WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

на правах рукописи

Аскарова Елена Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К СУРВИВИНУ

ДЛЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ БЕЛКА И

ОНКОДИАГНОСТИКИ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2013

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В.

Ломоносова и лаборатории синтетических вакцин Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

Каплун Александр Петрович, доктор химических наук, профессор кафедры органической химии им. И.М. Назарова Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Волкова Татьяна Даниловна, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории синтетических вакцин ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Официальные оппоненты:

Уткин Юрий Николаевич, доктор химических наук, заведующий лабораторией молекулярной токсинологии ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Желтухина Галина Александровна, кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник кафедры химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится «09» декабря 2013 г. в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу:





119571, г. Москва, пр-т Вернадского, д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В.

Ломоносова.

Автореферат разослан « 06 » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность проблемы. Сурвивин – это один из представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP), экспрессирующийся только в опухолевых, но не в здоровых тканях. В отличие от других белков семейства функции сурвивина не ограничиваются лишь ингибированием программированной клеточной смерти, он также является важным регулятором клеточного деления.

Благодаря своей бифункциональности сурвивин играет важную роль в онкогенезе: с одной стороны он позволяет клеткам с дефектами веретена деления продолжать деление, с другой – делает их устойчивыми к действию хемотерапевтических агентов, гамма-излучения и иммунотерапии [Li et al, 2006].

Было показано, что функции сурвивина могут зависеть от его локализации в клетке и структурного состояния [Pavlyukov et al, 2011]. Поэтому структурнофункциональные исследования этого белка являются актуальной задачей, решение которой приведет к лучшему пониманию процессов перерождения здоровой клетки в раковую, а также позволит разработать новые подходы к терапии и уточняющей диагностике онкозаболеваний.

Изучение структурно-функциональных особенностей сурвивина осложнено тем, что практически отсутствуют антитела, селективно связывающие различные структурные формы сурвивина. Мы предположили, что подобные антитела могут быть получены путем иммунизации животных синтетическими пептидными фрагментами сурвивина, моделирующими различные функционально важные участки белка.

Цель работы. Получение с помощью синтетических пептидов, моделирующих различные функционально важные участки сурвивина, антител, пригодных для изучения структурно-функциональных особенностей белка и уточняющей диагностики онкозаболеваний.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выбор пептидных фрагментов сурвивина для получения антител.

2. Иммунизация животных пептидными фрагментами сурвивина и получение противопептидных сывороток.

3. Выделение из сывороток с помощью аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными пептидами моноспецифических антител, направленных к строго определенным участкам сурвивина.

4. Изучение свойств полученных антител и оценка их пригодности для структурно-функциональных исследований сурвивина.

5. Исследование возможности использования полученных антител для уточняющей диагностики онкозаболеваний.

Научная новизна работы. В настоящей работе получена панель из 9 ранее не описанных моноспецифических антител к сурвивину, пригодных для структурно-функциональных исследований белка. Впервые показано, что антитела к различным участкам сурвивина имеют разное сродство к мономеру В организации работы принимал участие академик РАН, д.х.н., проф. Швец В.И.





белка и сурвивинсодержащему комплексу. Было впервые установлено, что лишь антитела к N-концевому участку сурвивина выявляют пул белка, вовлеченный в ход клеточного деления и солокализованый с комплексом белков-хромосомных пассажиров. С помощью полученных антител впервые показано, что мономер сурвивина и сурвивинсодержащий комплекс могут играть разные роли в онкогенезе и лишь мономер сурвивина принимает участие в злокачественном перерождении клетки. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата опухолевых клеток с помощью сорбентов с иммобилизованными моноспецифическими антителами к сурвивину.

Практическая значимость работы. В настоящей работе было показано, что мономер сурвивина экспрессируется только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс – как в опухолевых, так и смежных с опухолью тканях, что может быть использовано для диагностики рака. Было установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует со снижением степени дифференцировки опухоли и возрастанием стадии заболевания. Таким образом, моноспецифические антитела к сурвивину могут быть использованы для диагностики биологической агрессивности и метастатической активности опухоли.

Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV и XXV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013), 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008), XVI и XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2008, 2010), 30ом и 31ом европейском пептидном симпозиуме (Финляндия, 2008; Дания, 2010), Х чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2011), 1ом мультидисциплинарном симпозиуме «Молекулярная онкология: от лабораторного стола к медицине» (Украина, 2012), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013) и 15ом международном конгрессе по иммунологии (Италия, 2013).

Материалы диссертационной работы изложены в 3 статьях в рецензируемых научных журналах и в 19 сообщениях в тезисной форме и в виде материалов российских и международных конференций. Получен 1 патент РФ.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №10-04-01588-а и №12-04Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах с использованием 27 рисунков, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. С помощью синтетических фрагментов сурвивина получена панель из моноспецифических антител, пригодных для структурно-функциональных исследований.

2. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата опухолевых клеток с помощью моноспецифических антител, иммобилизованных на сефарозе.

3. Мономер сурвивина экспрессируется только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс – как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях. Содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует с агрессивностью и метастатической активностью опухоли.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор фрагментов сурвивина для получения антител Для получения антител, пригодных для структурно-функциональных исследований сурвивина и онкодиагностики, кроликов иммунизировали синтетическими пептидными фрагментами белка. Выбор фрагментов сурвивина был основан на результатах анализа данных литературы о структурных особенностях этого белка и его функционально важных участках, а также теоретического анализа аминокислотной последовательности белка. Часть пептидных фрагментов содержала расчетные Т-хелперные эпитопы, необходимые для стимуляции иммунного ответа у животных в свободном виде, без конъюгации с высокомолекулярным белковым носителем.

Рис.1. Схема функционально важных участков сурвивина и синтезированные фрагменты сурвивина.

D – участок димеризации; BIR – высоконсервативный домен, характерный для всех представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза; NES – сигнал ядерного экспорта (выделен рамкой) Выбранные фрагменты сурвивина были синтезированы в лаборатории синтетических вакцин ИБХ РАН. Всего для иммунизации животных использовали 11 синтетических фрагментов сурвивина (табл.1).

Таблица 1. Синтетические фрагменты сурвивина человека*.

Обозначение Участок белка Аминокислотная последовательность * Нумерация аминокислот дана по последовательности полноразмерного сурвивина человека (Swiss Prot ID O15392). Расчетные Т-хелперные эпитопы подчеркнуты (содержат девятичленный фрагмент, в первом положении которого находится гидрофобный а.о., а в девятом – R или K [Вольпина и соавт., 2002]), жирным курсивом выделена аминокислотная замена E/K129.

