WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Громова Мария Сергеевна

Холиновый и фенольный биосенсоры для высокочувствительного

определения ферментов-маркеров патологических состояний

Специальности:

02.00.15 – кинетика и катализ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 2011

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, Курочкин Илья Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук, профессор, Изумрудов Владимир Алексеевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « » декабря 2011 г. в 15 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ноября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Определение холина и фенола является важной биологической, клинической и токсикологической задачей. Более того, измерение активностей многих ферментов основано на регистрации продуктов гидролиза производных холина и фенола. К таким ферментам относятся ацетилхолинэстераза (АХЭ), бутирилхолинэстераза (БХЭ), карбоксилэстераза (КЭ), параоксоназа (ПОН1) и Nацетил--D-глюкозаминидаза (НАГаза). В свою очередь, знание активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 является важным моментом как при проведении экспериментальных исследований в токсикологии, нейробиологии, фармакологии, так и в клинической практике – терапии, в т.ч. анестезиологии и клинической токсикологии. НАГаза является одним из биомаркёров мастита коров, и определение её активности может быть использовано для диагностики этого заболевания на ранней стадии.





На сегодняшний день наиболее распространенным методом определения активностей выше перечисленных ферментов-маркёров патологических состояний в биологических жидкостях является спектрофотометрия. Развитие оптических методов достигло высокого уровня и позволяет осуществлять высокопроизводительный анализ ферментативной активности в лабораторных условиях. Однако в настоящее время растет потребность в массовых экспресс-исследованиях активностей этих ферментов непосредственно по месту лечения и в полевых условиях для чего требуются малые объемы пробы. Использование высокочувствительных портативных биосенсоров для определения активностей ферментов-маркёров патологических состояний представляет большой интерес для подобного рода задач медико-биологического мониторинга.

Одним из простых, дешевых и удобных способов формирования биосенсорных покрытий является метод последовательной адсорбции полиэлектролитов и ферментов (ПНП). Он заключается в чередующейся электростатической адсорбции на поверхность сенсора компонентов, несущих противоположный заряд и позволяет включать различные виды материалов в состав пленочных структур полиэлектролитов. Качество сборки полиэлектролитных конструкций зависит от индивидуальных особенностей поверхности для адсорбции, структуры полиэлектролитов, количества слоев и т.д. Толщины слоев и другие физико-химические характеристики этих конструкций оказались чувствительными к таким факторам, как рН, ионная сила, температура, анионно-катионный состав, время адсорбции полиэлектролитов, ионной силы и температуры раствора полиэлектролита.

Однако особенности формирования фермент-полиэлектролитных комплексов на твердой поверхности при их нанесении методом ПНП недостаточно изучены.

Таким образом, фундаментальные исследования в области создания сенсорных покрытий с последующим практическим применением разработанных биосенсоров является актуальной научной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка высокочувствительных биосенсоров для определения холина и фенола, а также исследование возможности практического применения разработанных биосенсоров для анализа АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови млекопитающих и НАГазы в молоке коров. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- Детальное исследование влияния условий формирования ферментполиэлектролитных пленок на основе холиноксидазы (ХО) и тирозиназы (Тир) на поверхности электродов - Изучение аналитических характеристик полученных планарных холиновых и фенольных биосенсоров - Разработка чувствительного и воспроизводимого способа определения холина и фенола в крови и молоке с использованием планарных биосенсоров - Разработка формата анализа ферментов-маркёров в крови и молоке с использованием биосенсоров на холин и фенол.

Научная новизна. Исследовано влияние галогенид анионов (F-, Cl-, Br-, I-) на адсорбцию ПДДА на поверхность графитового стержня и последующее нанесение отрицательно заряженных частиц (холиноксидазы и золота). Показано, что адсорбция ПДДА из растворов содержащих йодид-анион приводит к многократному увеличению чувствительности биосенсора (ПДДАKI/ХО) по холину. Предложена физико-химическая модель, объясняющая процесс формирования фермент-полиэлектролитных пленок в присутствии различных анионов.





