WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Федоров Сергей Николаевич

Химическая структура и биологическая активность некоторых морских

природных соединений и их синтетических аналогов

02.00.10 – Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой

степени доктора химических наук

Владивосток – 2012 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН (Владивосток, Россия) и в Институте Хормела при университете Миннесоты (Миннеаполис, США).

Научный консультант:

Академик РАН, доктор химических наук Стоник Валентин Аронович

Официальные оппоненты:

Булгаков Виктор Павлович Член-корр. РАН, доктор биологических наук, Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, заведующий отделом биотехнологии Попов Сергей Владимирович Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, заведующий отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии Звягинцева Татьяна Николаевна Доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, заведующая лабораторией химии ферментов

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « 29 » ноября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан » октября 2012 г.

«

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.





ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальность поиска и последующего изучения химической структуры и биологической активности морских природных соединений подтверждается опытом мировой науки. Установление их структур играет важную роль в развитии биоорганической химии, биохимии, биологии и медицины, без этого невозможно исследование биологических функций, путей биосинтеза и метаболизма таких веществ в соответствующих организмах, а также создание новых медицинских препаратов на основе морских природных соединений.

Известно, что морские природные соединения иногда обладают экстремально высокой биологической активностью. Среди них - самые мощные из небелковых токсинов (палитоксин, маитотоксин), противоопухолевые соединения с высочайшей токсичностью в отношении опухолевых клеток (спонгистатин, эктейнасцидины, бриостатины), вещества с очень высоким обезболивающим (конотоксины) и противовоспалительным эффектами (монаолид, контигнистерол).

Поиск новых природных противоопухолевых и канцерпревентивных веществ имеет большое практическое значение, поскольку лечение и профилактика онкологических заболеваний в последнее время становятся одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всех странах, включая Россию. За рубежом исследования профилактической и терапевтической противоопухолевой активности соединений природного происхождения особенно активно проводятся в США, а также во многих ведущих европейских странах. Недавно были разрешены к применению первые высокоэффективные противоопухолевые лекарства, созданные на основе морских природных соединений «джонделис» и «эребулин мезилат». В России систематические работы в области химии, биохимии, биотехнологии природных соединений из морских организмов, включая противоопухолевые вещества, выполняются в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ).

При создании новых лекарственных и профилактических противоопухолевых средств важную роль играют не только поиск, получение, исследование строения и свойств их активных субстанций, но и выяснение молекулярного механизма действия.

Без знания механизма действия препарата невозможно введение его в клиническую практику, поэтому изучение механизма действия, предполагающее использование самых современных методов молекулярной и клеточной биологии, является важной и актуальной частью работ по созданию противоопухолевых средств.

Недавно среди природных соединений из различных биологических объектов наземного происхождения найдена серия веществ, ингибирующих канцерогенез.

Канцерпревентивные метаболиты красного вина, зеленого чая, красного перца привлекли большое внимание. Соответствующие работы приобрели самую широкую известность и были опубликованы в ведущих научных журналах мира Science и Nature.

Морские организмы, безусловно, также содержат соединения, препятствующие возникновению и развитию опухолей, но в то же время все еще остаются малоизученными в отношении содержания в них биологически активных веществ этого типа действия. Вероятность нахождения новых морских низко- и высокомолекулярных соединений, обладающих канцерпревентивными свойствами, высока, а их поиск, выделение, изучение строения и механизма действия с целью последующего применения таких веществ в медицинской практике являются актуальными.





Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск, выделение (получение), установление химического строения новых морских природных соединений и их синтетических аналогов, а также исследование их канцерпревентивной и противоопухолевой активности вплоть до некоторых аспектов молекулярного механизма их действия.

При поиске новых морских биологически активных природных соединений были решены задачи отбора наиболее интересных с биохимической точки зрения образцов морских беспозвоночных путем применения широкого скрининга с использованием хроматографических методов и методов тестирования биологической активности.

Для выделения конкретных природных соединений ставились задачи оптимального использования современных хроматографических методов, включая тонкослойную, колоночную и высокоэффективную жидкостную хроматографию.

При установлении химической структуры и определении чистоты выделенных соединений решали задачи комплексного применения различных физико-химических и химических методов, включая ЯМР, ИК, УФ, КД, масс-спектрометрию, а также рентгеноструктурный анализ.

В рамках данной работы ставились также задачи определения особенностей биологической, в частности канцерпревентивной и противоопухолевой активности отобранных веществ, а также изучения молекулярных механизмов их действия. В частности, решали задачи изучения цитотоксической активности веществ, их влияния на индукцию апоптоза и клеточный цикл, на транскрипционную активность p53, AP- и NF-B ядерных факторов, на внутриклеточные уровни различных белков, включая фосфорилированные и нефосфорилированные формы киназ, циклинов и циклинзависимых киназ и других белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз.

Еще одной задачей работы было изучение связи между строением исследуемых соединений и их биологической активностью и установление соответствующих закономерностей, которые дадут возможность прогнозировать свойства новых природных веществ и препаратов, создаваемых на их основе. Эта задача была решена с помощью широкого набора экспериментальных методов с последующим применением статистических методов анализа.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Из спиртового экстракта морского моллюска Aplysia dactylomela были получены 3 новых терпеноида. При изучении химических свойств выделенных терпеноидов получены 8 их новых производных. Химическое строение этих веществ установлено рентгеноструктурным анализом и спектроскопическими методами. Показано, что один из этих терпеноидов, дактилон, обладает канцерпревентивными свойствами, которые реализуются путем остановки клеточного цикла трансформированных и опухолевых клеток с последующим апоптозом.

2. Из спиртовых экстрактов 4-х видов офиур и 2-х видов шестилучевых кораллов были выделены 9 новых полигидроксилированных стероидов, а еще 2 стероида были впервые выделены из морских организмов. Их строение установлено физикохимическими методами. Путем химических превращений получены 15 их новых производных. Сульфатированные полиоксистероиды из офиур и морских звезд проявляют цитотоксическое действие против нескольких линий опухолевых клеток человека, ингибируют биосинтез ДНК в клетках карциномы Эрлиха и вызывают быстрый вход ионов Са2+ в клетки из внеклеточной среды через кальциевые каналы.

3. Левиускулозид G, стероидный гликозид из морской звезды Henricia leviuscula обладает цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток и канцерпревентивной активностью. Эти активности связаны с индукцией апоптоза в опухолевых клетках человека и ингибированием трансформации нормальных клеток в опухолевые. Они опосредованы, по крайней мере отчасти, через индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и ингибирование транскрипционной активности, зависимой от онкогенных AP-1 и NF-B ядерных факторов, а также через ингибирование EGF-индуцированного фосфорилирования онкогенных протеинкиназ ERKs.

4. Алкалоид поликарпин из асцидии Polycarpa aurata и его синтетический аналог диметилполикарпин показывают высокую противоопухолевую и цитотоксическую активности, а также канцерпревентивную активность в малотоксичных концентрациях.

Эти активности поликарпинов, по крайней мере отчасти, обусловлены индукцией поликарпинами каспаза-3- и р53-зависимого апоптоза в трансформированных клетках.

Фосфорилирование и активирование под действием поликарпинов белка-супрессора опухолей р53 в свою очередь опосредовано активированными протеинкиназами JNKs, которые участвуют в фосфорилировании белка c-Jun, активировании р53 и последующем апоптозе.

5. Алкалоиды индольного типа шеринины А-Е из морского гриба Penicillium janthinellum не проявляют заметной цитотоксической активности в концентрациях до 200 мкМ. Однако уже в концентрации 13 мкМ шеринин Е ингибирует опухолевую трансформацию нормальных мышиных клеток. Кроме того, шеринины А-Е, также как и морские алкалоиды, 3- и 10-бромофаскаплизины, вызывают апоптоз опухолевых клеток человека.

6. Новый пренилированный 1,4-бензохинон (глабрухинон А) был выделен из асцидии Aplidium glabrum. Определено его химическое строение. Методами органического синтеза получены 9 новых и 3 ранее известных аналога глабрухинона.

Полученные полипренилхиноны индуцируют в клетках независимый от активации супрессора опухолей р53 апоптоз, обладают in vitro и in vivo канцерпревентивной и противоопухолевой активностью, и являются мощными индукторами АР-1 и NF-B ядерных транскрипционных факторов. Установлена зависимость между биологическими активностями и структурой в этом ряду соединений.

7. Биополярный необычный сфинголипид ризохалин из губки Rhizochalina incrustata, его аналоги и производные демонстрируют цитотоксические свойства по отношению к опухолевым клеткам человека и вызывают их р53- и каспаза-8, 9, 3зависимый апоптоз. Показано также, что МАРК JNK и ERK сигнальные пути участвуют в ответе JB6 Cl41 клеток на воздействие ризохалина и его аналогов.

8. Актинопорин RTX-A из актинии Heteractis crispa демонстрирует канцерпревентивную и цитотоксическую активности. Проявление RTX-A данных активностей может быть объяснено, по крайней мере частично, индукцией р53независимого апоптоза и ингибированием активности онкогенных АР-1 и NF-B ядерных факторов.

9. С11 циклопентенон (диосфенол) из асцидии Diplosoma sp. обладает канцерпревентивной активностью в субцитотоксических концентрациях.

Канцерпревентивное и цитотоксическое против опухолевых клеток действие диосфенола обусловлены индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках. По всей вероятности, МАРК JNK и р38 сигнальные пути участвуют в ответе клеток на воздействие диосфенола.

10.Тритерпеновые гликозиды из голотурий семейств Cucumariidae, Stichopodidae, Psolidae, Holothuriidae и Synaptidae показывают цитотоксические активности, а в малотоксичных концентрациях - канцерпревентивное действие. Механизм их действия связан с индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках и ингибированием онкогенных АР-1 и NF-B ядерных факторов транскрипции.

Научная новизна и практическая ценность работы. 44 новых морских вторичных метаболита и их синтетических аналога были выделены из морских организмов или получены в результате химических модификаций. Их строение было установлено физико-химическими и химическими методами. Впервые изучены канцерпревентивная и цитотоксическая активности (в отношении опухолевых клеток) 62-х морских природных соединений и их синтетических аналогов, большинство из которых являются новыми. Для многих из них исследована зависимость биологической активности от их химической структуры.