Пептид (I) представляет собой гидрофильный N-концевой фрагмент белка, содержит один из предполагаемых участков димеризации и расчетный Тхелперный эпитоп. Пептид (II) является укороченным фрагментом пептида (I) и моделирует только участок димеризации. Пептид (III) представляет собой гидрофильный фрагмент BIR-домена, отвечающего за антиапоптозную функцию сурвивина, и содержит расчетный Т-хелперный эпитоп. Пептиды (IV) и (V) являются перекрывающимися фрагментами предполагаемого сигнала ядерного экспорта сурвивина, благодаря которому происходит экспорт белка из ядра в цитоплазму клетки, и содержат второй участок димеризации белка. Пептид (VI) соответствует гидрофильному N-концевому участку -спирального домена, ответственного за регуляцию митоза, и включает в себя предполагаемый участок димеризации и два расчетных Т-хелперных эпитопа. Пептид (VII) содержит Сконцевой фрагмент (130-142) -спирального домена полноразмерного сурвивина, а также участок AYACNTSTL, соответствующий фрагменту (80-88) последовательности изоформы сурвивина-2B (Swiss Prot ID O15392-2). В результате соединения этих двух фрагментов (80-88)-(130-142) в пептиде (VII) формируется искусственный Т-хелперный эпитоп последовательности YACNTSTLK.

Известно, что в 129 положении аминокислотной последовательности нативного сурвивина может находиться либо остаток лизина, либо остаток глутаминовой кислоты. Остаток лизина в клетке подвергается ацетилированию, что способствует стабилизации димера сурвивина. С другой стороны, сурвивин, содержащий в 129 положении остаток глутаминовой кислоты, находится преимущественно в мономерной форме [Wang et al., 2010]. Для получения антител, способных распознавать аминокислотную замену в 129 положении белка, были использованы пептиды (VIII) и (IX), моделирующие участок аминокислотной замены. Пептиды (X) и (XI) – это укороченные фрагменты пептидов (VIII) и (IX) соответственно.

2. Получение панели моноспецифических антител к сурвивину с помощью синтетических фрагментов белка Синтетическими пептидными фрагментами сурвивина иммунизировали животных, при этом пептиды, содержащие расчетные Т-хелперные эпитопы (пептиды (I), (III), (VI) и (VII)), использовали в свободном виде. Остальными пептидами иммунизацию проводили в виде конъюгатов с гемоцианином улитки (KLH). Методом иммуноферментного анализа (ИФА) было изучено связывание сывороток с пептидами, на которые они были получены, и с рекомбинантным сурвивином. Показано, что все сыворотки, за исключением сывороток к пептидам (X) и (XI), содержат большое количество противопептидных антител и связываются с рекомбинантным белком (данные не приведены).

Для выделения моноспецифических антител были получены аффинные сорбенты с иммобилизованными синтетическими пептидами и подобраны индивидуальные условия хроматографии сывороток. При хроматографии сыворотки к пептиду (1-22) антитела были не способны связываться с лигандом.

Вероятно, при иммобилизации пептида (I) на сефарозе задействован остаток Lys15, входящий в центр связывания с антителами. В связи с этим мы провели иммунизацию животных конъюгатом пептида (1-22) с белковым носителем, что, как правило, приводит к выработке более широкого спектра антител. Из полученной сыворотки удалось выделить антитела с высокой концентрацией и титром (табл.2) При выделении антител к пептиду (54-74) был получен сорбент с низким содержанием лиганда, предположительно из-за высокой гидрофобности данного пептида. Поэтому хроматографию сыворотки к пептиду (54-74) проводили на сорбенте с укороченным фрагментом (62-74), который благодаря более низкой гидрофобности эффективнее иммобилизовался на сефарозе. Для выделения антител, распознающих аминокислотную замену в 129 положении белка, были использованы сорбенты с укороченными пептидными фрагментами (126-E129и (126-K129-132). В результате нами была получена следующая панель моноспецифических антител к сурвивину:

Таблица 2. Моноспецифические антитела к сурвивину.

3. Исследование свойств полученных моноспецифических антител к сурвивину Определение способности антител связываться с рекомбинантным Была изучена способность полученных антител связываться с рекомбинантным сурвивином в условиях ИФА и иммуноблота (табл.2, рис.2).

Наибольшую активность проявили АТ(I), АТ(II), и АТ(V)-(VII). Антитела АТ(IV) и АТ(IX) связывались с рекомбинантным сурвивином значительно слабее, а АТ(III) и АТ(VIII) лишь в высокой концентрации были способны взаимодействовать с белком.

Рис. 2. Связывание очищенных противопептидных антител к сурвивину с рекомбинантным белком в условиях иммуноблота. Визуализация с помощью диаминобензидина.

В условиях иммуноблота все противопептидные антитела связывались с белком с молекулярной массой 17 кДа, что соответствует мономеру сурвивина, при этом многие антитела выявляли также димер сурвивина с молекулярной массой 37 кДа (рис.2). Приготовление образца белка по методу Леммли и проведение электрофореза в присутствии SDS приводит, как правило, к полной денатурации белка и разрушению олигомерных комплексов. Тем не менее, сильные межбелковые взаимодействия между двумя молекулами сурвивина в составе димера могут приводить к его сохранению в данных условиях.

Следует заметить, что антитела, полученные на пептиды, содержащие аминокислотную замену E/K129, показали совершенно разные результаты по связыванию с рекомбинантным белком. Так, АТ(VIII) к пептиду (122-E129-134) практически не взаимодействовали с рекомбинантным белком, а АТ(IX) к пептиду (122-K129-134) связывались с белком значительно эффективнее. Так как в работе был использован рекомбинантный сурвивин, содержащий K129, мы предположили, что антитела АТ(VIII) и АТ(IX) могут распознавать аминокислотную замену в 129 положении сурвивина. В связи с этим кроссреактивность АТ(VIII) и АТ(IX) была изучена более подробно.

Изучение способности антител к пептидам (122-E129-134) и (122-K129-134) различать природную аминокислотную замену.

На первом этапе было изучено перекрестное связывание антител АТ(VIII) и АТ(IX) с пептидами, моделирующими участок аминокислотной замены в положении, (122-Е129-134) и (122-K129-134), а также с их укороченными фрагментами (126-Е129-132) и (126-K129-132) в условиях ИФА (табл.3).

Результаты проведенного исследования показали, что связывание антител АТ(VIII) и АТ(IX) с укороченными фрагментами (126-E129-132) и (126-K129-132) происходит селективно, т.е. антитела АТ(VIII) к пептиду (122-Е129-134) не связываются с пептидом (126-K129-132) и, наоборот, АТ(IX) к пептиду (122-K129не связываются с пептидом (126-E129-132).