Еще одним важным фактором при создании сенсоров является предобработка поверхности для адсорбции фермента. Проведя исследование влияния различных способов подготовки поверхности, было обнаружено, что использование углеродных наностержней приводит к наибольшему увеличению чувствительности сенсора. При нанесении пленки ПДДА/ХО на подслой из УНС происходит более чем семикратное увеличение чувствительности.

Разработаны планарные холиновые и фенольные биосенсоры на основе холиноксидазы и тирозиназы, соответственно. Исследовано влияние условий адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация, время высушивания слоев) и определены параметры, влияющие на активность биосенсоров: гидрофобность, молекулярная масса и заряд поликатиона, анионный состав буферного раствора, природа растворителя и количество циклов нанесения слоев ПДДА/фермент, присутствие многозарядных нанообъектов. Пределы обнаружения холинового и фенольного планарных биосенсоров являются одними из самых низких среди известных на данный момент сенсоров на холин и фенол и составляют 50 и 2,6 нМ, соответственно.

Практическая значимость работы. Разработанные высокочувствительные холиновые и фенольные планарные биосенсоры могут быть использованы как для непосредственного определения холина и фенола в низких концентрациях, так и для измерения ферментативной активности. Разработан новый биосенсорный формат определения активностей ацетил- и бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы в крови и N-ацетил--D-глюкозаминидазы в молоке. Высокая чувствительность биосенсоров позволяет определять выбранные ферменты-маркёры в низких концентрациях, пределы обнаружения АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 и НАГазы составили 4,5, 2, 2, 0,2 и 0,2 мЕд/мл, соответственно. Полученные пределы обнаружения значительно меньше нижней границы диапазона активностей этих ферментов в норме, что позволит использовать для анализа большие разведения и соответственно малые объемы крови (несколько мкл).

Показана применимость нового биосенсора для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы и ранней диагностики мастита коров.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005, 2010, 2011), Международных конгрессах «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009, 2011), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», (Белгород, 2008), Международной научной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), конференции «1st RussianHelenic Symposium «Biomaterials and bionanomaterials: resent advantage and safetytoxicology issues», (Крит, Греция, 2010), конференции «14th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference», (Интерлакен, Швейцария, 2011).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 13 работ, в том числе статьи в международном и отечественном журналах, 1 глава из книги, 10 тезисов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения в 4-х главах, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 224 ссылок. Работа содержит 74 рисунка, 16 таблиц.

Список сокращений:

SCC – подсчет количества соматических клеток АХЭ – ацетилхолинэстераза БХЭ – бутиририлхолинэстераза ВОПГ – высокоориентированный пиролитический графит КЭ – карбоксилэстераза МСУНТ – мультистенные углеродные нанотрубки НАГаза – N-ацетил--D-глюкозаминидаза ПДДА – полидиметилдиаллиаммоний хлорид ПНП – метод последовательной адсорбции полиэлектролитов ПОН1 – параоксоназа УНС – углеродные наностержни ФНАГ – фенил-N-ацетил--D-глюкозаминид ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В литературном обзоре рассматривается строение, физиологическая функция и биологическая роль ферментов-маркёров патологических состояний млекопитающих, а именно ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы и N-ацетил--D-глюкозаминидазы. Также подробно описаны и классифицированы способы определения активностей этих ферментов в крови и молоке (НАГаза). Поскольку определение активности выбранных ферментов-маркёров осуществляют путем измерения концентраций продуктов их ферментативного гидролиза – холина и фенола – то часть литературного обзора посвящена систематизации современных методов определения этих аналитов. Подробно описана технология последовательного нанесения полиэлектролитов, как успешный метод создания биосенсоров, в том числе на холин и фенол. Рассмотрены методы управления процессом формирования пленочных структур, созданных по методу ПНП.

Изготовление холиновых и фенольных биосенсоров. Холиновые биосенсоры на основе графитовых стержней были изготовлены адсорбцией поликатиона и холиноксидазы по технологии ПНП (адсорбция из раствора) на поверхность графитового стержня, модифицированного диоксидом марганца. Холиновые и фенольные биосенсоры на основе планарных электродов были изготовлены путем адсорбции диоксида марганца (для определения холина), полиэлектролита и фермента (холиноксидазы или тирозиназы) на поверхность сенсора по методу ПНП (адсорбция из капли) в условиях контролируемой влажности и температуры.

