WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ШНАЙДЕР КСЕНИЯ ЛЕОНИДОВНА

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕВОДНЫХ СРЕД

02.00.15 – Катализ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Казань – 2009

Работа выполнена на кафедре пищевой биотехнологии ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Харлампиди Харлампий Эвклидович доктор биологических наук, профессор Максютова Наиля Назибовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им.

В.И. Ульянова-Ленина»

Защита диссертации состоится « 25 » декабря 2009 г. в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, д.

68, КГТУ, зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан « 24 » ноября 2009 г.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте Казанского государственного технологического университета. Режим доступа http://www.kstu.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент В.М. Захаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ферментные препараты находят все более широкие области применения в биотехнологии пищевой, фармацевтической, косметической и других отраслях промышленности. Сравнительно новое направление – изучение применения ферментных препаратов в неводных средах, что позволяет значительно расширить круг объектов и процессов, для которых могут быть использованы ферментные препараты.





В настоящей работе объектами исследования являются растительные масла различного жирно-кислотного состава – льняное и рапсовое масла. Эти масла важны, как для пищевой промышленности, так и для технических целей. Так, химический гидролиз рапсового масла является основой для крупнотоннажного получения ПАВ.

К перспективнейшим объектам исследования среди растительных масел можно отнести льняное масло, содержание -3-ПНЖК (-линоленовой кислоты) в котором составляет 35-65 % к сумме кислот. Благодаря своему жирнокислотному составу и присутствию антиоксидантов льняное масло используется для профилактики и комплексного лечения многих заболеваний.

Наряду с льняным маслом неплохим источником -линоленовой кислоты может служить рапсовое масло.

Современные сорта рапса содержат 40-49 % масла, богатого олеиновой (45- 70 %), линолевой (15-28 %) и линоленовой (6-13 %) кислотами, вследствие чего рапсовое масло можно отнести к ценным растительным маслам.

Изучение процесса ферментативного гидролиза растительных масел актуально с точки зрения получения свободных высших жирных кислот, которые имеют очень широкий спектр применения. Ферментативные процессы, как известно, протекают в мягких условиях и обладают более выраженной селективностью.

Для пищевой промышленности указанные масла представляют ценность, как источники незаменимых -3 и -6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) – линолевой и -линоленовой кислот, которые выполняют функцию особого витамина, получившего наименование витамин F. ПНЖК семейства -3 и обладают широким спектром лечебно-профилактического действия, так как они В руководстве диссертационной работой принимала участие к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии Зиновьева М.Е.

являются биологическими предшественниками эйкозаноидов и структурными блоками биологических мембран.

В связи с этим интерес исследователей различного профиля к незаменимым ПНЖК семейств -3 и -6 чрезвычайно высок. При этом если источники ПНЖК семейства -6 довольно распространены, то гораздо более ограничен круг источников ПНЖК семейства -3. Поэтому поиск новых источников - ПНЖК, доступных и легко усвояемых является актуальной задачей. Для получения продуктов с повышенным содержанием -3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой и биологической ценностью была использована ферментативная трансформация растительных масел липазами различного происхождения.

Цель и задачи исследования. Выявление особенностей ферментативного гидролиза растительных масел различного жирно-кислотного состава липазами животного и микробиологического происхождения.

Получение нового модифицированного липидного продукта с повышенным содержанием -3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой ценностью.

Научная новизна. Панкреатическая липаза и липаза из Candida rugosa гидролизуют растительные масла в органических средах (углеводороды) в мицеллярных системах АОТ гораздо эффективнее, чем в эмульсии масло/вода стабилизированной АОТ.

Панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфична по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенных жирных кислот, чем насыщенных и мононенасыщенных.





Липаза из Candida rugosa в системе масло/вода гораздо эффективнее подвергает гидролизу растительные масла, чем панкреатическая липаза, при этом она труднее всего отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенной линоленовой кислоты, что позволяет получить модифицированные масла с повышенным относительным содержанием этой кислоты.

Практическая значимость. Разработан метод гидролиза льняного масла с применением липазы из Candida rugosa в отсутствии эмульгатора, что позволяет получить биологически-активный липидный продукт с повышенным относительным содержанием -3-ПНЖК.

Подобраны оптимальные условия для получения активных иммобилизованных препаратов липаз различного происхождения. Показано, что при иммобилизации необходимо введение хлорида кальция в гель агара и подобраны его оптимальные концентрации.