Новизна данной работы состоит и в том, что в России до недавнего времени еще не проводился направленный поиск канцерпревентивных природных соединений, а в других странах такой поиск проводился в основном среди природных соединений наземного, но не морского происхождения. Только в 2004 г. нами была опубликована первая статья, посвященная канцерпревентиному действию морских метаболитов, алкалоидов поликарпинов, выполненная совместно с американскими учеными. В настоящее время в ТИБОХ ДВО РАН организована экспериментальная база, обеспечивающая проведение таких работ. Для поиска соединений, обладающих канцерпревентивными свойствами, создана коллекция из более чем 80 клеточных линий опухолевых и нормальных клеток человека и мыши. В данной работе применены методы поиска соединений, ингибирующих EGF- и TPA-индуцируемую трансформацию мышиных JB6 Cl41 Р+ клеток в мягком агаре, MTS-метод определения цитотоксической активности, люциферазный метод определения АР-1, р53 и NF-Bзависимой транскрипционной активности, а в экспериментах используются генетически измененные клетки мыши, применяемые, в том числе для изучения влияния веществ на МАРК р38, JNK и ERK сигнальные пути. Ряд этих методик впервые поставлены нами в России. С помощью метода мягкого агара изучены канцерпревентивные свойства 27 морских природных соединений и их синтетических аналогов, найдено несколько соединений перспективных в качестве хемопревентивных средств, тормозящих опухолевое перерождение клеток.

Некоторые изученные вещества индуцировали апоптоз в опухолевых клетках человека, воздействовали на активность внутриклеточных белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз, и активировали ряд ядерных факторов, в том числе белоксупрессор опухолей р53. В процессе выполнения работы показано, что некоторые виды морского пищевого сырья, в частности морские водоросли и голотурии, содержат соединения с канцерпревентивными свойствами.

Результаты данных исследований могут найти применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии, расширить спектр используемых в России биологически активных добавок к пище и привести к разработке новых медицинских препаратов. По результатам работы получены 2 патента РФ на изобретения, связанные с открытием новых перспективных противоопухолевых и апоптоз-индуцирующих препаратов профилактической и терапевтической направленности.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде постерных сообщений и устных докладов на ряде научных конференций и симпозиумов, в том числе: VI International Symposium on marine natural products (Дакар, Сенегал, 1989), 10-th World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins (Сингапур, 1991). 8-th Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chemistry (Riga, Латвия, 1991), 8-th International Symposium on Marine Natural Products (Santa Cruz de Tenerife, Canary Islands, 1995), Научная Конференция ТИБОХ ДВО РАН (Владивосток, Россия, 1998), 9th International Symposium on Marine Natural Products (Townsville, Australia, 1998), IX Pacific Science International Congress (Taipei, Taiwan, 1998), Pacific Science Congress (Sydney, Australia, 1999), 95th AACR Annual Meeting (Orlando, Florida, USA, 2004), International Conference “Dietary Factors and Cancer Prevention: Current Premises and Future Promises” (Rochester, Minnesota, USA, 2004), IV Всероссийская Научная Конференция «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, Россия, 2006), The Commemorative International Symposium for the 60-th Anniversary of Dong-A University “Biotechnological Approaches for Agriculture and Medicine” (Busan, Korea, 2006), International Conference “Joint Russian-Korean Research of Physiological and Therapeutic Activity of Natural Compounds” (Vladivostok, Russia, 2007).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 30 статей в отечественных и международных журналах, 2 главы в монографиях, 2 патента и тезисов докладов региональных, всероссийских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация построена традиционно и состоит из 6 глав. Вслед за «Введением» следует «Литературный обзор», в котором дается представление о современных достижениях в области изучения структуры и противоопухолевой профилактической активности морских природных соединений, а также общие сведения о канцерогенезе, фазах его развития, методах изучения, внутриклеточных мишенях и сигнальных путях его ингибирования. В главе «Обсуждение результатов» приведены и обсуждены результаты выполненного исследования. Эта глава состоит из 8 разделов, в которых материал сгруппирован в «Экспериментальной части» даны сведения об использованных приборах и материалах, клеточных культурах, методиках выполненных экспериментов и сообщены характеристики полученных веществ. Завершают диссертацию «Выводы» и «Список цитированной литературы». Работа изложена на 295 страницах, содержит 34 таблицы, 78 рисунков и 9 схем. Список литературы включает 516 цитируемых работ.

Благодарности. Автор благодарен научному консультанту, академику РАН Стонику В.А., всем сотрудникам лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН, а также н.с. Радченко О.С., к.х.н. Баланевой Н.Н., к.х.н. Сметаниной О.Ф., д.х.н. Монастырной М.М., Жидкову М.Е. (ДВФУ), принимавшим участие в данной работе и представившим свои вещества для нашего изучения. Автор благодарен также д.х.н. Калиновскому А.И., к.х.н. Дмитренку П.С., к.х.н. Исакову В.В., к.х.н.

Герасименко А.В. (ИХ ДВО РАН), к.х.н. Попову Д.Ю. (ИХ ДВО РАН) – за получение и помощь в обработке спектральных данных или данных рентгеноструктурного анализа, к.б.н. Аминину Д.Л., к.б.н. Агафоновой И.Г., к.б.н. Шастиной В.В., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Ермаковой С.П., к.б.н. Горшковой И.А., к.б.н. Бердышеву Е.В. (Институт Хормела, США), проф. Боуд А.М. (Институт Хормела, США), проф. Донг З. (Институт Хормела, США) и сотрудникам его лаборатории, проф. Квак Д.Й. (Университет ДонгА, Республика Корея) и сотрудникам его лаборатории - за помощь в работе и проведение отдельных экспериментов по изучению биологической активности, а также к.б.н. Смирнову А.В. (ЗИН РАН, г. Санкт-Петербург), н.с. Красохину В.Б. и Гребневу Б.Б. – за определение видовой принадлежности изученных морских организмов.

Используемые сокращения. КД – круговой дихроизм; MTS – 5-(3карбоксиметоксифенил)–2–(4,5-диметилтиазолил)-3-(4-сульфофенил) тетразолий, внутренняя соль; EGF – эпидермальный фактор роста; IC50 – (Inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%; INCC50 – (Inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования клеток в мягком агаре на 50%; JB6 Cl41 DNM-p38 или JB6 Cl DNM-JNK1 или JB6 Cl41 DNM ERK2 – (dominant negative mutant), JB6 Сl41 клетки, доминант-негативно-мутантные по p38 или JNK1 или ERK2; FBS - сыворотка бычьих эмбрионов; МАРК – (Mitogen Activated Protein Kinases), митоген-активируемые протеин киназы; p38 – киназы, относящиеся к МАРК; JNKs - киназы, относящиеся к МАРК; ERKs - киназы, регулируемые экстраклеточными сигналами, относятся к МАР киназам; JB6 Cl41 р53 или JB6 Cl41 АР-1 или JB6 Cl41 NF-B – линии клеток со стабильно экспрессированным геном люциферазы, контролируемым промоторной р или АР-1 или NF-B нуклеотидной последовательностью; Rb – ретинобластома, белоксупрессор опухолей; р53 – белок-супрессор опухолей, ядерный транскрипционный фактор; AP-1 – активаторный белок-1, ядерный транскрипционный фактор; NF-B – (Nuclear Factor – B), ядерный транскрипционный фактор; Cdk4 – циклин-зависимая киназа; противоопухолевая активность – в данной работе – активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Химические структуры, свойства и биологическая активность Предполагается, что потребление разнообразной морской пищи приводит к значительному количественному уменьшению случаев заболеваний раком в Японии и других странах, население которых традиционно потребляет в пищу большое количество морепродуктов. Известно, что многие виды морской пищи содержат низкомолекулярные природные продукты, не характерные для наземных организмов.

Однако возможная роль большинства таких вторичных метаболитов, за исключением жирных кислот, в профилактике раковых заболеваний остается неизвестной.

Галогенированные хамиграновые сесквитерпеноиды представляют собой группу морских природных соединений, которые были найдены только в красных водорослях и моллюсках, питающихся этими растениями. Метаболиты этой серии были выделены из различных видов морских водорослей, принадлежащих к роду Laurencia, включая те виды, которые используются в пищу населением Японии, Гавайских островов и других стран мира. Противоопухолевые свойства этих соединений были изучены явно недостаточно.

Дактилон - галогенированный хамиграновый сесквитерпеноид из моллюска Aplysia dactylomela. Структура и абсолютная конфигурация. Из хлороформенного экстракта морского моллюска A. dactylomela был получен новый хамиграновый бромсодержащий сесквитерпеноид дактилон (1). Брутто-формула (1) С15Н21ОВr спектр дактилона близок к спектру ранее известного соединения 2, но отличается сдвигом сигнала одной из метильных групп от 0.95 до 1.72 м.д. и появлением мультиплета олефинового протона при 6.5 м.д. В связи с этим для 1 предложена структура 10-бромо-3,11,11-триметил-7-метилиден-спиро[5,5]ундец-2-ен-4-она.

Окончательно структура дактилона (1) и его абсолютная стереохимия установлена как (6S,10R)-10-бромо-3,11,11-триметил-7-метилиденспиро[5,5]ундец-2-ен-4-она с помощью рентгеноструктурного анализа. Конформации циклов: А – кресло, В - 6софа. Как следует из полученных данных, выделенный нами терпеноид (1) относится к производным (+)--хамигрена. Родственные 1 соединения с такой абсолютной стереохимией спироатома до этого были найдены только в двух видах красных водорослей рода Laurencia: L. elata и L. оbtusa.

Некоторые химические свойства дактилона. Семь новых терпеноидных производных получены нами из дактилона (1) путем химических превращений. Их структуры установлены сравнением ЯМР спектров со спектрами исходного дактилона (1), а также с помощью КД и масс-спектров.

Так, в результате восстановительного дебромирования дактилона (1) действием Zn в AcOH (схема 1) были получены новые хамиграновые сесквитерпеноиды 3 и 4.

Определена их абсолютная стереохимия как (3S,6S)-3,11,11-триметил-7-метилиден спиро[5,5]ундекан-4-она (3) и (6S)-3,11,11-триметил-7-метилиден-спиро[5,5]ундец-2ен-4-она (4).

Схема 1. Восстановительное дебромирование дактилона (1) до производных 3 и 4.

Гидрирование дактилона (1) над катализатором Адамса (схема 2) приводит к еще двум новым хамиграновым сесквитерпеноидам 5 и 6.

Схема 2. Реакция гидрирования дактилона (1) над катализатором Адамса.

Для терпеноидов 5 и 6 установлена абсолютная стереохимия как (3S,6S,7S,10R)-10бромо-3,7,11,11-тетраметилспиро[5,5]-ундекан-4-она и Обработка дактилона трифторуксусной кислотой в растворе в метаноле в течение дней при комнатной температуре приводит к миграции экзометиленовой двойной связи в эндоциклическое положение (схема 3). Единственный продукт реакции - (6S,10R)-10бромо-3,7,11,11-тетраметилспиро[5,5]ундека-2,7-диен-4-он (7) - получен с выходом 82%.

Предполагается, что морские хамиграновые сесквитерпеноиды биосинтезируются в результате циклизации бизаболановых предшественников. Нами установлено, что обратное превращение галогенированных хамигранов в сесквитерпеноиды бизаболанового типа неожиданно легко и с почти количественным выходом происходит в результате реакции хамигранов со щелочью.

