WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ТУТАЕВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ЗНАЧЕНИЕ НОВЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ В

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГОНСТИКЕ ЭРИТРЕМИИ И

ВТОРИЧНОГО ЭРИТРОЦИТОЗА.

Специальность 14.00.29. – гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2006 год 2

Работа выполнена в государственном некоммерческом учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Н.Д. Хорошко кандидат биологических наук А.В.Мисюрин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.А. Волкова кандидат биологических наук М.А.Эршлер Ведущее научное учреждение:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского.

Защита состоится «…..» …………………………2006 г. в………час.

на заседании диссертационного совета Д 001.042. в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: Москва, Новозыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра Российской Академии медицинских наук Автореферат разослан «………»…………………2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Эритремия хронический лейкоз с поражением клеткипредшественницы миелопоэза и характерной для опухоли неограниченной пролиферацией этой клетки, сохранившей способность дифференцироваться преимущественно по эритроидному ряду. Эритремия относится к группе хронических миелопролиферативных заболеваний (хМПЗ), в которую также входят эссенциальная тромбоцитемия и идиопатический миелофиброз (Воробьев А.И., 1985г; Воробьев А.И., 2002 г; Демидова А.В., 2001г).

Длительное время не удавалось выявить специфический молекулярный или генетический маркер для эритремии, что затрудняло проведение дифференциальной диагностики с вторичными эритроцитозами и внутри группы хронических Ph - негативных миелопролиферативных заболеваний.

Исследования 2000-2006 г.




выявили два новых молекулярных маркера, присущих 90-95% пациентов с диагнозом эритремии: гиперэкспрессию гена PRV-1 и мутацию Jak2V617F. В дальнейшем, было обнаружено, что эти маркеры встречаются при других хМПЗ, но в значительно меньшем проценте случаев и никогда у пациентов с вторичным эритроцитозом или здоровых доноров. Это позволило предположить, что данные маркеры чувствительны и специфичны, если не для проведения дифференциальной диагностики внутри группы хМПЗ, то для дифференциальной диагностики между эритремией и вторичными эритроцитозами. Кроме того, было установлено, что терапия различными цитостатическими препаратами оказывает влияние на уровень экспрессии гена PRV-1. На основании этого было высказано предположение о возможности его использования для определения эффективности проводящейся терапии.

Большой исследовательский интерес вызывает вопрос о том, как влияет сочетание различных молекулярных маркеров, обнаруженных у больных эритремией (гиперэкспрессия гена PRV-1, мутация Jak2V617F, рост эндогенных эритропоэтин-независимых колоний, низкий уровень эритропоэтина) на прогноз течения заболевания и развитие возможных осложнений. Все выше изложенное позволило сформулировать следующую цель исследования.

Цель исследования Оценить чувствительность и специфичность новых молекулярных маркеров гиперэкспрессии гена PRV-1 и мутации Jak2V617F для проведения дифференциальной диагностики эритремии и вторичных эритроцитозов, а также внутри группы хронических миелопролиферативных заболеваний.

Задачи исследования 1. Установить частоту выявления гиперэкспресии гена PRV-1 у пациентов с различными формами хМПЗ, вторичными эритроцитозами и здоровых доноров.

2. Установить частоту выявления мутации Jak2V617F у пациентов с диагнозом эритремии.

3. Исследовать динамику уровня экспрессии гена PRV-1 на фоне циторедуктивной терапии у пациентов с эритремией.

4. Определить частоту совпадения гиперэкспрессии гена PRV-1, мутации Jak2V617F, роста эндогенных эритропоэтин-независимых колоний и низкого уровня эритропоэтина у больных с эритремией.

Научная новизна • Определено значение новых молекулярных маркеров - гена PRV-1 и мутации Jak2V617F для проведения дифференциальной диагностики между эритремией и вторичными эритроцитозами.

• Получены собственные данные о влиянии циторедуктивных препаратов на уровень экспрессии PRV-1 и показано значение этого показателя для оценки эффективности проводящейся терапии.

Это неизбежно повлияет на выбор терапии и изменит понимание ремиссии при эритремии • Накоплены данные о совпадении различных молекулярных маркеров у пациентов, относящихся к группе хМПЗ.

Практическое значение работы Полученные данные создают перспективу ускорить и упростить проведение дифференциального диагноза, прежде всего между эритремией и вторичным эритроцитозом, мониторировать эффективность терапии эритремии Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в работу отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона, отделения стандартизации терапии заболеваний системы крови на базе консультативной поликлиники ГНЦ РАМН и гематологического центра г.Москвы на базе ГКБ им. С.П.Боткина; настоящая работа является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН «Разработка программы диагностики, мониторинга, дифференциальной диагностики и лечения хронических миелопролиферативных заболеваний» г.р.№ (I/VII.3.03).





Публикации По материалам диссертации опубликовано: научных работы в отечественной и 2 в зарубежной литературе.

Апробация работы Работа апробирована 23.06.2006 г на заседании проблемной комиссии ГНЦ иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения».

Основные положения диссертации доложены:

1. На съезде гематологов и трансфузиологов, приуроченном к 80 - летию создания Гематологического Научного Центра РАМН, Москва, 11- апреля 2006 года.

