, для которых существует четкий параллелизм между иммунотропным эффектом и воздействием на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ [Sibiryak et al., 2004], сведений о взаимосвязи иммунотропного эффекта ИЛ-2 и его влиянием на монооксигеназы нет.

Отечественный препарат дрожжевого рекомбинантного человеческого ИЛ-2, ронколейкин, активно внедряется в клиническую практику, как эффективный иммуномодулятор [Елькин и соавт., 2002; Козлов, 2002; 2006; Попович, 2004 и др.]. В то же время, побочные эффекты терапии ронколейкином, в частности его влияние на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, взаимосвязь с иммунотропным действием не охарактеризованы. Этот аспект действия ронколейкина представляется существенным, поскольку препарат, как, впрочем, и препараты других рекомбинантных цитокинов, нередко используется в рамках комплексной фармакотерапии, особенно в онкологии [Сепиашвили, 2001; Кислелевский и соавт., 2001; Киселва и соавт., 2001; Молчанов и соавт., 2002; Рукавицын, 2002; Попович, 2004].

В настоящее время характер окислительного метаболизма, спектр, участвующих в биотраснформации изоформ цитохрома Р450 для многих лекарственных препаратов четко установлен. Имеющиеся, а также вновь установленные сведения о характере воздействия цитокинов на те или иные изоформы, позволяет предположить направленность изменений биотрансформации совместно вводимых лекарств. Это определяет целесообразность создания компьютерной программы, позволяющей прогнозировать особенности фармакокинетической интерференции.

Все изложенное выше и определило актуальность настоящего исследования.

Цель исследования:

Оценить влияние человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) на цитохром Р450-зависимую монооксигеназную систему печени во взаимосвязи с иммунотропным эффектом в экспериментальных условиях и разработать компьютерную программу, позволяющую прогнозировать характер влияния цитокинов на биотрансформацию лекарственных средств Задачи исследования:

1. Изучить иммунотропные эффекты ронколейкина (влияние на структуру гемограммы, пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах, субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови) у интактных крыс при его введении в различных дозах 2. Изучить влияние ронколейкина на гистологическую структуру печени при его введении в различных дозах 3. Изучить влияние ронколейкина на конституитивные цитохром Р450зависимые монооксигеназы печени 4. Изучить иммунотропные эффекты ронколейкина и его влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени в условиях индукции повреждения печени гепатотропными ядами 5. Разработать компьютерную программу, позволяющую прогнозировать характер изменения метаболизма лекарственных препаратов при проведении комплексной цитокинотерапии Научная новизна:

Оценено влияние отечественного препарата дрожжевого рекомбинантного человеческого ИЛ-2 - ронколейкина на показатели пролиферативной активности, апоптоза в лимфоидных органах крыс, субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови крыс при введении препарата в различных дозах.

Установлено, что иммуностимулирующий эффект препарата проявляется в наибольшей степени при однократном введении низких доз цитокина и выражается в стимуляции гемопоэза, активации митогенеза тимоцитов, увеличении содержания в периферической крови Т-лимфоцитов, экспрессирующих -цепь рецептора к ИЛ-2.

Впервые установлено, что ронколейкин, при однократном введении крысам, в зависимости от дозы, вызывает умеренные изменения гистологической структуры печени “воспалительно-дистрофического” характера, причем эффект более выражен при введении низких доз цитокина. Ронколейкин изменяет конституитивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени. Характер влияния ронколейкина на монооксигенирование реализуется изоформами цитохрома Р различных подсемейств (CYP1A, CYP2B, CYP2C, CYP2E, CYP3A) неоднозначен. В зависимости от дозы ронколейкин увеличивает, или не влияет на CYP1A-зависимую этоксирезоруфин-7-деэтилазную (ЭРОД)активность, угнетает CYP2С-зависимую дибензилфлюоресцеин-дебензилазную (ДБФД) активность; угнетает CYP2Езависимую р-нитрофенол-гидроксилазную (ПНФГ) активность и мало влияет на CYP3А-зависимую эритромицин-N-деметилазную (ЭРНД) активность в печени.

Трхкратное ежедневное введение ронколейкина в дозе 1 x 105 ед./кг не сопровождается изменениями монооксигеназных активностей.

Впервые изучены иммуно-гепатотропные эффекты ронколейкина на фоне токсического гепатита, вызванного введением четырххлористого углерода.

Обнаружено, что ронколейкин при введении в дозе 1 x 105 ед. /кг препятствует вызванной четыреххлористым углеродом индукции CYP2E1, но не защищает печень от повреждения и потенцирует угнетение других монооксигеназ, а также усиливает иммунодепрессивное воздействие четырххлористого углерода на тимоциты.

Разработана компьютерная программа, позволяющая прогнозировать характер изменения метаболизма лекарственных препаратов при их совместном введении с препаратами рекомбинантных цитокинов Научно-практическая значимость работы:

Полученные результаты способствуют расширению знаний о цитокиновой регуляции цитохром Р450-зависимых монооксигеназ и биотрансформации ксенобиотиков и метаболизирующихся цитохромом Р450 эндобиотиков, а также углубляют понимание механизмов регуляции гомеостаза при инфекции и “иммунном” стрессе. Результаты работы свидетельствуют, что рекомбинантный ИЛ- (ронколейкин) характеризуется гепатотропным эффектом, в эффективных дозах изменяет морфо-функциональное состояние печени и е фармако-метаболизирующую функцию. Это имеет практическую значимость при проведении комплексной фармакотерапии, поскольку назначение различных лекарственных препаратов на фоне прима ронколейкина может изменить их фармакокинетику и, как следствие, фармакодинамику и токсичность.

Установлено, что токсические поражения печени гепатотропными ядами являются противопоказанием для применения ронколейкина.

Создана компьютерная программа, которая на основании полученных сведений о влиянии ронколейкина на те или иные изоформы цитохрома Р450, а также данных о характере влияния других препаратов цитокинов, позволяет прогнозировать характер изменения биотрансформации лекарственных средств и оптимизировать комплексную фармакотерапии с использование цитокинов.

Внедрение результатов исследования:

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу в лаборатории иммунофармакологии и иммунотоксикологии Института иммунологии и физиологии Уро РАН (г. Екатеринбург), лабораторию молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН (г. Уфа), используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре иммунологии и биохимии Челябинской государственной медицинской академии (г. Челябинск), на кафедре фтизиопульмонологии Башкирского государственного медицинского университета (г. Уфа).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дрожжевой рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (ронколейкин) у крыс, при однократном введении, в зависимости от дозы, проявляет иммунотропный эффект, обеспечивая стимуляцию гранулоцитопоэза, и воздействует преимущественно на Т звено иммунитета, усиливая митогненез тимоцитов, экспрессию -цепи рецептора к ИЛ-2 на зрелых Т-лимфоцитах периферической крови.

2. Ронколейкин, при однократном введении в низких дозах, вызывает умеренные изменения гистологической структуры печени в виде незначительных “воспалительно-дистрофических изменений” паренхимы органа. В зависимости от дозы ронколейкин изменяет конституитивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени, причем характер его влияния на монооксигеназную активность изоформ различных подсемейств неодинаков - ронколейкин преимущественно активирует Ah-рецептор-зависимые изоформы (CYP1A1/2) и преимущественно угнетает изоформы подсемемейств CYP2С, CYP2E, CYP3A.

3. Ронколейкин в условиях токсического поражения печени гепатотропным ядом (четыреххлористый углерод) препятствует индукции изоформы CYP2E1, но не защищает печень от повреждения, усиливает ее функциональную недостаточность и не обеспечивает коррекции нарушений иммунитета, вызванных токсикантом.

