WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Горчакова

Светлана Владимировна

СТРУКТУРА ВАРИАБЕЛЬНОГО РЕГИОНА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ МИЕЛОМНОЙ НЕФРОПАТИИ

14.01.21- Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 2011 г.

2

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научные руководители:

доктор медицинских наук Бирюкова Людмила Семеновна кандидат медицинских наук Никитин Евгений Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Голенков Анатолий Константинович доктор медицинских наук Головкина Лариса Леонидовна Ведущее научное учреждение:

Федеральное Государственное учреждение Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «29» июня 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном Государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 125167, Москва, Новый Зыковский проезд,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Гематологического научного центра Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «26»мая 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н. Зыбунова Е.Е.

Введение Актуальность проблемы.

Нефропатия является ведущим клиническим проявлением при множественной миеломе (ММ). В момент диагностики ММ признаки почечной недостаточности (ПН) выявляют в 40-50% случаев [Herrera G.A. et al., 2004; Sanders P.W., 2005; EleutherakisPapaiakovou V. et al., 2007]. Главным патогенетическим звеном в развитии миеломной нефропатии является секреция легких цепей (ЛЦ) иммуноглобулинов, которые могут вызывать повреждения различных структур нефрона: как канальцев, так и клубочков.

Наиболее частым (в 63-87% случаях) вариантом поражения почек при ММ является цилиндровая нефропатия [Ronco P., Aucouturier P. et al., 2001].

Под термином «цилиндровая нефропатия» (миеломная нефропатия, cast nephropathy) понимают поражение почек вследствие формирования белковых преципитатов (цилиндров или слепков) в дистальных канальцах и собирательных трубках. Цилиндры вызывают обструкцию дистальных канальцев и собирательных трубочек, что приводит к интерстициальному воспалению и фиброзу. Клинически выявляют признаки уремии с высоким уровнем азотемии. Эффективное лечение ММ приводит к улучшению функции почек в 50% случаев цилиндровой нефропатии [Barosi G., Boccadoro M. et al., 2004].

Образование цилиндров происходит при взаимодействии CDR3 (англ.

complemetary-determining region) участка вариабельного домена ЛЦ и гликопротеида Тамма-Хорсфолля, секретируемого эпителием восходящего отдела петли Генле [Huang Z.Q., Sanders P.W., 1997].

В патогенезе нефротоксичности определяющее значение имеют физикохимические свойства ЛЦ, их тропность к различным отделам нефрона и степень адгезии [Solomon A. et al., 1991; Preudhomme J.L. et al., 1994; Stevens F.J. et al., 1999;

Sanders P.W., 2005]. В частности, известны случаи высокого уровня секреции белка Бенс-Джонса в течение длительного времени без нарушения функции почек [Sanders P.W., 2005]. В то же время при секреции ЛЦ в минимальном количестве может развиться тяжелое необратимое поражение почек. В экспериментальных исследованиях in vitro было обнаружено [Ying WZ, Sanders PW, 2001], что способность ЛЦ взаимодействовать с гликопротеидом Тамма-Хорсфолля различна и зависит от строения CDR3 участка вариабельного домена ЛЦ.

Таким образом, CDR3 участок вариабельного домена определяет нефротоксичные свойства легких цепей и их способность вызывать развитие цилиндровой нефропатии при ММ. Изучение строения CDR3 участка вариабельного домена во взаимосвязи с клиническими проявлениями ММ позволит углубить представления о патогенезе формирования цилиндровой нефропатии, а также степени обратимости почечной недостаточности в каждом конкретном случае.

Цель исследования.

Установить значение структуры вариабельного региона и конкретно CDR участка легких цепей и их изоэлектрической точки в патогенезе цилиндровой нефропатии у больных множественной миеломой.

Задачи исследования.

1. Определить нуклеотидные последовательности вариабельных регионов легких цепей, синтезируемых плазматическими клетками у больных множественной миеломой с цилиндровой нефропатией и без нее.

2. Провести анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей вариабельных регионов легких цепей, включающий:

• оценку репертуара используемых V и J генов легких цепей у больных множественной миеломой с цилиндровой нефропатией и без нее, • установление степени гомологии V генов легких цепей герминальным генам.

• расчет изоэлектрической точки для вариабельного региона и CDR3 каждой легкой цепи.

• сравнение вариабельных регионов у больных множественной миеломой с цилиндровой нефропатией и без нее, используя методы компьютерного моделирования.

3. Проанализировать вероятность развития цилиндровой нефропатии и тяжесть поражения на основании анализа нуклеотидной последовательности вариабельного региона легкой цепи.

4. Исследовать клинические и лабораторные факторы риска развития цилиндровой нефропатии.

Научная новизна.

Установлена первичная структура вариабельного региона и CDR3 легких цепей, а также их изоэлектрическая точка у пациентов с миеломной нефропатией и без нее. Изучено прогностическое значение этих показателей при развитии цилиндровой нефропатии. Выявлен репертуар используемых семейств генов вариабельного региона у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее.

Научно-практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований многие данные получены впервые:

определены закономерности в использовании определенных семейств генов вариабельных регионов в синтезе легких цепей при множественной миеломе, установлено, что у пациентов с миеломной нефропатией и без нее нет различий в репертуаре используемых семейств генов вариабельных регионов. В результате проведенных исследований выявлено, что на основании первичной и вторичной структуры вариабельных регионов легких цепей, аминокислотного состава CDR3, изоэлектрической точки вариабельного региона легкой цепи и CDR3, невозможно установить их способность к образованию цилиндров с белком Тамма-Хорсфолля в почечных канальцах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для пациентов с множественной миеломой характерно использование специфического репертуара семейств генов вариабельного региона легких цепей. В группе V-генов достоверно чаще представлено I семейство. Среди J-генов чаще всего используется JII. В группе больных с секрецией лямбда легких цепей, преобладают V гены I и III семейств. Использование J –генов осуществляется только за счет II/III семейств.