Физико-химические характеристики. Поверхность графитовых стержней и планарных электродов была охарактеризована методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Характеристику фермент-полиэлектролитных пленок проводили методами АСМ, сканирующей электронной микроскопии и спектрофотометрии. Определение гидродинамических радиусов частиц полиэлектролита проводили методом квазиупругого динамического светорассеяния.

Электрохимические измерения активности биосенсоров проводились в амперометрическом режиме с использованием потенциостата IPC-2000 (Кронас, Россия).

Определение активностей АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 в крови мышей и человека и НАГазы в молоке коров проводилось электрохимическим и спектрофотометрическим способами.

Принцип работы холинового биосенсора основан на ферментативном окислении добавляемого в систему холина до бетаина и пероксида водорода в присутствии холиноксидазы. Последующее окисление пероксида водорода протекает при положительном потенциале (vs. Ag/AgCl) при участии MnO2 в качестве медиатора.

Измеряемый параметр представляет собой ток медиаторного электроокисления пероксида водорода, который пропорционален скорости окисления холина. Данный принцип был реализован в нашей лаборатории на примере биосенсора, представляющего собой модифицированный оксидом марганца графитовый стержень с нанесенной по методу ПНП холиноксидазой. Однако остались невыясненными факторы, оказывающие значительное влияние на активность биосенсора, такие как характер поверхности; время, концентрация компонентов и катионно-анионный состав буфера, из которого происходит адсорбция; химический состав полиэлектролита; включение в состав биосенсора наноматериалов и т.п.

Факторы, влияющие на адсорбцию холиноксидазы и поликатиона, для создания холинового биосенсора на основе графитовых стержней. Известно, что природа противоиона является значительным фактором, влияющим на свойства многослойных полиэлектролитных слоев сформированных по методу ПНП.

Таким образом, представляется целесообразным исследовать влияние галогениданионов (F-, Cl-, Br-, I-) на стадиях адсорбции ПДДА на активность получающегося биосенсора (ПДДА/ХО). В этом ряду энергия гидратации последовательно уменьшается, а значит и растет способность аниона экранировать заряды поликатиона. Сильное экранирование зарядов приводит к адсорбции поликатиона в агрегированном состоянии.

Дальнейшая способность адсорбированного поликатиона взаимодействовать с ферментом будет также меняться в зависимости от типа аниона, в присутствии которого происходила адсорбция. На Рис.1 представлены результаты определения чувствительности биосенсоров, полученных при адсорбции ПДДА из растворов 5 мМ К-фосфата, содержащих KF, KCl, KBr и KI в концентрации 0-100 мМ. Видно, что при адсорбции ПДДА из раствора KI в узком диапазоне концентраций (20-30 мМ) наблюдается увеличение чувствительности биосенсора более чем в 5 раз по сравнению с теми значениями чувствительности, которые получали при использовании других галогенидов (KF, KCl, KBr) и контролем (чистый буфер).

Рис. 1. Зависимость чувствительности биосенсора от концентрации галогенида калия в растворе ПДДА. – контроль (5 мМ К-фосфат без галогенида), – KF, – KCl, – KBr, – KI.

Относительные стандартные ошибки для трех измерений составили 30%.

Было показано, что при адсорбции холиноксидазы на ПДДА в присутствии различных галогенидов, значение эффективной константы Михаэлиса фермента в пленке не изменяется по сравнению с ее значением в растворе (KM(раствор) = 0,95±0,19 мМ, KM(KI) = 1,2±0,3 мМ). Постоянство KMэфф означает, что адсорбция холиноксидазы на поверхность электрода не влияет на доступность активного центра для субстрата.

Результаты динамического светорассеяния и турбодиметрического титрования показывают различие в поведении макромолекул ПДДА в растворе, содержащем йодиданион, по сравнению с другими анионами. Гидродинамический радиус частиц в растворах KCl составляет около 10 нм и слабо меняется при изменении концентрации от 20 до мМ. В тоже время тенденция к увеличению гидродинамического радиуса ПДДА наблюдается в растворах йодида калия, начиная с 20-30 мМ KI. Более того, согласно данным турбодиметрического титрования, при концентрации KI более 70 мМ наблюдается высаливание ПДДА, в то время как при изменении концентрации КСl/KBr вплоть до 500 мМ растворы поликатиона остаются прозрачными. Нанесение ПДДА в присутствии более высоких концентраций йодида приводит к получению неактивного биосенсора.