Схема 3. Перегруппировка дактилона (1) и его -изомера (7) с образованием производных Так, дактилон (1) и его -изомер (7) после обработки КОН в метаноле в течение часов при комнатной температуре претерпевают перегруппировку с размыканием бромсодержащего цикла и образованием производных бизаболанового типа 8 и соответственно (схема 3). Возможно, аналогичные трансформации хамиграновых предшественников имеют место также и в живых организмах. Сесквитерпеноиды с углеродным скелетом, аналогичным таковому для соединений 8 и 9, были выделены ранее из ряда горгонарий и губок.

канцерпревентивное действие. MTS-методом было показано, что дактилон мало токсичен в отношении мышиных JB6 Cl41 P+ клеток и клеток рака легкого человека, HT-460, его IC50 - около 150 и 200 мкМ соответственно. Для определения эффекта дактилона на опухолевую трансформацию нормальных клеток или колонеобразование опухолевых клеток был использован стандартный метод мягкого агара. В качестве промотора злокачественной трансформации мышиных JB6 Cl41 P+ клеток, которые при такой трансформации образуют многочисленные колонии при росте в мягком агаре, был использован эпидермальный фактор роста (EGF) в концентрации 10 нг/мл.

Результаты экспериментов показали, что дактилон проявляет канцерпревентивные свойства в практически нетоксичных дозах. Так, 50% ингибирование числа колоний трансформированных JB6 Cl41 Р+ клеток (INCC50) дактилоном наблюдается уже в концентрации 45.4 мкМ. Похожие эффекты зафиксированы в экспериментах по ингибированию дактилоном колонеобразования опухолевых клеток человека НТ-460, НСТ-116 и SK-MEL-5, при этом INCC50 равны 92.4; 70.5 и 99.2 мкМ соответственно.

Действие дактилона на клеточный цикл. С помощью проточной цитометрии показано, что дактилон индуцирует остановку клеточного цикла в JB6 Cl41 Р+ и SKMEL-28 клетках на стадии перехода от G1 к S фазе. Так, уже при концентрации 40 мкМ дактилон в значительной степени препятствует переходу JB6 Cl41 Р+ клеток из G1 в S фазу клеточного цикла, а при концентрации 60 мкМ он полностью блокирует прогрессию клеточного цикла на этом этапе. Однако при действии на доминантнегативно-мутантные JB6 Сl41 DNM-ERK2 клетки дактилон в концентрациях 10- мкМ не ингибирует, а наоборот, интенсифицирует переход клеток из G1 в S фазу. На основании этих данных мы предположили, что эффект дактилона на прогрессию клеточного цикла, по крайней мере частично, может быть опосредован через МАРК ERKs.

Индукция дактилоном апоптоза. Данные, полученные путем клеточной цитометрии, показали, что дактилон может индуцировать запрограммированную смерть клеток путем апоптоза. Индукция клеточного апоптоза дактилоном показана с использованием красителей Аннексин V-FITC и пропидиум йодид. Было найдено, что дактилон в малотоксичных дозах индуцирует дозозависимый апоптоз в мышиных JB Cl41 P+ клетках (рис. 1А), а также в опухолевых клетках человека SK-MEL-28 (рис. 1Б), HL-60 и THP-1. Таким образом, противоопухолевое действие дактилона можно объяснить его способностью вызывать остановку клеточного цикла с последующим апоптозом.

Рисунок 1. Индукция дактилоном (1) апоптоза в JB6 Cl41 Р+ (A) и SK-MEL-28 (Б) клетках.

Здесь и в последующих рисунках * р 0.05 (достоверное отличие от контроля).

Эффект дактилона на фосфорилирование и внутриклеточные уровни некоторых сигнальных белков и роль ERKs в воздействии дактилона на клетки млекопитающих. Некоторые ранее опубликованные данные показывают, что ERKsфосфорилирование и активирование может индуцировать остановку клеточного цикла.

В нашей работе установлено, что дактилон в концентрациях 50-100 мкМ индуцирует в JB6 Cl41 P+ клетках время- и дозозависимое фосфорилирование основных МАР киназ, включая ERKs (рис. 2А), р38 (рис. 2Б), и JNKs (рис. 2В). Основываясь на результатах изучения действия дактилона на клеточный цикл, мы также исследовали эффект различных его доз на экспрессию в клетках циклина D3, Cdk4 и фосфорилированных форм белка-супрессора опухолей ретинобластомы (Rb), которые регулируют прогрессию от G1 к S фазе клеточного цикла. Показано, что обработка дактилоном в концентрации 40-100 мкМ подавляет экспрессию циклина D3 и Cdk4, а также фосфорилирование Rb в JB6 Cl41 P+ клетках. Похожее ингибиторное действие дактилона наблюдалось также на SK-MEL-28 и HT-460 линиях опухолевых клеток.

Данные об активной роли ERK-сигнального пути в опосредовании индуцированного дактилоном ингибирования Rb фосфорилирования с последующей остановкой клеточного цикла на G1/S переходе были получены при сравнении эффектов дактилона на Rb белок в JB6 Cl41 P+, JB6 Cl41 DNM-ERK2, JB6 Cl41 DNMp38 и JB6 Cl41 DNM-JNK1 клетках.

Было найдено, что до концентрации 100 мкМ дактилон никак не воздействует на Rb фосфорилирование в JB6 Cl41 DNM-ERK2 клетках. Напротив, Rb фосфорилирование было подавлено после воздействия дактилона в JB6 Cl41 DNM-p38 и JB6 Cl41 DNMJNK1 клетках. Ингибиторный эффект дактилона на Rb фосфорилирование также значительно понижен в RSK2 (синдром Коффин-Лоури) клетках по сравнению с нормальными WT-RSK2 клетками.

Рисунок 2. Эффект дактилона (1) на фосфорилирование ERKs (А), р38 (Б), и JNKs (В) в RSK2 является основным субстратом ERKs в MAPK/ERK сигнальном пути. Кроме того, в пользу предположения об активной роли ERK-сигнального пути в механизме действия дактилона на клетки млекопитающих свидетельствует тот факт, что в концентрациях от 40 до 150 мкМ дактилон лишь незначительно влияет на жизнеспособность JB6 Cl41 DNM-ERK2 или RSK2 клеток, в отличие от JB6 Cl DNM-JNK1, JB6 Cl41 DNM-p38 и WT-RSK2 клеток, жизнеспособность которых понижается на 30-60%.

Влияние дактилона на р53-, АР-1- и NF-B-зависимую транскрипционную активность. Эффект дактилона на р53-, АР-1- и NF-B-зависимую транскрипционную активность оценивался с помощью JB6 Cl41 клеток со стабильно экспрессированным репортерным геном люциферазы, контролируемым р53, АР-1 или NF-B промоторными ДНК последовательностями. Белок-супрессор опухолей р53 играет критическую роль в апоптозе, а увеличение уровня р53 в клетке с последующим апоптозом характеризует эффект на клетку многих канцерпревентивных агентов, например резвератрола, экстракта черного чая и других. Однако в наших экспериментах дактилон в нетоксичных концентрациях 50-100 мкМ, напротив, в два раза ингибирует базовую р53-зависимую транскрипционную активность и в 1.2-1.6 раз активирует базовую АР-1- и NF-B-зависимую транскрипционную активность в JB Cl41 клетках.

Все полученные нами результаты показывают, что хамиграновые сесквитерпеноиды морского происхождения (представленные здесь дактилоном), являясь компонентами некоторых экзотических морских блюд, образуют перспективную группу канцерпревентивных и противоопухолевых природных соединений. Их противоопухолевое действие, вероятно, дополняется некоторыми другими эффектами галогенированных сесквитерпеноидов, сообщенными в литературе, например, их антибактериальной активностью по отношению к штаммам, устойчивым к действию антибиотиков, антивирусной активностью против вируса герпеса, а также антигельминтной активностью. Наличием всех этих эффектов могут быть объяснены полезные свойства, приписываемые общественным мнением такой морской пище.

Cесквитерпеноид с перегруппированным углеродным скелетом из моллюска A.

dactylomela. В литературе имеется много сообщений о выделении галогенированных сесквитерпеноидов хамигранового типа с углеродным скелетом типа А (рис. 3) из красных водорослей и моллюсков, питающихся этими водорослями. Более редкими являются соединения, имеющие углеродный скелет типа В (рис. 3).

Рисунок 3. Обычный (А) и прегруппированный (В) углеродные скелеты хамиграновых Мы выделили новый необычный негалогенированный сесквитерпеноид (10) c углеродным скелетом В из этанольного экстракта морского зайца A. dactylomela.

Структура кетонсодержащего цикла в 10 идентична структуре аналогичного фрагмента в дактилоне (1), что подтверждается спектральными данными. Другой цикл в 10, как было доказано методами ЯМР спектроскопии, включая NOE эксперименты, имеет конформацию кресла с двумя экзо-метиленовыми группами в -положениях и одной экваториальной метильной группой в -положении к спиро-атому. Эти данные в сумме указывают на конформацию этого цикла в виде7,10-кресла. Ранее рентгеноструктурный анализ показал, что дактилон (1) имеет абсолютную конфигурацию 6S,10R. Для того чтобы определить абсолютную конфигурацию в 10, мы получили насыщенный кетон 11 каталитическим гидрированием 10 и использовали еще один насыщенный кетон 3, который был получен ранее путем обработки дактилона (1) цинком в смеси уксусной кислоты и метанола (схема 4). Путем сравнения КД спектров производных 11 и 3, был сделан вывод о 6S конфигурации в соединении 10.

Схема 4. Получение производных 11 из соединения 10 и 3 из дактилона 1.

Таким образом, структура терпеноида 10 была определена как (6S,10S)-3,10диметил-7,11-диметилиден-спиро[5,5]ундец-2-ен-4-он.

Присутствие терпеноидов 10 и 1, имеющих одинаковую конфигурацию спиро-атома в экстрактах A. dactylomela, предполагает, что 10 может быть продуктом метаболизма дактилона (1) в организме моллюска (схема 5).

Схема 5. Гипотетическая схема биотрансформации дактилона 1 в терпеноид 10.

Аплидактон, терпеноид с беспрецедентным углеродным скелетом из моллюска A. dactylomela. Из спиртового экстракта A. dactylomela был выделен уникальный сесквитерпеноидный кетон 14, названный аплидактоном. Для установления его строения и абсолютной конфигурации использовали рентгеноструктурный анализ. В аплидактоне (14) были обнаружены значительные отклонения в длинах углерод-углеродных связей и значениях двугранных углов по сравнению с обычными, в том числе характерными для циклобутанов. КД спектр аплидактона показал положительный эффект Коттона с []287 = +42.8105. Применение правила октантов подтвердило абсолютную конфигурацию аплидактона, определенную рентгеноструктурным анализом.