Таблица 3. Кросс-реактивность антител АТ(VIII) и АТ(IX).

С другой стороны, при перекрестном связывании с пептидами (122-Е129и (122-K129-134) способность узнавать аминокислотный остаток не проявилась. Возможно, это связано с тем, что АТ(VIII) и АТ(IX) были получены в результате иммунизации удлиненными фрагментами (122-Е129-134) и (122-K129и при выделении антител на укороченных фрагментах (126-E129-132) и (126-K129-132) были получены антитела, часть из которых захватывает эпитопы удлиненных фрагментов.

На следующем этапе была изучена способность АТ(VIII) и АТ(IX) распознавать аминокислотную замену E/K129 в рекомбинантном сурвивине.

В условиях ИФА при концентрации рекомбинантного сурвивина 3. мкг/мл АТ(VIII) не способны связываться с ним, тогда как АТ(IX) связываются достаточно активно (табл.4). Увеличение концентрации белка до 15 мкг/мл приводит к тому, что антитела теряют свою способность распознавать E/K129 и связываются с рекомбинантным сурвивином практически с одинаковым титром.

Полученные данные говорят о том, что способность АТ(VIII) и АТ(IX) распознавать остаток в 129 положении рекомбинантного сурвивина зависит от концентрации белка.

Таблица 4. Связывание антител АТ(VIII) и АТ(IX) с рекомбинантным сурвивином в условиях ИФА в зависимости от концентрации белка.

АТ Иммуноген Концентрация рекомбинантного сурвивина на планшете Похожие данные были получены и при исследовании способности антител АТ(VIII) и АТ(IX) распознавать E/K129 в последовательности рекомбинантного сурвивина в условиях иммуноблота (рис.3).

Рис. 3. Способность АТ(VIII) и АТ(IX) распознавать остаток лизина в положении рекомбинантного сурвивина в условиях иммуноблота. Визуализация с помощью диаминобензидина.

При нанесении на трек 0.5 мкг белка и разведении антител 1:100 оба антитела выявляют рекомбинантный сурвивин, однако аффинность АТ(IX) значительно выше, чем АТ(VIII). Увеличение разведения антител до 1:200, при той же концентрации белка, приводит к тому, что АТ(VIII) перестают связываться с белком, тогда как связывание АТ(IX) остается практически таким же, как и при разведении 1:100. При нанесении на трек 5 мкг сурвивина, способность антител АТ(VIII) и АТ(IX) распознавать E129/K129 значительно снижается, однако остается очевидным, что АТ(IX) связываются с рекомбинантным сурвивином значительно активнее, чем АТ(VIII). Полученные данные показывают, что способность антител АТ(VIII) и АТ(IX) распознавать остаток в 129 положении зависит не только от концентрации белка, но и от концентрации самих антител.

Таким образом, было показано, что при низких концентрациях антител или низких концентрациях сурвивина антитела к пептидам (122-K129-134) и (122E129-134) распознают природную аминокислотную замену в 129 положении белка.

При иммунизации животных синтетическими пептидами, содержащими более 20 а.о., антитела могут вырабатываться не ко всей последовательности пептида, а к его участку. Поэтому были установлены участки связывания антител к пептидам (I), (VI) и (VII). Для этого в лаборатории синтетических вакцин ИБХ РАН были синтезированы перекрывающиеся фрагменты данных пептидов. С помощью ИФА была изучена способность очищенных антител связываться как с пептидами, на которые они были получены, так и их перекрывающимися фрагментами.

перекрывающимися пептидными фрагментами.

Антитела Антиген Аминокислотная последовательность

MGAPTLPPAWQPELKDHRISTF

APTLPPAWQPE

QPELKDHRISTF

ELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKK

ELTLGEFLKLD

АТ(VI)

KLDRERAKNKIAKETNNKK

IAKETNNKK

АТ(VII)

KVRRAIEQL

IEQLAAMD

Как видно из приведенных в табл.5 результатов, антитела АТ(I) направлены на С-концевой участок пептида (11-22). АТ(VI) связывались с фрагментами (95-105) и (103-121) и не взаимодействовали с фрагментом (113На основании полученных данных мы полагаем, что АТ(VI) обладают достаточно широкой специфичностью и связываются с участком (95-112).

АТ(VII) направлены преимущественно на участок (132-142), так как они не взаимодействовали с фрагментом (80-88)-(130-131), но связывались с фрагментами (130-138) и (135-142).

С учетом того, что АТ(III), АТ(VIII) и АТ(IX) были выделены из кроличьих сывороток с помощью сорбентов с иммобилизованными на них укороченными фрагментами пептидов, можно представить следующую схему участков связывания полученных моноспецифических антител:

Рис. 4. Участки связывания моноспецифических антител с сурвивином.

Изучение способности противопептидных антител выявлять эндогенный На следующем этапе работы была изучена способность полученных антител выявлять эндогенный сурвивин в лизатах клеток HeLa (карцинома шейки матки) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) в условиях иммуноблота. Известно, что в опухолевых клетках сурвивин локализуется как в ядре, так и цитоплазме [Mahotka et al., 2002], поэтому для исследования были получены суммарные клеточные лизаты.

Рис. 5. Иммуноблот лизатов клеток линий HeLa (1) и MCF-7 (2) с помощью моноспецифических антител к сурвивину. Визуализация с помощью системы ECL.

Показано, что все антитела связываются с эндогенным сурвивином. АТ(I) выявили в лизатах клеток HeLa белковую полосу в районе 38 кДа, а в лизатах клеток MCF-7 было обнаружено специфическое окрашивание полосы белка с молекулярной массой 40 кДа. Следует заметить, что в случае использования высоких концентраций данных антител наблюдали также слабое окрашивание белковых полос в районе 17 и 19 кДа в лизатах HeLa и MCF-7 соответственно (данные не приведены). АТ(II) связались с полосами белка массой 17 и 19 кДа в образцах HeLa и MCF-7. При использовании АТ(III) было выявлено слабое окрашивание полосы белка с массой 17 кДа только в лизате клеток HeLa.