2. Для пациентов с цилиндровой нефропатией характерно использование того же репертуара генов вариабельного региона легких цепей, что и для пациентов без цилиндровой нефропатии.

3. Гены вариабельного региона легких цепей, используемые миеломными клетками, совпадают с герминальными генами менее чем на 98%, что говорит о многочисленных мутациях. Накопление мутаций с заменой аминокислот в районах CDR свидетельствует о возможном контакте с антигеном.

4. На основании анализа первичной и вторичной структуры вариабельного региона легких цепей невозможно прогнозировать ее способность к образованию цилиндров с белком Тамма-Хорсфолля в почечных канальцах.

5. Развитие цилиндровой нефропатии коррелирует со стадией заболевания, определяемой по Durie-Salmon и по международной системе стадирования.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Апробация диссертации:

Основные положения работы доложены в виде стендового доклада и опубликованы на Всемирном конгрессе по нефрологии (Италия, Милан, 2009г.).

World Congress of Nephrology. (Italy, Milan, 2009). «Amino Acid Sequence of the Variable Region of Light Chains in multiple myeloma patients». Работа апробирована на заседании проблемной комиссии (ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России, Москва, 1 марта 2010 года).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 108 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методической главы, главы собственных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 2 рисунками, 8 схемами и фотографиями. Список литературы включает 143 источника: отечественные – 8, зарубежные – 135. Диссертация выполнена в отделении скорой медицинской помощи, полиорганной патологии и гемодиализа ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России (руководитель д.м.н. Л.С. Бирюкова), в лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России (заведующий лабораторией к.б.н. А.Б.

Судариков).

Материалы и методы исследования.

1. Общая характеристика больных, включенных в исследование.

В исследование включено 39 больных миеломной болезнью, проходивших лечение в ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России. Диагноз ММ был установлен в соответствии со стандартными клиническими, морфологическими и иммунохимическими критериями. Стадии заболевания определяли по B. J. M. Durie и S.E. Salmon (1975 г.), а также по международной системе стадирования (ISS).

Миеломная нефропатия была диагностирована у 22 (56,5%) больных. Группу сравнения составили 17 (43,5%) больных ММ, у которых миеломная нефропатия отсутствовала.

2. Выделение мононуклеаров из пунктата костного мозга.

Из костного мозга выделяли мононуклеары стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Мононуклеары костного мозга в количестве 106–107 мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80оС.

3. Выделение РНК и обратная транскрипция.

Из замороженных мононуклеаров костного мозга выделяли РНК с помощью набора RNeasy Mini Kit (“Qiagen”) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию определяли спектрофотометрически. Для обратной транскрипции использовали 2 мкг рибонуклеиновой кислоты (РНК) каждого образца. Одноцепочечную комплиментарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК) синтезировали при помощи обратной транскриптазы M-MLV (“Promega”) и случайных гексануклеотидов в качестве праймеров.

4. Анализ генов легких цепей и.

Определение семейства ЛЦ и.

Для определения клональной перестройки вариабельного региона легких цепей (VL), кДНК амплифицировали отдельно для 7 семейств ЛЦ и 11 семейств ЛЦ. Для этого использовали праймеры, специфичные к VL-семействам (табл. 1).

Полимеразноцепную реакцию (ПЦР) проводили в программируемом термостате "Perkin Elmer" в объеме 25 мкл, добавляя 3 мкл кДНК в 5-кратном разведении, 5 пмоль каждого праймера и смесь для ПЦР (“Promega”). После первоначальной денатурации (5 мин при 95оС) цикл с условиями 95оС 30 с, 60оС 30 с, 72оС 30 с повторяли 35 раз, после чего следовала 10-минутная инкубация при температуре 72оС. Анализ результатов проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1 мкг/мл) в TBE буфере (10х TBE: 1M Tris, 0,83 M борная кислота, mM EDTA) при напряженности электрического поля 0,10–0,15 B/м. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде светящихся полос при возбуждении ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм.

Последовательности праймеров, специфичные к VL-семействам.

После определения клонального продукта образец нарабатывали в объеме 50 мкл с праймером, специфичным соответствующему семейству V-генов. Клональный продукт очищали также методом электрофореза в 2% агарозном геле, после чего элюировали с помощью набора Diatom DNA Elution (Биоком, Москва, Россия).

Секвенирование ПЦР- продукта.

ПЦР-продукт секвенировали с праймера, специфичного семейству перестроенных V-, Vгенов, с использованием набора Big Dye Terminator на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100Avant (Applied Biosystems, “Foster City”, США).

Множественное выравнивание последовательностей и определение вторичной структуры.

Полученные последовательности анализировали, используя открытые базы данных IgBlast [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast] и IMGT software [http://imgt.cines.fr:8104]. Множественное выравнивание последовательностей выполняли с помощью программ ClustalW [http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2/index.html] и KALIGN [http://www.ebi.ac.uk/Tools/kalign/index.html].

Определение вторичной структуры проводили при помощи алгоритма Phyre [Protein structure prediction on the web: a case study using the Phyre server Kelley LA and Sternberg MJE. Nature Protocols 4, 363 - (2009)].