До выделения аплидактона трудно было предположить, что такие соединения, содержащие два циклобутановых цикла, «вписанных» в шестичленный цикл, могут быть достаточно устойчивы, и существовать в природе. Возможно, что биосинтетическим предшественником 14 может служить дактилон (1). В этом случае образование четырехчленного цикла в 14 является результатом энзиматической трансформации, включающей [2+2]-циклоприсоединение в 1 (схема 6). Известно, что оно может происходить под действием УФ-облучения соответствующих диненасыщенных соединений. Однако наши попытки получить аплидактон (14) из дактилона (1) путем долговременного УФ-облучения не увенчались успехом. Это свидетельствует в пользу in vivo образования аплидактона.

Схема 6. Гипотетическая схема трансформации дактилона 1 в аплидактон 14.

Мы предположили, что аплидактон, имеющий нуклеофильный центр, может быть перегруппирован в более стабильное соединение под действием донора протонов.

Действительно, реакция с p-TsOH дала с почти количественным выходом изомерное соединение 15 (схема 7). Структура и абсолютная конфигурация 15 были установлены тщательным ЯМР анализом, включая 1H-1H COSY, HMQC, HMBC и 1D-NOE эксперименты, а также КД спектроскопией. КД спектр показал положительный эффект Коттона с []287 = +36105, что подтвердило стереохимические особенности 15.

Схема 7. Перегруппировка аплидактона 14 в производное 15 под действием кислоты.

Биологическая активность аплидактона и хамигранового сесквитерпеноида (3R,4S,6S,10R) 10 – бромо – 3, 11, 11 – триметил - 7 -метилиден-спиро[5,5]ундекандиола из моллюска A. dactylomela. Было показано, что терпеноид 14 обладает весьма слабой цитотоксической активностью по отношению к JB6 Cl41 P+ клеткам, IC = 148 мкМ, более того, в концентрациях 25-75 мкМ, аплидактон (14) способствует ускорению клеточной пролиферации почти в полтора раза, по сравнению с контрольными клетками, в течение 24 ч.

Кроме того, было показано, что, аплидактон (14) обладает свойствами увеличивать UVB-индуцированную транскрипционную активность АР-1 и NF-B ядерных факторов. Так, в нецитотоксической концентрации 75 мкМ, аплидактон в два раза увеличивает транскрипционную активность АР-1 и в три раза активность NF-B ядерных факторов, не оказывая при этом большого влияния на активность р ядерного фактора. Вполне возможно, что именно с увеличением активности АР-1 и NFB ядерных факторов связано ускорение пролиферации клеток под действием нецитотоксических концентраций аплидактона. Таким образом, соединение обладает, вероятно, канцерпромоторными свойствами.

Хамиграновый сесквитерпеноид (3R,4S,6S,10R) 10-бромо-3,11,11-триметил-7метилиденспиро[5,5]ундекан-3,4-диол (16) был выделен нами из экстрактов A.

dactylomela. Была исследована цитотоксическая активность сесквитерпеноида 16 в сравнении с цитотоксической активностью дактилона (1) в отношении клеток лейкемии человека HL-60 и THP-1. Сесквитерепеноид 16 проявляет цитотоксическую активность по отношению к HL-60 и THP-1 лейкемическим клеткам с IC50 = 102 мкМ и 152 мкМ соответственно. Таким образом, замена сопряженной с двойной связью карбонильной группы в кольце В в дактилоне (1) на диольную группировку в терпеноиде 16 приводит к некоторому увеличению цитотоксической активности последнего по сравнению с дактилоном.

Цитотоксическая активность против опухолевых клеток терпеноидов из дальневосточной бурой водоросли Dictyota dichotoma. Из экстракта дальневосточной бурой водоросли D. dichotoma были выделены дитерпеноид пахидиктиол А (17) и сесквитерпеноид аксенол (18).

Как пахидиктиол А (17), так и аксенол (18) демонстрируют in vitro слабую цитотоксическую активность против опухолевых клеток человека HeLa, THP-1 и SNUC4. В то же время оба вещества значительно менее цитотоксичны по отношению к здоровым мышиным эпидермальным клеткам линии JB6 Cl41. Более того, дитерпеноид пахидиктиол А (17) показывает примерно в два раза более высокую цитотоксическую активность по отношению к вышеперечисленным клеточным линиям, чем сесквитерпеноид аксенол (18) (табл. 1).

Таблица 1. IC50 пахидиктиола А (17) и аксенола (18) по отношению к опухолевым клеткам человека HeLa, THP-1 и SNU-C4 и нормальным эпидермальным клеткам Клеточная линия Цитотоксическая концентрация (IC50), мкМ карцинома) 2. Химическая структура и биологическая активность стероидных производных из иглокожих и шестилучевых кораллов Моносульфатированный полиоксистероид (20R)-холест-5-ен-3,4,21-триол 3сульфат натрия из офиур Ophiura sarsi, Ophiura leptoctenia и Stegophiura brachiactis.

Основным компонентом фракции полярных стероидов из офиуры O. sarsi оказался стероидный сульфат 19.

Структуру 19 установили на основании анализа его ЯМР, ИК и МС данных. После сольволиза 19 нагреванием в смеси диоксан-пиридин получили десульфатированное производное 20. Ацетилирование 19 давало моносульфатированный диацетат 21, сольволитическое десульфатирование которого приводило к диацетату 22. Для доказательства наличия в стероиде 20 -диольной группировки, было проведено его периодатное окисление с последующим восстановлением боргидридом натрия и ацетилированием. Окисление 19 реактивом Саррета привело к образованию в 4-м положении карбонильной группы, сопряженной с 5,6-двойной связью, и подтвердило, таким образом, что сульфатированный гидроксил расположен у С-3, а вторичная гидроксильная группа находится в -положении к двойной связи. На основании полученных данных мы предложили для выделенного соединения 19 структуру (20R)холест-5-ен-3,4,21-триола натрия. Этот сульфатированный полиоксистероид был идентифицирован в этанольных экстрактах еще двух видов дальневосточных офиур: O. leptoctenia и S. brachiactis.

Ди- и три- сульфатированные полиоксистероиды из O. sarsi. Продолжив исследования экстрактов из офиуры O. sarsi, мы выделили новые ди- и трисульфатированные стероидные полиолы 23, 24 и 25. Ввиду того, что соединение 24 не удалось очистить до индивидуального состояния, структурно изучался продукт его десульфатирования 26, что и позволило определить химическое строение стероида 24.

Наблюдаемые в ЯМР спектрах 23 по сравнению со спектрами 19 сдвиги сигналов протонов CH2-21 в слабое поле и сигналов углеродных атомов С-20 и С-21 в сильное и слабое поля, соответственно, могут быть объяснены сульфатированием С- гидроксигруппы в соединении 23. Это было подтверждено получением идентичного продукта сольволиза 20 из стероидов 19 и 23. На основании этих данных для 23 была установлена структура (20R)-холест-5-ен-3,4,21-триола 3,21-дисульфата натрия. Этот стероид был выделен нами также из этанольного экстракта O. aculeata.

После ацетилирования и последующего сольволитического десульфатирования стероида 23 был получен полиоксистероид, содержащий ацетоксильную группу при Сидентичный по спектральным характеристикам моноацетату стероидного триола 26, выделенному после десульфатирования подфракции полиоксистероидов, где преобладал стероид 24.

Кроме того, сравнение спектров триацетатов, полученных из 23 и 24 после сольволитического десульфатирования и ацетилирования, показало их идентичность друг другу. Установлено, что они имеют формулу 27. Расположение сульфатных групп в молекуле 24 было определено при сравнении 1Н ЯМР спектра подфракции сульфатированных полиоксистероидов, где преобладающим компонентом был стероид 24, со спектром сульфатированного моноацетата, полученного при ацетилировании стероида 23. Эти спектры оказались идентичными. Таким образом, для сульфатированного полиоксистероида 24 было доказано строение (20R)-4-ацетоксихолест-5-ен-3,21-диол 3,21-дисульфата натрия.

Сульфатированный полиоксистероид 25 при попытке ацетилирования не изменялся, а продукт его сольволиза 28 в масс-спектре имеет пик молекулярного иона с m/z 418. В С ЯМР спектре триола 28 присутствуют сигналы трех атомов углерода, связанных с кислородом, и двойной связи. Ацетилирование соединения 28 приводит к триацетату 29, который отличается от триацетата холест-5-ен-3,4,21-триола (27). Сравнение спектров 13С ЯМР 28 и 20, а также 1Н ЯМР спектров их ацетатов 29 и 27 показывает почти полное совпадение сигналов С-12 - С-27 и небольшое отличие сигналов атомов в кольцах А и В. Был сделан вывод об идентичности боковых цепей триолов 28 и 20. На основании спектральных данных мы предположили, что две вторичные гидроксильные группы и двойная связь находятся в полициклической части молекулы и образуют фрагмент А. Данные спин-декаплинг экспериментов, а также ширина сигналов протонов СН-2 и СН-3, указывают на их экваториальную конфигурацию и 2,3расположение гидроксильных групп. Следовательно, сульфатированный полиоксистероид 25 имеет строение (20R)-холест-5-ен-2,3,21-триол 2,3,21трисульфата натрия.

Дисульфатированные стероидные триолы из офиуры Ophiopholis aculeata. Из офиуры O. aculeata были получены дисульфатированные стероидные триолы 30-32.

При сравнении 13С ЯМР спектра 30 со спектром 25 можно было убедиться, что разница в химсдвигах углеродных атомов стероидного ядра для этих соединений значительна лишь для С-2, что говорит о наличии в 30 свободной гидроксильной группы при С-2 по сравнению с сульфатной группой при С-2 в 25. И наоборот, сигналы С-3 и С-21 в спектре 30 смещены в слабое поле по сравнению с соответствующими сигналами в 13С ЯМР спектре известного триола 28, что свидетельствует о наличии в 30 сульфатных групп при С-3 и С-21. Два дополнительных (по сравнению со спектрами 25 и 28) сигнала в области двойных связей (128.5 и 138.1 м.д.) указывают на то, что в боковой цепи стероида 30 имеется еще одна двойная связь. Наконец, присутствие в 13С ЯМР спектре 30 только 26 сигналов углеродных атомов показывает, что эта боковая цепь укорочена. Дальнейшее доказательство структуры стероида 30 мы проводили, используя 13С и 1Н ЯМР, а также масс-спектры моноацетата 33, в результате чего было установлено, что полиоксистероид 30 имеет структуру (20R,22Е)-24-нор-холеста-5,22диен-2,3,21-триол 3,21-дисульфата натрия. Из сравнения спектров 13С и 1Н ЯМР стероидов 31, 32 и 23 можно было сделать вывод о том, что 23, 31, 32 имеют одну и ту же структуру стероидного ядра, а разница между ними заключается лишь в строении боковых цепей. При сравнении химсдвигов протонов СН2-21 в 1Н ЯМР спектре смеси стероидов 31 и 32 с таковыми в спектрах известных сульфатированных полиоксистероидов 23, 25, стало очевидно, что в 31 и 32 в 21-положении боковой цепи находится сульфатная группа. При ацетилировании с последующим десульфатированием из 31 был получен моноацетат 34.

