WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЧЕРВОНЦЕВА

Алевтина Михайловна

ПОВРЕЖДЕНИЕ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ

В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ

ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗОВ

14.00.29 – гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук Научные руководители: член-корреспондент РАМН, профессор В.Г.Савченко доктор биологических наук Ю.А. Романов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.А.Масчан доктор биологических наук, профессор Н.С.Сергеева

Ведущая организация: Московский областной научноисследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Защита состоится “ 18 ” июня 2008 г. в час.

на заседании диссертационного Совета Д 002.042.01 при Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 125167, г. Москва, Новозыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Автореферат разослан “ 16 ” мая 2008г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

До настоящего времени химиотерапия остается основным методом лечения острых лейкозов. Несмотря на большое разнообразие цитостатических средств, базисными препаратами в терапии острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) являются цитозин-арабинозид (цитозар, цитарабин) и даунорубицин. Семидневная инфузия цитарабина в комбинации с трехдневным введением антрациклинового антибиотика является основой всех ныне существующих программ и проводится большинству больных на всех этапах терапии ОМЛ:

индукции, консолидации и поддержания ремиссии [Савченко, 1999]. Одним из прогрессивных методов лечения ОМЛ считается применение высоких доз цитарабина, благодаря чему удается существенным образом увеличить процент общей и безрецидивной выживаемости пациентов [Cassileth, 2005]. Использование высоких или средних доз цитарабина в сочетании с митоксантроном и идарубицином наиболее эффективно у больных с рецидивами и резистентными формами ОМЛ [Савченко, 2004; Tallman, 2005].

Поскольку основным в тактике современной химиотерапии острых лейкозов является принцип интенсификации лечения, риск возникновения различных осложнений со стороны многих органных систем (нервной системы, желудочно-кишечного тракта, печени и т.д.), включая сердечно-сосудистую, возрастает.

Сосудистый эндотелий является одной из основных тканевых систем организма человека. Покрывая всю поверхность сосудистого русла, эндотелий характеризуется высокой функциональной активностью и участвует в обменных процессах, регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток, формировании новых сосудов, работе свертывающей-противосвертывающей системы крови и т.д. [Cines, 1998].

Воздействие различных неблагоприятных факторов приводит к "дисфункции" эндотелия, следствием чего могут являться нарушения сосудистого тонуса, проявление признаков провоспалительных и протромботических изменений [Esper, 2006; Endemann, 2004].

В условиях in vivo эндотелий обладает сравнительно низкой пролиферативной активностью и относится к медленно обновляемым тканям [Hopson, 1984]. Однако, скорость его регенерации в отдельных участках сосудистого русла при некоторых состояниях (как патологических, так и физиологических) и воздействиях может значительно возрастать и достигать десятков процентов в сутки [Schwartz, 1977; Folkman, 1995]. По всей видимости, пролиферирующие и, в меньшей степени, покоящиеся эндотелиальные клетки могут становиться потенциальной мишенью для цитостатических препаратов, применяемых в терапии лейкозов. Кроме того, являясь внутренней оболочкой сосудов, эндотелий первым контактирует с препаратами, вводимыми в кровеносное русло: пиковые концентрации цитостатических препаратов, по-видимому, могут оказывать прямое повреждающее действие на эндотелиальные клетки. В то же время, эндотелий может обладать чувствительностью и к более низким концентрациям препаратов, длительное время находящихся в кровотоке [de Vos, 2004].

химиотерапевтических препаратов, достаточно широк: от асимптоматических флебитов до потенциально смертельных васкулопатий (вено-окклюзионная болезнь, тромботическая микроангиопатия) [Shahab, 2006]. При этом индуцированное токсическое воздействие на неполноценности [Баркаган, 2001]. Несмотря на то, что клинические проявления сосудистой патологии для многих препаратов хорошо известны, детальные механизмы ее развития в большинстве случаев изучены недостаточно.

В настоящее время лабораторная диагностика поражений сосудистого эндотелия в основном заключается в определении в крови растворимых маркеров, специфичных для эндотелиальных клеток (фактор Виллебранда, тромбомодулин, эндотелин-1, растворимые формы молекул клеточной адгезии и др.). Однако их содержание может зависеть от ряда сопутствующих патологий, не связанных с поражением эндотелия, что указывает на недостаточную достоверность их анализа [Borawski, 2001; Woywodt, 2004; Endemann, 2004].

определение уровня циркулирующих эндотелиальных клеток [Dignat-George, 2000].

Детекция клеток эндотелия в крови по совокупности специфичных маркеров позволяет оценить не только функциональные изменения и степень поражения эндотелия, но также и последующее его восстановление.

Цель исследования:

Основной целью данного исследования явилось изучение некоторых механизмов развития сосудистой патологии, обусловленной возможным повреждением эндотелиальных клеток в процессе цитостатической терапии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать экспериментальную модель для оценки эффектов цитостатических препаратов с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека.

2. Изучить влияние цитостатических препаратов с различным механизмом действия на пролиферацию, жизнеспособность эндотелиальных клеток и организацию монослоя эндотелия.

3. Исследовать функциональные изменения культивируемых эндотелиальных клеток при воздействии цитозин-арабинозида и даунорубицина, включая экспрессию различных периферической крови.

цитостатических препаратов in vitro.

циркулирующих эндотелиальных клеток в крови здоровых доноров и больных ОМЛ в процессе лечения.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые охарактеризовано влияние основных цитостатических препаратов (цитарабина и даунорубицина) и их сочетаний, применяемых в терапии больных ОМЛ, на структурные и функциональные особенности клеток эндотелия с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека. Оценено влияние препаратов на целостность монослоя и жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия.

Впервые установлено, что инкубация культивируемых клеток с цитозинарабинозидом вызывает ряд изменений, имеющих провоспалительную направленность:

усиливается экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (Е- и Р-cелектинов, периферической крови.

В ходе экспериментов in vitro удалось прояснить основные способы репарации поврежденного монослоя эндотелиальных клеток после воздействия цитостатических препаратов.

Отдельный раздел исследования был посвящен изучению повреждающего действия проводимой химиотерапии на эндотелий сосудов больных ОМЛ. Впервые методом проточной цитометрии проведено динамическое исследование содержания циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45-, CD146+/CD45- в крови цитостатических препаратов сопровождается увеличением содержания циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке, что подтвердило данные, полученные в экспериментальной модели in vitro.

миелотоксического агранулоцитоза в крови больных ОМЛ выявляются клеткипредшественники эндотелия, появление которых может быть связано с процессами функциональной активности этих клеток явились результаты культивирования мононуклеарных клеток крови, показавшие наличие колониеобразующих единиц эндотелия (КОЕ-Энд).