2. На 11 встрече Европейской гематологической ассоциации (EHA-2006, Нидерланды, Амстердам, июнь 2006) исследования» Гематологического Научного Центра РАМН, Институт трансплантации костного мозга и молекулярной гематологии, Москва, 28-29 июня 2006 года. (ГНЦ РАМН, июнь –2006г, Москва).

Объем и структура работы Материалы диссертации изложены на 105 страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами и 24 рисунками. Состоят из введения, 3 глав, включая обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель содержит 95 библиографических источников (9 отечественных и 86 иностранных авторов).

Работа осуществлялась в период с марта 2003г. по июнь 2006г. на базе отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (научный руководитель – проф., д.м.н. Н.Д. Хорошко) и в лаборатории генной инженерии (заведующий лабораторией к.б.н. А.В. Мисюрин) Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук (далее – ГНЦ РАМН, директор – академик РАМН и РАН, проф. А.И.Воробьев). Рост эндогенных эритропоэтин-независимых колоний определялся в лаборатории физиологии кроветворения с.н.с., к.б.н. Манаковой Т.Е. (зав. лаб. проф., д.б.н. Дризе Н.И.).

Уровень эритропоэтина определялся в лаборатории отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (в.н.с., к.б.н. Левина А.А.). Гистологическое исследование биоптатов костного мозга выполнялось с.н.с., к.м.н. Семеновой Е.А. в патологоанатомическом отделении (заведующий отделения: член-корр. РАМН, д.м.н., проф. Франк Г.А.). Лечение пациентов осуществлялось в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ РАМН, научно-поликлиническом отделении ГНЦ РАМН, в городском гематологическом центре на базе ГКБ им. С.П.Боткина.

За коллегиальную помощь и содействие в проведении работы автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам отделений и лабораторий ГНЦ РАМН:

д.м.н., проф. Н.Д.Хорошко, к.б.н. А.В.Мисюрину, к.м.н. М.А. Соколовой, к.м.н.

Е.П. Сысоевой, к.б.н. А. А. Левиной, д.б.н., проф. Н.И.Дризе, к.б.н.

Т.Е.Манаковой, к.м.н. Т.И. Колошейновой, к.м.н. А.Л. Меликян, к.м.н.

Л.Ю.Колосовой, Е.В.Аксеновой, к.м.н. Н.В. Цветаевой, С.В. Кузнецову, Ю.П.Финашутиной, проф. Л.Г. Ковалевой. Руководителю и сотрудникам городского гематологического центра на базе больницы С.П. Боткина: к.м.н.

В.Л.Ивановой, Н.А.Лобановой, к.м.н. М.Е.Рыбаковой, Н.И. Юдиной.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Общая характеристика больных Всего в исследование было включено 69 пациентов с установленным диагнозом хронических миелопролиферативных заболеваний. Из них: человек с диагнозом эритремия, 15– эссенциальная тромбоцитемия, 8 – идиопатический миелофиброз. Для формирования группы отрицательного контроля, были получены пробы от 15 доноров и 16 больных с установленным диагнозом вторичного эритроцитоза. Всем пациентам с эритремией и эссенциальной тромбоцитемией, диагноз был установлен в соответствии с критериями PVSG. В 39 случаях эритремии, 15 - эссенциальной тромбоцитемии, 8 - идиопатического миелофиброза, 10 – вторичного эритроцитоза диагноз был подтвержден гистологическим исследованием костного мозга. Краткие клинико-гематологические данные больных на момент взятия пробы для установления уровня экспрессии гена PRV-1приведены в таблице №1.

Общая характеристика пациентов, вошедших в исследование.

Hb, г/л 156,65*(111-190) 136,31* (113-179) 134,56*(97-166) 169*(30-191) эритроциты, 5,49* (3,05-8,4) 4,66* (2,9-6,5) 4,65*(3,47-6,11) 5,76*(5,5-6,7) х1012/л Ht, % 0,49*(0,34-0,6) 0,42*(0,34-0,6) 0,4*(0,34-0,45) 0,47*(0,4-0,54) лейкоциты, 9,53* (3,3–27,3) 8,1* (3,4 -13,1) 6,72* (3,4 -11,5) 10,52* (4 -10,3) х109/л тромбоциты, 396,75*(66-1597) 845,5* (244-2180) 364,11*(95-733) 230*(138-291) х109/л мегалия, (число больных) Длитель- 82,36* (1-348) 30,33* (3-96) 52,87* (6-168) 30,7* (1-150) ность заболевания, (мес) Примечание: *-среднее значение, (разброс) Основной целью нашего исследования было определение значения новых молекулярных маркеров - гиперэкспрессии гена PRV-1 и мутации Jak2 для проведения дифференциальной диагностики между эритремией и вторичным эритроцитозом. Поэтому основное внимание было уделено пациентам с диагнозом эритремии (n=46).

Все больные были разделены на четыре группы в зависимости от проводившейся терапии:

• В группу №1 включены пациенты не получавшие цитостатической терапии (кровопускания, дезагреганты) и впервые выявленные (n=9).