Расчет изоэлектрической точки вариабельного региона и CDR3.

Изоэлектрическую точку вариабельного региона и CDR3 рассчитывали с помощью программы Calculation of protein isoelectric point [http://isoelectric.ovh.org/].

При анализе расчетной изоэлектрической точки вариабельных регионов ЛЦ и CDR сравнивались группы с миеломной нефропатией и без нее.

Статистический анализ.

Достоверность гипотез для непараметрических данных проверяли с помощью критерия 2 с поправкой Йейтса, для параметрических – с помощью критерия Стьюдента. Множественное выравнивание последовательностей и определение вторичной структуры проводились с помощью программ KALIGN и ClustalW2.

Результаты.

1. Характеристика больных, включенных в исследование.

В исследование было включено 39 пациентов с множественной миеломой.

Среди них были 24 мужчины, 15 женщин (1,6:1). Медиана возраста группы составила 58 лет, разброс от 37 до 82 лет. 28 больных имели стадии ММ III B, стадии III A, II B, II A имели 5, 3 и 3 пациентов соответственно (таблица 2 и таблица 3). Пациентов лечили различными терапевтическими режимами, включая VAD, M2, MP, PAD, высокодозную химиотерапию с последующей трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток крови (ВДХТ с ТСКК).

У 22 (56,5%) больных была диагностирована миеломная нефропатия. Из них у 9 она была установлена на основании результатов биопсии почки. У 13 пациентов цилиндровая нефропатия была констатирована на основании разработанных нами в результате длительного наблюдения за больными следующих клинических критериев цилиндровой нефропатии.

Клинические критерии цилиндровой нефропатии.

1. повышение креатинина более 177 мкмоль/л при наличии белка Бенс-Джонса 2. выявление прямой корреляции между ПН и уровнем моноклональной секреции и ответом на цитостатическую терапию;

3. регресс ПН в течение 3 и более месяцев на фоне цитостатической терапии;

4. отсутствие предсуществующих хронических заболеваний почек.

Группу сравнения составили 17 (43,5%) больных ММ, у которых миеломная нефропатия отсутствовала.

«Золотым стандартом» диагностики поражения почек по типу цилиндровой нефропатии является биопсия. В группе исследованных пациентов биопсия была выполнена всего у 11 из 39 больных. В связи с этим мы пользовались клиническими критериями, выработанными нами на основании собственных наблюдений.

Общая характеристика больных, включенных в исследование.

курсы Концентрация креатинина 858 (203-2420) 135 (66-756) мкмоль/л (медиана, мин-макс) Уровень моноклональной 33,8 (10,5-78) 57,8 (4,6-84) секреции иммуноглобулинов в плазме г/л (медиана, мин-макс) Концентрация белка Бенс- 2,0(0,21-7,5) 0,63(0,01-3,9) 1, По нашим данным, наблюдающаяся у части пациентов ПН разрешается в течение 1 месяца после начала лечения (госпитализации). В таких случаях речь идет об острой почечной недостаточности (ОПН), обусловленной комплексом факторов, в том числе гиперкальциемией, дегидратацией, септическими осложнениями, гиперурикемией, возникающей при повышенном распаде опухолевых клеток на фоне химиотерапии. Как правило, при коррекции данных нарушений функция почек полностью восстанавливалась в течение 3 недель – 1 месяца.

Истинная цилиндровая нефропатия не купируется столь быстро. Ни у кого из наших пациентов она не разрешилась ранее 3-месячного срока. 90% больных с поражением почек при ММ в качестве ведущего патогенетического механизма имеют именно миеломную (цилиндровую) нефропатию. Руководствуясь данными критериями, мы распределили пациентов на две группы: с цилиндровой нефропатией и без нее. Из 39 пациентов, включенных в исследование, 11 была проведена биопсия почки. Из них у 9 была диагностирована цилиндровая нефропатия, у 2 пациентов редкие варианты поражения почек при ММ: болезнь депозитов тяжелых цепей (БДТЦ) и иммунотактоидный гломерулонефрит. У 1 пациента было выявлено сочетанное поражение почек: болезнь депозитов ЛЦ (БДЛЦ) и цилиндровая нефропатия. Остальным пациентам биопсию не выполняли.

1.1. Характеристика больных с цилиндровой нефропатией.

В группу с поражением почек по типу цилиндровой нефропатии были отнесены 22 пациента. У 13 пациентов цилиндровая нефропатия была констатирована на основании выработанных нами клинических критериев, у 9 - на основании данных биопсии. В дебюте заболевания 16 больным потребовалось проведение заместительной почечной терапии (ЗПТ). Из них у 2 пациентов с доказанной биопсией цилиндровой нефропатией, произошло постепенное улучшение функции почек (в течении 3 месяцев), позволившее прекратить проведение гемодиализа. В обоих случаях улучшение функции почек происходило на фоне снижения уровня моноклональной секреции в результате проводимой полихимиотерапии (ПХТ).

У 14 пациентов с цилиндровой нефропатией на фоне проводимого лечения функция почек не улучшилась, и они остались зависимыми от заместительной почечной терапии.

У 6 пациентов в дебюте заболевания была выявлена ПН, не требующая проведения заместительной почечной терапии. В данной группе улучшение функции почек, коррелирующее с уровнем моноклональной секреции, отмечалось у 3 больных.

У одного из этих пациентов цилиндровая нефропатия была верифицирована с помощью биопсии почки.

1.2. Характеристика больных без цилиндровой нефропатии.