Полученные экспериментальные данные позволили расширить существующие представления о механизмах развития сосудистой патологии у больных на фоне проводимой химиотерапии. Детекция циркулирующих эндотелиальных клеток может иметь практическое значение в диагностике поражения эндотелия при использовании различных цитостатических препаратов в онкологической практике. Кроме того, определение исходного числа эндотелиальных клеток и динамический контроль их содержания в крови могут быть использованы в практическом здравоохранении для оценки эффективности противоопухолевого лечения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на заседании Проблемной комиссии ГУ ГНЦ РАМН (04.03.2008); 46-й Ежегодной конференции Американского общества гематологов (США, 2004); 25-й Международной гематологической школе (Москва, 2004);

Ежегодной сессии Международной ассоциации по клеточной терапии ISCT (Берлин, 2006);

Международном конгрессе «Моделирование болезней крови» (Лион, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезисных сообщения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 118 страницах и включает 22 рисунка, 4 таблицы и список литературы, содержащий 239 ссылок.

Положения, выносимые на защиту:

1. Препараты, применяемые в терапии острых лейкозов (цитозин-арабинозид и даунорубицин), оказывают различное по характеру повреждающее действие на эндотелиальные клетки человека in vitro.

2. Воздействие цитозин-арабинозида приводит к изменениям функциональных параметров культивируемых эндотелиальных клеток.

3. Цитостатическая терапия острых лейкозов индуцирует повреждение эндотелия in vivo, проявлением чего является выявление в крови пациентов циркулирующих эндотелиальных клеток.

4. Регенерация эндотелия после повреждения химиотерапевтическими препаратами in vitro и in vivo происходит за счет различных механизмов: изменения формы и размеров дифференцированных эндотелиальных клеток, а также пролиферации и вступления в дифференцировку колониеобразующих единиц эндотелия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток человека. Среда 199 с солями Эрла, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), сбалансированный солевой раствор Эрла, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), L-глутамин, пируват натрия, пенициллин-стрептомицин, трипсин-ЭДТА, фосфатный буфер Дульбекко (ФБД) были получены от фирмы GIBCO (США). Диспаза (нейтральная протеаза из B.Polymyxa), гепарин (натриевая соль), желатин (культуральной степени чистоты), бычий сывороточный альбумин (БСА) – произведены фирмой Sigma (США). Фактор роста эндотелиальных клеток (ECGS – Endothelial Cell Growth Supplement), выделенный из ткани мозга человека, был предоставлен Научно-практической лабораторией стволовых клеток человека ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Чашки Петри, культуральные планшеты, центрифужные пробирки, пипетки и другие расходные материалы для культивирования клеток – продукция фирм Corning (США) или Costar (Голландия).

Для получения первичных культур эндотелиальных клеток пупочной вены человека применяли метод Gimbrone et al. [1974] в модификации А.С.Антонова и соавт. [1981].

Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 10 минут при 600g, осадок ресуспендировали в среде культивирования (среда 199 с добавлением 25 мМ HEPES, Ед/мл пенициллина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% ЭТС, 25 мкг/мл ECGS и 5 Ед/мл гепарина) и высевали на предварительно покрытые 0,1% желатиной чашки Петри диаметром 100 мм. Культуры клеток помещали в СО2– инкубатор и выращивали при температуре +37С и 5% СО2. Через 18-24 часа культуры отмывали раствором Эрла и заменяли среду культивирования на свежую. В дальнейшем смены сред проводили через 2-3 суток.

После достижения клетками состояния конфлуэнтности культуры отмывали раствором Эрла, снимали трипсином-ЭДТА, ресуспендировали в свежей порции среды культивирования и в разведении 1:3 – 1:5 использовали для посадки под конкретные эксперименты. В работе использовали монослойные культуры 1-2 пассажа. Ежедневный контроль культур проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии (Diaphot-TMD, Nikon, Япония).

Моделирование химиотерапевтического воздействия in vitro. Для моделирования повреждающего действия на эндотелий в работе использовали два препарата: цитозинарабинозид и даунорубицин. Цитозин-арабинозид, относящийся к антиметаболитам, был представлен тремя фармацевтическими препаратами, использующиеся в нашей клинике:

цитозар (Upjohn&Pharmacia, Бельгия), алексан (Henrich MACK, ФРГ), цитарабин (Therabel Pharma, Бельгия). В качестве представителя антрациклиновых антибиотиков исследовали фармацевтический препарат даунорубицина – рубомицина гидрохлорид производства фирмы Лэнс-Фарм, Россия.

Исходные препараты разводили в стерильном растворе Эрла до концентрации мг/мл, разделяли на аликвоты и хранили при температуре -20С. Рабочие разведения получали путем непосредственного добавления расчетного количества препарата в среду культивирования или серией последовательных двукратных разведений. Диапазон концентраций в культуральной среде цитозин-арабинозида составлял – 10 нг/мл - 1 мг/мл;

даунорубицина - 0,1 мкг/мл - 0,1 мг/мл. В ряде экспериментов использовали сочетание различных концентраций обоих препаратов. После добавления препаратов среды морфологических и количественных изменений проводили ежедневно с помощью фазовоконтрастной микроскопии.

Оценка цитостатического и цитотоксического эффекта.

По числу прикрепленных клеток. Клетки высаживали в 24- или 48-камерные культуральные планшеты с плотностью порядка 103 клеток/см2 и культивировали до формирования монослоя. После 24-часовой инкубации с препаратами в исследуемом диапазоне концентраций эндотелиальные клетки отмывали раствором Эрла, фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на ФБД рН=7.2-7.4, окрашивали 0,1% водным раствором толуидинового синего, отмывали дистиллированной водой и высушивали. Для подсчета числа клеток применяли метод компьютеризированной видеомикроскопии [Романов, 2003;

Мерзликина, 2005; Romanov, 2007]. На распечатках нескольких случайно выбранных полей эндотелиальных клеток для каждой концентрации препаратов. За 100% принималось число клеток в контрольных культурах.

По включению меченого предшественника синтеза ДНК. Перед проведением эксперимента исходный концентрат бромодеоксиуридина (БДУ, Cell Labeling Kit, BRDU, Amersham, США) разводили в стерильной культуральной среде в соответствии с рекомендациями фирмыпроизводителя. Через 24 часа после добавления исследуемых препаратов в контрольные и опытные культуры эндотелиальных клеток добавляли БДУ и инкубировали на протяжении последующих 18 часов. Пролиферирующие клетки выявляли с помощью иммуногистохимии:

культуры отмывали раствором Эрла, фиксировали 15 мин охлажденным до -18С метанолом и высушивали. После регидратации культуры обрабатывали смесью нуклеазы и моноклональных антител к БДУ в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Дальнейшие этапы окрашивания проводили с использованием биотин-стрептавидинпероксидазной техники с применением набора реактивов Histoscan в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Monoclonal Detector Kit, Biomeda, США).

Результаты оценивали с помощью световой микроскопии.

Выявление колониеобразующих единиц эндотелия (КОЕ-Энд). Эксперименты выполняли в двух модификациях. В первом случае культуры эндотелия инкубировали по отдельности с цитарабином и даунорубицином в течение 7 суток. Смена культуральных сред на свежие и новые добавления препаратов проводились ежедневно. Затем культуры отмывали и заменяли среду культивирования на стандартную. Последующие смены сред производили через 48 часов. Динамическое наблюдение за морфологическими и количественными изменениями культур, а также выявление очагов клонального роста проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии на протяжении 4-х последующих недель.