Разработан метод выделения кальциевых и натриевых солей жирных кислот льняного масла, который включает последовательную ферментативную и химическую обработку масла. Данные соли находят применение в качестве добавок к корму сельскохозяйственных животных, а также могут использоваться как основа для получения ПАВ, восков и др.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международной научно-практической конференции “Биотехнология. Вода и пищевые продукты” (Москва, 2008), на Х Международной конференции молодых ученых “Пищевые технологии и биотехнологии” (Казань, 2009), на XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Казань, 2009), на ежегодных отчетных конференциях КГТУ (2007-2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (129 наименований источников). Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает в себя 19 таблиц и 43 рисунка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве катализаторов использовали: коммерческий препарат Lipase from porcine pancreas, Type II лиофильно высушенный (активность – 100- ед./мг белка с использованием оливкового масла в качестве субстрата, производство – США); коммерческий препарат Lipase from Candida rugosa, Type VII лиофильно высушенный (активность – 700-1500 ед./мг белка по оливковому маслу, производство – Япония); коммерческий препарат, содержащий липазу, “Novozyme 868” жидкий (активность – 178 ед./мг белка по оливковому маслу, производитель Novo Nordisk A/S, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd (Дания)).

Исходную активность ферментных препаратов липаз определяли модифицированным методом Ота, Ямада и колориметрическим методом с использованием п-нитрофенилбутирата.

Изучение гидролиза масел ферментными препаратами липаз осуществляли в системе прямых и обращенных мицелл АОТ, в системе масло/вода в отсутствии эмульгатора, в эмульсиях масла с использованием в качестве эмульгатора желатина, а также гидролиз масла с добавлением органического растворителя.

Для включения фермента (панкреатической липазы или липазы из Candida rugosa) в мицеллы к 1 мл раствора АОТ в определенной концентрации (от 0,03 до 0,12 М/л) в органической среде (пентан, гексан, гептан, октан, декан), содержащей субстрат (льняное или рапсовое масло) в концентрации от 42,9 до 269,6 мкМ/мл, добавляли раствор ферментного препарата в фосфатноцитратном буфере с рН 7,4 (количество буфера 0,0-1,0 мл; количество ферментного препарата 0,07-1,00 мг/мл). Смесь интенсивно встряхивали и выдерживали в течение 1-36 часов при определенной температуре (от 20 °С до 55 °С).

Количество выделившихся в ходе реакции жирных кислот определяли методом титрования.

В контрольную пробу фермент вносили непосредственно перед титрованием.

Гидролиз в водной среде проводили подобным образом, с использованием в качестве эмульгатора АОТ.

Выход жирных кислот (мкМ/мг белка) рассчитывали по формуле:

где О – количество 0,2 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование пробы, мл; К – количество 0,2 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование контроля, мл; Т – титр щелочи; 200 – коэффициент пересчета в мкмоли жирных кислот; В – концентрация ферментного раствора, мг/мл.

Иммобилизацию ферментных препаратов липаз проводили методом включения в гель агара, содержащий хлорид кальция в концентрации от 0,0 М/л до 1,1 М/л. Затем с помощью иммобилизованных ферментных препаратов липаз проводили гидролиз льняного масла и эмульгированного оливкового масла.

Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз в отсутствии эмульгатора осуществляли следующим образом: льняное (рапсовое) масло эмульгировали в воде с помощью высокоскоростного диспергатора. В мл эмульсии масло/вода вносили 30 мг сухого ферментного препарата липазы (панкреатической липазы или липазы из Candida rugosa). Реакцию осуществляли при температуре 37 С с интенсивным перемешиванием (число оборотов – 150) в течение определенного времени (от 1 до 10 часов).

Для отделения жирных кислот был применен метод холодной рафинации.

Из гидролизата льняного масла после обработки его липазой из Candida rugosa выделяли кальциевые соли жирных кислот. Для этого в промытый гидролизат вносили гидроксид кальция. Полученную смесь тщательно перемешивали и оставляли до полного застывания.

Анализ полученных продуктов осуществляли следующими методами:

ИК-спектроскопия, ТСХ, ГЖХ.

Все эксперименты проводили в 3-12 повторностях. Результаты обрабатывали с помощью пакета статистических программ «Statistica». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения жирно-кислотного состава, в частности количества -линоленовой и линолевой кислот в исследуемых маслах, использовали метод газожидкостной хроматографии. Данные представлены в таблице 1.

1 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз Для проведения гидролиза, чтобы адсорбция фермента на поверхности гидрофобного субстрата была продуктивной, широкое применение нашли эмульгаторы различной природы (целлюлоза, гуммиарабик, поливиниловый спирт, желатин и другие). Однако в связи с тем, что отделение продуктов гидролиза от эмульгатора (ПАВ) усложняет задачу, исследовалась возможность ферментативного гидролиза льняного и рапсового масел при отсутствии эмульгатора в системе масло/вода.

Показано, что панкреатическая липаза в подобранных условиях осуществляет гидролиз льняного и рапсового масел в системе масло/вода с крайне низким выходом жирных кислот. Так, максимальный выход целевого продукта через 4 часа гидролиза льняного масла составил 70 мкМ или 2,5 %.