В группе сравнения из 17 пациентов у 2 отмечались редкие варианты поражения почек: иммунотактоидный гломерулонефрит и БДТЦ. Варианты поражения почек верифицированы на основании исследования биоптата почки.

Данные пациенты нуждались в заместительной почечной терапии. Также у пациентов наблюдали нарушения функции почек, обусловленные гиперкальциемией – у 2 пациентов, дегидратацией – у 1, гиперурикемией - у 1, септическими осложнениями у пациентов. Как правило, данные нарушения носили приходящий характер и быстро купировались на фоне проводимой терапии.

Сводная таблица по результатам исследования (начало). Пояснения к таблице 3: VL-V ген вариабельного региона, JL-J ген вариабельного региона, Ip VL- изоэлектрическая точка вариабельного региона, Ip CDR3- изоэлектрическая точка CDR3.

Сводная таблица по результатам исследования (продолжение). Пояснения к таблице 3: VL-V ген вариабельного региона, JL-J ген вариабельного региона, Ip VL- изоэлектрическая точка вариабельного региона, Ip CDR3- изоэлектрическая точка CDR3.

2. Анализ использованных генов вариабельных регионов ЛЦ.

При анализе последовательностей генов вариабельного региона у всей группы больных ММ была установлена разная степень гомологии с герминальными VLгенами. В подавляющем большинстве случаев процент гомологии герминальным V генам и составил менее чем 98% за счет многочисленных мутаций (медиана 89%, мин -71%, макс – 97%). Таким образом, VL-гены, используемые миеломными клетками, во всех случаях обнаруживали признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствовало о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли.

В ходе мутационного процесса в герминальных центрах происходит селекция клонов, обладающих наибольшей аффинностью к данному антигену. В ходе созревания антител происходит неслучайное накопление мутаций, приводящих к аминокислотной (несинонимной) замене в районах, определяющих комплементарность (CDR). В каркасных районах (FWR) мутации распределены случайно. В случае VL-генов человека, в распоряжении исследователя имеется одна последовательность, и поэтому факт отбора мутаций можно выявить при сравнении частоты мутаций c аминокислотной заменой в CDR и FWR.

В отсутствие отрицательного или положительного селекционного воздействия на ген, мутационный процесс должен приводить к случайному и равномерному распределению мутаций. В случае иммуноглобулинов, селекционное воздействие осуществляется по белковому продукту, то есть отбираются мутации, приводящие к аминокислотным заменам (несинонимные).

В нашей группе исследованных пациентов выявляется кластерирование (накопление) несинонимных мутаций в районах CDR, т.е. последовательность VL имеет признаки целенаправленной селекции антигеном.

Характер использования VL-генов в нашей выборке больных ММ отличается от репертуара у здоровых доноров (табл. 4, 5).

В группе V -генов преимущественно представлено I семейство (50%), за счет IGKV1-33*01 (21%), семейства VII и VIII представлены не достаточно по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Среди J-генов чаще всего использованы JII (42%), за счет IGKJ2*01(43%).

В группе больных с секрецией лямбда ЛЦ, преобладали гены I (55%), за счет IGLV1-44*01(27%), и III (36%) семейств, VII было представлено не достаточно, VVI, VV, VVI, VVII, VVIII, VIX и VX не были представлены вообще по сравнению с здоровыми добровольцами. Использование J –генов осуществлялось только за счет JII/III (100%), в то время как у здоровых добровольцев представлены преимущественно JVI(54%) и в меньшей степени JI(7%). Встречавшиеся сочетания V- и J-генов не повторялись чаще 2 раз.

Представленность V и J-генов в нормальном репертуаре и при ММ.

Семейство V – Пациенты с Лимфоциты Семейство J – Пациенты с Лимфоциты Представленность V и J-генов в нормальном репертуаре и при ММ.

Семейство V – Пациенты с Лимфоциты Семейство J – Пациенты с Лимфоциты *- достоверность гипотез проверяли с помощью критерия 2 с поправкой Йейтса на непрерывность. Статистически достоверные различия выделены полужирным начертанием.

Таким образом, при анализе использованных генов вариабельных регионов ЛЦ, мы установили факт постфолликулярного происхождения клеток опухоли, а также признаки целенаправленной селекции антигеном. Репертуар использованных генов вариабельного региона отличается от репертуара в популяции.

3. Сравнение использования VL и JL генов у больных с цилиндровой нефропатией и без нее.

Результаты представлены в таблицах 6 и 7. Различий в использовании конкретных V- и J-генов ЛЦ в группе больных миеломной нефропатией и без нее получено не было.

Использование семейств V-генов и типов у больных с миеломной нефропатией и без нее.

Использование семейств J-генов и типов у больных с миеломной нефропатией и без нее.

Семейство J– Пациенты с ЦН,абс. Пациенты без ЦН,абс.

Семейство J – Пациенты с ЦН, абс. Пациенты без ЦН, абс.

4. Множественное выравнивание.

При проведении множественного выравнивания аминокислотных последовательностей ЛЦ с помощью программ ClustalW2 и KALIGN значимых различий между белками, полученными от больных ММ с цилиндровой нефропатией и без цилиндровой нефропатии, не наблюдалось (рис. 1,2,3,4). Наряду с этим, у больных ММ, не осложненной цилиндровой нефропатией, отмечалась несколько более высокая вариабельность последовательности, в особенности в N-концевых районах белков, в сравнении с группой больных ММ и цилиндровой нефропатией.