прединкубированные с цитостатическими препаратами в течение 24-48 часов и 5-7 суток культуры эндотелиальных клеток снимали трипсином-ЭДТА и пересаживали на чашки Петри диаметром 60 мм в разведении 1:200 от исходной плотности монослоя. Через 3 недели культуры фиксировали и окрашивали толуидиновым синим, после чего подсчитывали число колоний, видимых невооруженным глазом.

Оценка адгезивных параметров эндотелиальных клеток и моделирование межклеточных взаимодействий. Для оценки изменения экспрессии клетками различных классов молекул клеточной адгезии культуры инкубировали в течение 48-72 часов с цитарабином в концентрации 10-20 мкг/мл. Контролем служили культуры, выращенные без добавления препарата. Клетки отмывали раствором Эрла и снимали раствором трипсинаЭДТА, затем осаждали центрифугированием и инкубировали в течение 45 минут с ФИТЦили ФЭ-мечеными мышиными моноклональными антителами к CD54 (ICAM-1), CD (VCAM-1), CD62-E (E-селектин), CD31 (PECAM-1) и CD62-P (Р-селектин) (Becton Dickinson).

В качестве негативного контроля использовали неиммунные IgG соответствующего класса (Becton Dickinson). После отмывки ФБД-БСА клетки ресуспендировали в растворе FaxFlow и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson).

Для подтверждения результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали иммуногистохимический анализ. Контрольные и инкубированные с цитарабином 10-20 мкг/мл в течение 48-72 часов культуры фиксировали на пластике в течение 15 мин раствором CellFix (Becton Dickinson), отмывали ФБД и ФБД с добавлением БСА (ФБД-БСА). Следующий этап включал в себя применение того же спектра нативных мышиных моноклональных антител, которые использовались при выявлении молекул клеточной адгезии методом проточной цитометрии. Дальнейшее окрашивание проводили с помощью набора реагентов, входящих в Monoclonal Detector Kit (Biomeda) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Результаты оценивались с помощью световой микроскопии.

Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров и больных методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1.077 г/л) с использованием готовой коммерческой среды LymphoSep (ICN) или Histopaque (SigmaAldrich). Полученные лейкоциты отмывали центрифугированием в избытке раствора Эрла и ресуспендировали в среде культивирования в концентрации 2х106 клеток/мл. Затем клеточную суспензию в равных объемах добавляли в культуральные среды контрольных и подвергшихся воздействию цитарабина эндотелиальных клеток. Через 30 минут инкубации неадгезировавшие клетки бережно отмывали раствором Эрла; культуры фиксировали 2,5% адгезированных лейкоцитов оценивали с помощью метода компьютеризированной видеомикроскопии, описанного в предыдущих разделах.

Выявление циркулирующих эндотелиальных клеток.

Характеристика больных. В работе использовали образцы венозной крови здоровых доноров и больных ОМЛ, находящихся на лечении в клинике химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (руководитель отделения член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор В.Г.Савченко). В исследование были включены 7 больных ( женщин и 2 мужчин) в возрасте от 21 до 51 года (среднее 40±11). Основные характеристики пациентов приведены в Таблице 1. В контрольную группу было включено 3 здоровых донора: 2 женщины и 1 мужчина в возрасте 24, 31 и 34 лет.

Таблица 1. Характеристика пациентов.

Варианты химиотерапии, проводимой больным на момент исследования:

курс “7+3”: цитарабин 100 мг/м2 2 раза в сутки 1-7-й день; даунорубицин 45 мг/м2 или 60 мг/м2 1 раз в сутки 1-3-й день.

курс ”НАМ”: цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 1-3-й день; митоксантрон 10 мг/м2 1 раз в курс “HD-Ara-C”: цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 1-й, 3-й, 5-й день.

курс “HAD”: цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 3-5-й день; даунорубицин 45 мг/м2 1 раз Интервал между предшествующим курсом химиотерапии и моментом начала обследования составлял от 33 до 63 дней (в среднем 44 дня). Определение и анализ количества эндотелиальных клеток в периферической крови проводились всем больным перед началом лечения, в процессе введения цитостатических препаратов и в течение длительного периода после химиотерапии. Каждому больному было выполнено от 5 до повторных исследований. В день взятия образцов параллельно выполняли исследование уровня лейкоцитов крови.

Подготовка и исследование образцов крови. Для определения циркулирующих эндотелиальных клеток у больных с ОМЛ применяли метод мультипараметрической проточной цитометрии. Из цельной гепаринизированной (50 Ед/мл) крови отбирали аликвоты в объеме от 100 мкл до 1000 мкл (в зависимости от содержания лейкоцитов).

Образцы объемом более 100 мкл предварительно центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин для осаждения всех клеточных элементов. После удаления избытка плазмы до получения конечного объема 100-150 мкл клетки инкубировали в течение минут при температуре +2-8С с антителами к CD45-ФИТЦ и одному из исследуемых маркеров: CD54-ФЭ, CD34-ФЭ, СD146-ФЭ (Вecton Dickinson). После лизиса эритроцитов (BD FACS Lysing Solution) клеточные суспензии анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson). Накопление данных прекращали после получения от 100000 до 250000 CD45-положительных событий (лейкоцитов) в каждом образце. За основу анализа был взят стандартный протокол выявления гемопоэтических стволовых клеток ISHAGE [Barnett,1999]. Циркулирующими эндотелиальными клетками считали события, определяемые как клетки с фенотипом CD45CD34+ или CD45-/CD54+, или CD45-/CD146+, располагающиеся в левом верхнем углу графика FL1/FL-2. События с размерами меньше, чем у лимфоцитов, из анализа исключались. В дальнейшем проводился пересчет относительного содержания эндотелиальных клеток в соответствии с уровнем лейкоцитов крови на момент исследования.

Культивирование эндотелиальных клеток крови. Гепаринизированную кровь (20 мл) переносили в стерильную пробирку и оставляли на 30-60 минут для седиментации эритроцитов. Обогащенную лейкоцитами плазму переносили в отдельную пробирку и центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл среды для культивирования эндотелиальных клеток и помещали в культуральные флаконы с площадью поверхности 75 см2, заранее покрытые желатином. Через 5-7 дней среду с неприкрепившимися клетками удаляли и заменяли на свежую. Динамическое наблюдение за прикрепившимися клетками производили с помощью фазово-контрастной микроскопии на протяжении 4-6 недель.

При достижении колониями размеров около 1 - 4 мм культуры отмывали раствором Эрла и пассировали на желатинизированные флаконы площадью 25 см2 и продолжали культивирование до формирования монослоя. При необходимости клетки вновь пересевали с разведением 1:3.

Для подтверждения эндотелиальной природы полученных клеточных колоний и культур, полученных в результате пассирования, клетки анализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания и проточной цитометрии. В данной части исследования использовали мышиные моноклональные антитела к CD54 (ICAM-1), CD (VCAM-1), CD31 (PECAM-1), CD62P (P-селектину), CD62E (Е-селектину), CD34, CD146, VEGFR-2/KDR (R&D Systems, США) и кроличьи поликлональные антитела к фактору фон Виллебранда (Sigma, США).