Полученные результаты согласуются с данными о характере связывания АТ(III) с рекомбинантным белком в условиях ИФА и иммуноблота и еще раз подтверждают низкую аффинность данных антител к сурвивину. При использовании АТ(IV) наблюдали слабое окрашивание полосы белка массой кДа в лизатах клеток HeLa, в лизатах клеток MCF-7 специфической реакции выявлено не было. АТ(V) в свою очередь интенсивно окрашивали белковые полосы с подвижностью 17 и 19 кДа в лизатах HeLa и MCF-7. С помощью АТ(VI) и АТ(VII) были выявлены белковые полосы в районах 17 и 38 кДа в лизатах клеток HeLa и в районах 19 и 40 кДа в лизатах клеток MCF-7, причем при использовании АТ(VI) наблюдали диффузное окрашивание нескольких полос в диапазоне 15-19 кДа. Оба антитела продемонстрировали большее сродство к белкам массой 17 и 19 кДа. При использовании АТ(VIII) было выявлено окрашивание белковых полос с массами 17 и 19 кДа в лизатах клеток HeLa и MCF-7, тогда как АТ(IX), распознающие остаток K129, оказались не способны связаться с сурвивином. Возможно, это связано с тем, что в клетках данных линий экспрессируется сурвивин, содержащий в 129 положении остаток глутаминовой кислоты.

Таким образом, полученные нами моноспецифические антитела выявили полосы белков с молекулярными массами 17 и 38 кДа в лизатах клеток HeLa и белковые полосы с подвижностью 19 и 40 кДа в лизатах клеток MCF-7. Масса белка 17 кДа соответствует массе мономера основной изоформы – полноразмерного сурвивина. Выявляемый в лизате клеток MCF-7 белок с массой 19 кДа, возможно, соответствует другой изоформе белка – сурвивину-2В, либо, что кажется более вероятным, сурвивину, подвергшемуся посттрансляционным модификациям, характерным для данной клеточной линии.

Белковые полосы с массами 38 и 40 кДа, как мы полагаем, соответствуют сурвивинсодержащим белковым комплексам. Косвенным подтверждением того, что в них присутствует сурвивин, служит тот факт, что их выявляют антитела, направленные к различным участкам сурвивина: АТ(I), АТ(IV), АТ(VI) и АТ(VII). Мы полагаем, что сурвивинсодержащий белковый комплекс с массой 38 кДа в клетках HeLa может являться димером сурвивина. Данное предположение было сделано на основании того, что при связывании антител с рекомбинантным сурвивином, образующим в растворе устойчивые димеры, антитела выявляют полосу димера в этом районе. Кроме того, в ряде работ было показано сохранение димерной формы эндогенного сурвивина в условиях иммуноблота [Singh et al., 2007; Conway et al. 2003]. Белковый комплекс с массой 40 кДа в клетках MCF-7 в свою очередь может соответствовать либо гетеродимеру сурвивина с какой-либо из его изоформ, либо димеру сурвивина, подвергшегося посттрансляционным модификациям, характерным для данной клеточной линии.

Для того, чтобы доказать, что белковая полоса массой 38 кДа соответствует белковому комплексу, мы подобрали условия для его разрушения.

Известно, что димер рекомбинантного сурвивина разрушается при обработке мочевиной [Engelsma et al., 2007]. Поэтому мы изучили влияние обработки образцов лизата клеток HeLa 6М мочевиной на интенсивность окрашивания белковой полосы, соответствующей 38 кДа. В качестве контроля использовали образец лизата без добавления мочевины.

Из рис. 6 видно, что при обработке лизата клеток HeLa 6М мочевиной интенсивность окрашивания белковой полосы с массой 38 кДа значительно снижалась, что подтверждает наше предположение о том, что данная полоса соответствует белковому комплексу.

Следует заметить, что интенсивность окрашивания полосы мономера сурвивина оставалась практически неизменной. Мы полагаем, что в лизатах клеток равновесие мономер-сурвивинсодержащий комплекс смещено в сторону мономера, поэтому разрушение комплекса не приводило к видимому повышению концентрации мономера.

Необходимо подчеркнуть, что все полученные антитела проявили разное сродство к мономеру и сурвивинсодержащему комплексу (рис.5). Наибольшую специфическую активность показали антитела к пептидам (I), (V) и (VII), при этом АТ(I) связываются преимущественно с сурвивинсодержащим комплексом, АТ(V) связываются только с мономером белка, а АТ(VII) выявляют и мономер и сурвивинсодержащий комплекс.

Показано, что АТ(II), полученные к фрагменту (3-13), в отличие от АТ(I), полученных к участку (1-22), выявляют только мономер сурвивина. Из данных литературы известно, что в образовании димера сурвивина задействован участок белка (6-9) [Chantalat et al., 2000]. По-видимому, участок (3-13) находится в контактной области двух молекул сурвивина в составе димера и оказывается недоступным для связывания антител, поэтому антитела к фрагменту (3-13) выявляют лишь мономерную форму сурвивина. В свою очередь низкое сродство к мономеру АТ(I) может быть связано с посттрансляционными модификациями сурвивина на данном участке, например, фосфорилированием остатка Ser [Colnaghi et al., 2010]. Возможно, в результате подобных модификаций антитела, полученные к фрагменту (1-22), не могут выявлять фосфорилированный мономер белка. Не исключено, что сурвивин в составе комплекса не фосфорилирован, и поэтому АТ(I) способны с ним связываться.

АТ(V), полученные к фрагменту (95-105), проявили высокую аффинность к мономеру белка. Даже в высоких концентрациях данные антитела не продемонстрировали перекрестного связывания с сурвивинсодержащим белковым комплексом. Мы полагаем, что специфичность АТ(V) именно к мономеру сурвивина связана с вовлечением участка белка (95-105) в образование димера. В результате димеризации данный участок оказывается внутри гидрофобного кора белка и не доступен для связывания антител [Chantalat et al., 2000]. В отличие от АТ(V), антитела АТ(VI) были получены с помощью более длинного фрагмента белка (95-121) и направлены, как было ранее показано при установлении участков связывания антител, на участок (95чем, по-видимому, объясняется связывание данных антител как с мономерной формой сурвивина, так и с сурвивинсодержащим комплексом.

АТ(VIII), распознающие E129, выявили мономер сурвивина, что полностью согласуется с данными литературы о том, что сурвивин, содержащий в положении остаток глутаминовой кислоты, находится преимущественно в мономерной форме.

Таким образом, в результате данного исследования было установлено, что полученные нами антитела выявляют эндогенный сурвивин в лизатах опухолевых клеток линий HeLa и MCF-7, при этом имеют различное сродство к мономеру и сурвивинсодержащему комплексу. Для дальнейшего исследования мы отобрали наиболее активные и специфичные антитела – АТ(I), связывающиеся с сурвивинсодержащим комплексом, АТ(V), выявляющие мономер сурвивина, а также АТ(VII), связывающиеся как с мономером, так и с сурвивинсодержащим комплексом.

Иммуноцитохимическое исследование клеток HeLa, находящихся на различных стадиях клеточного цикла, с помощью противопептидных Была изучена способность антител АТ(I), АТ(V) и АТ(VII) связываться с сурвивином в клетках HeLa, находящихся в интерфазе и митозе.