Кластерные схемы являются графическим изображением попарного сравнения аминокислотных последовательностей с числовым эквивалентом – процентом схожести. Чем больше процент схожести аминокислотных последовательностей, тем ближе они расположены друг к другу в графической схеме. Независимый кластерный анализ первичной структуры вариабельного региона ЛЦ дает возможность объединить в группы больных, со сходной первичной структурой и общим филогенетическим происхождением ЛЦ. Ожидалось, что ЛЦ пациентов с цилиндровой нефропатией образуют отдельные кластеры, что позволит установить закономерности в аминокислотном строении вариабельных регионов, определяющие способность ЛЦ образовывать белковые цилиндры. В группе больных с секрецией ЛЦ -типа выделено 3 кластера, а в группе больных с секрецией ЛЦ -типа кластера. При этом оказалось, что больные с миеломной нефропатией равномерно распределены и не образуют отдельных кластеров (рис. 1,2).

Аналогичные результаты были получены в отношении гипервариабельных фрагментов ЛЦ – CDR3, CDR2 и CDR1. Различий в распределении полученных аминокислотных последовательностей CDR3 у больных с миеломной нефропатией и без нее не получены (рис. 3,4).

Помимо этого, нами была предпринята попытка обнаружения специфических мотивов в структурах вариабельных регионов у больных с миеломной нефропатией и без нее. Определение вторичной структуры этих фрагментов при помощи алгоритма Phyre не позволило выявить никаких специфических участков – все имеющиеся в нашем распоряжении полипептиды распознавались программой как стандартные ЛЦ иммуноглобулинов, без каких бы то ни было значимых различий во вторичной структуре.

Таким образом, полученные нами данные не позволили выявить определенных закономерностей или различий в первичной и вторичной структуре ЛЦ у больных с миеломной нефропатией и без нее, которые могли бы служить предикторами развития нефропатии.

5. Анализ расчетной изоэлектрической точки вариабельных регионов и CDR3.

В ранее опубликованных исследованиях пытались установить взаимосвязь между нефротоксичностью ЛЦ и их изоэлектрической точкой, причем определяли как изоэлектрическую точку уропротеинов, так и расчетную на основании аминокислотного строения вариабельного региона ЛЦ. В нашем исследовании при анализе расчетной изоэлектрической точки вариабельного региона ЛЦ и CDR достоверных различий в значениях изоэлектрической точки у больных с миеломной нефропатией и без нее получено не было (табл. 8).

Независимый кластерный анализ структуры вариабельных регионов ЛЦ лямбда.

Независимый кластерный анализ структуры вариабельных регионов ЛЦ каппа.

Пояснения к рисункам 1, 2: N1-11, M1-28 – порядковые номера, присвоенные пациентам; IGLV_IGLJ, IGKV_IGKJ – гены, кодирующие вариабельный регион; N – пациенты без МН, Y и выделенные рамкой – пациенты с МН.

Независимый кластерный анализ структуры CDR3 ЛЦ лямбда.

Независимый кластерный анализ структуры CDR3 ЛЦ каппа.

Пояснения к рисункам 3,4: N1-11, M1-28 – порядковые номера, присвоенные пациентам; IGLV_IGLJ, IGKV_IGKJ – гены, кодирующие вариабельный регион; N – пациенты без МН, Y и выделенные рамкой – пациенты с МН.

Анализ изоэлектрической точки вариабельного региона ЛЦ и CDR3.

Тип ЛЦ Изоэлектрическая точка вариабельного региона, Me p Таким образом, можно утверждать, что расчетная изоэлектрическая точка вариабельного региона и CDR3 не может служить предиктором развития цилиндровой нефропатии.

6. Анализ клинических и лабораторных факторов, предсказывающих развитие цилиндровой нефропатии.

Цилиндровая нефропатия является самым частым и потенциально обратимым вариантом поражения почек. В связи с этим представляется особенно важным исследовать клинические/лабораторные показатели, которые позволяли бы предсказывать развитие этого осложнения миеломной болезни. Кроме того, в случае выявления устойчивой ассоциации между развитием цилиндровой нефропатии и структурой ЛЦ, был бы необходим анализ потенциальных вмешивающихся факторов. С учетом изложенного выше, в исследовании предусматривался моно- и многовариантный анализ факторов, ассоциирующихся с цилиндровой нефропатией.

В моновариантный анализ были включены пол, возраст (больше или меньше лет), тип ЛЦ (каппа или лямбда), стадия Durie-Salmon, стадия по международной системе стадирования, семейства VL-генов, изоэлектрическая точка вариабельного региона ЛЦ, изоэлектрическая точка района CDR3, уровень pIg в плазме, тип pIg, количество белка Бенс-Джонса в моче, уровень белка в крови, уровень кальция в сыворотке, уровень бета-2-микроглобулина, уровень гемоглобина, уровень лейкоцитов, уровень тромбоцитов (табл. 9,10).

Качественные признаки, включенные в моновариантный анализ.

В таблицах представлены отдельно качественные и количественные признаки в связи с различием в критериях, использовавшихся для исследования ассоциации. Из всех проанализированных параметров достоверное значение имели только стадия по Durie-Salmon, стадия по международной системе стадирования, количество белка в моче и уровень бета-2-микроглобулина.

В группе больных с уровнем белка Бенс-Джонса в моче более 2 г/л цилиндровая нефропатия наблюдалась в 12 (85%) случаях из 14. Если уровень белка в моче составлял менее 2 г/л, нефропатия развивалась в 42% (11 больных из 26). Рубеж 2 г/л хорошо дискриминирует группы больных, однако индивидуальная предсказующая способность теста не велика (индекс Юдена 0,4).