функциональных колониеобразующих единиц эндотелия культуры 2-3 пассажа пересевали на покрытые желатином культуральные флаконы 75 см2 в разведении 1:100 от исходной плотности монослоя (5-6х104 кл/см2). Динамическое наблюдение за формированием очагов клонального роста проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии в течение недель. В дальнейшем полученные колонии окрашивали толуидиновым синим либо фенотипировали с помощью ранее применявшихся антител к P-селектину и фактору фон Виллебранда.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Повреждение и репарация эндотелия in vitro.

Культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека 1-го и 2-го пассажей, использованные в работе, были представлены гомогенной популяцией одноядерных клеток веретеновидной или полигональной формы. При культивировании в среде, содержащей дополнительный фактор роста (ECGS) клетки активно пролиферировали, и при использовании БДУ индекс мечения культур в стадии активного роста достигал 40-60%. По мере достижения конфлюэнтного состояния (состояния монослоя) скорость роста клеток замедлялась вследствие контактного торможения, а культуры приобретали характерный вид "булыжной мостовой".

Влияние цитозин-арабинозида на морфологию и пролиферацию эндотелиальных клеток. В процессе отработки экспериментальной модели был исследован широкий диапазон концентраций препарата в среде культивирования, с запасом перекрывающий его содержание в крови больных при использовании средних (100 мг/м2) и высоких (3 гр/м2) доз.

При исследовании различных препаратов группы цитозин–арабинозида, полученных от различных фирм-производителей (цитозар, цитарабин, алексан), существенных различий в их активности выявлено не было (Рис. 1). Для оценки эффективности препаратов был проведен анализ их активности в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1 мг/мл. При фазово-контрастной микроскопии культур уже через 3-4 часа наблюдалось появление открепившихся свободно плавающих клеток, число которых визуально возрастало пропорционально времени инкубации и концентрации препарата в среде культивирования.

При 24-часовой инкубации действие цитозин-арабинозида сохранялось практически неизменным в широком диапазоне концентраций от 0,5 мкг/мл до 1 мг/мл и прекращалось (число клеток достигало контрольного уровня), при концентрации менее 100 нг/мл (Рис. 2А).

В серии экспериментов с применением БДУ было установлено, что мишенью цитозинарабинозида являются клетки, вступающие в митотический цикл. Добавление препарата приводило в течение 18-24 часов к полному исчезновению из культуры БДУ-меченых клеток.

Жизнеспособность пролиферирующих клеток сохранялась (меченые БДУ клетки выявлялись в составе монослоя) лишь при концентрациях препарата, не превышающих нг/мл (Рис. 3), что соответствовало данным, приведенным на рисунке 2А.

Параллельно с откреплением части клеток в культурах эндотелия, инкубируемых в присутствии цитарабина, наблюдалось снижение плотности монослоя по сравнению с контрольными (Рис. 4 А, Г). При времени инкубации, не превышающем 24-48 часов, действие препарата было обратимым: уже через 18-24 часа после отмывки и замены среды на свежую в культуре появлялось значительное количество БДУ-меченных, а в последующие сутки делящихся клеток.

Рисунок 3. Влияние цитозин-арабинозида на включение БДУ в культуре эндотелиальных клеток человека. А – контрольные клетки; Б и В – то же, в присутствии цитозин-арабинозида, 100 мкг/мл и 200нг/мл, соответственно. Иммунопероксидазная техника, Х200.

Морфологические изменения эндотелиальных клеток под действием даунорубицина. В широком диапазоне концентраций (от 1,5 мкг/мл до 0.1 мг/мл) даунорубицин оказывал выраженное цитотоксическое действие, приводящее в течение 24 часов к повреждению значительной части эндотелиальных клеток (Рис. 2Б) и нарушению целостности монослоя (Рис. 4Б). При уменьшении концентрации препарата до 0,4-0,75 мкг/мл число прикрепленных к пластику клеток возрастало, но монослой по-прежнему был нарушен. Лишь при концентрации даунорубицина в среде, равной или менее 200 нг/мл жизнеспособные эндотелиальные клетки были способны оставаться в состоянии монослойной культуры, несмотря на гибель части из них (Рис. 4В). Увеличение времени инкубации с препаратом до 48 часов приводило к возрастанию его эффекта примерно вдвое.

Рисунок 4. Морфологические изменения в культуре эндотелиальных человека при инкубации с даунорубицином (Б-В) и цитозин-арабинозидом (Г-Е).

А – контрольные клетки; Б и В – клетки после 48 часов инкубации с ДНР, 5 мкг/мл и нг/мл, соответственно; Г и Д – вид культур через 48 часов и 7 суток инкубации с цитозинарабинозидом, 10 мкг/мл; Е – культура Д: появление колоний ЭК через 10 суток после удаления цитозин-арабинозида из среды культивирования. Фазовый контраст, Х100.

Изменения эндотелиальных клеток при совместном применении цитозин-арабинозида и даунорубицина. С целью выявления возможного потенциирования действия двух препаратов, было проведено исследование по их одновременному добавлению в культуральные среды. Как видно из рисунка 2 В и Г, разница между количеством эндотелиальных клеток, инкубированных с цитозин-арабинозидом в широком диапазоне концентраций и даунорубицином в дозе 0,75 мкг/мл и “монотерапией” цитозин-арабинозидом составила 25%. В тоже время кривые, соответствующие содержанию клеток после воздействия разных доз даунорубицина в присутствии или отсутствии цитарабина ( мкг/мл), практически идентичны.

Таким образом, при совместном использовании препаратов было установлено, что цитозин-арабинозид практически не оказывает влияния на эффекты даунорубицина, а цитотоксичность смеси определяется в основном антрациклиновым антибиотиком.

Репарация культуры эндотелия. Колониеобразующие единицы эндотелия. На основании ранее полученных данных о схожести воздействия доз цитозин-арабинозида на эндотелиальные клетки в широком диапазоне концентраций для последующих экспериментов был выбран препарат цитарабин в условной "терапевтической" дозе, равной 10 мкг/мл среды.

При увеличении времени инкубации эндотелиальных клеток с цитарабином до 6- суток в культуре наблюдалось прогрессивное снижение их плотности, вплоть до 15-20% от исходной. При этом целостность монослоя сохранялась за счет сильно распластанных клеток, оставшихся на пластике (Рис. 4Д). После "отмены" препарата, т.е. отмывки и последующего культивирования клеток эндотелия в стандартной среде, морфология культур оставалась практически неизменной на протяжении последующих 7-9 суток. Однако при возникновение отдельно расположенных островков, состоящих из мелких активно пролиферирующих клеток (Рис. 4Е). В последующие несколько суток размеры возникших клеточных колоний продолжали возрастать, в результате чего культуры практически полностью восстанавливались.