• В группу №2 вошли больные, которым проводилась монотерапия гидроксимочевиной (n=25).

• Пациенты, вошедшие в группу №3, получали IFN – в комбинации с гидроксимочевиной (n=8).

• В группу №4 вошли больные, леченые монотерапией IFN- (n=4).

Кроме того, внутри каждой группы больные эритремией в зависимости от результатов проводившейся терапии были разделены на 3 подгруппы пациентов достигших полной, частичной и не достигших ремиссии в соответствии со следующими критериями.

Полная клинико-гематологическая ремиссия:

- исчезновение жалоб и плеторы;

- нормализация всех показателей периферической крови (Hb 160 г/л, эритроциты 5,5х10 /л, лейкоциты 10х10 /л, тромбоциты 400х10 9/л);

-отсутствие спленомегалии;

-нормализация соотношения жирового и деятельного костного мозга и различных ростков кроветворения, в том числе нормальное количество мегакариоцитов.

Частичная клинико-гематологическая ремиссия:

-исчезновение жалоб, плеторы;

-значительное улучшение всех показателей гемограммы (эритроциты 6х10 12/л, лейкоциты 10 - 12х10 9/л, тромбоциты 400 - 600х10 9/л);

-уменьшение селезенки на 50% от исходных размеров;

-снижение клеточности костного мозга не менее чем не 50%, в частности, уменьшение числа красных клеток в костном мозге.

Отсутствие ответа:

-отсутствие положительной динамики вышеуказанных показателей или непродолжительное (менее 1 мес.) улучшение показателей.

Ниже приведены результаты лечения больных эритремией в зависимости от эффективности проводившейся терапии.

Результаты проводившейся терапии пациентам с эритремией (флеботомия, первичные) (гидроксимочевина) (гидроксимочевина с IFN-) Пациентам с различными формами хМПЗ, а также группе контроля (здоровые доноры и пациенты с диагнозом вторичного эритроцитоза) определяли следующие молекулярные маркеры:

• экспрессия гена PRV- • мутация Jak2 (22 пациентам с диагнозом эритремия) • рост эндогенных эритропоэтин-независимых колоний (ЭЭК) • уровень эритропоэтина Определение уровня экспрессии гена PRV-1.

Данный процесс состоял из нескольких этапов.

1.Выделение фракции чистых гранулоцитов.

От каждого больного путем флеботомии был получен образец крови объемом 15 мл, в качестве антикоагулянта был использован цитрат. Для осаждения эритроцитов к крови добавляли равный объем 3% раствора Декстрана –Mr 500000.

центрифугировали ее на EPPENDORF 5415 в течение 10 мин/1,5 тыс. оборотов в минуту. Верхнюю фазу удаляли и разводили клеточный осадок в изотоническом растворе NaCl, объем которого был равен начальному объему крови. Для выделения фракции чистых гранулоцитов полученный раствор наслаивали на 5 мл фикола (Mono-Poli, ICN) и центрифугировали в течение мин/1,5 тыс. оборотов в мин. После этого удаляли верхнюю фазу, содержащую мононуклеары. Оставшиеся эритроциты элиминировались посредством гипотонического лизиса (0,2% NaCl в течение не более 30 сек). Этот метод позволял получить более чем на 98% чистую фракцию гранулоцитов, что было подтверждено при проведении визуального контроля мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Полученные гранулоциты лизировали в 500-600 мкл буфера следующего состава: 4.5 M гуанидин изотиоцианата, 25 mM цитрата натрия, 0.5% лаурил саркозила, 0.1 М 2-меркаптоэтанола [Chomczynski].

2.Выделение РНК с помощью кислой фенольной экстракции.

В пробу добавляли фенол в объеме, равном объему лизирующего буфера (1:1), затем хлороформ объема фенола и ацетат натрия 2М (рН 4,5) 1/10 от общего объема раствора. Смешивали раствор на вортексе и затем центрифугировали на EPPENDORF 5415 в течение 10 мин/10 тыс. оборотов в минуту. Отбирали верхнюю РНК-содержащую фазу и добавляли равный ей по объему раствор изопропанола. Затем выдерживали при –70С0 в течение как минимум 2 часов.

После этого пробу центрифугировали в течение 5 минут при 12 тыс. оборотов в минуту, осадок дважды промывали 200 мкл 70% этанола и центрифугировали в течение 5 минут на 12 тыс. оборотов в минуту. В дальнейшем осадок, содержащий РНК, растворяли деионизированной водой и использовали для проведения реакции обратной транскрипции.

3.Реакция обратной транскрипции RT.

При проведении реакции обратной транскрипции (RТ) проводили отжиг РНК (1мкл) и 2 мкл гексамеров (концентрация 99 пкМ), общим объемом 3 мкл, в течение 30 секунд при 950С с последующим быстрым охлаждением (лед).

Далее добавляли реакционную смесь (20мкл) следующего состава: 75мМ KCl, 50мМ Трис (рН 8,9), 10мМ DTT, 3мМ MgCl2, 1мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов, 20ед. ингибитора РНКаз (Promega), 100ед. обратной транскриптазы M-MLV (Promega). Реакцию обратной транскрипции проводили при 370С в течение 60 минут.