Данные атомно-силовой микроскопии пленок ПДДА/ХО, адсорбированных на высокоориентированный графит (ВОПГ) из растворов, содержащих KCl и KI, свидетельствуют о различном характере распределения молекул ХО в зависимости от того, в присутствии какого галогенида (KI или KCl) осуществляли адсорбцию ПДДА (Рис. 2). В случае нанесения ПДДА из растворов KCl основным структурным элементом пленки ПДДА/ХО является зерно средним латеральным размером 50 нм (с учетом конволюции), которое может быть соотнесено с отдельными молекулами или олигомерами фермента. Однако в случае нанесения ПДДА из растворов KI фермент в бислойной структуре объединен в крупные домены, структурные детали которых неразличимы при использовании стандартных зондов. Выделение объектов методом секущей плоскости для таких систем дает один связный объект на всей площади изображения.

Рис. 2. АСМ изображения пленок ПДДА/ХО на поверхности ВОПГ. На врезках произведено выделение объектов методом секущей плоскости. ПДДА наносили из растворов 5 мМ Кфосфата в присутствии (A) 20 мM KCl и (Б) 20 мM KI. Размер изображения 11 мкм2.

Отметим, что аналогичное распределение наночастиц золота (Au), имеющих схожий с холиноксидазой размер 10 нм и несущих отрицательный заряд, было получено при их адсорбции на поверхность ВОПГ/MnO2 (Рис. 3). С помощью сканирующей электронной микроскопии было обнаружено равномерное распределение единичных наночастиц золота практически без образования агрегатов на поверхности ПДДА, преадсорбированного в присутствии KCl, в то время как для поликатиона, нанесенного из раствора KI, наблюдается образование крупных агрегатов наночастиц золота с неразрешаемой внутренней структурой.

Рис. 3. СЭМ изображения пленок ПДДА/Au на поверхности ВОПГ/MnO2: нанесение ПДДА из мМ К-фосфата в присутствии (A) 20 мМ KCl, (Б) 20 мМ KI. Размер изображения 4040 мкм2.

Исследование спектров поглощения пленок ПДДАKCl/Au и ПДДАKI/Au, приготовленных в условиях эксперимента на прозрачной подложке свидетельствуют о сдвиге максимума поглощения на 10 нм в сторону длинноволновой области спектра одновременно с достоверным повышением оптической плотности примерно на 20 мОD в случае адсорбции полимера из 20 мМ KI (Рис. 4). Принимая во внимание данные СЭМ, можно предположить, что адсорбция золотых наночастиц на ПДДАKI приводит к иному распределению наночастиц на поверхности и преимущественно в агрегированном состоянии.

Оптическая плотность, мOD поверхности полиметилметакрилата. (1)- ПДДАKI/Au, (2)ПДДАKCl/Au, (3)- подложка перед нанесением золотых Итак, адсорбция противоположно заряженных частиц (в частности, молекул ХО или наночастиц Au) на слой ПДДА, предварительно адсорбированный из растворов, содержащих KCl и KI (Рис. 5) может протекать по следующей схеме:

(1) ПДДАKCl/ХО – ПДДА в присутствии хлорид-анионов предположительно присутствует в растворе в виде отдельных молекул. При адсорбции полиэлектролита на поверхность происходит равномерное распределение ионогенных групп (сайтов связывания с противоположно заряженными объектами). Последующая адсорбция ХО приводит формированию плотной пленки фермента в виде равномерно распределенных небольших агрегатов. Аналогичная ситуация наблюдается при адсорбции золотых наночастиц. Чувствительность полученного биосенсора по холину составляет 35,3 мА М-1 см-2.