Для подтверждения присутствия в составе культур колониеобразующих клеток была предпринята попытка их выявления с помощью метода клонирования. В результате проведенных экспериментов было установлено, что при плотности посадки порядка 10- эндотелиальных клеток/см2 отдельные клетки способны пролиферировать и в течение 2- недель формировать колонии, содержащие от нескольких десятков до нескольких сотен клеток. Способность культур к клонированию сохранялась после инкубации клеток с цитарабином. Однако число колониеобразующих единиц после длительной инкубации с цитарабином было ниже, чем в контрольных культурах (в среднем 1 на 1000 посаженных клеток) и к 14-15 суткам составляло около 1 на 2-3 тысячи.

Ни появления отдельных колоний эндотелиальных клеток, ни восстановления подвергнутых клонированию после инкубации с даунорубицином, в аналогичных условиях культивирования выявлено не было.

Влияние цитарабина на адгезивные параметры эндотелия. При изучении экспрессии молекул клеточной адгезии было установлено, что контрольные культуры практически не содержали клеток, экспрессирующих на своей поверхности Р- и Е-селектины и VCAM-1 (Рис.

5А). В то же время почти все клетки содержали умеренное количество ICAM-1 и положительно окрашивались на PECAM-1 (Рис. 5Д и Ж). В результате 48-72-часовой инкубации с цитарабином эндотелиальные клетки претерпевали ряд структурнофункциональных изменений, описанных выше. Одновременно, при иммуногистохимическом анализе в культурах было отмечено появление клеток, экспрессирующих на поверхности Рселектин, Е- селектин, а также молекулу клеточной адгезии семейств иммуноглобулинов VCAM-1 (Рис. 5, Б-Г, соответственно). Окрашивание на PECAM-1 становилось более интенсивным по сравнению с контролем (Рис. 5, З). Наиболее выраженные изменения (значительное увеличение экспрессии) были выявлены в отношении ICAM-1 (Рис. 5, Е).

Рисунок 6.

Адгезия мононуклеарных клеток здорового донора к контрольным эндотелиальным клеткам (А) и культурам после инкубации с цитарабином (Б).

Окрашивание по методу Гимза.

Увеличение, Х 250.

Результаты гистохимического окрашивания были подтверждены методом проточной цитометрии. Число клеток, экспрессирующих Р-селектин, Е-селектин и VCAM- увеличивалось и в ряде случаев достигало 2-3%. Доля ICAM-1-положительных клеток и интенсивность окрашивания также возрастали после инкубации эндотелиальных клеток с цитарабином. Некоторое усиление окрашивания клеток по сравнению с контрольными культурами отмечалось и в случае PECAM-1.

При исследовании адгезивных свойств клеток в контрольных культурах наблюдалась лишь незначительная адгезия мононуклеаров периферической крови – 1,1±0,3 лейкоцита на 10 эндотелиоцитов (Рис. 6 А). После 48-72-часовой инкубации с цитарабином, несмотря на объективное снижение плотности монослоя эндотелиальных клеток, количество адгезировавших лейкоцитов значительно возрастало по сравнению с контрольными культурамии составляло 24,3±5,7 лейкоцитов на 10 эндотелиоцитов (Рис. 6 Б). При этом значительная часть мононуклеаров за 30 минут эксперимента успевала мигрировать в субэндотелиальное пространство. Сходные результаты были получены при анализе адгезии мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациентов, проходящих курс химиотерапии по поводу острого лейкоза.

2. Циркулирующие эндотелиальные клетки. Колониеобразующие единицы эндотелия.

Динамика изменения содержания эндотелиальных клеток в крови больных в процессе лечения. Результаты экспериментов, описанные в предыдущих разделах, показали, что цитарабин и даунорубицин обладают способностью приводить к гибели и появлению в культуральной среде значительного количества свободно плавающих эндотелиальных клеток. По аналогии с исследованиями in vitro, можно предположить, что клетки, подвергшиеся воздействию цитостатических препаратов, также слущиваются с поверхности сосудистой стенки и оказываются в периферическом кровотоке.

Поскольку экспрессия исследуемых маркеров (CD54, CD34, CD146) описана и на активированных лимфоцитах, для исключения ложноположительных результатов проводили двойное окрашивание с использованием антител к общелейкоцитарному антигену CD45. За циркулирующие эндотелиальные клетки принимали события с фенотипом CD54+/СD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45- (Рис. 7). Динамика изменений количества клеток с характерным антигенным профилем (молекула клеточной адгезии эндотелия+/CD45-) суммирована на рисунке 8.

Перед началом введения цитостатических препаратов уровень эндотелиальных клеток в крови больных ОМЛ варьировал в широких пределах (CD54+/CD45- от 10 до 466;

CD34+/CD45- от 32 до 453; CD146+/CD45- от 53 до 104 клеток/мл). Наименьшее их количество выявлялось у больных после предшествующего лечения стандартными дозами цитарабина с даунорубицином. В контрольной группе здоровых доноров среднее число клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45- составило 44, 22,5 и клеток/мл, соответственно, что согласуется с результатами большинства исследователей [Del Papa, 2004; Khan, 2005].

ДО ЛЕЧЕНИЯ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ

Рисунок 7. Результаты выявления циркулирующих клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146/CD45- в крови больного Т.В.О. до лечения и на 5 сутки терапии.

Рисунок 8. Динамика изменения содержания циркулирующих клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146/CD45- в крови больного З.Т.Ф. в процессе лечения и в послекурсовом периоде.

Как следует из рисунка 8, динамика выброса CD34+/45- клеток в кровоток практически совпадала с данными, полученными при анализе клеток с фенотипом CD54+/CD45-.

Количество циркулирующих эндотелиальных клеток, экспрессирующих CD146, также повышалось в процессе химиотерапии, но в отличие от предыдущих популяций, изменения наблюдались в более ранние сроки и были менее выражены.

Сравнительный анализ количественных изменений эндотелиальных клеток в крови больных показал различную степень повреждения сосудистого эндотелия в зависимости от используемых схем цитостатической терапии. При проведении курсов высоких доз цитарабина в сочетании с митоксантроном в первые три дня лечения наблюдалось повышение CD54+/CD45- клеток в 3,6-5,3 раз по сравнению с исходным уровнем, что совпадало с введением цитозин-арабинозида. Последующее применение митоксантрона поддерживало достаточно высокие значения эндотелиальных клеток, превышающие, в одном случае, число клеток, определяемых в первые дни курса. В случае использования высокодозной монотерапии цитарабином кратность увеличения уровня CD54+/CD45клеточной популяции составила 5,6 раз. Использование в терапии антрациклинового антибиотика даунорубицина приводило к нарастанию числа эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке в 9-24 раза. Существенный подъем CD34+/45-клеток наблюдался у двоих больных на программах “7+3” и “HDAra-C” (в 25 и 44 раза, соответственно). При анализе клеток крови с фенотипом CD146+/CD45- их количественное содержание увеличивалось в 3-8 раз по сравнению с исходными значениями.

В послекурсовом периоде заметное повторное увеличение клеточных популяций CD54+/CD45- и CD34+/CD45- отмечалось на 7-9 сутки после окончания курса химиотерапии.