В то же время гидролиз масел липазой из Candida rugosa в установленных условиях протекает значительно интенсивнее. Максимальный выход жирных кислот через 9 часов гидролиза льняного масла составил 1241 мкМ или 43,8 %, что в 17,7 раза превышает выход продуктов гидролиза масла панкреатической липазой. При гидролизе рапсового масла максимальный выход жирных кислот наблюдался через 3 часа от начала процесса и составил 37,0 %.

Для получения липидного продукта с улучшенным жирно-кислотным составом на основе льняного масла (рапсового масла), свободные жирные кислоты отделяли методом холодной рафинации. Далее продукт анализировали методом ГЖХ. Полученные данные представлены в таблице 2.

Изменение количественного и качественного состава льняного масла (рапсового масла) после гидролиза липазой из Candida rugosа преимущественно отделяет в ацилглицеридах льняного масла остатки олеиновой и линолевой кислот, а также значительно снижает содержание пальмитиновой кислоты в масле. Отделив данные кислоты от гидролизованного льняного масла, становится возможным обогатить полученный продукт -линоленовой кислотой. Таким образом, относительное содержание ценной -3-ПНЖК в липидном продукте увеличилось с 49,5 % до 66,7 %.

При гидролизе рапсового масла липазой из Candida rugosа также в основном отделяется олеиновая кислота, что подтверждает специфичность данного фермента по отношению к мононенасыщенным жирным кислотам. Однако относительное содержание ценных линолевой и -линоленовой кислот в конечном продукте повышается незначительно.

2 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы. Мицеллярные системы Другим подходом позволяющим избежать стадии эмульгирования субстрата является применение органических сред. В частности хорошие результаты показывают мицеллярные системы.

Был изучен гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы в системе обращенных мицелл поверхностноактивного вещества АОТ (ди-(2-этил)-гексиловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты) и подобраны оптимальные условия.

Показано, что при гидролизе льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы при изменяющихся концентрациях субстрата наблюдается увеличение выхода жирных кислот до определенной насыщающей концентрации, которая для льняного масла составила 157 мкМ/мл, для рапсового масла – 50 мкМ/мл. Гидролиз рапсового масла панкреатической липазой протекает со значительно более низким выходом жирных кислот.

Методом двойных обратных координат (метод Лайнуивера-Берка) были рассчитаны значения констант уравнения Михаэлиса-Ментен (Км и Vmax). Данные представлены в таблице 3.

Панкреатическая липаза Льняное масло (пентан) 161,3 16, Рассчитать значения Км и Vmax при гидролизе рапсового масла ферментным препаратом панкреатической липазы не представляется возможным.

Зависимость каталитической активности ферментного препарата панкреатической липазы от степени гидратации мицелл в процессе гидролиза растительных масел имеет вид кривых, представленных на рис. 1.

Рис. 1 – Влияние степени гидратации на ферментативный гидролиз растительных масел ферментным препаратом панкреатической липазы в системе обращенных мицелл АОТ: – гидролиз льняного масла; 2 – гидролиз рапсового масла Условия эксперимента: среда – пентан; концентрация АОТ – 0,05 М/л; рН 7,4; время реакции – 1 час Согласно представленным данным для панкреатической липазы наблюдаются ярко выраженные максимумы при значении степени гидратации (0) равном 56. Увеличение содержания воды в системе приводит к уменьшению выхода жирных кислот.

Был рассчитан радиус внутренней полости мицеллы солюбилизирующей панкреатическую липазу, который составил rm = 88 (8,8 нм).

Ферменты можно разделить на две группы: способные и неспособные взаимодействовать с мицеллярной матрицей. Тестом на эту способность является зависимость каталитической активности ферментов от концентрации ПАВ в мицеллярной системе. Данные, полученные при гидролизе растительных масел ферментным препаратом панкреатической липазы, представлены на рис. 2.

Рис. 2 – Влияние количества АОТ на гидролиз растительных масел ферментным препаратом панкреатической липазы в системе обращенных мицелл: 1 – гидролиз льняного масла; среда – декан; 2 – гидролиз рапсового масла; среда – гексан Условия эксперимента: рН 7,4; время реакции – 1 час Из данных представленных на рис. 2 видно, что активность панкреатической липазы при гидролизе как льняного, так и рапсового масел зависит от концентрации АОТ, свидетельствуя о взаимодействии липазы с внутренней поверхностью мицеллы. Увеличение концентрации молекул АОТ в среде до 0, М/л способствует небольшому росту каталитической активности фермента.

Увеличение концентрации молекул АОТ в системе обращенных мицелл приводит к увеличению числа меньших по размеру мицелл, соответственно, происходит перераспределение воды в мицеллах и изменение степени гидратации, величина которой составила 0 = 31. Это способствует уменьшению радиуса мицеллы rm= 50,5 (по расчету rm = 5,05 нм, по сравнению с rm = 8, нм, полученным ранее) и, как следствие, к увеличению поверхности раздела фаз.

Установлено, что наиболее высокий выход жирных кислот при гидролизе льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы наблюдается в среде декана, а при гидролизе рапсового масла – в среде гексана.