С ЯМР и масс-спектры 34 подтверждают его структуру как моноацетата С27стероидного триола с двумя двойными связями. Чтобы окончательно определить строение стероида 31, моноацетат 34 после ацетилирования и последующего гидрирования над катализатором Адамса был превращен в известное ранее производное - триацетат 27. Идентификацию проводили с помощью 1Н ЯМР и массспектров. Таким образом, строение сульфатированного полиоксистероида установлено как (20R)-холеста-5,25-диен-3,4,21-триол 3,21-дисульфат натрия.

Сульфатированный полиоксистероид 32 выделить в индивидуальном состоянии не удалось. Его 13С ЯМР спектр был получен «вычитанием» из спектра смеси стероидов 31 и 32 спектра 31. Присутствие в спектре стероида 32 сигналов при 130.2 и 133.3 м.д.

позволяет предположить наличие в его боковой цепи двойной связи, отличной от 25(26)-двойной связи стероида 31, а именно: 22-связи. Смесь стероидов 31 и ацетилировали и провели сольволиз полученных ацетатов. Попытки разделить смесь продуктов этих превращений не были успешными. Однако 1Н ЯМР спектр смеси подтвердил наличие в стероиде 32 22-двойной связи с транс-расположением олефиновых протонов. Смесь полученных моноацетатов затем ацетилировали, а фракцию стероидных триацетатов 35 и 36 разделили с помощью ВЭЖХ. Масс-спектр 36 подтверждает структуру триацетата С27-стероидного триола с двумя двойными связями (одна - в ядре, другая - в боковой цепи). Структура боковой цепи 36 доказана с помощью ЯМР экспериментов. Для окончательного подтверждения структуры стероида 32 его производное 36 было превращено в известный триацетат 27 путем гидрирования над катализатором Адамса. Идентификацию провели сравнением 1Н ЯМР и масс- спектров, они были идентичны. Таким образом, для сульфатированного полиоксистероида была 32 определена структура (20R)-холеста-5,22-диен-3,4,21триола 3,21-дисульфата натрия.

Дисульфатированные стероидные тетраолы из офиуры O. aculeata.

Поскольку смесь дисульфатированных полиоксистероидов 37 и 38, выделенную из O. aculeata, разделить не удалось, а спектральный анализ смеси был затруднен ассоциацией в растворах, вызванной наличием сульфатных групп, то структурно изучались продукты их ацетилирования и последующего десульфатирования, а именно - смесь эпимеров 39 и 40.

При сравнении 13С и 1Н ЯМР спектров смеси с соответствующими спектрами стероида 33 можно было сделать вывод об идентичном строении стероидного ядра в 33 и 39, 40 и о существенной разнице в структуре их боковых цепей. Сигналы углеродных атомов боковой цепи смеси 39 и 40 (кроме сигналов С-20 и С-21) имеют вид "дублетов" с разницей в химсдвигах 0.1-0.06 м.д., а для С-24 эта разница составляет 0.08 м.д. Именно такой вид 13С ЯМР спектров характерен для смеси стероидных эпимеров по одному из атомов боковой цепи. Химсдвиги углеродных атомов боковой цепи свидетельствуют о наличии в ее структуре гидроксильной и ацетоксильной групп, а также 25(26)-двойной связи. 1Н ЯМР спектр и эксперименты ЯЭО подтверждают наличие 25(26)-двойной связи, гидроксильной группы у С-21 и (20R)-конфигурацию в стероидах 39 и 40, а также наличие в положении С-24 ОАсгруппы. Расщепление сигнала этой ОАс-группы на два примерно равных синглета (2.05 и 2.06 м.д.) указывает на то, что смесь состоит из приблизительно эквимолярных количеств 24R и 24S-эпимеров 39 и 40. Основываясь на структурах ацетатов 39 и 40, мы определили для нативных полиоксистероидов 37 и 38 строение (20R,24R)- и (20R,24S)-холеста-5,25-диен-2,3,21,24-тетраол 3,21-дисульфатов.

Идентификация 3,21-дисульфатированных стероидных диолов в офиурах O.

aculeata, O. sarsi и S. brachiactis. Продолжив изучение полярных стероидов из офиур, мы получили в индивидуальном состоянии и идентифицировали ранее известные (20R)-5-холестан-3,21-диол 3,21-дисульфат натрия (41) и (20R)-холест-5-ен-3,21диол 3,21-дисульфат натрия (42) в O. aculeata, O. sarsi и S. brachiactis. Идентификация стероидов 41 и 42 проводилась сравнением 13С и 1Н ЯМР, а также масс-спектров исходных сульфатов и их производных 43 и 44 с литературными данными.

Вероятные пути биосинтеза сульфатированных полиоксистероидов офиур.

Наиболее характерными местами гидроксилирования и сульфатирования для полиоксистероидов офиур являются положения 2, 3, 4, а в боковой цепи - 21.

Возможные пути их биосинтеза изображены на схеме 8. Предшественниками этих соединений являются, очевидно, стерины (45, R=боковая цепь). Образование 2,3- и 3,4окисей (46, 50) может быть следствием энзиматической дегидратации свободных стеринов с последующим окислением образующихся при этом 2(3)- и 3(4)-двойных связей. Размыкание эпоксициклов при их взаимодействии с протоном и реакция соответствующих карбкатионов (47, 51) с сульфат-анионом, по-видимому, завершают этот процесс, что приводит к образованию соответствующих сульфатированных полиоксистероидов (48, 49, 52, 53).

Схема 8. Возможные пути биосинтеза сульфатированных полигидроксистероидов в офиурах Биологическая активность полярных стероидов. Действие на опухолевые и нормальные клетки млекопитающих. В наших экспериментах полиокситероид 19, выделенный из O. sarsi, показывает слабую цитотоксическую активность против опухолевых клеток человека HL-60, HeLa, SNU-C4, а также против мышиных эпидермальных JB6 Сl41 клеток в концентрациях 50-200 мкг/мл. Причем при концентрации 200 мкг/мл 19 на 100% ингибирует рост всех используемых клеточных линий. IC50 равна 121, 135, 101 и 114 мкг/мл в отношении HL-60, HeLa, SNU-C4 и JB Cl41 клеток соответственно. Следовательно, более высокую активность стероид проявляет против SNU-C4 опухолевых клеток человека (рак кишечника).

Полярные стероиды 23 и 31 из O. aculeatа, отличающиеся друг от друга только наличием в боковой цепи стероида 31 25(26)-двойной связи, в концентрациях до мкг/мл не проявляют ни цитотоксической активности по отношению к клеткам карциномы Эрлиха и к лимфоцитам мыши, ни гемолитической активности по отношению к эритроцитам мыши. Влияние стероидов 23 и 31 на транспорт ионов Са2+ через клеточную мембрану было исследовано при помощи радиоизотопного и спектрофлюориметрического методов с использованием ионов радиоактивного изотопа Са2+ и флуоресцентного кальциевого зонда. Оказалось, что 23 и 31 в концентрациях 1-100 мкг/мл и времени инкубирования с клетками 5 мин стимулируют быстрый вход ионов Са2+ в клетки карциномы Эрлиха (рис. 4). Причем стероид 31 примерно в 8 раз более активен, чем 23.

Рисунок 4. Влияние стероидов 23 и 31 на вход ионов Са2+ в клетки карциномы Эрлиха.

Подобный эффект стероидов 23 и 31 на внутриклеточную концентрацию Са2+ зафиксирован также на лимфоцитах и макрофагах мыши.

Противоопухолевая активность и механизм действия левиускулозида G, стероидного гликозида из морской звезды Henricia leviuscula. Гликозилированные стероиды являются обычными вторичными метаболитами морских звезд.

Левиускулозид G (LSG, 54) был выделен из дальневосточной морской звезды H.

leviuscula в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ и показал гемолитическую и нейритогенную активности. Однако его проапоптотические и противоканцерогенные свойства до наших работ не были изучены.

Проапоптотические свойства левиускулозида G.

CH3O Канцерпревентивная и цитотоксическая активности левиускулозида G.

Результаты изучения цитотоксической активности показали, что даже концентрация LSG 80 мкМ является нецитотоксической для JB6 P+ Cl41 клеток (рис. 5 А).

Рисунок 5. Действие LSG (54) на жизнеспособность JB6 P+ Cl41 клеток (А). Ингибирование LSG EGF-индуцированной проканцерогенной трансформации JB6 Cl41 P+ клеток (Б).

LSG дозoзависимым образом и в нецитотоксических концентрациях ингибирует трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток, индуцированную эпидермальным фактором роста (EGF) (рис. 5 Б).

Действие левиускулозида G на АР-1-, р53- и NF-B-зависимую транскрипционную активность. Для того чтобы изучить механизм действия LSG на клеточном уровне, было исследовано его действие на АР-1-, р53- и NF-B-зависимую транскрипционную активность в JB6 Cl41 клетках. Роль АР-1 ядерного транскрипционного фактора в пролиферации, дифференциации и EGF-индуцированной прораковой трансформации JB6 P+ Cl41 клеток хорошо известна, а ингибиторы АР- активности рассматриваются как потенциальные противооопухолевые и/или канцерпревентивные вещества. Полученные нами результаты показывают, что LSG является новым ингибитором базовой, а также EGF-индуцированной АР-1-зависимой транскрипционной активности. Ядерный транскрипционный фактор NF-B также участвует в активации большого числа генов, включая гены, ответственные за воспалительные процессы, подавление апоптоза и клеточный ответ на инфекцию.

Рисунок 6. Ингибирование LSG базовой NF-B-зависимой (А) и активирование базовой р53зависимой (Б) транскрипционной активности в JB6 Cl41 клетках. **Относительные единицы.

В противоположность этому, активирование белка-супрессора опухолей р53 ведет к ингибированию клеточного роста путем остановки клеточного цикла или индукции апоптоза. В нашем исследовании LSG, подобно многим другим противоопухолевым веществам, в нецитотоксических концентрациях и дозозависимым образом ингибировал NF-B-зависимую (рис. 6 А), но индуцировал р53-зависимую транскрипционную активность (рис. 6 Б) в JB6 Cl 41 клетках.

Действие левиускулозида G на EGF-индуцированное фосфорилирование ERKs. Известно, что ERKs – существенный элемент контроля клеточного деления.

ERKs способны активировать онкогенные факторы транскрипции, такие как AP-1, NFB, и c-Myc. Сами ERKs также фосфорилируются и активируются эпидермальным фактором роста в процессе опухолевой трансформации мышиных эпидермальных JB Cl41 P+ клеток. Ингибиторы ERKs рассматриваются в качестве противоопухолевых веществ. Наши эксперименты показали, что LSG дозозависимым образом ингибирует EGF-индуцированное ERKs фосфорилирование и активирование в нецитотоксических концентрациях 20-40 мкМ (рис. 7).