(2) ПДДАKI/ХО – в данном случае йодид-анионы способны более эффективно экранировать заряды ПДДА, что приводит к ассоциации молекул полиэлектролита в растворе. В этих условиях поликатион адсорбируется на поверхность в форме агрегатов, тем самым увеличивая количество ионогенных групп на единицу площади, экспонированных в раствор и доступных для взаимодействия с противоположно заряженными объектами. Это позволяет молекулам ХО и золотым наночастицам адсорбироваться с образованием крупных и плотных доменов. Чувствительность полученного биосенсора по холину в этом случае увеличивается и составляет 183,3 мА Мсм-2.

Влияние ионной силы и природы низкомолекулярного катиона исследовали, адсорбируя ПДДА из растворов, содержащих различные концентрации катионов Li+, Na+, K+ и Cs+. В данном случае на стадии адсорбции ПДДА ионная сила создавалась добавлением к 10 мМ фосфату соответствующего катиона хлорид в концентрации 0,1, 0, и 1 М. Результаты исследований приведены на Рис. 6.

Отклик биосенсора, нА Данная зависимость свидетельствует о том, что увеличение ионной силы раствора для всех исследованных хлоридов приводит к уменьшению активности биосенсора (амперометрического отклика на стандартную концентрацию холина). Возможным объяснением данному факту является то, что адсорбция полиэлектролита из растворов с высокой ионной силой происходит в более компактной и менее заряженной конформации, что приводит к ослаблению электростатического взаимодействия холиноксидазы и поликатиона.

Влияние природы катиона в растворе холиноксидазы на активность биосенсора проверялось путем замены Na-фосфатного буфера на Li, K, Cs-фосфатный буфер, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии эффекта катиона на процесс адсорбции холиноксидазы. Влияние анионов изучали путем определения активности биосенсора, полученного в результате адсорбции ХО из растворов, содержащих 35 мМ K-фосфатного буфера и KF, KCl, KBr и KI в концентрации 35 мМ.

Добавление в раствор холиноксидазы анионов F-, Cl- практически не изменяет ее способность эффективно адсорбироваться на пленки. В то же время Br-, а особенно Iприводят к заметному снижению активности конструкции. В случае нанесения фермента в присутствии йодид-аниона (ПДДА/ХОKI) наблюдается трехкратное падение активности системы. В этих условиях формирование первого слоя ПДДА происходит стандартным образом. Поскольку в ряду анионов F Cl Br I наименьшая энергия гидратации наблюдается для йодид-аниона, то сила его взаимодействия с положительно заряженными группами ПДДА оказывается наибольшей, что в свою очередь препятствует эффективной посадке фермента. Чувствительность полученного биосенсора по холину составляет 11, мА М-1 см-2.

В литературе описаны различные методы предварительной подготовки поверхности с целью улучшения эффективности адсорбции полиэлектролитов. Так, одним из подходов является включение углеродных наноматериалов, в качестве отрицательно заряженного многозарядного объекта, в состав ферментполиэлектролитных пленок, полученных по технологии ПНП. Для этой цели в данной работе были использованы окисленные мультистенные углеродные нанотрубки (МСУНТ) и наностержни (УНС). Результаты показали, что использование окисленных МСУНТ и УНС (ПДДА/МСУНТ(УНС)/ПДДА/ХО) приводит к увеличению отклика биосенсора в 2, раза, что, скорее всего, связано с увеличением исходной шероховатости поверхности. При увеличении количества подслоев из ПДДА и УНС до 6 активность биосенсора ((ПДДА/УНС)6 /ПДДА/ХО) увеличивается в 7,6 раза относительно простой бислойной конструкции ПДДА/ХО. Чувствительность полученного биосенсора по холину составляет 268,3 мА М-1 см-2.

Холиновый биосенсор на основе планарных электродов. Для создания холинового биосенсора были использованы графитовые планарные электроды, содержащие медиаторный слой MnO2*. Медиатор, поликатион и фермент наносили на поверхность планарных электродов капельным методом по технологии ПНП. В качестве базовой конструкции мы рассматривали биосенсор, представляющий бислойную пленку ПДДА/ХО. В первую очередь были исследованы параметры адсорбции компонентов, такие как время адсорбции и концентрация полиэлектролита и фермента, время высушивания слоев. Оптимальные условия адсорбции компонентов представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Условия адсорбции компонентов пленки ПДДА/ХО.