Применяя систему обращенных мицелл АОТ в качестве среды реакции ферментативного гидролиза льняного и рапсового масел, становится возможным снизить оптимальную температуру реакции с 37 °С до 25 °С.

Повысить скорость гидролитического процесса возможно изменяя содержание фермента в среде. Согласно полученным данным, выход жирных кислот в ходе гидролиза льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы максимален при концентрации фермента в системе – 0, мг/мл (0 = 31).

Полученные результаты по влиянию времени на ферментативный гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы представлены на рис. 3-6.

Рис. 3 – Влияние времени на выход жирных кислот при гидролизе льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы: 1 – среда – декан; 2 – среда – вода Условия эксперимента: концентрация субстрата – 157 мкМ/мл; 0 31; концентрация АОТ – 0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента – 0,07 мг/мл Рис. 4 – Влияние времени на скорость гидролиза льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы: 1 – среда – декан; 2 – среда – вода Условия эксперимента: концентрация субстрата – 157 мкМ/мл; 0 31; концентрация АОТ – 0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента – 0,07 мг/мл Рис. 5 – Влияние времени на выход жирных кислот при гидролизе рапсового масла ферментным препаратом панкреатической липазы: 1 – среда – гексан; 2 – среда – вода Условия эксперимента: концентрация субстрата – 50 мкМ/мл; 0 31; концентрация АОТ – 0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента – 0,07 мг/мл Рис. 6 – Влияние времени на скорость гидролиза рапсового масла ферментным препаратом панкреатической липазы: 1 – среда – гексан; 2 – среда – вода Условия эксперимента: концентрация субстрата – 50 мкМ/мл; 0 31; концентрация АОТ – 0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента – 0,07 мг/мл Таким образом, для ферментного препарата панкреатической липазы при гидролизе льняного и рапсового масел в системе обращенных мицелл АОТ в среде органического растворителя оптимальное время процесса составило 30 ч.

По полученным данным были рассчитаны каталитические константы скоростей реакций ферментативного гидролиза льняного и рапсового масел. Данные представлены в таблице 4.

Значения kkat, рассчитанные для процесса гидролиза льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы 0,0163 0,0025 0,0098 Как видно из представленных в таблице 4 данных, при аналогичных условиях проведения процесса число каталитических актов совершаемых активным центром панкреатической липазы при гидролизе льняного масла в среде декана в 6,5 раз выше, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ.

3 Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa.

Гидролиз льняного масла также был осуществлен с помощью липазы из Candida rugosa с использованием мицеллярной системы АОТ.

Показано, что при концентрации льняного масла в системе 157 мкМ/мл наблюдается максимальный выход продуктов гидролиза.

Методом двойных обратных координат (метод Лайнуивера-Берка) были рассчитаны значения констант уравнения Михаэлиса-Ментен (Км и Vmax) для гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa. Данные представлены в таблице 5.

Низкое значение Км при гидролизе льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы (Км=161,3 мкМ) свидетельствует о том, что панкреатическая липаза обладает большим сродством к льняному маслу, чем липаза из Candida rugosa.

В то же время значение Vmax при гидролизе льняного масла липазой из Candida rugosa значительно превышает максимальную скорость гидролиза панкреатической липазой (Vmax=16,0 мкМ/мг·мин), что связано с изначально более высокой каталитической активностью исходного фермента.

Зависимость выхода продуктов гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa от степени гидратации мицеллярной системы приведена на рис.

Рис. 7 – Влияние степени гидратации на ферментативный гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл АОТ Условия эксперимента: среда – гексан; концентрация АОТ – 0,05 М/л; рН 7,4; время реакции – 1 час Зависимость представленная на рис. 7 имеет три максимума: первый максимум – при 0 167, второй – при 0 778 и третий – при 0 1000. Наличие нескольких максимумов может свидетельствовать о нескольких фазовых переходах в системе при изменяющихся концентрациях воды. В точке максимальной каталитической активности фермента происходит геометрическое совпадение внутренней полости мицеллы с молекулой фермента. Радиус внутренней полости мицеллы, солюбилизирующей липазу из Candida rugosa при 0 167 составляет rm = 254,5 (25,4 нм); при 0 778 – rm = 1171 (117,1 нм) и при 0 1000 – rm = 1504 (150,4 нм).

Несмотря на то, что в целом состав молекулы панкреатической липазы не является исключительно гидрофобным, ее вторичная и третичная структуры, согласно литературным данным, возможно, таковы, что значительное число неполярных аминокислот находится на поверхности молекулы, а не спрятано внутри. В связи с этим молекула панкреатической липазы требует меньшего объема гидратно-сольватной оболочки. Проведенные исследования это подтверждают. Уменьшение степени гидратации (с 56 до 31) и соответственно радиуса мицелл (с 8,8 нм до 5,05 нм) приводит к увеличению активности панкреатической липазы.