4. Прогнозирование характера взаимодействия препаратов рекомбинантных цитокинов с другими лекарственными препаратами возможно в рамках компьютерной программы на платформе Microsoft.NET 2.0 с применением технологии ADO.NET 2.0 в среде Microsoft Visual Studio 2005.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на научно-практической конференции “Рациональное использование лекарств” (г. Пермь, 2004), 2-ой Российской школе по иммунотерапии (г. Новороссийск, 2005), Всероссийском научном симпозиуме “Цитокины. Стволовая клетка” (г. Новосибирск, 2005), XIII Российском национальном Конгрессе “Человек и лекарство” (г. Москва, 2005), IV конференции иммунологов Урала (г. Уфа, 2005), V конференции иммунологов Урала (г. Оренбург, 2006), Российской конференции молодых ученых, посвященной памяти Н.Н. Кеворкова (г. Пермь, 2006).

Публикации:

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 129 страницах, иллюстрирована 9 таблицами и рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов.

Список литературы включает 301 источников (88 отечественных и 213 зарубежных).

Благодарности:

Автор выражает глубокую благодарность программисту Курчатову П.В. за помощь в разработке программы для анализа характера фармакокинетической интерференции.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на 200 половозрелых крысах-самцах линии WAG/Rij массой 140-160 г. Животные содержались в пластиковых клетках в стандартных условиях вивария с 12-часовым световым циклом “день-ночь”, получали стандартное питание и свободный доступ к воде. За 12 часов до умерщвления животных кормление прекращали. При работе с животными соблюдались Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных (1989). Все болезненные манипуляции и умерщвление животных осуществляли под эфирным наркозом, по достижению животными “бокового положения”.

Коммерческий препарат дрожжевого рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рИЛ-2, ронколейкин) (ООО “БИОТЕХ”, С.-Пб.) разводили стерильным изотоническим раствором хлорида натрия и вводили внутрибрюшинно однократно в диапазоне доз от 5 x 106 ед./кг до 6 x 104 ед./кг Объем вводимой жидкости составлял 1 мл на 100 г массы животного. Контрольные группы получали эквивалентное по объему и, в зависимости от концентрации ронколейкина, содержанию, разведенных физиологическим раствором хлорида натрия компонентов стабилизаторов ронколейкина (натрия додецилсульфат, D-маннит, дитиотреитол), предоставленной фирмой-производителем. Тестирование животных осуществляли спустя 24 часа после введения рекомбинантного цитокина.

Токсический гепатит вызывали путм введения четыреххлористого углерода (CCl) в виде 50%-го масляного раствора в объме 0,4 мл /100 г массы крысы подкожно, в течение четырх дней [Скакун и соавт., 1975; Олейник, 1983; Скакун и соавт., 1984; Виноградов и соавт., 1993]. Контрольная группа получала эквивалентное количество кукурузного масла.

Для анализа гемограммы кровь (200 мкл) получали у наркотизированных животных из ретроорбитального синуса, помещали в пробирки с сорбированным антикоагулянтом (BD). Эритроциты лизировали добавлением 2 мл раствора CellLyse (BD), дважды омывали раствором CellWash (2 мл) (BD), ресуспендировали в растворе CellFix (1 мл) (BD) и затем анализировали параметры прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния на проточном цитофлюориметре FASC Calibur (BD).

В некоторых опытах морфологичесий состав крови анализировали традиционным методом: мазки крови фиксировали метанолом и далее окрашивали по РомановскомуГимзе, микроскопировали на световом микроскопе Jenamed-2 при увеличении x 1000.

Для получения суспензий тимоцитов или спленоцитов кусочки тимуса или селезнки помещали в 0,15 М фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР, рН 7,2).

Ткань органа измельчали в стеклянном гомогенизаторе, избегая вращательных движении. Клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр, эритроциты лизировали раствором CellLyse (BD), клетки отмывали, ресуспендировали в ФСБР в концентрации - 1 x 106 клеток/мл и далее использовали для анализа.

Анализ клеточного цикла и апоптоза спленоцитов и тимоцитов осуществляли традиционным методом окрашивания йодистым пропидием с последующей цитофлюометрией на проточном цитометре FASC Calibur (BD). Использовали стандартную процедуру окрашивания: клеточную взвесь фиксировали в ледяном 70% этаноле из расчета 1 часть взвеси клеток и 9 частей этанола. Фиксированную взвесь центрифугировали в течение 5 мин (150g), супернатат удаляли и клетки ресуспендировали в гипотоническом растворе йодистого пропидия (Applechem) (0,1% цитрат натрия, 0,1% Triton X-100, йодистый пропидий 50 мкг/мл). Далее клетки инкубировали при комнатной температуре 30 мин и анализировали на проточном цитофлюориметре. Данные анализировали в рамках программного обеспечения CellQuest. Оценивали величину гиподиплоидного пика (М1), что соответствовало апоптотирующим клеткам, величину G1/G0 - пика (М2), что соответствовало покоящимся клеткам и клеткам находящимся в пресинтетической фазе, и величину SG2M – пика (М3), что соответствовало клетками, находящимся в фазе синтеза ДНК и митотическом цикле [Darzynkiewicz et al., 1994].

В процессе иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови оценивали содержание CD3+CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов, CD3+CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов/супрессоров, а также экспрессию -цепи рецептора к ИЛ-2 (CD25+) на СD3+ Т-лимфоцитах крови. Исследование проводилось методом прямого двухпараметрического иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови. Использовались мышиные моноклональные антитела против поверхностных антигенов лимфоцитов крысы и соответствующие изотипические контроли (все реактивы фирмы Caltag Lаbs.) - анти CD3-FITC IgM, антиCD4-PE IgG1, антиCD8-PE IgG1, антиCD25-PE IgG1, IgM-FITC/IgG1-PE. Результаты цитофлюорометрии обрабатывали в рамках программы программы CellQuest.

Для оценки гистологической структуры печени использовали обзорные препараты. Кусочки органа фиксировали в 10%фосфатно-буферном формалине и заливали в парафин. С помощью микротома (Leiсa) готовили срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали по общепринятой методике гематоксилин-эозином.

Морфологические исследования проведены на базе лаборатории морфологии ГУЗ “Всероссийский центр глазной и пластической хирургии” Росздрава.

субмитохондриальная фракция печени (12000g - гомогенаты, S12-фракция), которые адекватно заменяют очищенные микросомы при определении монооксигеназных активностей [Pelkonen et al., 1974; Myers et al., 2001]. Все процедуры получения S12фракции производили на холоде (4 оС). Для получения S12-фракции навеску органа помещали в 50mM TRIS-HCl буфер (pH 7,4), содержащий 1,15% KCl. Соотношение “масса навески: буфер” составляло 1:10 (вес: объм). Навеску органа гомогенизировали в тефлоновом гомогенизаторе (3000об/мин, 3 мин). Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге JUAN K23 с угловым ротором в режиме 12000g, 20 мин, 4oС. Супернатант (S12-фракцию) переносили в пластиковые пробирки (Costar) и хранили при -70oС. Содержание белка в S12-фракции оценивали, используя метод Бредфорда и стандартный набор для определения белка ProteinAssay Kit (BioRad). Калибровку осуществляли по раствору бычьего сывороточного альбумина.

Дибензилфлюоресцеин-дебензилазную (ДБФД) активность определяли флюорометрическим методом [Stresser et al., 2000; 2002]. Определение 7этоксирезоруфин-О-деэтилазной (ЭРОД) активности осуществляли по методу R. Pohl и J. Fouts [1980]. Оценку р-нитрофенол-гидроксилазной (ПНФГ) и эритромицин-Nдеметилазной (ЭРНД) активностей осуществляли колориметрически, используя при анализе ПНФГ-активности метод, описанный [Forkert et al., 2001], а при анализе ЭРНД-активности метод [Werrigloer, 1978]. При анализе монооксигеназных активностей использовались реактивы фирмы Sigma (St. Louis, Mo), GENTEST (BD).

Флюорометрические исследования проведены на флюориметре VersaFluor 1. (BioRad), колориметрические – на планшетном фотометре MultiskanPlus (Labsystems).

Содержание общего билирубина в сыворотке (мкМ/л) определяли по методу Иендрашика-Грофа, используя стандартный набор реагентов “БИЛИРУБИН-НОВО” (Вектор-Бест, г. Новосибирск).

Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке оценивали кинетическим методом при 25оС на анализаторе Reflotron (Roche), используя стандартные тест - полоски REFLOTRON GPT (“сухая” химия).

Содержание малонового диальдегида (МДА) исследовали биохимическим методом, предложенным И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили [1977].

Статистическую обработку результатов исследования проводили стандартными методами вариационной статистики в рамках программного обеспечения Statistica для Windows, версия 6.0. Для отрицания “нулевой” гипотезы использовались, в зависимости от характера распределения, групповой t-критерий Стьюдента для независимых признаков или параметрические критерии различии. Различия между группами считались статистически значимыми при Р0,05. При Р0,10 различия расценивались как тенденция к увеличению или снижению значений [ Трахтенберг и соавт., 1991].

Результаты исследования и их обсуждение.

В первой серии экспериментов было изучено влияние ронколейкина при его введении крысам в различных дозах и режимах на показатели гемограммы периферической крови, пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах, фенотипические особенности Т-лимфоцитов периферической крови, а также гистологическую структуру печени и конститутивные монооксигеназные активности.

При введении в максимальной дозе (5 x 106ед./кг) ронколейкин вызвал статистически значимый лейкоцитоз (содержание лейкоцитов увеличивалось на 52, %, P=0,03), однако существенного изменения структуры лейкограммы не наблюдалось. Введение рекомбинантного цитокина в дозе 2,5 x 106 ед./кг не приводило к нарастанию числа лейкоцитов в целом, но значимо изменялась структура гемограммы: нарастало процентное содержание лимфоцитов, а доля моноцитов и палочкоядерных гранулоцитов достоверно снижалась. При однократном введении в дозе 1 x 106 ед./кг статистически значимых изменений числа лейкоцитов и структуры гемограммы по сравнению с контрольной группой животных ронколейкин не вызывал. При дальнейшем снижении дозы (5 x 105 ед./кг) вновь наблюдался лейкоцитоз (число лейкоцитов возрастало на 34 %, P=0,04), причем при последующем снижении дозы цитокина эта тенденция сохранялась, но статистически значимых различий с контролем не было. При введении в дозе 5 x 105 ед./кг изменений структуры гемограммы не было, но введение в 2,5 x 105 ед./кг ронколейкина вызывало стимуляцию гранулоцитопоэза (возрастало процентное содержание молодых и зрелых форм гранулоцитов и уменьшалась “доля” лимфоцитов). Введение ронколейкина в дозе 1 x 105 ед./кг не вызвало статистически значимых изменений гемограммы, а введение в минимальной дозе приводило к снижению содержания лимфоцитов. Трхкратное ежедневное введение препарата в дозе 1 x 105 ед./кг не изменяло структуры гемограммы.

Аналогичные данные были получены при анализе относительного содержания клеток в регионах мононуклеаров и гранулоцитов, полученных при анализе параметров светорассеяния клеток на проточном цитофлюориметре. В этом случае статистически значимое возрастание относительного содержания клеток в регионе гранулоцитов наблюдалось в группе животных, получавших ронколейкин в дозе 2, x 105 ед./кг, в остальных случаях значимых различий не было.

Таким образом, влияние рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) на показатели лейкограммы интактных крыс при его однократном внутрибрюшинном введении в диапазоне доз от 6 х 104 ед./кг до 5 х 106 ед./кг не характеризуется ни прямой, ни обратной доза - зависимостью. Интерпретация полученных данных достаточно сложна, поскольку ИЛ-2, будучи продуктом активированных Т-лимфоцитов, контролирующим их экспансию и пролиферацию, обеспечивает не только “цитокиновую поддержку” Т-клеточного иммунного ответа, но и индуцирует продукцию других цитокинов (особенно в высоких дозах), в частности, гематопоэтических колониестимулирующих факторов и цитокинов-регуляторов гемопоэза (ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-5), провоспалительных цитокинов ФНО, ИЛ-1, ИЛ- [Возианов и cоавт., 1998; Ветра и соавт., 2000; Ярилин, 2000; Le Gros et al., 1987;

Kupper et al., 1987; Cuturi et al., 1989; Warren et al., 1996; Mehrotraet al., 1998].

Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов, - в зависимости от дозы, состояния иммунной системы, режима введения ИЛ-2 может вызвать разноплановые изменения гематологических показателей [Егорова и соав., 1999; Козлов, 2002; Hladik et al., 1994; Elias et al., 2004; Morgan et al., 2005]. Не исключено, к примеру, что наблюдаемый при введении высокой дозы ронколейкина лейкоцитоз является следствием индукции выброса провоспалительных цитокинов.

Для более детальной характеристики иммунотропного эффекта далее была изучена пролиферативная активность и апоптоз клеток лимфоидных органов (тимус и селезенка) после однократного введения рекомбинантного цитокина.

При однократном внутрибрюшинном введении в диапазоне доз от 2,5 x ед./кг до 5 x 10 5 ед./кг ронколейкин статистически значимо не влиял на пролиферативную активность и апоптоз спленоцитов. При введении в дозе 1 x ед./кг ронколейкин вызывал статистически значимое снижение величины диплоидного пика на цитофлюорограммах (Р=0,01), т.е. количества клеток, находящихся в фазе покоя и пресинтетической фазе клеточного цикла (G1/G0клеток). При этом наблюдалась тенденция к возрастанию величина SG2M - пика, что в совокупности свидетельствует о возрастании митотического потенциала клеток, а индекс пролиферации статистически значимо возрастал (рисунок 2). Дальнейшее снижение дозы цитокина в диапазоне от 5 x 105 ед/кг до 1 x 105 ед/кг существенно не изменяло митотической активности спленоцитов и их апоптоза. В минимальной дозе (6 x 104 ед/кг) вновь проявлялось активирующее влияние ронколейкина на митогенез спленоцитов.

В диапазоне доз от 2,5 x 10 6 ед./кг до 5 x 105 ед./кг ронколейкин статистически значимо не влиял на пролиферативную активность и апоптоз тимоцитов. Однако, при снижении дозы (2,5 x 10 5 ед./кг и 1 x 105 ед./кг) проявлялось отчетливое тимусстимулирующее действие препарата - ронколейкин статистически значимо увеличивал величину SG2M - пика и, следовательно, количество митотически активных клеток.

Рисунок 1. Цитофлюорограммы, иллюстрирующие ДНК-структуры клеточного цикла и апоптоза тимоцитов и спленоцитов, окрашенных йодистым пропидием (FACSCalibur) M1 - гиподиплоидные (апоптотирующие) клетки; M2 - диплоидный пик (G0G1) Рисунок 2. Влияние ронколейкина на индекс пролиферативной активности тимоцитов и спленоцитов.

По оси ординат: показатели в % от таковых в контрольной группе (100%). По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - ронколейкин 2,5 х 10 6 ед./кг, 3 - ронколейкин 1 х ед./кг, 4 - ронколейкин 5 х 105 ед./кг, 5 - ронколейкин 2,5 х 105 ед./кг, 6 - ронколейкин 1 х 105 ед./кг, 7 - ронколейкин 6 х 104 ед./кг При этом содержание клеток, находящихся в фазе покоя, имело тенденцию к снижению, а индекс пролиферации значимо возрастал. В минимальной дозе (6 x ед/кг) наблюдаемая закономерность сохранялась, однако различия не были статистически значимы. Уже в ранних работах было показано, что ИЛ-2 является ключевым цитокином, контролирующим развитие тимоцитов, обеспечивающим их пролиферацию и защищающим от апоптоза, функцию ЭКТ [Ярилин, 1999; Kintzel et al., 1991].

Ранние тимоциты экспрессируют рецептор к ИЛ-2 и мРНК ИЛ-2, а добавление экзогенного ИЛ-2 в культуры фетальных тимоцитов или его введение индуцирует пролиферацию тимоцитов [Toribio et al., 1989; Maslinski et al., 1992; Varas et al., 1997].