Влияние катионно-анионного состава буферного раствора поликатиона на активность холинового биосенсора. Результаты изучения влияния низкомолекулярных анионов, а также высоких значений ионной силы раствора (0,02 – 3М), из которого происходит адсорбция ПДДА, на отклик холиноксидазного биосенсора, показали, что увеличение ионной силы, создаваемой бромид- или хлорид-анионами приводит к уменьшению активности образующегося биосенсора. Сравнение активностей сенсоров, в которых ПДДА был адсорбирован из 20 мМ растворов различных галогенидов, показало, как и следовало ожидать, что только в случае адсорбции ПДДА в присутствии йодиданионов происходит увеличение отклика биосенсора. Изучение влияния катионного состава буферного раствора проводилось сравнением активностей биосенсоров, полученных адсорбцией ПДДА из 50 мМ фосфатных буферных растворов в присутствии Li+, Na+, K+, Cs+. Оказалось, что в случае пленок, сформированных на поверхности планарных электродов, также как и для пленок на графитовых стержнях, не наблюдается значительного влияния природы катиона в растворе поликатиона.

Dontsova E.A., Zeifman Y.S., Budashov I.A., Eremenko A.V., Kalnov S.L., Kurochkin I. N., Screenprinted carbon electrode for choline based on MnO2 nanoparticles and choline oxidase/polyelectrolyte layers, Sensors and Actuators B: Chemical, 2011, V. 159 (1), P. 261-270.

Влияние этилового спирта на адсорбцию компонентов. Как обсуждалось в литературном обзоре, уменьшение диэлектрической проводимости растворителя приводит к усилению взаимодействий полимер-полимер между сегментами полимерной молекулы и снижению силы взаимодействий полимер-растворитель, что сказывается в свою очередь на улучшении адсорбции полимера на поверхность. При нанесении поликатиона в присутствии этилового спирта в диапазоне 0-40%, было выявлено 30% увеличение активности биосенсора при адсорбции ПДДА из 30% раствора этанола. В то же время добавление этилового спирта в раствор холиноксидазы при ее нанесении на поликатион не дает эффекта увеличения активности биосенсора.

Зависимость активности биосенсора от числа циклов нанесения слоев полимера и фермента. Одним из способов увеличения количества фермента в пленке является увеличение числа циклов нанесения слоев полиэлектролит/фермент. Было показано, что при увеличении количества циклов нанесения компонентов пленки активность биосенсора возрастает и достигает максимума в случае конструкции (ПДДА/ХО)5. При дальнейшем увеличении циклов адсорбции ПДДА и ХО (n 8) активность сенсора начинает идти на спад. В случае адсорбции полимера из раствора, содержащего 20 мМ йодид-анионов, зависимость активности биосенсора от количества слоев (ПДДАNaI/ХО)n, выглядит аналогичным образом. При этом абсолютное значение максимума то же, что и в случае адсорбции ПДДА из растворов, не содержащих NaI, однако достигается уже при трех слоях ПДДА/ХО. Такой результат можно объяснить существованием диффузионных затруднений проникновения субстрата (и/или продукта реакции) к иммобилизованному ферменту (поверхности электрода) при увеличении толщины пленки.

Отдельно было показано, что в отличие от холиновых биосенсоров на основе графитовых стержней, использование наноматериалов для создания подслоя для последующего нанесения пленки ПДДА/ХО, не дало увеличение отклика. Измерение шероховатости поверхности планарного электрода и графитовых стержней до и после нанесения диоксида марганца показало, что шероховатость планарных электродов значительно выше в обоих случаях (Табл. 2), что и может быть объяснением наблюдаемого эффекта.

Таблица 2. Шероховатость графитовых стержней и планарных электродов.

поверхности графита, нм Шероховатость (Ra) слоя Ra определяет величину среднего значения отклонения координаты z (шероховатости поверхности) образца в пределах анализируемой области.