Количественные признаки, включенные в моновариантный анализ.

Стадия по международной системе Количество белка Бенс-Джонса в В группе больных без цилиндровой нефропатии медиана уровня бета-2микроглобулина составила 5,3 мг/л (разброс 2,1 – 14,3, 25 - 75 персентиль = 3,6 – 10, мг/л). В группе больных с цилиндровой нефропатией медиана уровня бета-2микроглобулина составила 15 мг/л (разброс 4,9 – 35, 25 - 75 персентиль = 11,8 – мг/л). Различия между группами высоко достоверны (p=0,000001, X2).

Бета-2-микроглобулин входит в оценку стадий по международной системе стадирования. Концентрация этого белка повышается при ПН, поэтому этот показатель не может быть включен в многовариантный анализ. Концентрация белка Бенс-Джонса в моче входит в оценку стадий по Durie-Salmon. В связи с этим проведение многовариантного анализа оказалось невозможным.

Таким образом, нам не удалось идентифицировать клинических и лабораторных факторов, не включенных в существующие системы стадирования, которые независимо предсказывали бы вероятность развития цилиндровой нефропатии.

Проведенный нами анализ структуры ЛЦ позволил установить определенные закономерности в использовании семейств VL и JL-генов миеломными клетками.

Репертуар V и V-генов, а также J и J-генов носит специфический характер и не совпадает с частотой использования генов в нормальной популяции. В то же время различий в репертуаре семейств VL и JL генов у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее получено не было.

При анализе последовательностей генов вариабельного региона было установлено, что гомология герминальным генам была менее 97%. VL-гены, используемые миеломными клетками, во всех случаях обнаруживают признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствует о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли. У каждого пациента с множественной миеломой плазматические клетки синтезируют свой уникальный моноклональный продукт, его уникальность обеспечивается именно прошедшей соматической гипермутацией. Ранее существовала гипотеза, что миелома возникает на уровне стволовых клеток. Если бы это было так, то плазматические клетки были бы гетерогенны по секретируемому продукту. Проведенный анализ показал, что структура опухоли горизонтальная, поскольку плазматические клетки гомогенны, секретируют одинаковые по структуре иммуноглобулины.

Также в группе исследованных пациентов выявляется кластерирование несинонимных мутаций в районах CDR, т.е. последовательность VL имеет признаки целенаправленной селекции антигеном.

Таким образом, опухоль возникает из клетки, прошедшей антигензависимую дифференцировку. Полученные нами данные совпадают с литературными [Hadzidimitriou A. et al., 2006, Kosmas C. Et al., 1999, Sahota S.S. et al., 1997].

Цилиндровая нефропатия является, безусловно, лидирующим вариантом поражения почек при ММ, но это не позволяет исключить вероятность развития других типов нефропатии. Причем, именно цилиндровая нефропатия считается потенциально обратимой разновидностью поражения почек. В связи с этим, вариант нефропатии необходимо установить в дебюте заболевания, т.к. это влияет на выбор тактики лечения пациента. Например, в последнее время множество исследований посвящено использованию в заместительной почечной терапии фильтров, позволяющих селективно удалять свободные ЛЦ [Basnayake K. Et al., 2008, Hutchison C.A. et al., 2008]. Раннее применение данного вида терапии позволяет увеличить вероятность обратимости ПН.

В настоящее время единственным достоверным методом, с помощью которого можно установить вариант поражения почек при ММ, является биопсия почки.

Безусловно, данный метод исследования является потенциально опасным, особенно, учитывая склонность пациентов с ММ к развитию кровотечений, дорогостоящим, требующим особого внимания к пациенту и наличия необходимой патологоанатомической базы. Исследование структуры ЛЦ могло бы быть эквивалентом, альтернативой биопсии почки, позволяющим упростить верификацию типа поражения почек.

На основании многолетнего опыта наблюдения за пациентами с ММ и поражением почек также возможно предположить тип поражения почек с определенной долей вероятности, но только ретроспективно, анализируя характер течения заболевания. Поэтому мы провели в нашей работе моновариантный анализ с целью выявить клинические/лабораторные показатели, которые позволяли бы предсказывать развитие этого осложнения миеломной болезни. Кроме того, в случае выявления устойчивой ассоциации между развитием цилиндровой нефропатии и структурой ЛЦ был бы необходим анализ потенциальных вмешивающихся факторов.

С учетом выше изложенного, в исследовании предусматривался моно- и многовариантный анализ факторов, ассоциирующихся с цилиндровой нефропатией.

Нам не удалось идентифицировать клинические и лабораторные факторы, которые независимо предсказывали бы вероятность развития цилиндровой нефропатии.

Несмотря на огромное количество исследований, посвященных моделированию различных вариантов поражения почек при ММ, установлению связей между свойствами конкретной ЛЦ и формирующимся типом нефропатии, проведенное нами исследование абсолютно исключает наличие корреляции между вероятностью и тяжестью цилиндровой нефропатии и первичной структурой ЛЦ, а также предсказанной вторичной структурой. Таким образом, основным фактором, который определяет способность ЛЦ связываться с белком Тамма-Хорсфолля, является третичная структура ЛЦ. Известно, что способность антител специфически связывать те или иные антигены может определяется их третичной структурой. Возможно, что нефротоксичность ЛЦ при цилиндровой нефропатии обусловлена структурными особенностями моно- или олигосахаридов, присоединяющихся к белку Бенс-Джонса, или другими причинами, для поиска которых необходимы дальнейшие исследования.