Судя по полученным данным, оптимальный тимус-стимулирующий эффект при экзогенном введении рекомбинантного цитокина проявляется при использовании невысоких доз препарата, что согласуется с данными других исследователей [Varas et al., 1997]. Закономерен активирующий эффект рИЛ-2 на клетки периферических лимфоидных органов. Очевидно, что “отвечающими” клетками в этом случае являются как зрелые примированные Т-лимфоциты, для которых ИЛ-2 является фактором экспансии [Ярилин, 1999], так и, опосредованно, В-лимфоциты. Не удивительно, что дозовая зависимость влияния ронколейкина на спленоциты иная, нежели для клеток тимуса.

Одним из ведущих, клинически значимых эффектов ИЛ-2 при его введении пациентам с иммунологической недостаточностью является восстановление субпопуляционной структуры Т-лимфоцитов [De Paoli, 2001]. В этой связи, представлялось особо интересным оценить характер влияния ронколейкина на субпопуляционную структуру Т-лимфоцитов периферической крови, а также экспрессию -цепи рецептора к ИЛ-2 на CD3+Т-лимфоцитах, как показателя активации Т-клеток. В этих экспериментах ронколейкин вводили в дозах, обеспечивающих тимус-стимулирующий эффект, 2,5 x 10 5 ед./кг и 1,0 x 105 ед./кг.

Результаты иммунофенотипирования представлены на рис. 3.

При введении в дозе 2,5 x 10 5 ед./кг содержание CD4+ Т-лимфоцитов практически не изменялось, а при введении меньшей дозы (1,0 x 10 5 ед./кг) ронколейкин вызывал тенденцию к увеличению содержания CD4+ Т-хелперов, однако достоверных различий с контрольной группой животных не было.

Содержание CD3+CD8+ лимфоцитов в группах животных, получавших ронколейкин, по сравнению с контрольной группой также не изменялось. В то же время, при введении рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 2,5 x 105 ед./кг прослеживалась отчетливая тенденция (P=0,07) к увеличению содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих цепь рецептора к ИЛ-2 (CD3+CD25+ лимфоцитов) в периферической крови, а при введении препарата в дозе 1,0 x 105 ед./кг содержание CD25-экспрессирующих Тлимфоцитов возрастало почти в 2 раза, и различия с контрольной группой были статистически значимы. Полученные результаты подтверждают иммунотропный эффект рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина), при его введении в невысоких дозах направленный на индукцию Т-клеточных механизмов.

Рисунок 3. Влияние ронколейкина на содержание основных субпопуляций Тлимфоцитов (CD3+CD4+ и CD3+CD8+) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих -цепь рецептора к ИЛ-2 (CD3+CD25+) в периферической крови контрольных крыс и крыс, получавших различные дозы препарата.

Вверху: Цитофлюорограммы, иллюстрирующие анализ субпопуляций CD3+CD4+ лимфоцитов и CD3+CD25+ лимфоцитов в периферической крови контрольной крысы, и крысы, получавшей Ронколейкин Внизу: Показатели в % от таковых в контрольной группе - 100 % В целом, данные, полученные в результате анализа иммунотропных свойств рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) при его однократном внутрибрюшинном введении интактным крысам, демонстрируют, что эффект рекомбинантного цитокина в значительной мере зависит от дозы. Причм иммуностимулирующее действие проявляется при введении относительно невысоких доз препарата, в диапазоне от 6 x 104 до 2,5 x 105 ед./кг, что проявляется усилением пролиферативного потенциала спленоцитов или тимоцитов, тенденцией к нарастанию CD4+ Т-лимфоцитов в циркуляции, возрастанию числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих -цепь ИЛ-2Р.

На следующем этапе исследований были оценены гистоморфологические изменения в печени при введении ронколейкина. Через 24 часа после введения ронколейкина в дозе 5 x 106 ед./кг, на обзорных препаратах печени в отличие от крыс контрольной группы часто встречались гипертрофированные ядра гепатоцитов с одним или двумя ядрышками. А при введении ронколейкина в дозах 2,5 x 106 ед. /кг в венозных сосудах определялись умеренные признаки стаза крови. При введении ронколейкина в диапазоне доз от 1 x 106 ед. /кг до 5 x 105 ед. /кг изменения гистологической структуры печени были несколько более выражены, чем при его введении в высоких дозах. На некоторых срезах отмечались признаки мелковакуольной жировой дистрофии цитоплазмы гепатоцитов в области отдельных портальных трактов и явления застоя плазмы крови в отдельных центральных венах. В таких участках синусоиды вокруг центральных вен несколько расширялись.

При введении ронколейкина в диапазоне доз от 2,5 x 105 до 1 x 105 ед./кг описанные изменения сохранялись: в печени нередко обнаруживались участки клеток с вакуолизированной цитоплазмой, хотя при этом структура ядер в клетках не изменялась (рис. 4). В перипортальных областях иногда обнаруживались небольшие по площади лимфоцитарные инфильтраты. В портальных кровеносных сосудах таких участков выявлялись признаки стаза элементов крови, синусоиды были расширены.

Желчные протоки и крупные кровеносные сосуды не изменялись.

Рисунок 4.Гистологическая структура печени крыс при введении ронколейкина в В минимальной дозе 6 x 104 ед. /кг ронколейкин вызвал неоднородные морфологические изменения в печени. Большей частью паренхима печени состояла из мелких равномерно окрашивающихся гепатоцитов, выстроенных в характерные балочные структуры. Ядра печеночных клеток с крупными глыбами хроматина были четко очерчены. Дистрофические изменения в цитоплазме гепатоцитов не обнаруживались. В синусоидах хорошо просматривались веретеновидные синусоидальные клетки. Обращали на себя внимание признаки стаза крови в отдельных портальных венах и артериях. В таких зонах паренхимы печени, где эти явления наблюдались, синусоидные капилляры были расширены и содержали элементы крови. В некоторых участках печени, независимо от локализации в дольке, выявлялась мелкоочаговая пролиферация купферовских клеток.

Таким образом, введение рекомбинантного ИЛ-2 - ронколейкина вызвало умеренные изменения гистологической структуры печени, максимально выраженные именно при введение низких доз цитокина, т.е. имелся определенный параллелизм между иммунотропным эффектом. Существенно, что описываемые морфологические изменения не сопровождались негативной динамикой биохимических показателей активность сывороточной аланинаминотрансферазы (АЛТ), уровень общего билирубина, а также содержание малонового диальдегида в гомогенатах печени крыс, получавших ронколейкин по сравнению с контрольной группой животных, оставались неизменными, независимо от дозы введенного цитокина. Отсутствие повреждений гепатоцитов выгодно отличает ронколейкин от рекомбинантных интерферонов и рекомбинантных провоспалительных цитокинов. Введение рекомбинантных интерферонов, как в экспериментальных условиях, так и в клинических ситуациях, вызывает развитие синдрома цитолиз гепатоцитов, а введение высокой дозы рекомбинатного ИЛ-1 (6 x 106 ед./кг) вызывает выраженную дистрофию гепатоцитов и резкое нарушение внутрипечночной гемоциркуляции Ахматов А.Т., Сибиряк С.В., 2004; Shibayama, 1992; Wang et al., 1995; Shirasugi et al., 1997; Bradham et al., 1998.

Для анализа влияния ронколейкина на функциональную активность монооксигеназной системы печени были использованы субстраты, позволяющие судить о монооксигеназной активности изоформ цитохрома Р450, различающихся по механизмам транскрипционной регуляции экспрессии генов и регуляции монооксигенирования.