Аналитические характеристики планарных холиновых биосенсоров и кинетические параметры холиноксидазы в пленках полимера. Аналитические характеристики планарных холиновых биосенсоров, проявивших высокую активность:

ПДДA/ХО, ПДДAEtOH/ХО, ПДДANaI/ХО, (ПДДA/ХО)5 и (ПДДANaI/ХО)3, представлены в Табл. 3. Электроды сохраняют не менее 50% активности при хранении с осушителем при 4°С в течение 5 месяцев.

Следует отметить высокую чувствительность конструкции (ПДДA/ХО)5 и (ПДДANaI/ХО)3 и низкие пределы обнаружения по холину. Разработанные сенсоры характеризуются самым низким пределом обнаружения (50 нМ) среди известных на данный момент сенсоров на холин и почти на порядок превосходят предел обнаружения описанного в литературе биосенсора, имеющего более сложную конструкцию Pt/МСУНТ/(ПАА/ПВС)3/(ПДДА/ХО)8 (2·10-7М). В зависимости от конкретного практического приложения может быть использован тот или иной биосенсор.

Таблица 3. Сравнение аналитических характеристик наилучших конструкций, полученных на Предел обнаружения, Воспроизводимость, % электродов) Чувствительность, – операционная стабильность, % снижения отклика за измерение.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что техника трафаретной печати совместно с методом ПНП позволяют получить воспроизводимую, стабильную и чувствительную систему для всех выбранных конструкций электродов.

Таким образом, систематическое изучение факторов, влияющих на свойства фермент-полиэлектролитных пленок, нанесенных на поверхность графита, позволило сделать следующие выводы. Если поверхность имеет низкую шероховатость (графитовые стержни), то для увеличения количества мест связывания фермента можно использовать низкомолекулярные электролиты (например, KI) для перевода молекул полиэлектролита в ассоциированное состояние, а также углеродных наноматериалов (окисленные нанотрубки и наностержни). С другой стороны, если поверхность изначально имеет высокую шероховатость (планарные электроды), большое значение имеют условия адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация), а также последующая обработка полиэлектролитных слоев (время высушивания). Также было обнаружено, что присутствие этанола, а также йодид-анионов при формировании полиэлектролитного слоя, приводит к увеличению активности сенсорных покрытий.

Фенольный биосенсор на основе планарных электродов. Для создания фенольного планарного биосенсора была также использована технология ПНП.

Основными составляющими сенсора являются графитовый электрод, созданный методом трафаретной печати, на который методом послойного нанесения полиэлектролитов адсорбированы ПДДА и фермент тирозиназа. Принцип определения фенола основан на двух последовательных ферментативных реакциях: оксигидроксилирование фенола с последующим окислением пирокатехина до хинона в присутствии молекул кислорода. В результате последней реакции образующиеся хинон и/или фенокси-радикал могут восстанавливаться на поверхности электрода при отрицательных потенциалах (vs.

Ag/AgCl). Ток их восстановления пропорционален концентрации фенола в растворе. При создании тирозиназных планарных биосенсоров нами были использованы подходы к формированию фермент-полиэлектролитных пленок, такие же, как и при разработке планарных холиноксидазных сенсоров. Результаты оптимизации параметров адсорбции компонентов представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Условия адсорбции компонентов пленки ПДДА/Тир.

Изменение анионного состава буферного раствора ПДДА (добавление 20 мМ растворов галогенидов) при последующей адсорбции Тир не привело к изменению активности биосенсора, что, скорее всего, связано с особенностями структуры фермента.

Увеличение числа циклов нанесения слоев (ПДДА/Тир)n от 1 до 2 привело также к двукратному увеличению активности биосенсора. Дальнейшее увеличение числа слоев Тир приводит лишь к уменьшению отклика сенсора.

Использование наноматериалов для создания фенольного биосенсора.