У большинства больных количество циркулирующих CD54+/CD45- клеток возрастало по сравнению с исходными данными в 6-25 раз, а CD34+/CD45- в 4-22 раза, что превышало значения, полученные на фоне проведения цитостатической терапии. При этом уровень лейкоцитов крови у шести больных находился в пределах от 0,2 до 0,9х109/л, лишь у одной пациентки он составлял 2х109/л. Таким образом, наблюдаемое увеличение содержания циркулирующих эндотелиальных клеток приходилось на период агранулоцитоза или выраженной цитопении. В течение дальнейшего наблюдения количество клеток (CD54+/CD45-, CD34+/CD45-) у всех пациентов в крови снижалось, но сохранялось выше значений, которые имелись в начале исследования. Число клеток, экспрессирующих CD146, напротив, оставалось повышенным или несколько увеличивалось на вторые сутки после лечения с последующим плавным снижением их количества в крови практически до исходного уровня.

В целом полученные результаты подтверждают предположение о массивной деэндотелизации сосудистой поверхности в ходе цитостатической терапии. Включение в программу лечения даунорубицина значительно повышает риск нарушения целостности эндотелиального слоя, что согласуется с приведенными выше результатами исследований in vitro. Последующий подъем («вторая волна») числа циркулирующих эндотелиальных клеток, предшествующий по времени началу выхода пациентов из агранулоцитоза дает основание предположить, что эти клетки жизнеспособны и, возможно, являются клеткамипредшественниками, способными участвовать в регенерации эндотелия. Доказательством этому могло бы стать выявление функциональных КОЕ-Энд в крови.

Формирование колоний эндотелиальных клеток в культуре лейкоцитов крови. Через 4-6 дней от момента посадки мононуклеаров крови, забранной на пике «второй волны», в культуре отмечалось появление единичных распластанных клеток, морфологически сходных с эндотелиальными. В дальнейшем эти клетки формировали очаги роста, которые со временем увеличивались в размерах. К 9-15 суткам культивирования некоторые колонии достигали диаметра 3-5 мм и насчитывали до нескольких тысяч клеток (Рис. 9).

Число клеточных колоний, возникающих на 10-15 сутки культивирования, варьировало у изолятов, полученных из крови пациентов после проведения комбинированной терапии, и составляло от 9 до 25 при посадке лейкоцитов в количестве от 9 до 28х106 (cреднее 14,5±7,8х106), выделенных из 20 мл крови. При посадке лейкоцитов крови пациента после проведенной монотерапии высокими дозами цитозин-арабинозида роста клеточных колоний отмечено не было. Аналогичные негативные результаты были получены при исследовании крови здоровых доноров и пациентов на момент введения цитостатических препаратов.

Фенотипическая характеристика получаемых культур. Для доказательства эндотелиальной природы клеток, формирующих колонии, были использованы методы иммуногистохимии и проточной цитометрии. Несмотря на вариабельность по интенсивности окрашивания, преобладающее число клеток в колониях содержало фактора Виллебранда (ФВ), что подтверждает их эндотелиальную природу. Кроме этого, в некоторых крупных колониях на поверхности клеток, распластанных на пластике и составляющих монослой, наблюдались клеточные тяжи, напоминающие капилляроподобные структуры. Клетки, формирующие эти образования, также положительно окрашивались на ФВ.

При пассировании культур, содержащих несколько крупных эндотелиальных клонов, клетки сохраняли высокую пролиферативную активность и через 10-12 дней культивирования формировали конфлуэнтный монослой. Высокие темпы роста клеток сохранялась и при последующих пассажах. При иммунофенотипическом анализе клетки характеризовались наличием совокупности маркеров, подтверждающих их эндотелиальную природу (ICAM-1, PECAM-1, CD146, ФВ, VEGFR-2, CD34) (Рис. 10).

Представленные экспериментальные данные позволяют заключить, что через определенный период после проведения противоопухолевой терапии в крови появляются клетки, способные к инициации культуры эндотелия и к образованию капилляроподобных структур. По-видимому, появление в крови клеток с высоким уровнем пролиферации и способностью к колониеобразованию может быть обусловлено высокой потребностью к восстановлению целостности поврежденного сосудистого эндотелия. Несовпадение данных, полученных с помощью проточной цитометрии и культивирования, может быть объяснено тем, что лишь часть выявляемых по фенотипу циркулирующих клеток клоногенны в описанной системе культивирования. Отсутствие функциональных КОЕ-Энд в крови пациентов в период введения препаратов и в крови здоровых доноров может объясняться либо их нежизнеспособностью, либо слишком малым их количеством, выходящим за пределы чувствительности метода.

Вопрос о происхождении циркулирующих эндотелиальных клеток, составляющих "вторую волну", не имеет однозначного ответа. С одной стороны, возможным источником эндотелиальных клеток может быть сама сосудистая стенка. Об этом свидетельствуют данные, полученные Lin и соавт.: большинство клеток-предшественников эндотелия, циркулирующих в крови (более 95%), имеют не костномозговое происхождение [Lin, 2000].

Результаты работ нескольких других коллективов доказывают присутствие в сосудистой стенке резидентных клеток-предшественников, являющихся источником постнатального васкулоогенеза. Так называемые “васкулярные” зоны имеются в артериях большого и среднего калибра, а также в венах всех органов и систем [Zengin, 2006; Hu, 2004; Ingram, 2005]. Результаты наших собственных исследований и ранее полученные данные также показали присутствие в монослое сосудистого эндотелия популяции “камбиальных” эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным потенциалом и обладающих клоногенными свойствами в культуре клеток [Романов, 1998, 1999]. С другой стороны, нельзя исключить, что клетки, выделенные из крови больных, имеют костномозговое происхождение и способны мигрировать в места повреждения эндотелия с восстановлением его целостности, что согласуется с данными, представленными другими авторами [Hur, 2004; Gulati, 2003; Shi, 1998]. В эту же пользу говорят и наблюдения, сделанные в ходе данного исследования: клетки «второй волны» негативны в отношении маркера дифференцированных эндотелиальных клеток – CD146.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведения экспериментов удалось установить, что и цитарабин, и даунорубицин способны оказывать повреждающее воздействие на культуру эндотелиальных клеток человека. Однако характер влияния этих двух препаратов на клетки оказался различен. Основной мишенью цитарабина являются пролиферирующие эндотелиальные клетки, и его цитостатическое действие можно охарактеризовать как фазовозависимое. При этом, несмотря на гибель значительной части клеток, целостность монослоя эндотелия не нарушается. Диаметрально противоположное действие на культуру эндотелиальных клеток продемонстрировал антрациклиновый антибиотик даунорубицин. В широком диапазоне концентраций препарат оказывал выраженный цитотоксический эффект вне зависимости от фазы клеточного цикла. Подобное повреждение эндотелиальных клеток приводило к нарушению целостности монослоя, т.е. деэндотелизации поверхности. При совместном применении цитарабина и даунорубицина выявлено, что эндотелиотоксичность смеси определяется, главным образом, антрациклиновым антибиотиком.