Метаболизм этоксирезоруфина - О-деэтилирование осуществляется, в основном, изоформами цитохрома CYP1A1 и CYP1A2, которые отвечают преимущественно за трансформацию полициклических планарных соединений [Щербаков и соавт., 1994; Guengerich et al, 1982; Ryan et al., 1990]. Особенностью этих изоформ является то, что регуляция транскрипции генов этих изоформ осуществляется через арилуглеводородный рецептор (Ah-рецептор) [Nebert et al., 2004]. При введении ронколейкина в высоких дозах 5 x 106 ед./кг и 2,5 x 106 ед./кг статистически значимых изменений CYP1A1-зависимой ЭРОД-активности по сравнению с контрольными группами не было (рисунок 5). При введении ронколейкина в дозе 1 x 106 ед./кг, скорость монооксигенирования этоксирезоруфина несколько снижалась, при дальнейшем снижении дозы до 5 х 10 5 наблюдалось нарастание ЭРОД-активности (статистически достоверных отличий от контроля не было, из-за значительной вариабельности результатов). Однократное введение препарата в дозы 2,5 x 105 ед./кг вызвало достоверную индукцию ЭРОД-активности (рис. 5). При дальнейшем снижении дозы ЭРОД активность оставалась повышенной, по сравнению с контрольной группой, но достоверных отличий не было. Таким образом, влияние ронколейкина на активность Ah-рецептор-зависимых изоформ цитохрома Р450 зависело от дозы, угнетающего эффекта выявлено не было, более того, рИЛ-2 вызывал индукцию цитохрома Р450.

Использование дибензилфлюоресцеина в качестве селективного субстрата для оценки монооксигенирования, осуществляемого подсемействами изоформ цитохрома Р450 CYP2C и CYP3A предложено сравнительно недавно [Stresser et al., 2000; 2002].

Рисунок 5. Влияние ронколейкина на монооксигеназные активности в S-12 фракции гомогенатов печени крыс.

Показатели представлены в % к контрольным значениям. По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - ронколейкин, 5 х 106 ед./кг, 3ронколейкин 2,5 х 106 ед./кг, 4 - ронколейкин 1 х 106 ед./кг, 5 - ронколейкин 5 х 105 ед./кг, 6 - ронколейкин 2,5 х 105 ед./кг, 7 ронколейкин 1 х 105 ед./кг, 8 - ронколейкин 6 х 104 ед./кг При этом, как уже отмечалось, что в отличие от человека, у которого в гепатоцитах преобладает экспрессия изоформ CYP3A (CYP3A4), у крыс преобладает экспрессия изоформ СYP2C (CYP2C6/7). Транскрипционная регуляция генов CYP2C и CYP3A сопряжена с ядерными “orphan” рецепторами (PXR, CAR, RXR) [Quttrochi, Guselian, 2003]. В диапазоне доз от 5 до 2,5 x 106 ед./кг ронколейкин не изменял ДБФДактивности. При введении препарата в дозе 1 x 106 ед./кг скорость монооксигенирования дебензилфлюоресцеина несколько возрастала, однако статистически значимых различий с контрольной группой не было. При снижении дозы до 5 х 105 ед./кг наблюдалось незначительное снижение ДБФД-активности, а при введении в дозах 2,5 x 10 5 ед./кг и 1 x 105 ед./кг отмечалась статистически значимое снижение CYP2С-зависимой ДБФД-активности. Однократное введение ронколейкина в дозе 6 x 104 ед./кг не вызвало статистически значимых изменений.

Полученные результаты свидетельствуют, что введение ронколейкина в невысоких дозах угнетает у крыс CYP2C-зависимое монооксигеирование.

N-деметилирование эритромицина селективно осуществляется изорформами подсемейства CYP3A [Guengerich et al, 1982; Ryan et al., 1990; Hines et al., 2001;

Quattrochi et al., 2001]. Характер изменения эритромицин-N-деметилазной активности (ЭРНД) при введении Ронколейкина в различных дозах иллюстрирует рисунок 5.

Видно, что статистически значимых изменений скорости деметилирования эритромицина в субмитохондриальной фракции гомогенатов печени не было, независимо от дозы введнного цитокина.

Гидроксилирование р-нитрофенола осуществляется, изоформой CYP2Е1, которая отвечает преимущественно за трансформацию низкомолекулярных ксенобиотиков - спиртов, кетонов, а также четырххлористого углерода, бензола, толуола, анилина [Сибиряк и соав., 2003; Guengerich et al, 1982; Ryan et al., 1990;

Morel et al., 2000]. Изоформа CYP2E1 является, в некоторой мере, уникальной, поскольку железо гема цитохрома находится в ней исходно в высокоспиновом состоянии. Для индукции этой изоформы нет необходимости в синтезе белка de novo, а в процессе индукции, CYP2E1 генерирует свободные радикалы и является одной из наиболее “прооксидантных” изоформ [Щербаков и соавт., 1994; Гуляева и соавт., 1994, 1997; Morel et al., 2000]. Роль CYP2E1 в организме очень важна, учитывая участие в биосинтезе регулирующих сосудистый тонус производных арахидоновой кислоты [Сибиряк и соавт., 2006]. При введении в максимальной дозе (5 x 106 ед./кг) ронколейкин статистически значимо, резко, снизил CYP2Е1-зависимую ПНФГактивность. При введении в дозе 2,5 x 106 ед./кг ронколейкин не изменял интенсивности метаболизма p-нитрофенола. При дальнейшем снижении дозы постепенно нарастало угнетающее воздействие: в дозах 1 x 106 ед./кг и 5 x 105 ед./кг ронколейкин вызывал тенденцию к снижению ПНФГ-активности, а при ведении в дозах 2,5 x 105 ед./кг и 1 x 105 ед./кг статистически значимо снижал ПНФГактивность. При введении в минимальной дозе рекомбинантный цитокин не изменял биотрансформации p-нитрофенола. Таким образом, введение рИЛ-2 оказывало однонаправленный ингибиторный эффект на монооксигеназную активность, реализуемую изоформой CYP2E1.

Суммируя результаты проведенных исследований можно заключить, что введение дрожжевого рекомбинантного IL-2 (ронколейкина) изменяет состояние цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы печени, причм характер влияния цитокина на конституитивную активность тех или иных изоформ неоднозначен и определяется дозой введения цитокина. На основании полученных данных можно говорить о параллелизме между иммунотропными и гепатотропными эффектами рИЛ-2 - наиболее отчетливо влияние рИЛ-2 проявлялось именно при введении невысоких доз препарата, которые обеспечивают иммунотропный эффект и его влияние на Т звено иммунитета. Этот факт хорошо согласуется с современным представлением о тесной связи между иммунной и монооксигеназной системами, которые можно рассматривать как систему “иммунохимического гомеостаза” [Ковалев и соавт., 1994; Сибиряк и соавт., 2003; 2006].

Наши результаты свидетельствуют об индуцирующем воздействии рИЛ-2 на изоформы подсемейства 1А, отсутствии влияния на изоформы подсемейства CYP3A и преимущественно ингибиторном воздействии на изоформы подсемейства CYP2C и CYP2E. Эти данные частично противоречат результатам, полученным другими исследователями. Обнаружено, что бактериальный рИЛ-2 при введении крысам (1ед./кг) или мышам (50 000- 250 000 ед./мышь) приводит к удлинению гексобарбиталового сна, угнетению метаболизма бензпирена, этилморфина, этоксирезоруфина, амидопирина, бензфетамина, пентоксирезоруфина, эритромицина, активности эпоксидгидролазы. Это сопровождается падением суммарного уровня цитохрома Р450 в микросомах печени и белков изоформ, относящихся к различным подсемействам (CYP1A, 2B, 2C, 2D, 3A) [Ansher et al., 1992; Abdel-Razzak et al., 1993;

Thal et al., 1994].

По данным Tinel и соавторов [1995, рИЛ-2 снижает уровень иммунореактивных белков CYP1A2, 2B1/2, 2С11, 3А2, 2D1. Этот эффект устраняется введением в среду антител против ИЛ-2P или ингибитором тирозинкиназы генистеином. В то же время, некоторые исследования подтверждают полученные нами данные и свидетельствуют о способности рИЛ-2 индуцировать дебризохин и буфуралол-гидроксилазы (CYP2D), 7-этоксикумарин-О-деэтилазу (CYP1A1/2) и бензферамин-N-деметилазу [Morgan, 2001]. Нельзя не обратить внимание и на различные технологии получения рекомбинантных бактериальных и дрожжевых цитокинов. В чем причина разнопланового влияния ронколейкина на цитохром Р450?