4.ПЦРв реальном времени.

Уровень экспрессии гена определялся с помощью методики ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени использовался прибор IQ (фирмы BioRad) и технология TaqMan ПЦР основанная на 5`ICycler экзонуклеазной активности полимеразы. Для каждого образца проводились два отдельных эксперимента:

1. для количественного определения PRV-1, 2. для количественного определения 2-микроглобулина.

Для сравнения уровня экспрессии PRV-1 в разных образцах использовалось отношение количества копий РНК PRV-1 к количеству копий 2-микроглобулина. 2-микроглобулин также использовался в качестве нормировки в статьях зарубежных авторов, исследовавших PRV-1 ген с помощью количественной ПЦР. Количество копий каждого гена определялось относительно стандартной калибровочной кривой, которая строилась в каждом эксперименте на основании серии разведений матрицы (искусственно синтезированного олигонуклеотида длиною 66 оснований, комплементарного PRV-1), содержащей известное количество копий гена для PRV-1 и плазмиды с такими же свойствами для 2-микроглобулина. Серия разведений матрицы и плазмиды представляла собой последовательность 10-кратных разведений от 108 копий в 1 мкл до 104 копий.

В качестве красителя в нашем исследовании использовался флуоресцентный зонд с красителем FAM 490.

PRV-1 транскрипт амплифицировался при помощи праймеров, созданных на основании последовательности человеческой PRV-1 m-RNA Gen Bank для проведения количественной оценки с помощью RT-PCR (Taq Man). Для определения концентрации РНК использовались зонды, комплиментарные экзонной сшивке на молекуле РНК. Это позволило исключить влияние на результаты RT-PCR примесей ДНК.

PRV-1 прямой: 5' -TTA ACT CCC TCC CGC TTT GG-3' PRV-1 обратный: 5' -AGA CTG GGC ACC TCA AGG ATC- 3' зонд: 6-FAM-CCC CAG CAG ACC CA-MGB Праймеры использовавшиеся для определения 2-микроглобулина:

2-микроглобулин прямой: 5' -GAG TAT GCC TGA CGT GTG- 3' 2-микроглобулин обратный: 5' -AAT CCA AAT GCG GCA TCT- 3' зонд: FAM-CTC CAT GAT GCT TAC ATG TCT –C-BHQ Условия для проведения циклов количественной реакции RT-PCR для PRV-1 и 2-микроглобулина были следующие: 95 С0 –10 мин, затем 50 циклов: 95 С0 сек, 60 С0– 60 сек. Для каждого образца, в том числе и для разведений плазмид ПЦР-реакция проводилась одновременно в трех лунках (трипликаты).

Соотношение матрицы и реагентов было следующим: 5 мкл кДНК и мкл реакционной смеси. Конечный состав реакционной смеси включал в себя:

200 нМ PRV-1 прямого, 200 нМ PRV-1 обратного праймера; 220 нМ для микроглобулина прямого и обратного праймеров; 118 нМ флюоресцентного зонда для PRV-1; 80 нМ зонда для 2 микроглобулина; 20 мМ трис-HCl, pH 8,9;

50мМ KCl; 4 мМ MgCl2; 1 мМ dNTP; 0,01М 2-меркаптоэтанол; 1 ед. Taq-ДНКполимеразы, обладающей 5` экзонуклеазной активностью.

Определение наличия мутации Jak Этот процесс состоял из нескольких этапов. Первый - ПЦР-амплификация с целью получения фрагмента, содержащего Jak2мутацию, второй - очистка полученного фрагмента с помощью электрофореза в 6 % полиакриламидном геле. Участки гелей, содержащие интересующие ПЦР-продукты, вырезали, тщательно растирали и суспендировали в 400 мкл буфера для элюции содержащего 1,0 М NaCl в буфере ТЕ. Образцы инкубировали при 50С0 в течение 12ч, затем осколки геля осаждали на центрифуге EPPENDORF при 12 тыс. оборотов в мин. Супернатант переносили в другую пробирку, элюированную ДНК высаживали тремя объемами этанола, причем после добавления спирта пробирки трижды замораживали-оттаивали с помощью жидкого азота. После осаждения ДНК на центрифуге EPPENDORF 5415 при 12 оборотов в мин. супернатант удаляли, осадок ДНК промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в 10 мкл деионизированной воды. 1 мкл этого раствора использовали для определения полноты элюции и качества препаративного выделения ПЦР-фрагмента с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле. Правильность полученных фрагментов подтверждалась методом секвенирования продуктов ПЦР в ЦКП «Геном» на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Использовался прибор: автоматический секвенатор ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (4-х капиллярный).

Выявление эндогенных эритропоэтин-независимых колоний (ЭЭК) Оценка роста эритроидных колоний была проведена в лаборатории физиологии кроветворения. Исследовали периферическую кровь 59 пациентов с диагнозом хМПЗ. Эндогенные эритроидные колонии, образованные из эБОЕ-Э, и стимулированные колонии, образованные из БОЕ-Э, оценивали в полутвердых культурах в мтц.