Рисунок 7. Ингибирование LSG EGF-индуцированного фосфорилирования ERKs в JB Таким образом, биологическая активность LSG выражается в индукции апоптоза в опухолевых клетках человека и ингибировании трансформации нормальных клеток в опухолевые. Она реализуется, по крайней мере отчасти, через индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и ингибирование транскрипционной активности, зависимой от онкогенных AP-1 и NF-B ядерных факторов, а также через ингибирование EGF-индуцированного фосфорилирования и активирования онкогенных ERKs. На примере изучения LSG показано, что некоторые стероидные гликозиды из морских звезд представляют собой группу морских вторичных метаболитов, перспективных в качестве потенциальных противоопухолевых и канцерпревентивных веществ.

3. Биологическая активность морских алкалоидов и их аналогов.

Биологическая активность и механизм действия поликарпина и его синтетического аналога диметилполикарпина. Противоопухолевый алкалоид поликарпин (55) из асцидии Polycarpa aurata. высоко токсичен в отношении опухолевых клеток человека. Это соединение и его производное диметилполикарпин (56) были получены путем полного химического синтеза в лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ с хорошими выходами.

N N N N N N

Исследование цитотоксической и канцерпревентивной активностей поликарпина и диметилполикарпина. Методом MTS было показано, что поликарпин (55) и диметилполикарпин (56) ингибируют жизнеспособность JB6 Cl41 P+ клеток с IC50=7.2 и 7.7 мкМ соответственно. Канцерпревентивную активность поликарпина и его производного 56 исследовали с помощью метода мягкого агара. В качестве активаторов процесса опухолевой трансформации JB6 Cl41 P+ клеток в мягком агаре были использованы EGF (10 нг/мл) и форболовый эфир (ТРА, 20 нг/мл). Полученные результаты показывают, что алкалоиды 55 и 56 обладают канцерпревентивной активностью в малоцитотоксических концентрациях, при этом INCC50 равны для 1.2-1.5 мкМ, а для 56 - 2.5-4.3 мкМ. Таким образом, оба вещества демонстрируют способность тормозить трансформацию нормальных клеток, причем поликарпин (55) в 2 раза более активный ингибитор злокачественного перерождения клеток, чем диметилполикарпин (56).

Индукция апоптоза в JB6 Cl41 P+ клетках, а также в опухолевых клетках человека. Методом проточной цитометрии показано, что поликарпины 55 и индуцируют апоптоз в JB6 клетках дозозависимым образом (рис. 8). В этом случае также более активен, чем 56. Однако такие активности обоих веществ по отношению к одним и тем же лейкемическим клеткам человека примерно одинаковы.

Рисунок 8. Индукция поликарпином (55) (А) и диметилполикарпином (56) (Б) апоптоза в Поликарпин в концентрации 5 мкМ вызывает ранний апоптоз в 17.3% и поздний в 81.8% HL-60 клеток, соответствующие цифры для диметилполикарпина - 18.7% и 76.0%. Оба вещества оказались более активными индукторами апоптоза по отношению к HL-60 клеткам по сравнению с ТНР-1 клетками. Действительно, при концентрации мкМ 55 вызывает общий апоптоз в 56.7% HL-60 клеток, но лишь в 22.5% ТНР-1 клеток.

Аналогичный результат получен и для 56. Вестерн-блоттингом с использованием первичных антител к прокаспазе-3 и к активной, расщепленной форме каспазы- установлено, что 55 и 56 активируют каспазу-3 в JB6 Cl41 P+ клетках в зависимости от времени и концентрации веществ (рис. 9).

Рисунок 9. Активирование поликарпином (55) (А) и диметилполикарпином (56) (Б) Эти результаты показывают, что канцерпревентивные и противоопухолевые свойства поликарпинов могут быть обусловлены индукцией каспаза-3-зависимого апоптоза в трансформированных или раковых клетках.

диметилполикарпином. С применением метода ветерн-блоттинга мы показали, что поликарпин и диметилполикарпин индуцируют дозозависимое фосфорилирование МАРК р38, JNKs и ERKs (рис. 10 А-В) в JB6 Cl41 Р+ клетках. Так, поликарпин и диметилполикарпин начинают стимулировать фосфорилирование p38 киназы и JNKs уже при концентрации 2.5 мкМ, но фосфорилирование ERKs они индуцируют только при концентрации 10 мкМ и выше.

Диметилфосфо-р поликарпин Рисунок 10. Индукция поликарпином и диметилполикарпином фосфорилирования МАРК Индукция поликарпином и диметилполикарпином фосфорилирования белка cJun по Ser 73 в Jnk+/+, но не в Jnk1/и Jnk2/ мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ). c-Jun является известным субстратом для JNKs. Наши результаты показывают, что и поликарпин, и диметилполикарпин в концентрациях 7.5мкМ индуцируют c-Jun фосфорилирование по Ser 73 в Jnk+/+ мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) дозозависисмым образом (рис. 11).

Рисунок 11. Воздействие поликарпина и диметилполикарпина на фосфорилирование c-Jun по Ser 73 в Jnk+/+ и Jnk1/ МЭФ (А), а также в Jnk+/+ и Jnk2/ МЭФ (Б).

В то же время никакого активирования c-Jun фосфорилирования не наблюдается в Jnk1/и Jnk2/ МЭФ. Этот результат ясно показывает, что поликарпины индуцируют активность JNKs.

Роль МАР киназ в индукции поликарпином или диметилполикарпином проапоптотического сигнала в JB6 Cl41 клетках. MTS методом была оценена роль MAP киназ в эффектах поликарпина или диметилполикарипна на жизнеспособность клеток. Экспрессия доминант-негативной формы JNK1 приводит к резкому увеличению числа JB6Cl 41 JNK1 DNM клеток, выживших после воздействия токсичных концентраций поликарпинов по сравнению с контрольными JB6 Cl41 Р+ клетками. С другой стороны, экспрессия доминант-негативных форм р38 или ERK2, напротив, приводит к уменьшению числа выживших JB6 Cl41 р38 DNM или JB6 Cl ERK2 DNM клеток по сравнению с контрольными JB6 Cl41 Р+ клетками.

Далее, для подтверждения активной роли JNK киназ в опосредовании действия поликарпинов на клеточном уровне, мы изучили поликарпин- и диметилполикарпининдуцированный апоптоз в клетках с экспрессированными доминант-негативномутантными (DNM) формами MAP киназ или в Jnk1/и Jnk2/ МЭФ. Результаты этих экспериментов соответствуют результатам MTS экспериментов и указывают на то, что количество апоптотических JB6 Cl41 JNK1 DNM клеток после воздействия токсических доз поликарпинов значительно, на 20-70% меньше, чем в контрольных JB6 Cl41 клетках. Напротив, JB6 Cl41 p38 DNM клетки в тех же условиях дают значительно большее, на 20-50% количество апоптотических клеток по сравнению с контрольными JB6 Cl41 Р+ клетками. Экспрессия DNM ERK2 не приводит к большой разнице в апоптозе, индуцированном поликарпинами 55 и 56 в JB6 Cl41 ERK2 DNM и JB6 Cl41 Р+ клетках.

Для того чтобы еще раз подтвердить роль JNK киназ в поликарпин-индуцированном апоптозе, мы использовали специфические ингибиторы JNKs: SP600125 и ингибитор пептидной природы #420116. Результаты этих экспериментов показывают, что поликарпин-индуцированный апоптоз на 20-50% ингибируется этими JNK ингибиторами в JB6 Cl41 Р+ клетках. С другой стороны, 30-минутное преинкубирование JB6 Cl41 клеток со специфическим ингибитором р38 киназы, SB202190, имеет результатом значительное, на 20-30%, увеличение числа апоптотических клеток при концентрации поликарпинов 12.5 мкМ, в сравнении с контрольными клетками. Эти результаты подтверждают решающее значение МАРК JNK сигнального пути в индукции апоптоза поликарпином (55) и диметилполикарпином (56).

Роль белка-супрессора опухолей р53 в эффектах, индуцированных поликарпином и диметилполикарпином на клеточном уровне. Для того чтобы исследовать роль р в индукции апоптоза поликарпином и диметилполикарпином, мы изучили апоптоз в р53+/+ и р53-дефицитных (р53-/-) МЭФ. Для каждого из веществ, при концентрациях 10мкМ, количество апоптотических клеток в р53+/+ МЭФ в 2-4 раза выше, чем в р53-/МЭФ. Этот результат показывает, что р53 вовлечен в апоптоз, индуцированный поликарпином или диметилполикарпином. Для того чтобы показать, что оба соединения стимулируют активность р53, мы затем изучили индукцию поликарпинами р53-зависимой транскрипционной активности и р53-фосфорилирования в JB6 Cl клетках. Нами показано, что после обработки JB6 Cl41 клеток со стабильно экспрессированным р53-люциферазным репортерным геном (PG-13 клетки) поликарпинами при концентрациях от 2.5 до 12.5 мкМ, в клетках происходит значительное, на 25-50%, увеличение р53-зависимой транскрипционной активности (рис. 12).

Это увеличение хорошо согласуется с ростом внутриклеточных уровней фосфорилированной и нефосфорилированной форм ядерного фактора р53, наблюдаемым в JB6 Cl41 Р+ клетках, обработанных поликарпином или диметилполикарпином в концентрациях 7.5 мкМ и более (рис. 13).

Рисунок 12. Индукция поликарпином (А) и диметилполикарпином (Б) р53-зависимой Рисунок 13. Влияние поликарпина и диметилполикарпина на внутриклеточные уровни белка-супрессора опухолей р53 в JB6 Cl41 P+ клетках.

Роль JNKs в фосфорилировании белка-супрессора опухолей р53, индуцированном поликарпином и диметилполикарпином. Для того чтобы определить роль JNKs в фосфорилировании р53, индуцированном поликарпинами, мы изучили фосфорилирование р53 по Ser 15, индуцированное 55 и 56 в Jnk1, Jnk2 или Jnk+/+ МЭФ. Полученные результаты показывают, что фосфорилирование р53 было ингибировано в Jnk1/и Jnk2/ МЭФ по сравнению с Jnk+/+ МЭФ (рис. 14). Это указывает на востребованность JNK киназ в процессе поликарпин- или диметилполикарпин-индуцированного фосфорилирования р53 по Ser 15 и последующего апоптоза.

Рисунок 14. Влияние поликарпина и диметилполикарпина на внутриклеточные уровни белка-супрессора опухолей р53 в Jnk+/+, Jnk1/ и Jnk2/ МЭФ.

Таким образом, наши результаты показывают, что цитотоксическая и канцерпревентивная активности поликарпинов, по крайней мере отчасти, обусловлены индукцией каспаза-3-зависимого апоптоза. Кроме того, поликарпины активируют фосфорилирование р38, JNKs и ERKs в JB6 Cl 41 клетках и, следовательно, все три основных МАРК-сигнальных пути вовлечены в ответ JB6 клеток на действие поликарпинов. Мы также показали, что поликарпин-индуцированный апоптоз в значительной степени подавлен в клетках с экспрессированной доминант-негативномутантной формой JNK1 киназы. Поликарпины стимулируют р53-зависимую транскрипционную активность и р53 фосфорилирование в JB6 Сl 41 клетках.