Влияние цитокинов на монооксигеназы, в конечном счете, связано с изменением транскрипции генов различных изоформ. В свою очередь, механизмы транскрипционной регуляции генов различных изоформ неодинаковы. Это механизмы, связанные с ретиноид-X-рецептором активируемыми индукторами пролиферации пероксисом [Ge et al., 1998; Denison et al., 1995; Savas et al., 1999;

Aranda et al., 2001; Hines et al., 2001; Quattrochi et al., 2001; Kliewer et al., 2001]. В свою очередь, различные цитокины имеют индивидуальные сайты связывания в регуляторных участках генов изоформ, или контролируют активность транскрипционных факторов [Сибиряк и соавт., 2006]. Способность к связыванию зависит от дозы цитокина Hakkola et al., 2001].

Одной из точек приложения влияния рИЛ-2 на активность AhR-зависимых монооксигеназ может быть сигналлинг, связанный с ретинобластомным белком (Rb).

Наличие в домене арилуглеводородного рецептора субъединицы LXCXE, ответственной за взаимодействие с основным белком, контролирующим переход клетки из G1 в S фазу - белком ретинобластомы Rb, обеспечивает возможность контроля клеточного цикла при активации AhR [Hines et al., 2001; Ge et al., 1999]. В покоящихся клетках, ретинобластомный белок находится в гипофосфорилированном (активном) состоянии, для перехода клеток в фазу синтеза, необходима инактивация этого белка путем гиперфосфорилирования циклин-зависимыми киназами. Активация арилуглеводородного рецептора приводит к освобождению ингибитора циклинзависимых киназ и нарушению процесса гиперфосфорилирования ретинобластомного белка, в результате чего не происходит освобождения субъединицы E2F, контролирующей транскрипцию генов фазы синтеза и остановка клеточного цикла [Hines et al., 2001; Kolluri et al, 1999]. Не менее решающим для судьбы клеток является взаимодействие арилуглеводородного рецептора и транскрипционного фактора NFB [Tian et al, 1999]. В свою очередь, механизмы регуляции клеточного цикла ИЛ-2 в иммунокомпетентных клетках, тесно сопряжены с системой Rb-зависимого контроля клеточного цикла [Kolenko et al., 1997; Flores et al., 1999; Ertesvag et al., 2002; Colombetti et al., 2006].

Каковыми бы не были механизмы влияния, с прикладной точки зрения важно, что в рамках комбинированной фармакотерапии с использованием цитокинов и, в частности, ронколейкина, возможно нарушение фармакокинетических параметров лекарств, метаболизируемых различными изоформами цитохром Р450, следовательно, и изменение их фармакодинамики и токсичности.

Гепатотропные и иммунотропные эффекты ронколейкина в условиях индукции токсического поражения печени:

В настоящее время ронколейкин активно используется в терапии вирусных гепатитов [Лобзин и соавт., 2000]. В то же время, результаты проведенных экспериментов, в частности, выявленная способность ронколейкина ингибировать CYP2E1-зависимое монооксигенирование при введении в дозах, одновременно обеспечивающих иммунотропный эффект, закономерно поставили вопрос о возможности использования рИЛ-2 при таком токсическом поражении печени, при котором существенное патотоксикологическое значение имеет индукция CYP2E1, к примеру, CCl4-индуцированном гепатит. Известно также, что формирование CCl4индуцированного гепатита сопровождается выраженной иммуносупрессией [Horn et al., 2000].

Четырехкратное введение CCl4 вызывало формирование токсического поражения печени, что было документировано как морфологически, так и при оценке биохимических показателей. На обзорных срезах печени отчетливо прослеживались резкая вакуолизация гепатоцитов, появлялись очаги некроза, нарушалась архитектоника печеночной паренхимы, наблюдалась резкая перивазальная инфильтрация и геморрагическое пропитывание паренхимы печени.

Введение ронколейкина на фоне индукции токсического гепатита существенно не изменяло патогистологической картины (рис 6).

Рисунок 6. Гистологическая структура печени крысы, получавшей CCl4 и В группе крыс, получавших CCl4, более чем 6-ти кратно возрастала активность сывороточной АЛТ (298,2 ± 56,0 МЕ/л, против 42,2 ± 4,1 МЕ/л в контрольной группе, P 0.05), что свидетельствовало о цитолизе гепатоцитов. В гомогенатах печени возрастало содержание конечного продукта липопероксидации, - МДА (0, 104 ± 0, нМ/мг против 0, 053 ± 0,006 нМ/мг в контрольной группе, Р 0.05). Ронколейкин, при введении на фоне четыреххлористого углерода снижал содержание МДА (0, 053 ± 0,006 нМ/мг, P 0.05 в сравнении с группой, получавшей только CCl4)однако активность АЛТ была практически идентична таковой в группе крыс, получавших только CCl4 (266,9 ± 60,8 МЕ/л).

Ведение CCl4, приводило к глубокой депрессии ЭРОД-активности, ДБФДактивности, ЭРНД-активность имела тенденцию к снижению, а ПНФГ-активность значимо возрастала (рис. 7). Причем имелась высокая ранговая корреляция между уровнем ПНФГ-активности и уровнем МДА в контрольной группе (Rsp=0.70, P=0.01), что подтверждает роль CYP2E1 как источника свободных радикалов. Депрессия остальных видов активности связана, скорее всего, с повреждением гепатоцитов и свидетельствует о глубоком нарушении функциональной активности печени.

Рисунок 7. Изменение монооксигеназных активностей в субмитохондриальной фракции печени крыс при токсическом поражении, вызванном четыреххлористым углеродом, и при введении ронколейкина интактным крысам и на фоне CCl4.

Введение ронколейкина на фоне четыреххлористого углерода приводило к усилению депрессии CYP1A1/2-зависимой ЭРОД активности, CYP2С-зависимой эритромицина, существенно не изменялась. Что касается CYO2E1-зависимой ПНФГактивности, то сам ронколейкин, как и в предшествующем эксперименте, ингибировал ее и устранял индукцию, вызванную CCl4.

Развитие токсического гепатита сопровождалось иммуносупрессией, - CCl вызывал значимое усиление апоптоза спленоцитов и супрессию митогенеза тимоцитов Ронколейкин устранял апоптогенный эффект четыреххлористого углерода на спленоциты, но усиливал антимитотическое воздействие токсиканта на тимоциты (табл. 1).

Таким образом, вопреки ожиданиям, ронколейкин при введении на фоне токсического CCl4- индуцированного гепатита несмотря на снижение индукции изоформы цитохрома Р450 CYP2E1 и, как следствие, уменьшение липопероксидации в печени, не препятствовал повреждению печени, потенцировал угнетающее воздействие четыреххлористого углерода на другие изоформы цитохрома, усугублял функциональную недостаточность гепатоцитов. В последние годы установлено, что механизмы формирования CCl4- индуцированного гепатита связаны не только, и не столько, с генерацией свободных радикалов, но с “цитокиновым” повреждением гепатоцитов. Гепатотропные яды (CCl4 и диметилнитрозамин) индуцируют в печени продукцию ФНО, экспрессию апоптогенных ФНО-рецепторов 1 типа [Horn et al., 2000], индуцируют гибель гепатоцитов по механизму, связанному с экспрессией апоптогенного белка p21 [Serfas et al., 2006].

Как бы то ни было, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование ронколейкина при токсических поражениях печени вряд ли целесообразно, а явления токсического гепатита могут рассматриваться, как противопоказания к применению этого цитокина.

Влияние четыреххлористого углерода, ронколейкина и их комбинированного введения на показатели апоптоза и митогенеза спленоцитов и тимоцитов крыс животных (n) относительное содержание относительное содержание (M1-пик) (M2-пик) (M3-пик) (M1-пик) (M2-пик) (M3-пик) 1.Контроль (n = 12) 2.ССl4, четырехкратно, п/к, (n = 18) 3.Ронколейкин, однократно, 1 x 105 ед/кг (n = 10) 4.ССl4 + Ронколейкин (n = 12) Примечание: M1 – гиподиплоидный пик - апоптотирующие клетки; M2 диплоидный пик (G0G1) – покоящиеся клетки; M3 – пик (SG2M) – клетки, находящиеся в фазе синтеза ДНК и митотическом цикле.