По всей видимости, в данном случае имеет место именно такой механизм. К сожалению, имеющиеся в настоящее время в распоряжении молекулярных биологов биоинформационные инструменты не позволяют проводить сколько бы то ни было достоверное предсказание третичной структуры белка по его аминокислотной последовательности.

Учитывая все вышесказанное, можно сделать вывод, что данное исследование является одним из первых шагов в данном направлении.

Выводы 1. Строение первичной и вторичной структур вариабельных регионов легких цепей иммуноглобулинов, включая аминокислотный состав районов CDR и FWR, изоэлектрическую точку вариабельного региона и CDR3, распределение аминокислот с разным зарядом, не коррелирует с цилиндровой нефропатией.

Вероятность развития цилиндровой нефропатии и тяжесть поражения почек невозможно прогнозировать на основании анализа нуклеотидной последовательности вариабельного региона легкой цепи иммуноглобулинов.

2. Использование семейств генов вариабельного региона легких цепей миеломными клетками носит специфический характер. В группе V -генов достоверно чаще представлено I семейство - 50% (р0,0001) по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Среди J-генов чаще всего использовалось JII - 42% (р=0,005).

3. В группе больных с секрецией лямбда легких цепей, преобладали V гены I р=0,002) и III - 36%(р=0,012) семейств, II семейство было представлено не достаточно – 9%(р=0,001) по сравнению с репертуаром у здоровых доноров.

Использование J –генов осуществлялось только за счет II/III семейств р0,0001), в то время как у здоровых доноров представлены преимущественно VI (54%) и в меньшей степени I (7%) семейства.

4. Различий в репертуаре используемых генов вариабельного региона легких цепей у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее получено не было.

5. Используемые миеломными клетками гены вариабельного региона легких цепей во всех случаях обнаруживают признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствует о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли. Кластерирование несинонимных мутаций в районах CDR свидетельствует о возможном контакте с антигеном.

6. Статистический анализ позволил выявить достоверную корреляцию между стадией заболевания, определяемой по Durie-Salmon (p=0,0006) и по международной системе стадирования (р=0,003) и развитием цилиндровой нефропатии.

Список используемых сокращений.

CDR – complemetary-determining region FR - framework region VL – вариабельный регион легкой цепи БДЛЦ - болезнь депозитов легких цепей БДТЦ - болезнь депозитов тяжелых цепей ВДХТ с ТСКК – высокодозная химиотерапия с трансплантацией стволовых клеток крови ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития РФ – Федеральное Государственное бюджетное учреждение гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации кДНК - комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота ММ - множественная миелома ОПН - острая почечная недостаточность ПН - почечная недостаточность ПХТ – полихимиотерапия ПЦР – полимеразноцепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ХТ – химиотерапия Список опубликованных работ по теме диссертации Горчакова С.В., Рехтина И.Г. Современные представления о патогенезе миеломной нефропатии. Гематология и трансфузиология, 2008, т.53, №4, Горчакова С.В., Рехтина И.Г., Яцков К.В., Суханова Г.А., Голицина Е.П., Варшавский В.А., Бирюкова Л.С. Болезнь депозитов моноклональных иммуноглобулинов как редкий вариант поражения почек при множественной миеломе. Терапевтический архив, 2009, №7, С.78-82.

Горчакова С.В., Рехтина И.Г., Никитин Е.А., Каменский П.А., Судариков А.Б., Бирюкова Л.С. Первичная структура вариабельного региона легких цепей в патогенезе миеломной нефропатии. Гематология и трансфузиология, 2009, т.54, №6, с. 28-33.

Рехтина И.Г., Голицина Е.П., Варшавский В.А., Горчакова С.В., Бирюкова Л.С. Обратимость тяжелой почечной недостаточности при миеломной болезни. Нефрология и диализ. Т.11, №3, 2009, с. 257-262.

Gorchakova S. V., Rehtina I. G., Nikitin E. A., Biryukova L. S. «Amino Acid Sequence of the Variable Region of Light Chains in multiple myeloma patients». World Congress of Nephrology, Milan, May 22-26. 2009. Abstract

 


Похожие работы:

«АНТРОПОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА КЛИНИКО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ХИРУРГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ АОРТАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПРИ ПАТОЛОГИИ ВОСХОДЯЩЕГО ОТДЕЛА АОРТЫ У ПАЦИЕНТОВ, ПЕРЕНЕСШИХ КЛАПАНОСОХРАНЯЮЩУЮ ОПЕРАЦИЮ 14.00.44 – сердечно-сосудистая хирургия, 14.00.06 – кардиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск – 2008 Работа выполнена в лаборатории ишемической болезни сердца Центра хирургии аорты, коронарных и периферических...»

«НАНАГЮЛЯН ГАЙК ВАЛЕРИЕВИЧ ДО- И ИНТРАОПЕРАЦИОННАЯ ЭХОГРАФИЯ ПРИ РЕКОНСТРУКТИВНОПЛАСТИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЯХ У БОЛЬНЫХ С ТРУБНОПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ БЕСПЛОДИЕМ 14.01.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 1 Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России. Научный руководитель : доктор медицинских наук...»

«Покровская Ольга Станиславовна КРОВЕТВОРНАЯ ТКАНЬ И СТРОМАЛЬНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ В ПРОЦЕССЕ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕРАПИИ И МОБИЛИЗАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ 14.01.21 – Гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития...»