Липаза из Candida rugosa проявляет максимальную активность при значительно более высокой степени гидратации мицелл (рис.7). Таким образом, можно предположить наличие большего числа гидрофильных групп на поверхности белка и необходимость более объемной гидратно-сольватной оболочки белковой молекулы для проявления максимальной активности данным ферментом.

Изменяя концентрацию ПАВ в мицеллярной системе, также становится возможным регулировать каталитическую активность фермента. Данные по влиянию количества АОТ на выход продуктов гидролиза представлены на рис.

Рис. 8 – Влияние количества АОТ на гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в мицеллярной системе Условия эксперимента: среда – гептан; рН 7,4; время реакции – 1 час Согласно данным, приведенным на рис. 8, характер влияния концентрации АОТ на гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa отличается от влияния количества АОТ на гидролиз льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы. На кривой, представленной на рис. 8, наблюдается два пика. Первый соответствует содержанию АОТ в системе 0,03 М/л, второй – 0,1 М/л. Наличие двух максимумов на кривой, представленной на рис. 8, может наблюдаться в связи с фазовыми переходами, а также с перераспределением воды и фермента в мицеллах при изменяющихся концентрациях АОТ. Изменение оптимальной концентрации АОТ предполагает изменение степени гидратации системы, величина которой составила 0 = 1111, радиус мицеллы rm = 1670,5 (167,05 нм) при содержании АОТ – 0,03 М/л и 0 = 333, радиус мицеллы rm = 504 (50,4 нм) при содержании АОТ – 0,1 М/л.

Таким образом, для липазы из Candida rugosa наблюдается сложный характер зависимости протекания реакции гидролиза в мицеллярной системе как в зависимости от содержания воды, так и от содержания АОТ. Все это свидетельствует о том, что липаза из Candida rugosa представляет собой более лабильную систему, способную к легкой перестройке в зависимости от условий окружающей среды, по сравнению с более компактной панкреатической липазой.

В качестве органического растворителя при гидролизе льняного масла липазой из Candida rugosa использовали гексан, гептан, октан и декан. Как показали исследования, наилучшим растворителем является гептан.

Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл АОТ также дает возможность снизить оптимальную температуру процесса с °С до 25 °С.

Установлено, что выход жирных кислот в ходе гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa максимален при концентрации фермента в системе – 0,5 мг/мл (0 = 333).

Данные по влиянию времени на ферментативный гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa представлены на рис. 9 и 10.

Рис. 9 – Влияние времени на выход жирных кислот при гидролизе льняного масла липазой из Candida rugosa: 1 – среда – гептан; 2 – среда – вода Условия эксперимента: концентрация субстрата – 157 мкМ/мл; 0 333; концентрация АОТ – 0,10 М/л; рН 7,4; концентрация фермента – 0,5 мг/мл Рис. 10 – Влияние времени на скорость гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa: 1 – среда – гептан; 2 – среда – вода Условия эксперимента: концентрация субстрата –157 мкМ/мл; 0 333; концентрация АОТ – 0,10 М/л; рН 7,4; концентрация фермента – 0,5 мг/мл Для липазы из Candida rugosa при гидролизе льняного масла оптимальное время процесса составило 24 ч для водной среды и 30 ч для среды гептана.

Согласно данным, представленным на рис. 10, увеличение времени проведения гидролиза льняного масла в системе мицелл АОТ сопровождается уменьшением скорости реакции. При гидролизе эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ обнаруживается кажущаяся независимость скорости реакции от времени. По полученным данным были рассчитаны каталитические константы скорости реакции ферментативного гидролиза льняного масла. Данные представлены в таблице 6.

Значения kkat, рассчитанные для процесса гидролиза льняного масла Приведенные в таблице 6 результаты, свидетельствуют о том, что число каталитических актов совершаемых активным центром липазы в среде гептана почти в 7 раз выше, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ.

4 Активация и стабилизация ферментного препарата панкреатической липазы неорганическими соединениями Влияние на активность липаз может оказывать целый ряд веществ – желчнокислые соли, белки, различные виды эмульгаторов, неорганические соединения.

Было изучено влияние хлоридов кальция и магния, сульфата магния на активность ферментного препарата панкреатической липазы. Показано, что панкреатическая липаза обладает более низкой активностью при отсутствии ионов кальция или магния в среде. В то же время внесение этих солей приводит к его активации. Полученные результаты приведены в таблице 7.

Влияние некоторых солей на активность ферментного препарата Диапазон исследуемых концентраций хлоридов кальция и магния, сульфата магния от 0,01 М/л до 0,09 М/л.

Контрольная липолитическая активность ферментного препарата панкреатической липазы – 129 ед./мг (100 %).