Фосфорилирование р53 по Ser-15 подавлено в JNK1 и JNK2 нокаут клетках. Более того, поликарпины не способны индуцировать апоптоз в р53-дефицитных (р53-/-) мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) в противоположность с сильной индукцией апоптоза в МЭФ с экспрессированной формой р53 (р53+/+ МЭФ). Этот факт предполагает участие р53 в апотозе, индуцированном поликарпинами.

Фосфорилирование и активирование р53 было в свою очередь опосредовано активированными JNK киназами. Все это ясно указывает на проапоптотическую роль JNK-сигнального пути и показывает, что JNK киназы востребованы в фосфорилировании c-Jun, активировании р53 и последующем апоптозе, индуцированном поликарпинами.

Изучение биологической активности индольных алкалоидов шерининов A, E и D из морского гриба Penicillium janthinellum Biourge. Морские алкалоиды индольного типа шеринин А (ShA, 57), шеринин Е (ShE, 58) и шеринин D (ShD, 59) были выделены из заселяющего морские донные осадки гриба Penicillium janthinellum в лаборатории микробного биосинтеза ТИБОХ. Ранее было показано, что некоторые шеринины обладают инсектицидным действием, а также обладают свойством блокировать натриевые каналы. Мы исследовали ShА, ShЕ и ShD на цитотоксическую, канцерпревентивную и проапоптотическую активности и установили, что эти алкалоиды не токсичны в отношении мышиных JB6 Cl41 P+ и опухолевых HeLa клеток в дозах до 200 мкМ. Было установлено, что шеринин Е (58) в нецитотоксических концентрациях ингибирует неопластическую трансформацию JB6 Cl41 Р+ клеток, стимулированную EGF, и тем самым проявляет канцерпревентивные свойства. Так, 50% ингибирование числа колоний в обработанных ShЕ JB6 Cl41 Р+ клетках наблюдалось уже при концентрации 13 мкМ, а практически полное ингибирование роста колоний трансформированных клеток было достигнуто при концентрации ShE мкМ.

Для исследования проапоптотических свойств шерининов A, D, E были использованы клетки лейкемии человека HL-60 и метод проточной цитометрии.

Полученные данные показали, что эти алкалоиды дозозависимым образом индуцируют запрограммированную смерть клеток путем апоптоза. При концентрации 100 мкМ и инкубировании с клетками в течение 24 часов шеринин A вызывает апоптоз в 19%, шеринин Е – в 44%, а шеринин D - в 49% HL-60 клеток, по сравнению с 10% апоптоза в контрольных клетках. Таким образом, канцерпревентивную активность шерининов, по крайней мере частично, можно объяснить индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках.

Изучение проапоптотической активности 3-бромо- и 10-бромо- фаскаплизинов.

3-Бромо- и 10-бромо- фаскаплизины (60 и 61) были недавно выделены из морской губки Fascaplysinopsis reticulata и асцидии рода Didemnum и затем синтезированы в лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ и на кафедре органической химии ДВФУ. Ранее для этих алкалоидов была известна только цитотоксическая активность против нескольких линий опухолевых клеток человека и мыши. Нами с помощью проточной цитометрии изучена их проапоптотическая активность на HL-60 клетках.

Было показано, что алкалоиды 60 и 61 могут индуцировать запрограммированную смерть клеток. Найдено, что они индуцируют апоптоз в HL-60 клетках дозозависимым образом. Уже в концентрациях около 500 нМ 3-бромо- и 10-бромофаскаплизины вызывают апоптоз более 50% HL-60 клеток.

4. Глабрухинон А (деметилубихионон Q2) из асцидии Aplidium glabrum и его синтетические аналоги. Структура, противоопухолевая активность и механизм действия. Из этанольного экстракта дальневосточной асцидии Aplidium glabrum нами выделены два новых дипренилбензохинона, глабрухиноны А (62) и В (63). Структуры выделенных соединений установлены физико-химическими методами. 1Н ЯМР спектр глабрухинона А похож на спектр вераплихинона А, выделенного ранее из Aplidium sp., с тем лишь отличием, что содержит дополнительно типичный для метоксильной группы синглет при 4.02 м.д. Квартеты при 61.2 и 61.3 м.д. в 13С ЯМР спектре указывают на присутствие двух метоксильных групп в структуре 62. Присоединение терпеноидного фрагмента к С-5, а метоксильных групп к С-2 и С-3 бензохинонового остатка установлено после детального изучения ЯМР спектров, включая 1H-1H-COSY, NOESY и HMBC эксперименты. Сигналы двух трехзамещенных двойных связей, трех метильных групп, присоединенных к этим двойным связям, а также трех метиленовых групп в 13С ЯМР спектре ясно указывают на присутствие в структурах 62 и дипренильной боковой цепи.

Фактически, как было определено на основании химических сдвигов С-10 в 13С ЯМР спектрах 62 и 63, эти соединения отличаются друг от друга конфигурацией 2,3 двойной связи. В Е-изомере 62 сигнал метильной группы (С-10, 16.2 м.д.) наблюдается в более сильном поле по сравнению с аналогичным сигналом в Z-изомере 63 (22. м.д.), что согласуется с литературными данными. Сравнение 1Н ЯМР спектров 62 и показывает, что эти соединения содержат соответственно геранильный и нерильный типы боковой цепи. Можно отметить, что боковые цепи второго типа встречаются в природе редко, а большинство пренилированных бензохинонов, выделенных из морских объектов, имеют геранильную боковую цепь. Строение 62 и 63 было подтверждено их синтезом из 2,3,4-триметоксибензальдегида.

Очень интересным представляется факт, что глабрухинон А структурно более близко родственен к убихинонам, чем другие линейные полипренилхиноны, выделенные ранее из асцидий и губок. Поскольку глабрухинон А, в отличие от убихинонов, не содержит метильной группы в хиноидном остатке, он может быть назван деметилубихиноном Q2.

Цитотоксическая активность глабрухинона А и его синтетических аналогов.

Производные глабрухинона А (62), полипренилированные бензохиноны и гидрохиноны 64-75, были синтезированы так же, как и глабрухинон А.

Исследуемые вещества были разделены на три группы: структурная группа включает в себя вещества, имеющие в своей структуре изопреноидную часть, состоящую из двух изопреновых единиц (глабрухинон А (62) и его синтетические аналоги 64-67), структурная группа 2 – соединения с тремя изопреновыми единицами (вещества 68-72), структурная группа 3 – с 4-6 изопреновыми единицами (вещества 73Для оценки цитотоксической активности глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 использовали мышиные JB6 Cl41 P+ клетки и их стабильные трансфектанты JB6 Cl41 NF-B, JB6 Cl41 AP-1 и JB6 Cl41 р53 клетки, а также опухолевые клетки человека HT-460. Полученные значения IC50 для каждого из исследованных хинонов показаны в табл. 2. В результате исследования всех трех структурных групп хинонов было показано, что вещества 62, 64-75 дозозависимым образом воздействуют на жизнеспособность клеток в широком диапазоне концентраций от нескольких мкМ до нескольких сотен мкМ. Большинство веществ, входящих в структурную группу 2 обладают более сильной цитотоксической активностью, чем вещества из структурных групп 1 и 3 (табл. 2).

Таблица 2. IC50 и INCC50 глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64- по отношению к нормальным мышиным JB6 Cl41 и опухолевым клеткам человека НТHCT-116 и SK-MEL-28.

Группа Группа Группа н.и* - не исследовали Канцерпревентивная активность глабрухинона А и его синтетических аналогов. Канцерпревентивный эффект глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 исследовали методом мягкого агара. Полученные значения INСC50 для каждого из изученных хинонов отражены в табл. 2. Было показано, что все исследованные хиноны дозозависимым образом ингибируют трансформацию здоровых клеток в опухолевые или рост колоний опухолевых клеток в мягком агаре, причем вещества из группы 1 предотвращают EGF-индуцированную опухолевую трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток в нецитотоксических концентрациях (табл. 2).

Проапоптотическая активность глабрухинона А и его синтетических аналогов. Способность глабрухинона А и его аналогов индуцировать в клетках апоптоз исследовали методом проточной цитометрии.

Полученные результаты, показывают, что полипренилхиноны 62, 64- дозозависимым образом вызывают апоптоз в JB6 Cl41 P+ клетках. Кроме того, глабрухинон А индуцирует апоптоз в JY лимфобластах и опухолевых клетках человека SK-MEL-28, HT-460, HCT-116 (рис. 15), а также в лейкемических HL-60 клетках человека. Тем же методом было показано, что обработка HL-60 или THP-1 клеток глабрухиноном А в концентрации 30 мкМ приводит к значительному увеличению доли соответствующих суб-G1 клеток, что тоже является доказательством индукции апоптоза. Кроме того, индукция глабрухиноном А апоптоза в JB6 Cl41 P+ клетках была подтверждена методом «ДНК лестницы». Эти результаты демонстрируют, что глабрухинон А более эффективно действует против клеток меланомы SK-MEL-28 и рака кишечника HCT-116, чем против клеток рака легких HT-460.

Рисунок 15. Индукция глабрухиноном А апоптоза в JB6 Cl41 P+ и JY клетках, а также в опухолевых клетках человека SK-MEL-28, HT-460 и HCT-116.

Влияние глабрухинона А и его синтетических аналогов на р53-, АР-1- и NF-Bзависимую транскрипционную активность. Известно, что некоторые ядерные транскрипционные факторы, включая белок-супрессор опухолей р53, АР-1 или NF-B участвуют в индукции или ингибировании апоптоза под действием различных стимулов, в том числе при действии на клетку хемопревентивных или лекарственных препаратов. Мы изучили действие полипренилхинонов 62, 64-75 на эти три транскрипционных фактора.

Таблица 3. Наибольшее активирование или ингибирование АР-1-, NF-B- или р53зависимой транскрипционной активности в JB6 Cl41 клетках глабрухиноном А (62) и Результаты, представленные в табл. 3, отражают наибольшие значения активирования или ингибирования транскрипционной активности ядерных факторов хинонами 62, 64-75. Эти результаты свидетельствуют о том, что полипренилхиноны 62, 64-75 вызывают значительное (до 8-ми раз) увеличение базовой АР-1- или NF-Bзависимой и ингибирование (до 4-х раз) р53- зависимой транскрипционной активности.

Таким образом, наше исследование предполагает, что апоптоз, индуцируемый полипренилхинонами 62, 64-75, происходит независимо от активирования белкасупрессора опухолей р53, но может быть связанным с активированием ядерных транскрипционных факторов АР-1 и NF-B.