Уровень эритропоэтина Для всех больных, вошедших в исследование, в лаборатории оХТЛ и патологии эритрона был определен уровень эритропоэтина. Применялся иммуно – ферментный метод с использованием наборов фирмы ProCon С.-Петербург, Россия.

Гистологиеское исследование костного мозга.

Пациентам, вошедшим в исследование, гистологическое исследование костного мозга проводилось в патологоанатомическом отделении ГНЦ РАМН.

Для статистической обработки полученных данных применялись следующие методики:

1. Описательная статистика 2. Однофакторный дисперсионный анализ 3. Парный двухвыборочный t-тест для средних

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль гиперэкспрессии гена PRV-1 и мутации Jak2 в дифференциальной диагностике между эритремией и вторичными эритроцитозами, а также внутри группы хронических миелопролиферативных заболеваний (хМПЗ).

В нашем исследовании уровень экспрессии гена PRV-1 в группе здоровых доноров, относительно которого сравнивались уровни экспрессии других групп, составил от 0,117 до 7,17. Основной задачей нашего исследования было определение специфичности новых генетических маркеров гена PRV-1 и мутации Jak2 при проведении дифференциальной диагностики между эритремией и вторичным эритроцитозом, а также внутри группы хМПЗ. Были получены следующие данные.

Из 46 обследованных пациентов с диагнозом эритремии гиперэкспрессия гена PRV-1 была выявлена в 37 из 46 случаев (80%), у пациентов с диагнозом эссенциальной тромбоцитемии в 4 из 15 (27%) случаев и идиопатическим миелофиброзом в 4 из 8 (50%) случаев. Ни у одного пациента с диагнозом вторичного эритроцитоза, или здорового контроля не было обнаружено гиперэкспресии PRV-1. Полученные результаты показали, что гиперэкспрессия эритроцитозом, но не внутри группы хМПЗ. Это можно утверждать, поскольку гиперэкспрессия гена была выявлена в 27% у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией и 50% у пациентов с идиопатическим миелофиброзом.

Полученные результаты приведены на рисунке 1.

Рисунок 1. Различие экспрессии гена PRV-1 у больных эритремией, эссенциальной тромбоцитемией, идиопатическим миелофиброзом, вторичным эритроцитозом и здоровых доноров.

Определение мутации Jak2V617F проводилось 22 больным с эритремией, 6 с вторичным эритроцитозом и 3 здоровым донорам. Данный генетический дефект был выявлен у всех 22 пациентов с диагнозом эритремии, но не выявлен ни в случаях вторичного эритроцитоза, ни у доноров. Кроме определения «наличия-отсутствия» мутации Jak2, было вычислено соотношение мРНК, несущих и не несущих мутацию для каждого пациента. Исследование проводили на фоне терапии различными цитостатическими препаратами (гидроксимочквина, IFN-), а также у первичных и не получавших цитостатической терапии пациентов.

Результат графически отображен на рисунке 2.

Рисунок 2. Соотношение mRNA, несущих и не несущих мутацию Jak V617F, у пациентов с эритремией, получавших различную терапию.

Данные, представленные на рисунке 2, показывают, что в зависимости от терапии, которую получали пациенты с диагнозом эритремии, доля mRNA, несущих мутацию Jak2, менялась. Наибольшее количество mRNA, несущих гидроксимочевиной.

Возможно, что это также говорит о меньшей по сравнению с IFNэффективности терапии этим препаратом. Эти данные требуют дальнейшего исследования и уточнения. Таким образом, результаты, полученные при изучении мутации (а также имеющиеся литературные данные), позволяют сказать, что является специфичным маркером при проведении дифференциальной диагностики между эритремией и вторичным эритроцитозом.

Вероятно, в дальнейшем будут разработаны методики, которые позволят на основании количественного определения DNA, клеток несущих мутацию, определять эффективность проводящейся терапии.

Оценка уровня экспрессии гена PRV-1 для определения эффективности проводимой терапии.

Следующей задачей нашего исследования было определение влияния цитостатической терапии на уровень экспрессии гена PRV-1.

Как видно из рисунка 1, у 9 (20%) пациентов с диагнозом эритремии уровень экспрессии гена PRV-1 приближается к уровню здорового контроля, что не соответствует литературным данным, которые указывают, что частота этого признака у первичных больных эритремией достигает 90-98%. Причиной этого может быть терапия, которую получали пациенты.

В нашем исследовании только 5 человек, вошедших в группу №1, были первичными, остальные получали различную цитостатическую терапию (IFNкак монотерапию, так и совместно с гидроксимочевиной и гидроксимочевину в монорежиме). В группу пациентов №2, получавших монотерапию гидроксимочевиной, вошли 25 человек. Средняя продолжительность терапии составила 44,7 месяцев до первого определения уровня экспрессии гена PRV-1.

Средняя доза препарата 1,5 гр/сутки. На фоне проводившейся терапии клинико-гематологической ремиссии достигли 6 из 25 пациентов. Из них у была повышенная экспрессия гена PRV, а у 3 на уровне здорового контроля.