Как показывают результаты исследования, степень влияния неорганических соединений на скорость реакции гидролиза зависит от размера частиц эмульгированного субстрата. При этом прирост липолитической активности при введении хлорида кальция или хлорида магния в среду с большим размером частиц эмульсии существенно превышает прирост активности в эмульсии с меньшим размером частиц.

Сульфат магния показал более низкий активирующий эффект, чем хлорид магния.

5 Иммобилизация ферментных препаратов липаз в агаровый гель Исследована иммобилизация липаз различного происхождения в гель агара.

В процессе работы иммобилизации подверглись ферментный препарат панкреатической липазы, липаза из Candida rugosa и препарат “Novozyme 868”.

При использовании стандартного метода иммобилизации липаз в гель агара получены иммобилизованные препараты с крайне низкой активностью. Установлено, что внесение хлорида кальция в агаровый гель позволяет не только сохранить исходную активность, но и значительно ее повысить. Данные приведены в таблице 8.

Активность иммобилизованных в гель агара препаратов липаз Ферментный препарат Исходного Иммобилизованного фермента при внесении Показано, что удельная активность иммобилизованных ферментных препаратов липаз плавно возрастает с повышением концентрации хлорида кальция (диапазон концентраций составлял 0,1-1,1 М/л) и достигает максимального значения при содержании хлорида кальция в агаре 0,8 М/л для панкреатической липазы и препарата “Novozyme 868”, для липазы из Candida rugosa – 0,8-0, М/л.

Иммобилизация в гель агара ферментных препаратов липаз позволяет повысить их липолитическую активность относительно активности исходных ферментов: ферментного препарата панкреатической липазы – в 12,4 раза; липазы из Candida rugosa – в 5 раз; препарата “Novozyme 868” – в 11,6 раз.

Установлена возможность проведения ферментативного гидролиза не эмульгированного льняного масла иммобилизованными ферментными препаратами липаз.

ВЫВОДЫ

1. Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе масло/вода без внесения эмульгатора, позволяет выделить липидный продукт, обогащенный -линоленовой кислотой. Относительное содержание ценной -3ПНЖК в липидном продукте увеличилось с 49,5 % до 66,7 %.

Установлено, что в данной системе липаза из Candida rugosa проявляет более высокую специфичность по отношению к насыщенным, а также моно- и диненасыщенным жирным кислотам. Для выделения высших жирных кислот и отделения их от модифицированного масла (липидного продукта) применен метод холодной рафинации.

Панкреатическая липаза в системе масло/вода практически не осуществляет гидролиз растительных масел.

2. Установлено, что панкреатическая липаза способна расщеплять льняное масло в системе обращенных мицелл АОТ в среде декана в 3,3 раза эффективнее, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ. Гидролиз рапсового масла в среде гексана в 16,5 раз эффективнее гидролиза стабилизированной АОТ эмульсии масло/вода.

Определены оптимальные условия для проведения гидролиза льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы. Выход жирных кислот в оптимальных условиях составил 85 % для льняного масла и 45 % – для рапсового масла.

3. Фермент панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфичен по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенных жирных кислот, чем остатки насыщенных и мононенасыщенных кислот, что приводит к тому, что в системе обращенных мицелл АОТ в среде декана льняное масло гидролизуется почти в 2 раза эффективнее рапсового масла.

4. Установлено, что гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл АОТ лучше всего протекает в среде гептана и в 3,6 раз более эффективен, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ. Выход жирных кислот в оптимальных условиях составил 36 %.

5. Установлено, что на липолитическую активность и стабильность ферментного препарата панкреатической липазы оказывают активирующий эффект хлориды кальция и магния, сульфат магния. Подобраны оптимальные концентрации активирующих добавок.

6. Получены иммобилизованные препараты липаз с высокой удельной активностью. Активность иммобилизованных ферментных препаратов выше липолитической активности исходных ферментов: ферментного препарата панкреатической липазы – в 12,4 раза; липазы из Candida rugosa – в 5 раз, препарата “Novozyme 868” – в 11,6 раз.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Васина, К.Л. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз / К.Л. Васина [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. – 2007. – № 2. – С. 103-108.

2. Гамаюрова, В.С. Влияние ионов металлов на активность ферментного препарата панкреатической липазы / В.С. Гамаюрова, К.Л. Васина // Бутлеровские сообщения. – 2007. – Т. 12, № 7. – С. 51-54.

3. Ферментативные процессы, осуществляемые липазами в неводных средах / К.Л. Васина [и др.] // Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии: сб. науч. тр. – М.: ПищПромиздат, 2008. – С. 135-146.

4. Vasina, K.L. Enzymatic hydrolysis of linseed oil in reversed micelles / K.L.

Vasina, M.E. Zinovjeva, V.S. Gamaurova // Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине: тез. докл. XIV Международ. конф. – Казань: КГУ, 2009. – С. 90-91.