Иммуноцитохимическое окрашивание клеток было проведено совместно с сотрудниками лаборатории структурной биохимии ИБХ РАН.

В интерфазных клетках АТ(I) диффузно и ярко окрашивали нуклеоплазму ядер и очень бледно цитоплазму (рис.7а). В ходе митоза на стадиях профазы и метафазы (рис.7б) данные антитела отчетливо маркировали хромосомы. В клетках, находящихся на стадии анафазы, было выявлено яркое окрашивание в зоне образующейся перетяжки (рис.7в), а на стадии телофазы – яркое окрашивание в зонах перетяжки и остаточных телец Флеминга (рис.7г,д). Из данных литературы известно, что в ходе митоза сурвивин встраивается в комплекс белков-хромосомных пассажиров (CPC) [Jeyaprakash et al., 2007]. В ходе деления клетки CPC имеет ту же локализацию, что и сурвивин, выявляемый антителами АТ(I), поэтому мы полагаем, что АТ(I) связываются с пулом сурвивина, принимающим участие в митозе и локализованном совместно с комплексом хромосомных пассажиров.

Рис. 7. Локализация пула сурвивина, выявляемого антителами АТ(I) в клетках HeLa в интерфазе (а) и митозе (б-д). На рисунке приведены результаты окрашивания клеток с помощью АТ(I), DAPI и совмещение результатов окрашивания АТ(I) и DAPI.

а – интерфаза: ядра окрашены практически однородно и ярче, чем цитоплазма; стрелками указаны отдельные фокусы повышенной локальной концентрации белка в ядре; б – метафаза:

стрелкой указаны окрашенные хромосомы; в – анафаза: стрелкой указано окрашивание в зоне образующейся клеточной перетяжки; г,д – телофаза: стрелками указано окрашивание в зоне перетяжки и остаточных телец Флеминга.

Антитела АТ(V) и АТ(VII) в интерфазных клетках диффузно окрашивали ядро и цитоплазму клеток, при этом окрашивание цитоплазмы было интенсивнее, чем при использовании АТ(I) (рис.8, данные приведены только для АТ(V)). В митотических клетках при использовании обоих антител окрашивалась только цитоплазма клеток, тогда как в области хромосом, зонах перетяжки и остаточных телец Флеминга специфическое окрашивание отсутствовало.

Рис. 8. Локализация пула сурвивина, выявляемого антителами АТ(V) в интерфазных клетках HeLa. На рисунке приведены результаты окрашивания клеток с помощью АТ(V), DAPI и совмещение результатов окрашивания АТ(V) и DAPI.

Мы полагаем, что антитела АТ(V) и АТ(VII) не смогли выявить сурвивин, участвующий в регуляции митоза, так как они направлены на участки белка, задействованные в образовании комплекса хромосомных пассажиров и поэтому недоступные для связывания с антителами [Jeyaprakash et al., 2007].

В результате иммуноцитохимического исследования клеток HeLa было установлено, что лишь антитела АТ(I) к пептиду (1-22) выявляют пул сурвивина, принимающий участие в клеточном делении и локализованый совместно с комплексом белков-хромосомных пассажиров.

Разработка подхода к выделению сурвивина из лизата опухолевых клеток HeLa с помощью противопептидных антител При изучении взаимосвязи структуры и функций сурвивина большинство исследователей использует рекомбинантный сурвивин и белковые конструкции на его основе. Очевидно, что для получения наиболее полной информации необходимо проводить также исследования эндогенного сурвивина. Такие работы в настоящее время практически не ведутся, что связано с очень низким содержанием сурвивина в клетках. В связи с этим была поставлена задача разработать подход к выделению сурвивина из опухолевых клеток.

Для выделения сурвивина из лизата опухолевых клеток было предложено использовать противопептидные антитела, конъюгированные с сефарозой.

Получено три аффинных сорбента с иммобилизованными антителами АТ(I), АТ(V) и АТ(VII) соответственно.

На первом этапе была изучена способность полученных сорбентов связывать рекомбинантный сурвивин из раствора (рис.9). Для этого аффинные сорбенты инкубировали в растворе рекомбинантного белка, после чего путем центрифугирования отделяли сефарозу с образовавшимися иммунокомплексами от фракции несвязавшегося белка. Далее иммунокомплексы разрушали кипячением сорбента в буфере Леммли.

Рис. 9. Иммуннопреципитация рекомбинантного сурвивина из раствора с помощью аффинных сорбентов с иммобилизованными противопептидными антителами. Визуализация с помощью диаминобензидина.

а – исходный раствор рекомбинантного сурвивина; б – фракция несвязавшегося белка; в – выделенный белок.

Было показано, что все сорбенты эффективно связывают рекомбинантный сурвивин из раствора, при этом удается выделить белок в значительно большей концентрации, чем в исходном растворе. Наибольшую активность проявили антитела АТ(I) и АТ(VII), тогда как АТ(V) связывались с белком с меньшей аффинностью. В растворе после инкубации с аффинными сорбентами концентрация сурвивина была исчезающе мала. Полученные данные говорят о том, что аффинные сорбенты с иммобилизованными моноспецифическими антителами являются высокоэффективным инструментом для выделения белка из раствора.

На следующем этапе при отработке условий выделения эндогенного сурвивина с помощью АТ(VII) из лизата клеток HeLa были изучены различные способы разрушения иммунокомплексов и подобраны оптимальные условия для выделения белка (рис.10). Показано, что наиболее эффективный способ выделения сурвивина – это инкубация сорбента со связавшимся белком в элюирующем буфере при pH 2.5 в течение 10 мин (рис.10, дорожка 5). Следует отметить, что такая обработка приводит к эффективному выделению сурвивина без разрушения антител (как в случае кипячения в буфере Леммли, рис. дорожка 3), что означает, что этот сорбент может быть использован повторно.

На следующем этапе была изучена способность всех полученных аффинных сорбентов с иммобилизованными антителами связывать эндогенный сурвивин из лизата клеток HeLa (рис.11).

Рис. 11. Иммунопреципитация сурвивина из лизата клеток HeLa с помощью сорбентов с иммобилизованными противопептидными антителами.

Визуализация с помощью системы ECL.

а – лизат клеток HeLa; б – фракция несвязавшихся белков; в – выделенный белок.