Десяти пациентам из этой группы через 8 месяцев было проведено повторное динамическое определение уровня экспрессии гена.

Результаты показали, что у 3 пациентов уровень экспрессии PRV-1 возрос, а у снизился,рисунок3.

PRV-1/B2m Рисунок 3. Изменение в динамике уровня экспрессии гена PRV-1 у гидроксимочевиной.

Режим проводящейся терапии гидроксимочевиной не менялся, состояние пациентов оставалось стабильным, тромбо-геморрагических осложнений не отмечалось. Следовательно, можно сделать вывод, что на фоне терапии гидроксимочевиной нет зависимости между длительностью терапии и уровнем экспрессии гена PRV-1.

Несколько другая картина наблюдалась в группе пациентов, получавших монотерапию препаратами IFN-а, или же совместно с гидроксимочевиной. В эти группы вошли 4 и 8 пациентов соответственно. Из них гематологической ремиссии (полной и частичной) в группе пациентов, получавших совместную терапию IFN- с гидроксимочевиной (группа №3), достигли 6 из 8 человек, а в группе моно терапии IFN- 4 из 4 (группа №4).

отмечено у 2 из 8 пациентов из группы №3 и 2 из 4 из группы №4. Различие между уровнями экспрессии гена PRV-1 в группе №3 и группе здоровых доноров было не достоверным (p=0,1097). Этот факт отличал эту группу от групп пациентов, получавших монотерапию гидроксимочевиной, IFN-, а также не получавших цитостатической терапии, где между уровнями экспрессии гена у здорового контроля и пациентов, входящих в эти группы соответственно. Эти данные позволяют предположить, что терапия в группе эффективна по сравнению с терапией, которую получали пациенты в других группах. Пяти пациентам из группы №3 и 2 из №4, было проведено повторное определение уровня экспрессии гена PRV-1 через 8 месяцев. За этот период доза и режим приема гидроксимочевиной и IFN- не менялся, в состоянии пациентов из группы №3 и 2 из группы №4 отмечалась положительна динамика в виде полной нормализации показателей гемограммы. У остальных пациентов состояние оставалось стабильным, тромбо-геморрагических осложнений не отмечалось.

PRV-1/B2m Рисунок 4. Изменение в динамике уровня экспрессии гена PRV-1 у Наши данные, графически представленные на рисунке 4, а также данные, полученные рядом зарубежных исследователей, демонстрируют зависимость уровня экспрессии гена PRV-1 от длительности терапии препаратами IFN-.

Однако только дальнейшее увеличение числа наблюдений и мониторинг уровня экспрессии гена PRV-1 позволит оценить значение данного теста для оценки эффективности проводящейся терапии препаратами IFN-.

Сопоставив уровни экспрессии гена PRV-1 пациентов с эритремией и результатами терапии этих пациентов (без учета разных программ терапии), мы получили следующие результаты (представлены на рисунке 5).

РЕМИССИЯ

РЕМИССИИ

Рисунок 5. Сопоставление уровня экспрессии гена PRV-1 и клинического состояния больных эритремией, независимо от проводившейся терапии.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что большое число больных с нормальным уровнем экспрессии гена PRV-1 находится в группе достигших ремиссии. Следовательно, можно предположить, что улучшение клинико-гематологического состояния больных как правило сопровождается снижением уровня экспрессии гена PRV-1.

молекулярными маркерами, применяющимися в диагностике эритремии и уровнем эритропоэтина.

Завершающей задачей было выявить совпадение молекулярно-генетических маркеров (PRV-1, Jak2V617F, эндогенных эритропоэтин-независимых колоний (ЭЭК), эритропоэтин) у пациентов с эритремией и попытаться оценить их осложнений. Совпадение гиперэкспрессии гена PRV-1 с ростом эндогенных эритроидных колоний отмечалось у 19 из 36 пациентов, которым были проведены оба исследования. Для 22 пациентов была определена мутация Jak в дополнение к ЭЭК, экспрессии гена PRV-1 и низкому уровню эритропоэтина.

Было выявлено совпадение Jak2/ PRV-1 у 19 из 22 (86,4%) пациентов, Jak2/ЭЭК у 19 из 22 (86,4%) пациентов, Jak2/ PRV-1/ ЭЭК/низкий уровень эритропоэтина у 10 из 22 (45,5%) пациентов. Результаты представлены на рисунке 6.

Э ритро по этин

ЭЭК ЭЭК ЭЭК

гена P R V -1, м ута ци я Jak2, р ост эн д о генн ы х эр и тро по этин -незав ис им ы х кол они й (Э Э К ), эри тр оп оэ ти н.

Рисунок 6. Оценка совпадения молекулярно-генетических маркеров в группе больных эритремией.

При оценке совпадения между этими маркерами необходимо учитывать, что большинство пациентов перед проведенными исследованиями получали циторедуктивную терапию IFN- или гидроксимочевиной, а также комбинацию этих препаратов.

Влияние проводившегося лечения на процесс формирования ЭЭК, а также уровень экспрессии гена PRV-1 и эритропоэтина до конца не изучено, так же как и влияние каждого из них на фенотип заболевания. Кроме того, неизвестна степень «чувствительности» каждого признака к проводящейся терапии и скорости нивелирования на ее фоне.