5. Гамаюрова, В.С. Влияние воды на ферментативный гидролиз растительных масел в неводных средах / В.С. Гамаюрова, К.Л. Васина // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: материалы Международ. науч.- практ. конференции. – М.: ЗАО “Экспо-биохим-технологии”, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2008. – С. 264.

6. Васина, К.Л. Иммобилизация ферментных препаратов липаз / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, В.С. Гамаюрова // Пищевые технологии и биотехнологии:

тез. докл. Х Международ. конф. молодых ученых. – Казань: Изд-во «Отечество», 2009. – С. 234.

7. Васина, К.Л. Влияние ионов кальция и магния на активность ферментного препарата панкреатической липазы / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, В.С.

Гамаюрова // Материалы конкурса студ. науч.-исслед. работ, 2007. – С. 276.

8. Васина, К.Л. Влияние гексана на ферментативный гидролиз льняного масла в системе обращенных мицелл / К.Л. Васина, В.С. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 5-9 февраля 2007 г. – Казань: Изд-во Казан. гос.

технол. ун-та, 2007. – С. 244.

9. Васина, К.Л. Влияние ионов кальция на активность иммобилизованной панкреатической липазы / К.Л. Васина, В.С. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 5-9 февраля 2007 г. – Казань: Изд-во Казан. гос. технол. ун-та, 2007. – С. 245.

10. Васина, К. Л. Ферментативный гидролиз растительных масел в системе обращенных мицелл АОТ / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 4-8 февраля 2008 г. – Казань: Изд-во Казан. гос. технол. ун-та, 2008. – С. 241.

11. Васина, К.Л. Получение полиненасыщенных жирных кислот ферментативным гидролизом растительных масел / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, В.С.

Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 3-6 февраля 2009 г. – Казань: Изд-во. Казан. гос. технол. ун-та, 2008. – С. 237.

12. Васина, К.Л. Иммобилизация липаз в агаровый гель / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, В.С. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 3- февраля 2009 г. – Казань: Изд-во. Изд-во. Казан. гос. технол. ун-та, 2008. – С.

238.



 
Похожие работы:

«Баталова Татьяна Леонидовна Анионная полимеризация -капролактама в присутствии ароматических полиимидов в качестве активаторов 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва-2006 2 Работа выполнена на кафедре химической технологии пластических масс РХТУ им. Д.И. Менделеева и в лаборатории конденсационных полимеров Института элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН. Научный...»

«РОБЕР Марина Юрьевна ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН. Научный руководитель : доктор химических наук Т. Б. Тенникова Официальные оппоненты : доктор химических наук А. Ю. Меньшикова...»

«САЛЛУМ Мухамед Июссеф ВЛИЯНИЕ СТЕХИОМЕТРИИ И ДОПИРУЮЩИХ ПРИМЕСЕЙ НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ И ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРИСТАЛЛОВ НИОБАТА ЛИТИЯ Специальность: 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена на кафедре лазерной химии и лазерного материаловедения химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный...»

«МИЛЬТО Владимир Ильич СИНТЕЗ ПОЛИЯДЕРНЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ОКСИДНЫЕ И КАРБОНИЛЬНЫЕ МОСТИКОВЫЕ ЗВЕНЬЯ 05.17.04 – Технология органических веществ 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Иваново – 2007 2 Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова. Научный консультант : доктор химических наук, профессор Орлов Владимир...»

«АЛЕКСАНДРОВ ЮРИЙ БОРИСОВИЧ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ИНДИВИДУАЛЬНОГО СОСТАВА ГАЗООБРАЗНОГО ТОПЛИВА И ПРОДУКТОВ ЕГО ГОРЕНИЯ НА ОСНОВЕ КОМПЬЮТЕРНО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МОДУЛЯ - аналитическая химия 02.00.02 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2007 2 Работа выполнена в Казанском государственном энергетическом университете Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Новиков Вячеслав Федорович Официальные...»

«МАНАНКОВА АННА АНАТОЛЬЕВНА СИНТЕЗ НЕФТЕПОЛИМЕРНЫХ СМОЛ НА ОСНОВЕ ДИЦИКЛОПЕНТАДИЕНОВОЙ ФРАКЦИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ХЛОРИДА И АЛКОКСИХЛОРИДОВ ТИТАНА (IV) 02.00.13 – нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Тюмень – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский Томский политехнический университет на кафедре Технологии...»

«ПАНОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА ПЕРЕГРУППИРОВКИ ФОСФОР-АЗОТИСТЫХ ЛИГАНДОВ КАК СПОСОБ СИНТЕЗА ФОСФИНОАМИДНЫХ И ИМИНОФОСФОРАНАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ МЕТАЛЛОВ 02.00.08 – Химия элементоорганических соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Нижний Новгород 2013 2 Работа выполнена в лаборатории кремнийорганических соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской...»