АТ(I), иммобилизованные на сефарозе, оказались не способны связаться с сурвивинсодержащим комплексом в нативной форме, и полученный образец не содержал сурвивина, тогда как во фракции несвязавшихся белков концентрация сурвивинсодержащего комплекса была такой же, что и в лизате. В случае использования сорбента с АТ(V) образец выделенного белка содержал мономер сурвивина, при этом во фракции несвязавшихся белков сурвивин не был обнаружен. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что АТ(V) связываются с мономером нативного сурвивина с высоким сродством. При использовании антител АТ(VII) был выделен мономер сурвивина с примесью сурвивинсодержащего комплекса.

Таким образом, было показано, что аффинные сорбенты, полученные на основе антител АТ(V) и АТ(VII), связывают нативный сурвивин с высоким сродством и пригодны для выделения эндогенного сурвивина из лизата опухолевых клеток линии HeLa.

5. Исследование диагностического потенциала противопептидных антител к сурвивину Исследование опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы с помощью моноспецифических антител к сурвивину С помощью АТ(I) и АТ(V), специфичных к сурвивинсодержащему комплексу и мономеру соответственно, было проведено исследование опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы от 5 пациентов. Из образцов тканей были получены гомогенаты, которые в дальнейшем изучали с помощью иммуноблота (рис.12).

Антитела АТ(I) во всех образцах выявили сурвивинсодержащие комплексы с массами 38-40 кДа, при этом в зоне мономера (17 кДа) специфическое окрашивание отсутствовало. АТ(V), в свою очередь, связывались только с мономером сурвивина в образцах опухолевых тканей, в образцах смежных с опухолью тканей специфическая реакция отсутствовала. В данном исследовании антитела вновь продемонстрировали свою специфичность к мономеру и сурвивинсодержащему комплексу.

Рис. 12. Иммуноблот образцов опухолевых (а) и смежных с опухолью (б) тканей от пяти пациентов с диагнозом рак молочной железы. Визуализация с помощью системы ECL.

Таким образом, было показано, что мономер сурвивина присутствует только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс – как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях, что может быть использовано для диагностики рака. Полученные данные позволяют предположить, что мономер и сурвивинсодержащий комплекс играют разную роль в онкогенезе, причем именно мономер участвует в злокачественном перерождении клеток.

Возможно, процесс образования сурвивинсодержащего комплекса является механизмом регуляции функций сурвивина в клетке. Продолжение данного исследования требует изучения значительно большего количества образцов, а также сопоставления полученных данных с клинико-патологическими показателями исследуемых опухолей.

Исследование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину методом иммуноблота Проведенное нами исследование образцов опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы показало, что в отличие от сурвивинсодержащего комплекса мономер сурвивина присутствует только в опухолевых тканях. Представляло интерес изучить содержание мономера и сурвивинсодержащего комплекса в опухолевых тканях другого типа. В связи с этим мы провели исследование гомогенатов опухолевых тканей мочевого пузыря от 14 пациентов методом иммуноблота с помощью антител АТ(I) и АТ(V).

Рис. 13. Иммуноблот гомогенатов опухолевых тканей от 14 пациентов с диагнозом рак мочевого пузыря. Визуализация с помощью системы ECL.

С помощью антител АТ(I) и АТ(V) сурвивин был выявлен практически во всех образцах опухолевых тканей (рис.13). Лишь в двух образцах сурвивин не был обнаружен ни в виде мономера, ни в виде сурвивинсодержащего комплекса (образцы 8 и 9). В мономерной форме сурвивин был выявлен в 10 образцах из исследованных, причем интенсивность специфической реакции в разных образцах была неодинаковой. Сурвивинсодержащий комплекс в значимых количествах присутствовал лишь в трех опухолевых образцах (образцы 1, 5 и 11).

Таким образом, было показано, что мономер сурвивина содержится в большинстве исследованных образцов опухолевых тканей. Остается открытым вопрос о взаимосвязи содержания мономера и сурвивинсодержащего комплекса, выявляемых методом иммуноблота, с агрессивностью опухоли. Для ответа на этот вопрос необходимо провести широкомасштабное исследование гомогенатов опухолевых тканей и сопоставление полученных данных с клиникопатологическими показателями.

Иммуногистохимическое исследование серии образцов рака мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину С помощью противопептидных антител к сурвивину АТ(I), АТ(V) и АТ(VII) совместно с сотрудниками патологоанатомического отделения Московского научно-исследовательского онкологического института им. П. А.

Герцена было проведено иммуногистохимическое исследование образцов опухолевых тканей молочной железы. Наилучшие результаты были получены при использовании АТ(VII), связывающихся в иммуноблоте с мономером и сурвивинсодержащим комплексом. Данные антитела выявляют эндогенный сурвивин ядерной и цитоплазматической локализации, при этом интенсивность специфической реакции различается от случая к случаю (рис. 14).

Рис. 14. Иммуногистохимическая реакция с АТ(VII) в трех образцах опухолевых тканей молочной железы.

То, что интенсивность окрашивания клеток в разных образцах была неодинакова, косвенно свидетельствует о вариабельности экспрессии сурвивина при раке молочной железы и возможности использования АТ(VII) для уточняющей диагностики онкозаболеваний. В связи с этим диагностический потенциал антител к пептиду (VII) был изучен более подробно.

Совместно с сотрудниками патологоанатомического отделения Московского научно-исследовательском онкологического института им. П. А.

Герцена было проведено иммуногистохимическое исследование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря от 60 пациентов. Исследуемый материал был разделен на группы по стадиям G и Т. Стадия G описывает метастатическую активность опухоли, чем выше стадия G, тем ниже степень дифференцировкиопухолевых клеток, тем менее благоприятен прогноз течения заболевания. Стадия Т описывает распространение и агрессивность первичной опухоли, чем выше стадия Т, тем больше размер опухоли и тем хуже прогноз.

Образцы опухолевой ткани всех 60 пациентов исследовали с помощью иммуногистохимии с антителами АТ(VII). В каждом образце полуколичественным методом был определен процент клеток, имеющих цитоплазматическое и ядерное окрашивание. На рис.15 представлены примеры специфического окрашивания.

Рис. 15. Иммуногистохимическая реакция в опухолевых тканях мочевого пузыря с антителами к сурвивину.

а – отрицательная реакция; б – положительная реакция в ядрах клеток опухоли; в – положительная реакция в цитоплазме клеток опухоли; г – положительная реакция в ядрах и цитоплазме клеток опухоли.

Для каждой группы пациентов (разделенных по стадии G и T) была проведена статистическая обработка полученных данных, результаты которой приведены на рис.16.

Рис. 16. Процент окрашивания клеток в зависимости от стадии G и T.