Компьютерная программа прогноза изменений биотрансформации фармакологических препаратов в условиях комплексной цитокино- и фармакотерапии Программа разработана для платформы Microsoft.NET 2.0 с применением технологии ADO.NET 2.0 в среде Microsoft Visual Studio 2005 (рис. 8). Для долговременного хранения данных используется технология XML. Для работы программы необходимо наличие Microsoft.NET Framework 2.0. Работа программы состоит из циклов запросов пользователя к данным и ответов программы. В качестве долговременного хранилища используемых данных выступают файлы в формате XML. При запуске данные загружаются в память, после чего пользователь посредством оконного интерфейса может формировать параметризованные запросы, анализировать результаты работы программы, а также изменять данные. В качестве базы данных о характере биотрансформации лекарств сведение представленные на сайтe http://www.dml.georgetown.edu. Первый этап работы программы предполагает работу исследователя, который в режиме диалогового окна “Данные ” вводит интересующие его изоформы, интересующий препарат цитокинов, а также, на основании собственных исследований или данных литературы характер воздействия препарата цитокинов на ту, или иную изоформу цитохрома Р450 (рис. 9).

Рисунок 8. Работа в диалоговом окне “Данные” компьютерной программы для изучения взаимодействия рекомбинантных цитокинов и других фармакологических препаратов на уровне окислительного метаболизма В режиме “Данные - изоформы цитохрома” исследователь первоначально осуществляет ввод названия интересующих его изоформ цитохрома P450. Затем, в режиме диалогового окна “Данные - воздействующие препараты” осуществляется ввод названия воздействующего препарата и ввод характера влияния этого препарата на те, или иные изоформа цитохрома Р450. Использование соответствующих “управляющих клавиш” предполагает возможность добавления названий препаратов.

Далее, в рамках работы диалогового окна “Данные - Препараты” осуществляется запрос об особенностях окислительной биотрансформации того или иного препарата из списка, имеющегося в базе данных. При этом возможно дополнение списка с указанием характера их биотрасформации с помощью соответствующих “управляющих клавиш”.

Рисунок 9. Работа в диалоговом окне “Анализ” компьютерной программы для изучения взаимодействия рекомбинантных цитокинов и других фармакологических препаратов на уровне окислительного метаболизма Следующий этап работы программы предназначен как для самого исследователя, так и для пользователей. В рамках диалогового окна “Анализ” осуществляется ввод препарата цитокина и совместно вводимого препарата и выясняется характер фармакокинетической интерференции.

ВЫВОДЫ

1. Дрожжевой человеческий рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) при однократном введении крысам проявляет иммунотропное действие и изменяет клеточный состав крови. В зависимости от дозы ронколейкин индуцирует лейкоцитоз (5 x 106 ед./кг и x 105 ед. /кг), активирует лимфопоэз (2,5 x 106 ед./кг) или гранулоцитопоэз (2,5 x ед./кг), стимулирует митотический потенциал спленоцитов (1 x 10 6 ед./кг и 6 x ед/кг) и тимоцитов (2,5 x 105 ед/кг и 1 x 105 ед./кг), при введении в низких дозах ронколейкин вызывает тенденцию к увеличению содержания CD3+CD4+ Тлимфоцитов (1 x 105 ед./кг) в периферической крови и индуцирует экспрессию -цепи рецептора к ИЛ-2 на Т-лимфоцитах (2,5 x 105 ед/кг и 1 x 105 ед./кг).

2. Ронколейкин, при однократном введении, вызывает зависимые от дозы изменения гистологической структуры печени в виде умеренных дистрофических изменений гепатоцитов и инфильтрации паренхимы клеточными элементами крови, преимущественно мононуклеарного ряда. Эти изменения более выражены при введении низких доз ронколейкина (2.5 x 105 ед/кг и 1 x 105 ед./кг) и не сопровождаются повреждением гепатоцитов, холестазом и интенсификацией липопероксидации в печени.

3. Ронколейкин изменяет конституитивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в печени. Влияние ронколейкин на изоформы цитохрома Р различных подсемейств неодинаково и зависит от дозы: при введении в дозе 2,5 x этоксирезоруфина (ЭРОД-активность); в диапазоне доз от 1 до 2,5 x 105 ед./кг ронколейкин угнетает CYP2C-зависимое дебензилирование дибензилфлюоресцеина (ДБФД-активность); ронколейкин не изменяет интенсивности CYP3A-зависимого Nдеметилирования эритромицина (ЭРНД-активность); при введении в дозе 5x106 ед./кг, а также в диапазоне доз от 1 до 2,5 x 105 ед./кг ронколейкин угнетает CYP2E1зависимое гидроксилирование р-нитрофенола (ПНФГ-активность).

4. На фоне введения гепатотропного яда (четыреххлористого углерода) ронколейкин (1 x 105 ед./кг) устраняет индукцию CYP2E1 и снижает интенсивность липопероксидации в печени, но не препятствует повреждению паренхимы органа и потенцирует вызванное токсикантом угнетение монооксигеназ изоформ CYP1A1/2 и CYP2C.

5. Ронколейкин при введении на фоне гепатотропного яда не обеспечивает полноценной коррекции неблагоприятного воздействия четыреххлористого углерода на иммунную систему: ронколейкин уменьшает апоптогенное действие четырххлористого углерода на спленоциты, но не устраняет антимитотические воздействия токсиканта на тимоциты.

6. Разработана пользовательская программа, позволяющая прогнозировать изменение метаболизма и активности некоторых препаратов при их использовании в комплексной фармакотерапии с рекомбинантными цитокинами.

Практические рекомендации:

При назначении рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) в рамках комплексной фармакотерапии желательно учитывать особенности биотрансформации совместно вводимых препаратов, и в зависимости от изменении их биотрансформации осуществлять коррекцию их терапевтической дозы. Применение рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) не целесообразно при токсических поражениях печени и токсические гепатозы являются противопоказанием для применения этого цитокина.

Список публикаций по теме диссертационной работы Шамова (Кидрасова) Е.Н. Влияние Ронколейкина на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах у крыс / Шамова (Кидрасова) Е.Н., Сибиряк С.В. // Рациональное использование лекарств: Мат. научн. практ.

Конференции – Пермь. - 2004. – Ч. 2. – С. 48 – 49.

Шамова (Кидрасова) Е.Н. Влияние человеческого рекомбинантного IL (Ронколейкина) на конституитивные монооксигеназные активности печени у крыс WAG/Rij / Шамова (Кидрасова) Е.Н., Сибиряк С.В., Нигматуллина Э.А. // Тез. XIII Росс. Национ. Конгр. “Человек и лекарство” – Москва. – 2006. – С. 126.

Кидрасова Е.Н. Иммунотропные эффекты человеческого рекомбинантного ИЛРонколейкина) у крыс и его влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени / Сибиряк С.В., Кидрасова Е.Н.// Вестник Уральской Медицинской академической науки. – 2006. - № 1. - С. 98 – 104.

Шамова (Кидрасова) Е.Н. Гепатотропные эффекты человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (Ронколейкина) у крыс / Шамова (Кидрасова) Е.Н., Сибиряк С.В., Нигматуллина Э.А. // Цитокины и воспаление. – 2005. – № 3. - С. 149.

Кидрасова Е.Н. Влияние человеческого рекомбинантного IL 2 (Ронколейкина) на цитохром Р450-зависимые монооксигеназные активности и фармакометаболизирующую функцию печени / Кидрасова Е.Н., Сибиряк С.В., Нигматуллина Э.А. // Иммунология Урала. – 2005. – № 1 (4) - С. 158 – 159.

Шамова (Кидрасова) Е.Н. Иммунотропные эффекты человеческого рекомбинантного IL 2 (Ронколейкина) у крыс / Шамова (Кидрасова) Е.Н., Сибиряк С.В., Вахитов В.А. // Тез. Межд. Конгр. “Иммунитет и болезни: от теории к терапии”.– Москва. – 2005. – С.56.