«Шабанова Елена Владимировна МНОГОМЕРНАЯ ОБРАБОТКА СПЕКТРАЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ В ДУГОВОМ АТОМНО-ЭМИССИОННОМ АНАЛИЗЕ ПРИРОДНЫХ И ТЕХНОГЕННЫХ ОБРАЗЦОВ Специальность 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Иркутск – 2013 Работа выполнена в лаборатории оптического спектрального анализа и стандартных образцов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт геохимии им. А.П. Виноградова...»

«САЛОВ ДМИТРИЙ ИГОРЕВИЧ СОРБЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ С ИМПРЕГНИРОВАННЫМИ ГИДРАЗОНАМИ ДЛЯ РЕНТГЕНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ВОДАХ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук 02.00.02–аналитическая химия Краснодар 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет на кафедре аналитической химии Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Темердашев Зауаль Ахлоович Официальные оппоненты : доктор...»

«Радзиховская Мария Александровна ФАЗОВЫЕ РАВНОВЕСИЯ И ХИМИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В ПЯТИКОМПОНЕНТНОЙ ВЗАИМНОЙ СИСТЕМЕ Li, K|| F, Br, MoO4, WO4 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Самара - 2013 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Самарский государственный технический университет на кафедре общей и неорганической химии Научные...»

«Чапуркин Сергей Викторович РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ФТОРСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИКАРБОНИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И СИНТЕЗ ПЕРОКСИДОВ НА ИХ ОСНОВЕ 02.00.03. – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Волгоград 2010 Работа выполнена на кафедре Органическая химия Волгоградского государственного технического университета. Научный руководитель доктор химических наук, профессор Рахимов Александр Имануилович. Официальные оппоненты : доктор...»

«Мостович Евгений Алексеевич СИНТЕЗ АЗОТИСТЫХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ РЯДА ДИАЗЕПИНА, ИЗОКСАЗОЛА, ИМИДАЗОЛИДИНА И НИТРОНИЛНИТРОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ 2-ИМИДАЗОЛИНА В РЕАКЦИЯХ 1,2-БИСГИДРОКСИЛАМИНОВ И 1,2-БИСАЛКОКСИАМИНОВ С КАРБОНИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ (02.00.03 – органическая химия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук НОВОСИБИРСК – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Новосибирском институте органической...»

«УДК 577.322.5 КОВАЛЕВСКАЯ Надежда Владимировна ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСОВ ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И L.CASEI С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТОМ ТРИМЕТОПРИМОМ 02.00.15 - катализ 03.00.04 - биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского...»

«ГРИШИН АЛЕКСЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ Исследование электрохимических превращений оксидов углерода в активной зоне темнового электрического разряда 02.00.05 —Электрохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Республика Казахстан Караганда, 2007 Работа выполнена в ТОО Институт органического синтеза и углехишга РК лауреат государственной премии, Научные руководители: академик НАН РК, д.х.н., профессор...»

«ЩЕРБИНА Наталья Александровна КВАНТОВО–ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТЕРЕОСПЕЦИФИЧНОСТИ КОНСТАНТ СПИН–СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 13С-13С В ОКСИМАХ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иркутск – 2008 2 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ангарская государственная техническая академия Научный руководитель доктор химических наук, профессор Кривдин Л. Б....»

«Кузовкова Анна Александровна СИНТЕЗ И КОЛЛОИДНО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГИДРОЗОЛЕЙ ОКСИДА ЦИНКА 02.00.11 – Коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена на кафедре технологии химико-фармацевтических и косметических средств (ТХФ и КС) Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Авраменко Григорий Владимирович,...»

«Романенко Сергей Владимирович Феноменологическое моделирование аналитических сигналов в форме пиков 02.00.02 — аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Томск 2006 2 Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета Научный консультант : доктор химических наук А. Г. Стромберг Официальные оппоненты : доктор физико-математических наук, в.н.с. Померанцев А.Л. доктор химических...»

«ВОРОНИН Олег Геннадьевич ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗ ГИДРОГЕНАЗАМИ ДЛЯ КОНВЕРСИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ В ЭЛЕКТРИЧЕСТВО Специальности: 02.00.15 – кинетика и катализ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2010 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель :...»

«Субботкина Ирина Николаевна ДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КРАСИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДИАФРАГМЕННОГО, ТОРЦЕВОГО РАЗРЯДОВ И ОЗОНА 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии растворов им. Г. А. Крестова РАН (ИХР РАН) Научные руководители: доктор химических наук, профессор Максимов...»

«БОГАЧЕВ Дмитрий Александрович ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ НА ТОЛЩИНУ ТОНКИХ ПЛЕНОК ВОДНЫХ И ФОРМАМИДНЫХ РАСТВОРОВ NaCl И CuSO4 В СИСТЕМЕ – МОДЕЛЬ ПРЯМОЙ ЭМУЛЬСИИ В ГИДРОФИЛЬНОМ КАПИЛЛЯРЕ 02.00.11 – коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2010 2 Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета Санкт-Петербургского Государственного...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.