Небольшое число пациентов, а также непродолжительный период наблюдения (в среднем 8 мес.) за ними не позволили выявить клинические особенности течения заболевания, зависящие от тех или иных генетически-молекулярных маркеров. Возможно, что изучение этих вопросов является целью дальнейших исследований.

Полученные нами данные, а также результаты зарубежных авторов позволяют сделать следующие ВЫВОДЫ:

1. Определение уровня экспрессии гена PRV-1 является эффективным и чувствительным методом, позволяющим с высокой долей вероятности проводить дифференциальную диагностику между эритремией и вторичным эритроцитозом.

2. Новый молекулярный маркер - мутация Jak2, чувствителен в 100% случаев при проведении дифференциальной диагностики между эритремией и вторичными эритроцитозами.

3. Повышение уровня экспрессии гена PRV-1 не может быть использовано для проведения дифференциальной диагностики внутри группы хМПЗ.

4. Выявлена линейная зависимость уровня экспрессии гена PRV-1 от длительности терапии Интерфероном-альфа.

5. Не установлена зависимость уровня экспрессии гена PRV-1 у пациентов с гидроксимочевины.

6. Отсутствию ремиссии у пациентов с эритремией соответствует гиперэкспрессия гена PRV-1. Достижение частичной ремиссии в 50% случаев сопровождается нормализацией уровня экспрессии PRV-1. У всех пациентов с полной клинико-гематологической ремиссией отмечается нормальный уровень экспрессии гена PRV-1.

7. Определена частота совпадения молекулярных маркеров эритремии Jak2/ PRV-1 в 86,4%, Jak2/ЭЭК в 86,4%, Jak2/ PRV-1/ ЭЭК/низкий уровень эритропоэтина в 45,5% случаев соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Всем первичным пациентам, которым проводится дифференциальная диагностика между вторичным эритроцитозом и эритремией, показано определение наличия гиперэкспрессии гена PRV-1 и мутации Jak2.

2. Определение в динамике уровня экспрессии гена PRV-1 у пациентов, получающих терапию препаратами IFN- как в монорежиме, так и в комбинации с другими цитостатическими препаратами, поможет наряду с клиническими данными, более глубоко оценить эффективность проводимой терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Tutaeva V.V., Sokolova M.A., Tzvetaeva N.V., Semenova E.A., Ivanova V.L., Kolosheinova T.I., Misurin A.V., Khoroshko N.D. Application of PRV- mRNA expression level and JAK2V617F mutation for differential diagnostics between polycytemia vera and secondary erythrocytosis. Influence of Interferon therapy on PRV-1 expression. 11th congress of the European Hematology Association 2006 June 2 - 5 2006, poster session I, № 2.Tutaeva V.V., Sokolova M.A., Tzvetaeva N.V., Semenova E.A., Ivanova V.L., Kolosheinova T.I., Misurin A.V., Khoroshko N.D. Influence of long term Hydroxyurea treatment on PRV-1 expression level in polycytemia vera patients. 11th congress of the European Hematology Association 2006 June 2 poster session I, № 3.Тутаева В.В., Цветаева Н.В., Соколова М.А., Меликян А.Л., Колошейнова Т.И., Колосова Т.И., Левина А.А., Манакова Т.Е., Семенова Е.А., Мисюрин А.В., Хорошко Н.Д. Значение гиперэкспрессии гена PRVи мутации Jak2 в дифференциальной диагностике эритремии.

Проблемы гематологии и переливания крови. 2006; №2:c 4. Цветаева Н.В., Хорошко Н.Д., Соколова М.А., Шмакова Р.В., Семенова Е.А., Лопухин О.В., Романова Е.А., Судариков А.В., Васильев С.А., Орел Е.Б., Рудакова В.Е., Иванова В.Л., Серебряная Л.А., Седова Г.Т., Манокова Т.Е., Тутаева В.В., Левина А.А., Мамукова Ю.И. Хронические миелопролиферативные заболевания и беременность. 2006; №10: с 68-

 
Похожие работы:

«ОМАРОВ Омар Ильясович ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ НЕСОСТОЯТЕЛЬНОСТИ ПИЩЕВОДНО - ЖЕЛУДОЧНОГО ПЕРЕХОДА ПРИ АКСИАЛЬНЫХ ГРЫЖАХ (экспериментально-клиническое исследование) 14.01.17 – хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Махачкала - 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Дагестанская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской...»

«Белопасова Анастасия Владимировна ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ РЕЧЕВОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С ПОСТИНСУЛЬТНОЙ АФАЗИЕЙ Специальность 14.01.11 – нервные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научный центр неврологии Российской академии медицинских наук Научные руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Кадыков Альберт Серафимович Научный консультант...»