Зависимость биологической активности глабрухинона А и его синтетических аналогов от их химической структуры. Полученные результаты показывают, что биологическая активность полипренилхинонов 62, 64-75 зависит от длины терпеноидных боковых цепей. Статистический анализ данных из табл. 2 показывает, что при увеличении длины полипренильной части молекул полипренилхинонов от 2 до 3 изопреновых единиц, цитотоксическая активность соединений увеличивается, но при дальнейшем увеличении до 4-6 единиц - резко уменьшается.

При статистическом анализе результатов ингибирования полипренилхинонами 62, 64-75 опухолевой трансформации JB6 Cl41 P+ клеток (см. табл. 2) было найдено, что хиноны из группы 1 обладают наиболее сильной канцерпревентивной активностью по сравнению с хинонами из групп 2 или 3, а хиноны из группы 3 наименее активны среди всех трех групп хинонов. Затем, мы сравнили данные по цитотоксической активности (IC50, JB6 Cl41 P+ клетки) изученных полипренилхинонов 62, 64-75 (табл. 2) с данными по их канцерпревентивной активности (INCC50, JB6 Cl41 P+ клетки). Было найдено, что хиноны из группы 1 ингибируют трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток в нецитотоксических концентрациях и потенциально могут быть использованы в качестве канцерпревентивных препаратов, в отличие от хинонов из группы 2.

полипренилхинонов зависит от положения метоксильной группы по отношению к терпеноидной боковой цепи в молекуле. Мы выбрали несколько пар структурно похожих хинонов, которые имеют метоксильные группы в одинаковых положениях.

Такими парами были: орто-аналоги, хиноны 64 и 71; мета-аналоги, хиноны 65 и 69 и пара-аналоги, хиноны 66 и 70. Основываясь на данных из табл. 2 и 3, можно сделать вывод, что канцерпревентивная и АР-1-зависимая транскрипционная активности хинонов возрастают в ряду орто-мета-пара-аналогов. В свою очередь среди парааналогов 66 и 70 наиболее активным является 66, имеющий в боковой цепи две изопреновые единицы.

Ингибирование глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха in vivo.

Ингибирование глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха изучали in vivo методом магнитно-резонансной томографии с использованием белых нелинейных мышей с привитой карциномой Эрлиха. Глабрухинон А растворяли в смесях растворителей DMSO-H2O, 1:1 или EtOH-H2O, 1:1. Обработку мышей веществом начинали за день до (канцерпревентивный эффект) или через сутки после тансплантации опухоли (терапевтический противоопухолевый эффект).

Результаты изучения показаны на рис. 16 как процент ингибирования роста опухоли в зависимости от времени воздействия глабрухинона А. Показано, что рост солидной карциномы Эрлиха в мышах ингибируется на 50% после превентивной инъекции глабрухинона А в концентрации 30 мг/кг (LD50 = 35 мг/кг), растворенным в 50% DMSO или 50% EtOH (рис. 16 A или 16 Б соответственно). Когда глабрухинон А используют в той же концентрации в качестве терапевтического препарата, через сутки после инокуляции опухоли, ингибирование роста опухоли составляет 20-25% (рис. 16 В).

Рисунок 16. Ингибирование глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха in vivo.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«ПОТАПОВА ЛЮДМИЛА ИЛЬИНИЧНА ЦИКЛИЧЕСКАЯ КООПЕРАТИВНАЯ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНАЯ ВОДОРОДНАЯ СВЯЗЬ В КАЛИКС[n]АРЕНАХ (n=4,6,8) ПО ДАННЫМ ИК ФУРЬЕ-СПЕКТРОСКОПИИ И КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИХ РАСЧЁТОВ. 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ – 2008 2 Работа выполнена в ГОУ ВПО “Казанский государственный архитектурностроительный университет”. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Коваленко Валерий...»

«АХМАД ДЕСОКИ МОХАМАД МОХАМАД ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРНЫХ ФАКТОРОВ НА КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА И КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ДИПИРРОЛИЛМЕТЕНОВ С СОЛЯМИ d- И f-ЭЛЕМЕНТОВ В РАСТВОРАХ 02.00.01 – неорганическая химия 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2010 1   Работа выполнена на кафедре неорганической химии ГОУ ВПО Ивановский государственный химико-технологический университет Научный руководитель : кандидат...»

«Тараканов Павел Александрович СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОРФИРАЗИНОВ С 5,7-ЗАМЕЩЁННЫМИ ДИАЗЕПИНОВЫМИ ФРАГМЕНТАМИ 02.00.03 – органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ивановский государственный химико-технологический университет Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Стужин Павел...»

«СТАРОДУБОВА Светлана Евгеньевна ТРИПЛЕТНЫЕ СОСТОЯНИЯ МЕТАЛЛОЦЕНОВ Zr(IV) И Hf(IV). КООРДИНАЦИОННОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕТАЛЛОЦЕНОВ С ОЛЕФИНАМИ 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН и Педагогическом институте Южного федерального университета (г. Ростова-наДону) Научный руководитель : кандидат химических наук Лукова Галина Викторовна...»

«Носкова Галина Николаевна Твердые углеродсодержащие композитные электроды для определения элементов вольтамперометрическими методами Специальность 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Томск – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский Томский политехнический университет на кафедре физической и...»

«Гессе Женни Фердинандовна КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ СЕРЕБРА(I) С ГЛИЦИНАТ-ИОНОМ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ 02.00.01 – Неорганическая химия 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново – 2010 Работа выполнена на кафедре общей химической технологии Ивановского государственного химико-технологического университета Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Шарнин Валентин Аркадьевич Научный...»

«Соколова Татьяна Владимировна Спектрально-люминесцентные и фотохимические свойства некоторых метилфенолов и дигидрохинолинов в разных средах 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск 2006 Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии химического факультета и в лаборатории фотофизики и фотохимии молекул физического факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«Насыбуллин Руслан Федорович кандидатская диссертация по теме “Электрохимически инициируемые каскадные и мультикомпонентные реакции альдегидов и С-Н кислот” 02.00.03 химические наук и Д 002.222.01 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им Н. Д. Зелинского Российской академии наук 119991, Москва, Ленинский проспект, 47. Тел.: (499) 137-13-79 E-mail: sci-secr@ioc.ac.ru Предполагаемая дата защиты диссертации: 10 июня 2014 года Дата размещения полного...»

«АКЧУРИН СЕРГЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ Влияние различных факторов на процесс извлечения бромид- и иодид-ионов из природных минеральных источников 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Муштакова Светлана Петровна Официальные оппоненты : Решетов Вячеслав...»

«Авдеева Надежда Михайловна Пробоподготовка QuEChERS и дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция при одновременном определении микотоксинов различных классов хроматографическими методами 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2013 2 Работа выполнена на кафедре химии ФГБОУ ВПО Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых доктор...»

«ДУНАЕВ АЛЕКСАНДР ВАЛЕРЬЕВИЧ КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕРАВНОВЕСНОЙ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЫ ХЛОРА И ХЛОРОВОДОРОДА С АЛЮМИНИЕМ И АРСЕНИДОМ ГАЛЛИЯ 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Ивановский государственный химикотехнологический университет. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Светцов Владимир Иванович Официальные оппоненты : доктор...»

«Корчагин Денис Владимирович ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ОРГАНИЧЕСКИХ МАГНЕТИКОВ НА ОСНОВЕ КРИСТАЛЛОВ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2009 Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии наук Научный руководитель : д.х.н., профессор, академик Алдошин Сергей Михайлович Официальные оппоненты : д.ф.-м.н., профессор Шибаева Римма Павловна...»

«ГАЛЯС АНДРЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ ФАЗОВЫЕ РАВНОВЕСИЯ И СТРУКТУРА РАСТВОРОВ ЭФИРОВ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В МАГНИТНОМ ПОЛЕ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения (химические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2012 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина Научный руководитель доктор химических наук, профессор Вшивков Сергей Анатольевич Официальные...»

«КОНОНОВ ВАСИЛИЙ ДМИТРИЕВИЧ ВЛИЯНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СОЛЬВАТАЦИИ ТЕТРАФЕНИЛПОРФИНА НА РЕАКЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ К ОБРАЗОВАНИЮ МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ В АМФИПРОТОННЫХ СРЕДАХ 02.00.04. – Физическая химия 02.00.01. – Неорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново-2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО Ивановский государственный химикотехнологический университет. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Бурмистров Владимир...»

«  ЧУРАХИНА Юлия Ивановна ДИМЕРНЫЕ ПОРФИРИНЫ С ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДНЫМИ И КАЛИКС[4]АРЕНОВЫМИ СВЯЗЫВАЮЩИМИ ФРАГМЕНТАМИ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 02.00.04 - физическая химия 02.00.03 – органическая химия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Иваново - 2010 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии растворов Российской академии наук Научный руководитель : доктор химических наук, профессор...»

«. Нестеренко Алексей Михайлович ВЛИЯНИЕ КАТИОНОВ НА СТРУКТУРНЫЕ И ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ. МОЛЕКУЛЯРНО-ДИНАМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ. Специальность: 02.00.05 — Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2014 -2Диссертация выполнена в лаборатории биоэлектрохимии ФГБУН Института Физической Химии и Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН и на кафедре биофизики Биологического факультета ФГБОУ ВПО МГУ им....»

«Аль Ансари Яна Фуад КОМПЛЕКСЫ МЕТАЛЛОВ С МЕЗО-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫМИ ПОРФИРИНАМИ 02.00.01- неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2010 г. 2 Работа выполнена в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) доктор химических наук, академик Научный руководитель : Цивадзе Аслан Юсупович Официальные оппоненты : доктор химических наук Киселёв Юрий...»

«ГАЛЕЕВА ЭЛЬВИРА ИЛЬКАМОВНА ПОЛИУРЕТАНЫ НА ОСНОВЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ ПРОСТЫХ ОЛИГОЭФИРОВ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань 2009 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский государственный технологический университет (ГОУ ВПО КГТУ) Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Бакирова Индира Наилевна Официальные...»

«Мокрушин Иван Геннадьевич ТЕРМОЛИТИЧЕСКИЕ И НУКЛЕОФИЛЬНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ 3-АЦИЛПИРРОЛО[1,2-а]ХИНОКСАЛИН-1,2,4(5H)-ТРИОНОВ Специальность 02.00.03 – Органическая химия Автореферат на соискание ученой степени кандидата химических наук Пермь-2011 Работа выполнена на кафедре органической химии Пермского государственного национального исследовательского университета Научный руководитель : Масливец Андрей Николаевич, доктор химических наук, профессор Официальные оппоненты : Гейн...»

«Веклич Максим Александрович БЕСКИСЛОРОДНАЯ КОНВЕРСИЯ АЛКАНОВ С 1 С4 В УСЛОВИЯХ БАРЬЕРНОГО РАЗРЯДА 02.00.13 – Нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2014 Работа выполнена в лаборатории геохимии и пластовых нефтей Открытого акционерного общества Томский научно-исследовательский и проектный институт нефти и газа (ОАО ТомскНИПИнефть) Научный руководитель : доктор геолого-минералогических наук, кандидат химических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.