Моделирование цитостатического воздействия с использованием культур эндотелия позволило оценить функциональные изменения эндотелиальных клеток на фоне “терапии” цитарабином. Полученные данные доказывают, что в ответ на добавление препарата происходит активация эндотелиоцитов, которая проявляется, прежде всего, изменением экспрессии различных классов молекул клеточной адгезии и усилением взаимодействия с (генерализованные) провоспалительные изменения могут возникать и в сосудистой стенке в процессе лечения. Нельзя также исключить, что дисфункция эндотелия является ведущим патогенетическим фактором в развитии сосудистых осложнений у онкогематологических больных в ответ на цитостатическую терапию.

Исследования репаративной способности эндотелия in vitro показали, что восстановление эндотелиальной ткани может осуществляться несколькими путями. При незначительных повреждениях, вызванных кратковременным присутствием цитостатического препарата, целостность монослоя поддерживается за счет распластывания сохранившихся клеток. В последующие несколько дней количество эндотелиальных клеток и плотность культуры восстанавливаются в результате интенсивной клеточной пролиферации. При увеличении продолжительности цитостатического воздействия и истощении пула пролиферирующих клеток поддержание целостности монослоя осуществляется практически исключительно за счет распластывания клеток, оставшихся в культуре.

Интересно, что даже после длительного присутствия в среде цитарабина и полной элиминации клеток, способных к делению, эндотелий все же сохраняет способность к регенерации. Это связано с сохранением в составе монослоя покоящихся клеток, не подверженных воздействию фазозависимого препарата. Данные клетки по праву можно назвать “тканевыми клетками-предшественниками эндотелия” или “колониеобразующими единицами эндотелия”. После окончания "курса" эти клетки способны активироваться и продуцировать клоны клеток, приводящих к восстановлению структуры эндотелия. Приведенные факты свидетельствуют о "физиологичности" процессов репарации эндотелия в описанной культуральной системе, чего нельзя сказать об изменениях эндотелиальных клеток в ответ на добавление даунорубицина. В результате проведенных экспериментов по выявлению КОЕ-Энд было установлено, что их реакции на этот препарат, по всей видимости, необратимы.

Доказательством правоты концепции повреждения эндотелия при цитостатической терапии пациентов с ОМЛ, а возможно, и с другими патологическими состояниями, является выявление циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке.

Исследование крови больных ОМЛ, которым проводилась цитостатическая терапия, полностью подтвердило высказанное предположение. Уже в первые дни лечения содержание циркулирующих эндотелиальных клеток возрастало (иногда, в десятки раз) по сравнению с исходным уровнем и снижалось после окончания курса. Результаты анализа фенотипа циркулирующих эндотелиальных клеток с использованием нескольких маркеров эндотелия (CD54, CD34, CD146) свидетельствуют, что в процесс повреждения вовлечены клетки, выстилающие как магистральные сосуды, так и капиллярное русло.

Одним из возможных механизмов регенерации эндотелия связан с участием недифференцированных эндотелиальных клеток. Если данный механизм задействован и в случае регенерации эндотелия после проведенной химиотерапии, то жизнеспособные эндотелиальные клетки-предшественники, способные к клональному росту, должны присутствовать в крови пациентов в период восстановления. Действительно, проведенный анализ показал, что через 7-9 суток после окончания курса в крови пациентов определяется популяция CD45-негативных клеток, экспрессирующих эндотелиальные маркеры – CD54 и CD34 (но не CD146). Высокий уровень таких клеток сохраняется на протяжении 1-2 недель и затем снижается. При посадке суммарной фракции лейкоцитов периферической крови, выделенной в период выброса предполагаемых предшественников, и последующем культивировании вначале выявлялись единичные клетки, в дальнейшем – колонии клеток с морфологическими и фенотипическими признаками эндотелия.

Таким образом, проведенное исследование доказывает высокий уровень повреждения сосудистого эндотелия у пациентов, получающих цитостатическую терапию, и расширяет сложившиеся представления о механизмах регенерации эндотелия и развития сосудистой патологии у больных гемобластозами.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить повреждающее действие цитостатических препаратов (цитозин-арабинозада, даунорубицина) на эндотелиальные клетки человека.

2. Повреждающее действие цитозин-арабинозида проявляется в широком диапазоне концентраций (0,1 мкг/мл – 1 мг/мл) и связано с элиминацией из состава монослоя пролиферирующих клеток, не приводящей к нарушению целостности клеточного пласта.

Действие даунорубицина в концентрациях от 0,1 мкг/мл до 0,1 мг/мл сопровождается нарушением целостности монослоя вследствие необратимых токсических повреждений эндотелиальных клеток.

3. При короткой экспозиции цитозин-арабинозида (1-3 суток), целостность монослоя эндотелиальных клеток сохраняется за счет распластывания сохранившихся клеток и последующего восстановления плотности культур в результате их пролиферации. При продолжительной (7-9 суток) инкубации культур с препаратом поддержание целостности монослоя происходит исключительно за счет распластывания эндотелиальных клеток.

4. После продолжительной инкубации с цитозин-арабинозидом, в культуре сохраняется популяция колониеобразующих клеток (КОЕ-Энд), способных к пролиферации с последующей регенерацией монослоя. В культурах эндотелиальных клеток, инкубированных с даунорубицином, КОЕ-Энд не выявлены и восстановления целостности монослоя не происходит.

5. Функциональные изменения эндотелиальных клеток при культивировании в присутствии цитозин-арабинозида аналогичны провоспалительным: возрастает экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (P- и Е-селектинов, ICAM-1, VCAM-1 и PECAM-1) и увеличивается адгезия клеток крови на эндотелий.

6. В крови здоровых доноров и больных ОМЛ выявлены популяции клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45-, соответствующим циркулирующим эндотелиальным клеткам. На фоне введения цитостатических препаратов содержание циркулирующих клеток эндотелия увеличивается в среднем в 10 раз и снижается после окончания курса цитостатической терапии.

7. Через 1-2 недели после окончания курса химиотерапии в крови пациентов наблюдается "вторая волна" увеличения количества циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45-, но не CD146+/CD45-, среди которых присутствуют клетки-предшественники эндотелия (КОЕ-Энд).

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Романов Ю.А., Червонцева А.М., Савченко В.Г. Повреждение сосудистого эндотелия в процессе лечения острых лейкозов: исследование in vitro. Терапевтический архив. 2004;

№ 7, стр. 34-40.

2. Романов Ю.А., Червонцева А.М., Савченко В.Г. Влияние цитарабина на экспрессию молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелий-лейкоцит in vitro.

Терапевтический архив, 2006, № 7, стр. 67-72.

3. Chervontseva A.M., Savchenko V.G., Romanov Y.A. Injury of endothelium during the cytostasic therapy of AML patients. The American Society of Hematology 46th Annual Meeting and Exposition.

Abstract

3907. 2004.

4. Romanov Y.A., Chervontseva A.M., Savchenko V.G. Vascular endothelium: target or victim of cytostatic therapy? ISCT Annual Meeting, May 2-5 2006, Berlin, Germany, abstr/poster.

5. Romanov Y.A., Chervontseva A.M., Savchenko V.G. Vascular endothelium: target or victim of cytostatic therapy? Can. J. Physiol. Parmacol. 2007; 85: 396-403.