«ЧЕЛНОКОВА Наталья Олеговна ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ХИРУРГИЧЕСКОЙ ТАКТИКИ ОПЕРАЦИЙ В БАССЕЙНЕ ПРАВОЙ ВЕНЕЧНОЙ АРТЕРИИ НА ОСНОВЕ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ И МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ НАРУШЕНИЙ ГЕМОДИНАМИКИ 14.03.02 – патологическая анатомия 14.01.17 – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Саратов – 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«Глецян Лилит Генриковна КЛИНИКО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЖИЛЫХ БОЛЬНЫХ С ПОРОКАМИ СЕРДЦА И НЕПОСРЕДСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ. (14.01.05 – кардиология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2011г. Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А. Н. Бакулева Российской академии медицинских наук. Научные руководители: доктор...»

«1 НА ПРАВАХ РУКОПИСИ СЕРЕБРОВА СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ СОВРЕМЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ ПРОТОННОЙ ПОМПЫ 14.00.25 – Фармакология, клиническая фармакология 14.00.05 – Внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук МОСКВА 2009 2 Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ, Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кукес Владимир Григорьевич...»

«Саутин Максим Евгеньевич ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИ НАПРАВЛЕННАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ ПСОРИАЗА И АТЕРОСКЛЕРОЗА АТОРВАСТАТИНОМ С УЧЕТОМ ОБЩИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФАКТОРОВ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2014 г. 2 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Пирузян...»

«СЕРОВА Ольга Алексеевна ОСОБЕННОСТИ ПОРАЖЕНИЯ ПИЩЕВОДА У ДЕТЕЙ 14.01.08 - Педиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ярославской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Ситникова Елена Павловна...»

«Калинин Владимир Анатольевич Клинико-электрофизиологические особенности и течение эпилепсии в различных возрастных группах 14.01.11 – нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Саратов – 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный консультант :...»

«ПОГУДИНА Анна Сергеевна КЛИНИКО-МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИПОКСИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У НОВОРОЖДЕННЫХ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА 14.01.08 – педиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Томск 2014 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской...»

«ФЕДОРОВ Сергей Павлович ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФАРМАКОДИНАМИКА РАБЕПРАЗОЛА 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология 14.00.05 – внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА 2008 Работа выполнена в Филиале Клиническая фармакология Научного центра биомедицинских технологий РАМН Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор БОГДАНОВ Александр Николаевич Кандидат медицинских наук СЕРЕБРОВА Светлана Юрьевна...»

«Глечян Ануш Михайловна Клиническая эффективность периндоприла и его влияние на диастолическую функцию и ремоделирование левого желудочка, жесткость магистральных артерий и эндотелий – зависимую вазодилатацию у пациентов с артериальной гипертонией и сердечной недостаточностью c сохраненной систолической функцией левого желудочка. 14.01.05– кардиология 14.01.13 - лучевая диагностика, лучевая терапия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук...»

«БУРЕНКОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ РАННЕЙ ГЕСТАЦИИ У ЖЕНЩИН С ИНСУЛИНЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 14.01.01 - Акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА 2012 2 Работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии с курсом перинатологии ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов Научные руководители: профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии ГОУ ВПО РУДН, доктор медицинских...»

«ХАФИЗОВА ФЛЮРА АСХАТОВНА КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЕ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТАКТИКИ ЛЕЧЕНИЯ РАЗНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ ХРОНИЧЕСКОГО ТОНЗИЛЛИТА 14.01.03 – болезни уха, горла и носа 14.03.02 – патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва–2012 2 Работа выполнена в Уфимском филиале ФГБУ Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Дайхес Николай...»

«ПОПКОВА НАДЕЖДА ИСИНГИЛЬДИНОВНА НЕКОТОРЫЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОНИЙ У ДЕТЕЙ ОРЕНБУРГСКОГО РЕГИОНА 14.01.08 – педиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург – 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации....»

«Щербакова Наталия Егоровна Современные методы обезболивания и критерии их эффективности при хронических головных болях напряжения 14.01.20 – анестезиология и реаниматология 14.01.11 – нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского Российской академии медицинских наук Научный...»

«ИВЖЕНКО Евгения Владимировна ФИЗИОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРОВ, ФОРМИРУЮЩИХ ЗДОРОВЬЕ ВОСПИТАННИКОВ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ОПЕКИ 14.02.01 – Гигиена Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург — 2013 г. Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской...»

«Темрезов Марат Бориспиевич КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ С КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ (14.01.26 – сердечно-сосудистая хирургия) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2012 1 Диссертационная работа выполнена на кафедре сердечно-сосудистой хирургии Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования и на базе...»

«Сорокин Александр Владимирович ВЛИЯНИЕ ОМЕГА-3 ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА ПОКАЗАТЕЛИ ВОСПАЛЕНИЯ И АТЕРОГЕНЕЗ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.01.05 - кардиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Курск - 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства...»

«Красильникова Богдана Борисовна Первичные лимфатические опухоли орбиты и придаточного аппарата глаза 14.00.29 – Гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН. Научные руководители: кандидат медицинских наук, доцент Кравченко С.К. доктор медицинских наук, профессор Гришина Е.Е. Официальные...»

«БАЗАРОВА НАДЕЖДА ЦЫРЕНОВНА НООТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА НООФИТ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Улан-Удэ – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук Научный руководитель : Николаев Сергей Матвеевич – доктор медицинских наук, профессор...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.