Кидрасова Е.Н. Отсутствие защитного эффекта Ронколейкина при поражении печени, вызванного гепатотропным ядом / Кидрасова Е.Н., Сибиряк С.В. // Вестник Уральской Медицинской академической науки. – 2006. - № 3 (1). - С. 85 - 87.

Кидрасова Е.Н. Характеристика функционального состояния печени и некоторые иммунологические показатели при введении Ронколейкина у крыс WAG/Rij в условиях токсического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом / Кидрасова Е.Н., Сибиряк С.В., Вахитов В.А. // Иммунология Урала. С. 15 - 16..

Шамова (Кидрасова) Е.Н. Изменение структуры гемограммы и субпопуляционной структуры лейкоцитов при введении Ронколейкина у крыс WAG/Rij / Сибиряк С.В., Шамова (Кидрасова) Е.Н., Юсупова Р.Ш. // Тез. Межд.

Конгр. “Иммунитет и болезни: от теории к терапии”.– Москва. – 2005. – С.56.



 
Похожие работы:

«СЕРГЕЕВА Светлана Владимировна ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ УПРАВЛЕНИЯ РИСКАМИ ЙОДДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ У ДЕТСКОГО НАСЕЛЕНИЯ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 14.02.01 – гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград - 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский университет имени В.И.Разумовского Министерства здравоохранения...»

«Жерноклеева Виктория Вадимовна РОЛЬ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ДИСПЛАЗИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В РАЗВИТИИ ОРТОПЕДИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА 14.01.08 – педиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград -2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко Министерства...»

«Липатова Ирина Степановна АЛЛОИММУНИЗАЦИЯ ГРУППОВЫМИ АНТИГЕНАМИ ЭРИТРОЦИТОВ (ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ И ПОПУЛЯЦИОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ) 14. 00. 29 – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН, г. Москва, филиале Дзержинская станция переливания крови Государственного учреждения здравоохранения Нижегородская...»

«ЗУРОЧКА Владимир Александрович ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА БЕСТИМ НА АКТИВНОСТЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO И ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ 14.00.36 – аллергология и иммунология 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2006 2 Работа выполнена в НИИ иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«Евдоченко Инесса Ивановна ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ ЭНДОМЕТРИЯ И СОСТОЯНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ЭНДОКРИННОМ БЕСПЛОДИИ У ЖЕНЩИН 14.00.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Томск – 2004 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Красноярской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской...»

«ПОЛИКАРПОВА Татьяна Сергеевна Гепаторенальный синдром при алкогольном циррозе печени: влияние полиморфизма генов и параметров ренин-ангиотензин-альдостероновой системы на течение и исход, эффекты вазопрессоров и альбумина. 14.01.04 – внутренние болезни 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2010 Работа выполнена на кафедре факультетской терапии медицинского факультета...»

«СМИРНОВ Олег Рудольфович ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКИ МУЛЬТИИНФАРКТНОЙ ДЕМЕНЦИИ И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЕЕ ТЕРАПИИ (Психиатрия – 14.00.18) АВТОРЕФЕРА Т диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 1992 -1 Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте психиатрии МЗ РФ Научный руководитель : доктор медицинских наук Е.Е.Букатина Официальные оппоненты :...»

«Чеботарь Анатолий Борисович Механизмы нарушений противоинфекционной защиты в раннем послеоперационном периоде у хирургических больных 14.00.16 – патологическая физиология 14.00.27 - хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Томск – 2005 1 Работа выполнена в ГОУВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Красноженов Евгений Павлович доктор...»

«ЧАРНАЯ МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ПРИ КАРДИОХИРУРГИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЯХ 14.00.16 – Патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2007 2 Работа выполнена в ГУ Российский научный центр хирургии имени акад. Б.В.Петровского РАМН Научный консультант : Дементьева Инна Иосифовна доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты : Шарова Юлия Алексеевна доктор биологических наук,...»

«СИМАКОВА Екатерина Станиславовна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ I ТИПА ПРИ ЛЕЧЕНИИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ 14.01.22 – ревматология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград – 2011 1 Работа выполнена в ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт...»

«БЕРКАЛОВ Михаил Юрьевич СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ НЕЙРОГУМОРАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПАЦИЕНТОВ ВО ВРЕМЯ АБДОМИНАЛЬНЫХ ОПЕРАЦИЙ В УСЛОВИЯХ СБАЛАНСИРОВАННОЙ АНЕСТЕЗИИ НА ОСНОВЕ КЕТАМИНА И НЕЙРОЛЕПТАНЕСТЕЗИИ. 14.00.37 – анестезиология и реаниматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2008 г. 2 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы. НАУЧНЫЙ...»

«БАЗАРОВА НАДЕЖДА ЦЫРЕНОВНА НООТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА НООФИТ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Улан-Удэ – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук Научный руководитель : Николаев Сергей Матвеевич – доктор медицинских наук, профессор...»

«ГРИШКОВ СЕРГЕЙ МИХАЙЛОВИЧ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНАЯ ТОМОГРАФИЯ В УТОЧНЕННОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ ПРЯМОЙ И СИГМОВИДНОЙ КИШКИ (14.01.13 – Лучевая диагностика, лучевая терапия 14.01.12 – Онкология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения России (директор – член-корреспондент РАМН, профессор Солодкий В.А.). Научные...»

«Донсков Александр Валерьевич МИКРОХИРУРГИЧЕСКИЙ КИШЕЧНЫЙ ШОВ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ ПРИ ЕЕ ПОВРЕЖДЕНИИ НА ФОНЕ ПЕРИТОНИТА (экспериментально-морфологическое исследование) 14.01.17 - Хирургия 14.03.01 - Анатомия человека АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства...»

«Капилетги Софья Гариевна ПРИМЕНЕНИЕ ТРАНСКРАНИАЛЬНОЙ МАГНИТНОЙ СТИМУЛЯЦИИ И ПЛАЗМАФЕРЕЗА В ТЕРАПИИ ДЕПРЕССИВНЫХ И ОБСЕССИВНО-КОМПУЛЬСИВНЫХ РАССТРОЙСТВ 14.00.18 - Психиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва 2003 Работа выполнена в отделе терапии психических заболеваний Московского научно-исследовательского института психиатрии МЗ РФ НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор медицинских наук, профессор С.Н.Мосолов ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:...»

«МУСАЕВА МЕХРИБАН ГУСЕЙН КЫЗЫ ОПТИМИЗАЦИЯ ПОДГОТОВКИ ПАЦИЕНТОКС БЕСПЛОДИЕМ ПРИ НЕУДАВШИХСЯ ПОПЫТКАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.00.01- Акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА 2009 2 Работа выполнена на кафедре акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии факультета первичной переподготовки врачей ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова Научный руководитель...»

«Челышева Екатерина Юрьевна КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОНИТОРИНГА МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОЛЕЙКОЗЕ 14.00.29 - Гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2007 4 Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук А.Г.Туркина кандидат биологических наук А.В.Мисюрин...»

«НОВИЧКОВА Елена Александровна ХАРАКТЕРИСТИКА ЭЛАСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СОСУДОВ И ВЕГЕТАТИВНОЙ РЕГУЛЯЦИИ У ЖЕНЩИН С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ В ПЕРИОД БЕРЕМЕННОСТИ 14.00.05 – внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Иваново 2009 Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ивановская государственная медицинская академия Федерального...»

«МАРЕНКО Екатерина Юрьевна ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДИАГНОСТИКИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ НА ЭТАПЕ ПЕРВИЧНОГО ЗВЕНА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ 14.01.08 – педиатрия 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Красноярск-2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа-Югра и в ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф....»

«ФАЙЗУЛЛАЕВ РАВШАН БАХОДЫРОВИЧ ГИГАНТСКИЕ АДЕНОМЫ ГИПОФИЗА (КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА, ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ) 14.00.28 – нейрохирургия АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК Москва - 2009 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН Научный консультант : Доктор медицинских наук, профессор Кадашев Борис Александрович Официальные оппоненты : доктор медицинских наук Лазарев Валерий...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.