6. Savchenko V.G., Chervontseva A.M., Romanov Y.A. Vascular damage by cytostatic drugs in acute leukemia patients. Workshop “Modelling of blood diseases”, November 5-8 2007, Lion, France, abstract p. 9.



 


Похожие работы:

«Темирджанова Светлана Юсуфовна Социально – гигиеническое исследование здоровья населения Карачаево-Черкесской республики 14.00.33. – Общественное здоровье и здравоохранение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения Росздрава Научный руководитель : доктор медицинских наук...»

«Киладзе Иракли Зурабович АОРТОКОРОНАРНОЕ ШУНТИРОВАНИЕ БЕЗ ИСКУССТВЕННОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ПРИ КОМОРБИДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.26 сердечно-сосудистая хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российский научный цент хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН. Научный руководитель : Доктор медицинских наук, профессор Жбанов Игорь Викторович Официальные...»

«ШЕСТАКОВ МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ МЕДИКО-СОЦИАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ С ДОХОДАМИ НИЖЕ ПРОЖИТОЧНОГО УРОВНЯ В СОВРЕМЕННЫХ СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва, 2010 г. Работа выполнена в ФГУ Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения Росздрава Научный консультант : заслуженный деятель науки РФ,...»

«ИВЖЕНКО Евгения Владимировна ФИЗИОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРОВ, ФОРМИРУЮЩИХ ЗДОРОВЬЕ ВОСПИТАННИКОВ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ОПЕКИ 14.02.01 – Гигиена Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург — 2013 г. Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской...»

«ГАДЖИЕВ Гаджимагомед Джамалутдинович ОЦЕНКА РИСКА ЗДОРОВЬЮ СОТРУДНИКОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИНСТИТУТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ 14.02.01 – Гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Иркутск – 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Гречаный...»

«Кобзева Ирина Владимировна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ 14.01.21 – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического...»

«АБРАМОВА Татьяна Федоровна СОСТОЯНИЕ ЗДОРОВЬЯ ДЕТЕЙ С НАРУШЕНИЕМ ЗРЕНИЯ, ПРОГНОЗИРОВАНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА ЕГО ОТКЛОНЕНИЙ 14.01.08 – Педиатрия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Иваново 2012 Работа выполнена на кафедре поликлинической педиатрии с курсом здорового ребенка и общего ухода за детьми Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ивановская государственная медицинская академия...»

«ХАМИДУЛЛИНА АЛЛА РИВГАТОВНА ВЛИЯНИЕ АНТИГИПЕРТЕНЗИВНЫХ СРЕДСТВ НА ПОКАЗАТЕЛИ ОБМЕНА ОКСИДА АЗОТА У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ 14.01.05 – кардиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Казань – 2010 2 Работа выполнена в ГОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию доктор медицинских наук, профессор Научный руководитель : Галявич Альберт Сарварович...»

«БАЙТЯКОВ Владимир Викторович ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДОВ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ И ВНУТРИСОСУДИСТОЙ ГЕМОКОРРЕКЦИИ В ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ВУЛЬГАРНЫМ ПСОРИАЗОМ 14.01.10 – кожные и венерические болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Екатеринбург – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева...»

«Теа Чанадири Коррекция окислительного стресса в иммунокомпетентных клетках (в спленоцитах) под действием комплекса катехинов зеленого чая на моделе экспериментального алиментарного ожирения 14.00.36 – Алергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тбилиси 2006 Работа выполнена в Институте медицинской биотехнологии Грузии. Научные руководители - Корсантия Борис, Доктор...»

«НЕЧУШКИНА ВАЛЕНТИНА МИХАЙЛОВНА РАК ТЕЛА МАТКИ (ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА И ТАКТИКА ЛЕЧЕНИЯ) 14.01.12 — онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва — 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук (директор — академик РАН и РАМН, профессор Давыдов М. И.) Научный консультант : доктор медицинских наук, профессор...»

«МАЛЫШЕВ Николай Николаевич ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КАРОТИДНОЙ ЭНДАРТЕРЭКТОМИИ ПРИ СТЕНОЗИРУЮЩИХ ПОРАЖЕНИЯХ СОННЫХ АРТЕРИЙ В ОТДАЛЁННОМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ 14.01.11 – Нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Иваново 2011 Работа выполнена на кафедре нервных болезней с медицинской генетикой и нейрохирургией Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ярославская государственная...»

«Кескин Гузаль Маратовна Местное применение такролимуса при ограниченных формах псориаза с учетом морфофункциональных изменений кожи 14.01.10 – кожные и венерические болезни 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители:...»

«ГРИШКОВ СЕРГЕЙ МИХАЙЛОВИЧ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНАЯ ТОМОГРАФИЯ В УТОЧНЕННОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ ПРЯМОЙ И СИГМОВИДНОЙ КИШКИ (14.01.13 – Лучевая диагностика, лучевая терапия 14.01.12 – Онкология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения России (директор – член-корреспондент РАМН, профессор Солодкий В.А.). Научные...»

«Аскеров Арсен Аскерович Этнические особенности миомы матки в субэкстремальных климатогеографических и социально-экономических условиях Кыргызстана 14.01.01. – акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Бишкек 2011 3 Работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии Кыргызско-Российского Славянского университета доктор медицинских наук, Научный консультант профессор Асымбекова Г.У. доктор медицинских наук,...»

«Белялов Фарид Исмагильевич ПСИХОСОМАТИЧЕСКИЕ И СРЕДОВЫЕ ФАКТОРЫ ПРИ НЕСТАБИЛЬНОЙ СТЕНОКАРДИИ 14.00.05 - внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург 2002 Работа выполнена в Иркутском государственном медицинском университете Научный консультант : доктор медицинских наук профессор В.И.Симаненков Официальные оппоненты : доктор медицинских наук профессор Б.Б.Бондаренко доктор медицинских наук профессор...»

«ГОЛОВИНСКИЙ Сергей Владимирович МНОГОФАКТОРНАЯ ОЦЕНКА И ЗАЩИТА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛЕГКИХ У ДОНОРОВ СО СМЕРТЬЮ ГОЛОВНОГО МОЗГА 14.01.24 – трансплантология и искусственные органы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения г. Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г....»

«Яцык Галина Александровна Современная лучевая диагностика инвазивного аспергиллеза легких у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения 14.01.21 – Гематология и переливание крови 14.01.13- Лучевая диагностика и лучевая терапия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва -2010 г. 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научные руководители: доктор медицинских наук...»

«Горбунова Елена Викторовна Особенности церебральной гемодинамики у взрослых пациентов с вторичным дефектом межпредсердной перегородки 14.01.05 – кардиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2010 2 Диссертационная работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Научные руководители: академик РАМН, профессор Л. А. Бокерия доктор медицинских наук М.В. Шумилина Официальные оппоненты :...»

«ПОЛУНИНА Елена Викторовна КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИИ ОРГАНА ЗРЕНИЯ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ 14.01.07 – глазные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2013 Работа выполнена на кафедре офтальмологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования Институт повышения квалификации Федерального...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.