Число пациентов со стадией G1 – 19; G2 – 22; G3 - 19; со стадией T1 – 20; T2 – 17; T3 – 14; T Было показано, что повышение содержания сурвивина как ядерной, так и цитоплазматической локализации коррелирует со снижением степени дифференцировки клеток опухоли, при этом достоверные различия были выявлены между группами G1, G2 и G3 (рис.16).

При сопоставлении экспрессии сурвивина со стадией заболевания было показано, что содержание сурвивина и в ядре, и в цитоплазме опухолевых клеток повышается на стадиях Т2-Т4, однако достоверные различия были выявлены только между T1 и группой T2-T4 (рис.16).

Таким образом, с помощью антител к пептиду (VII) было установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых клетках коррелирует со снижением степени дифференцировки клеток и возрастанием стадии заболевания. Эти данные показывают, что АТ(VII) могут быть с успехом применены для уточняющей диагностики биологической агрессивности и метастатической активности рака мочевого пузыря методом иммуногистохимии.

ВЫВОДЫ

1. С помощью синтетических пептидов получена панель из девяти моноспецифических антител, направленных к различным участкам сурвивина и пригодных для структурно-функциональных исследований белка.

2. Установлено, что антитела к пептидам (122-K129-134) и (122-E129-134) распознают природную аминокислотную замену в 129 положении белка.

3. Выявлено, что все антитела связываются с эндогенным сурвивином в лизатах опухолевых клеток, при этом антитела к пептиду (95-105) выявляют мономер сурвивина, антитела к пептиду (1-22) – сурвивинсодержащий комплекс, антитела к пептиду (80-88)-(130-142) связываются с мономером и сурвивинсодержащим комплексом.

4. Показано, что только антитела к пептиду (1-22) выявляют пул сурвивина, принимающий участие в клеточном делении и солокализованый с комплексом белков-хромосомных пассажиров.

5. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата клеток линии HeLa с помощью антител к пептидам (80-88)-(130-142) и (95-105).

6. С помощью антител к пептидам (1-22) и (95-105) показано, что мономер сурвивина присутствует только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс – как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях.

7. С помощью антител к пептиду (80-88)-(130-142) установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует со снижением степени дифференцировки клеток и возрастанием стадии заболевания, что может быть использовано для уточняющей диагностики рака мочевого пузыря.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах:

1. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ким Я.С., Филатова М.П., Владимирова Н.М., Кармакова Т.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Вольпина О.М. Антитела к синтетическим пептидам для выявления сурвивина в опухолевых тканях. // Биоорган. Химия.– 2010.– Т. 36, № 2.– С.178-186.

2. Вольпина О.М., Завалишина Л.Э., Волкова Т.Д., Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Короев Д.О., Андреева Ю.Ю., Петров А.Н., Франк Г.А. Ингибитор апоптоза сурвивин в переходноклеточном раке мочевого пузыря. // Архив патологии.– 2011.– Т. 73, № 2.– С. 8-10.

3. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Калинцева М.В., Завалишина Л.Э., Каплун А.П., Жарская О.О., Зацепина О.В., Вольпина О.М. Получение аффинноочищенных антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка. // Биоорг. Химия.– 2013.– Т.39, № 3.– С. 326-337.

Патенты:

1. Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Вольпина О.М., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Пептид, стимулирующий образование специфических антител, выявляющих сурвивин в опухолевых тканях. Патент РФ №2396277 от 24.04.2009.

Основные тезисы докладов:

1. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Короев Д.О., Титова М.В., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Волкова Т.Д., Вольпина О.М. Получение антител к опухолеассоциированному белку сурвивину с помощью синтетических пептидов. // Тезисы докладов и стендовых сообщений ХХ зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».– М.,– 2008.– С. 114.

2. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Короев Д.О., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Филатова М.П., Вольпина О.М. Выявление опухолеассоциированного белка сурвивина с помощью антител к синтетическим пептидам. // Материалы 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии».– М.,– 2008.– С. 28-29.

3. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ким Я.С., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Батева М.В., Вольпина О.М. Антитела к синтетическим фрагментам белка сурвивина для уточняющей диагностики раковых опухолей. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XХI зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».– М.,– 2009.– С. 56.

4. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ким Я.С., диагностического потенциала антител к синтетическим фрагментам сурвивина. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии".– М.,– 2010.– С. 5. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Антонова Л.П., Короев Д.О., Завалишина Л.Э., Филатова М.П., Вольпина О.М. Моноспецифические антитела к сурвивину для уточняющей диагностики онкологических заболеваний. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIII международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».– М.,– 2011.– С.

6. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Антонова Л.П., Короев Д.О., Каплун А.П., Якупов И.Ю., Завалишина Л.Э., Вольпина О.М.

Моноспецифические антитела к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка. // Сборник тезисов «Х чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова.– М.,– 2011.– С. 7. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Антонова Л.П., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Завалишина Л.Э., Каплун А.П., Вольпина О.М. Антитела к синтетическим фрагментам сурвивина - инструмент для структурнофункциональных исследований белка и диагностики онкозаболеваний. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии».– М.,– 2012.– С. 8. Akhidova E.V. (Askarova E.V.), Volkova T.D., Antonova L.P., Koroev D.O., Filatova M.P., Kaplun A.P., Zavalishina L.E., Volpina O.M. Monospecific antibodies to survivin for cancer diseases diagnostics and structure functional study. //

Abstract

book of The 1st Multidisciplinary Symposium «Molecular Oncology: from Laboratory Bench to Medicine».– Kyiv, Ukraine.– 2012.– P. 68.

9. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Калинцева М.В., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Каплун А.П., Завалишина Л.Э., Вольпина О.М.

Противопептидные антитела к сурвивину – инструмент для структурнофункциональных исследований белка. // Материалы VI Российского симпозиума «Белки и пептиды».– Уфа.– 2013.– С. 194.

10. Akhidova E.V. (Askarova E.V.), Kalintseva M.V., Volkova T.D., Yakupov I.Y., Koroev D.O., Zavalishina L.E., Volpina O.M. Synthetic immunoactive fragments of Survivin: selection and application for monomer and dimer detection. // Book of abstracts of The 15th International Congress of Immunology.– Milan, Italy.– 2013.–

 
Похожие работы:

«АНТОНОВ Антон Викторович ЭКСТРАКЦИЯ РЕНИЯ И МОЛИБДЕНА НЕЙТРАЛЬНЫМИ ЭКСТРАГЕНТАМИ 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2007 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Ищенко Анатолий Александрович Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор...»

«КУРОЧКИН СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СИНТЕЗА СВЕРХРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ МЕТОДОМ ТРЕХМЕРНОЙ РАДИКАЛЬНОЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2008 www.sp-department.ru Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : кандидат химических наук Грачев Вячеслав Петрович Официальные оппоненты : доктор химических наук,...»