«ПОПКОВА НАДЕЖДА ИСИНГИЛЬДИНОВНА НЕКОТОРЫЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОНИЙ У ДЕТЕЙ ОРЕНБУРГСКОГО РЕГИОНА 14.01.08 – педиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург – 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации....»

«Паршин Виктор Николаевич ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ОБУЧЕНИИ СРЕДНИХ МЕДИЦИНСКИХ РАБОТНИКОВ В ОБЛАСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЛЯ РАБОТЫ С НАСЕЛЕНИЕМ 14.00.33 – Общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2008 год 2 Работа выполнена в ФГУ Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный...»

«ОГАНЕСЯН Самвел Сергеевич ХИРУРГИЯ РИНОСКОЛИОЗА 14.00.04 – Болезни уха горла и носа Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург – 2009 2 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении СанктПетербургский научно-исследовательский институт уха, горла, носа и речи Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи Научный консультант : Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Янов Ю. К....»

«Макаров Сергей Николаевич Влияние методов коррекции расстройств микроциркуляции спинномозговых корешков и различных способов фиксации на исход оперативного лечения поясничного остеохондроза 14.01.15 - травматология и ортопедия 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2014 PDF создан с пробной версией pdfFactory Pro www.pdffactory.com Работа выполнена в ФГБУ Центральный научно-исследовательский...»

«Кирова Марина Владимировна ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ПИЩЕВОДА БАРРЕТТА Специальность 14.01.28 – гастроэнтерология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 1 Работа выполнена в государственном бюджетном учреждении здравоохранения Московский клинический научно-практический центр Департамента Здравоохранения г. Москвы Научный руководитель : Доктор медицинских наук, профессор Щербаков Петр Леонидович Официальные...»

«Букия Илона Ревазиевна Турбулентность ритма сердца и альтернация зубца Т у больных с гипертрофией миокарда различного генеза 14.01.05 – кардиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА – 2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Сулимов Виталий Андреевич Официальные оппоненты : доктор...»

«ЧЕЛНОКОВА Наталья Олеговна ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ХИРУРГИЧЕСКОЙ ТАКТИКИ ОПЕРАЦИЙ В БАССЕЙНЕ ПРАВОЙ ВЕНЕЧНОЙ АРТЕРИИ НА ОСНОВЕ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ И МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ НАРУШЕНИЙ ГЕМОДИНАМИКИ 14.03.02 – патологическая анатомия 14.01.17 – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Саратов – 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«НЕЧУШКИНА ВАЛЕНТИНА МИХАЙЛОВНА РАК ТЕЛА МАТКИ (ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА И ТАКТИКА ЛЕЧЕНИЯ) 14.01.12 — онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва — 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук (директор — академик РАН и РАМН, профессор Давыдов М. И.) Научный консультант : доктор медицинских наук, профессор...»

«Дзанаева Елена Владимировна КЛИНИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭМПИРИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ АЗИТРОМИЦИНОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ МАЛОГО ТАЗА У ЖЕНЩИН 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград-2013 Работа выполнена на кафедрах клинической фармакологии и дерматовенерологии и косметологии ГБОУ ВПО Ставропольский государственный медицинский университет Министерства...»

«ВАСИН Сергей Владимирович РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЕРАЦИИ ФОНТЕНА В МОДИФИКАЦИИ ЭКСТРАКАРДИАЛЬНОГО КОНДУИТА У ПАЦИЕНТОВ РАННЕГО ВОЗРАСТА /Сердечно-сосудистая хирургия –14.01.26./ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2010 Работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Зеленикин Михаил Анатольевич Официальные оппоненты : Селиваненко Вилор...»

«Щербакова Наталия Егоровна Современные методы обезболивания и критерии их эффективности при хронических головных болях напряжения 14.01.20 – анестезиология и реаниматология 14.01.11 – нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского Российской академии медицинских наук Научный...»

«КРЮЧКОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ К ИЗУЧЕНИЮ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА РАБОТАЮЩЕГО НАСЕЛЕНИЯ 14.02.01 - Гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2012 2 Работа выполнена в ФБУН Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Юдина...»

«Мургустов Ибрагим Баматгереевич Повторные резекции легкого у больных с послеоперационным рецидивом туберкулеза в оперированном легком 14.01.17. – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном учреждении Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза Российской академии медицинских наук (директор – Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН,...»

«Яцык Галина Александровна Современная лучевая диагностика инвазивного аспергиллеза легких у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения 14.01.21 – Гематология и переливание крови 14.01.13- Лучевая диагностика и лучевая терапия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва -2010 г. 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научные руководители: доктор медицинских наук...»

«ЦЫРЕНЖАПОВА Наталья Александровна ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УСЛОВИЙ ПРЕБЫВАНИЯ И ВОСПИТАНИЯ ДЕТЕЙ В ДОШКОЛЬНЫХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ 14.02.01 – гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Иркутск – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель :...»

«БУРЕНКОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ РАННЕЙ ГЕСТАЦИИ У ЖЕНЩИН С ИНСУЛИНЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 14.01.01 - Акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА 2012 2 Работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии с курсом перинатологии ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов Научные руководители: профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии ГОУ ВПО РУДН, доктор медицинских...»

«МУХТАРОВА АЙНУР ВАГИФ КЫЗЫ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТЕ- И ИНТРАНАТАЛЬНОГО ТОКОЛИЗА В УЛУЧШЕНИИ ИСХОДОВ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДОВ 14.01.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА 2011 2 Работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии с курсом перинатологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов (РУДН), Научно-Исследовательском Институте Акушерства и Гинекологии Министерства...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.