«КРАСИКОВА Инна Николаевна ЛИПИДЫ НЕКОТОРЫХ НАЗЕМНЫХ И МОРСКИХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ КАК ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ЭНДОТОКСИНОВ 02.00.10 — биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Владивосток 2009 Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН Официальные оппоненты : член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Васьковский Виктор...»

«ЛЕЛЕТ МАКСИМ ИВАНОВИЧ СИНТЕЗ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УРАНОМОЛИБДАТОВ И УРАНОВОЛЬФРАМАТОВ ЩЕЛОЧНЫХ МЕТАЛЛОВ 02.00.04 – Физическая химия химические наук и АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Нижний Новгород 2013 Работа выполнена на кафедре химии твердого тела Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского...»

«Корчагина Евгения Викторовна АГРЕГАЦИЯ ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ В РАЗБАВЛЕННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения, физико-математические наук и Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов Физического факультета Московского государственного университета...»

«МОХАММЕД АБДУЛ - ХАКИМ АБДУЛЛАХ АХМЕД СИНТЕЗ И СВОЙСТВА АРИЛГЕТЕРОАЛИФАТИЧЕСКИХ ДИАМИНОСПИРТОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ 02.00.03. Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва 2012 г. Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н. Назарова Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Борисова Елена Яковлевна...»

«Молчанов Алексей Сергеевич ВЛИЯНИЕ СОЛЬВАТАЦИИ НА ДИССОЦИАЦИЮ И КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ L-ТИРОЗИНА И ДОФАМИНА С ИОНАМИ Ni(II) и Cu(II) В ВОДНО-ЭТАНОЛЬНЫХ СРЕДАХ 02.00.01 неорганическая химия 02.00.04 физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново - 2011 Работа выполнена на кафедре общей химической технологии ГОУ ВПО Ивановский государственный химико-технологический университет доктор химических наук, Научный руководитель :...»

«ГОРКОВЕНКО Александр Александрович УдК:547.455.62З:542.952 СИНТЕЗ СТЕРЕОРЕГУАЯРНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ИОННОЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИЕй АНГИДРОСШРОВ И ИХ СВОЙСТВА 02.00.06- Химия высокомолекулярных соединений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук !987 Москва www.sp-department.ru Ра60'1'а анn01иеиа а.аабора'!'ории химии naiпepoa омеиа Трудоаоi'О Красиоrо...»

«Беликов Николай Евгеньевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ НОВЫХ ФОТОХРОМНЫХ МЕТОК (02.00.10 – Биоорганическая химия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова. Научный руководитель : доктор химических наук Ходонов Андрей Александрович Официальные оппоненты :...»

«АЛЕХИНА АНАСТАСИЯ ИВАНОВНА Синтез и свойства полифункциональных фосфорсодержащих аминосоединений 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань-2008 Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Газизов Мукаттис Бариевич Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Пудовик Михаил Аркадьевич доктор химических...»

«МАНАНКОВА АННА АНАТОЛЬЕВНА СИНТЕЗ НЕФТЕПОЛИМЕРНЫХ СМОЛ НА ОСНОВЕ ДИЦИКЛОПЕНТАДИЕНОВОЙ ФРАКЦИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ХЛОРИДА И АЛКОКСИХЛОРИДОВ ТИТАНА (IV) 02.00.13 – нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Тюмень – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский Томский политехнический университет на кафедре Технологии...»

«СУХОРУКОВ АЛЕКСЕЙ ЮРЬЕВИЧ ВОССТАНОВЛЕНИЕ 5,6-ДИГИДРО-4Н-1,2-ОКСАЗИНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННУЮ МЕТИЛЕНОВУЮ ГРУППУ ПРИ С-3. НОВЫЕ СИНТЕЗЫ НА ОСНОВЕ НИТРОЭТАНА. 02.00.03 Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2009 Работа выполнена в лаборатории химии нитросоединений Института органической химии им. Н. Д. Зелинского...»

«БАУМАН ВАЛЕНТИНА ТРОФИМОВНА МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ 7,8-АННЕЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ДИГИДРО- И ТЕТРАГИДРОТЕБАИНА С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИЙ КРОСС-СОЧЕТАНИЯ (02.00.03 – органическая химия) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск - 2008 2 Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Шульц Э.Э. Официальные оппоненты : доктор химических наук,...»

«УСАЧЁВ Борис Иванович ХИМИЯ ФТОРСОДЕРЖАЩИХ ПИРОНОВ И ИХ КОНДЕНСИРОВАННЫХ (ГЕТЕРО)АНАЛОГОВ Специальность 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Екатеринбург 2010 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Уральский государственный университет им. А. М. Горького Научный консультант - доктор химических наук, профессор Сосновских Вячеслав Яковлевич...»

«ПОМЕРАНЦЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА ПОЛУЧЕНИЕ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА НИТЕВИДНЫХ КРИСТАЛЛОВ Ba6Mn24O48 Специальность 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2007 1 Работа выполнена на Факультете наук о материалах и в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор...»

«CИТНИКОВ НИКОЛАЙ СЕРГЕЕВИЧ МЕТОДОЛОГИИ СИНТЕЗА АНТИМИТОТИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ КОЛХИЦИНОВОГО РЯДА 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Нижний Новгород – 2012 Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н. И....»

«МИТАСОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА НАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ ПИРИДИЛСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИМЕРОВ ДЛЯ КООРДИНАЦИОННОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2008 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ивановский государственный химико-технологический университет Научный руководитель кандидат химических наук, доцент Агеева...»

«Лаврентьева Екатерина Константиновна Темплатирование в системах, содержащих глины, как метод управления свойствами полимер-композиционных сорбентов и платиновых электрокатализаторов Специальности: 02.00.06 – высокомолекулярные соединения 02.00.05 – электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре физики...»

«Сальников Денис Сергеевич КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА СУЛЬФОКСИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И ДИОКСИДОВ ТИОМОЧЕВИН И ИХ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ В РЕДОКС-ПРОЦЕССАХ 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2008 Работа выполнена на кафедре технологии пищевых продуктов и биотехнологии ГОУ ВПО государственный химикоИвановский технологический университет. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Макаров Сергей...»

«Новикова Анастасия Александровна ОБЪЕМНЫЕ СООТНОШЕНИЯ В МОРФОТРОПНЫХ РЯДАХ СЛОЖНЫХ ОКСИДОВ Специальность: 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону 2014 2 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии химического факультета ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону Научный руководитель : Налбандян Владимир Бабкенович, кандидат химических наук, доцент Официальные...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.