Конструирование поверхностей методом послойного нанесения полиэлектролитов предполагает использование не только фермента, имеющего суммарный отрицательный заряд глобулы, но и большого спектра положительно и отрицательно заряженных объектов для придания поверхности необходимых характеристик. Из ранее проведенных исследований известно, что включение заряженных объектов в состав сенсора увеличивает его чувствительность. Для достижения поставленной цели исследовалось влияние некоторых белковых и неорганических материалов на чувствительность биосенсора. В качестве таких объектов в нашей работе использовались: окисленные мультистенные углеродные нанотрубки, наночастицы золота, диаметром 10 нм и геннноинженерный белок GP18 бактериофага Т4, образующий в растворе трубчатые структуры (длина 100-120 нм, ширина 40 нм, высота 15-20 нм). Указанные структурированные объекты включались в конструкцию тирозиназного электрода, используя подход ПНП и измерялась активность полученных биосенсоров (Табл. 5). В качестве контроля использовали простую бислойную конструкцию ПДДА/Тир.

Таблица 5. Аналитические характеристики конструкций с включением нанообъектов.

Стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD) вычислялось Как видно из представленных данных, добавление слоя из нанообъектов значительно повышает активность биосенсоров. Самой активной оказалась конструкция, содержащая углеродные нанотрубки, предел обнаружения уменьшился почти в два раза.

Использование наночастиц золота также привело к увеличению активности, но при этом и сильно увеличился разброс значений. Наименьшее увеличение активности наблюдалось в случае нанесения на электрод белковых нанотрубок.

Так как добавление дополнительного слоя нанотрубок увеличило активность электродов почти вдвое, следующим этапом работы стала проверка влияния количества подслоев из нанотрубок на активность образующегося биосенсора. При добавлении каждого следующего слоя нанотрубок поверхность сенсора становится более разветвленной и способна адсорбировать на себя большее количество полимера и фермента. При наличии двух подслоев наблюдался максимальный эффект, активность биосенсора увеличивалась в 3,5 раза. Плотность посадки фермента на поверхности можно также увеличить добавлением слоев тирозиназы на уже сформированную поверхность из нанотрубок. Для этого на электрод с конструкцией (ПДДА/МСУНТ)2/ПДДА/Тир наносились стандартным методом дополнительные слои ПДДА и Тир. Таким образом, для самой чувствительной конструкции (ПДДА/МСУНТ)2/(ПДДА/Тир)2 удалось понизить предел обнаружения фенола до 2,6 нМ.

Аналитические характеристики планарных фенольных биосенсоров.

Аналитические характеристики наиболее активных конструкций суммированы в Табл. 6.

Как и в случае холиновых биосенсоров в зависимости от требуемой чувствительности анализа может быть использована как сложная, так и простая конструкция.

Таблица 6. Сравнение аналитических характеристик наилучших конструкций, полученных на Предел обнаружения по фенолу, Линейный диапазон, M Воспроизводимость, % (RSD для – операционная стабильность, % снижения отклика за измерение.

Применение холинового и фенольного биосенсоров для анализа ферментовмаркёров в крови. В этой части работы изложены результаты исследования возможности электрохимического определения активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови с использованием разработанных биосенсоров на холин и фенол. Биосенсоры представляли собой планарные графитовые электроды с нанесенной бислойной конструкцией ПДДА/ХО – для анализа холина и ПДДА/Тир – для анализа фенола.

Согласно литературным данным для анализа АХЭ в качестве субстрата используют ацетилхолин, для анализа БХЭ – бутирилхолин, а для анализа КЭ и ПОН1 может использоваться фенилацетат. Среди предложенных реагентов лишь бутирилхолин является высокоспецифичным субстратом для БХЭ, использование АХ и ФА требует добавления ингибиторов для удаления мешающих активностей. Так, в частности, ацетилхолин, помимо АХЭ, способен гидролизоваться также и БХЭ, а фенилацетат с разной степенью эффективности гидролизуется всеми ферментами.

В данной работе была разработана и использована следующая схема определения активностей выбранных ферментов. Сначала требуемое количество гемолизата инкубировали со специфическими ингибиторами в оптимальных условиях инкубации в течение фиксированного времени, после чего туда же добавляли требуемое количество соответствующего субстрата и инкубировали еще в течение времени t. Здесь и далее такую смесь, содержащую гемолизат, ингибитор и субстрат, называли инкубационной смесью. Затем аликвоту инкубационной смеси переносили в электрохимическую ячейку с буфером. Как было показано в предварительных экспериментах, 25-ти кратное (и более) разбавление инкубационной смеси, происходящее в электрохимической ячейке, приводит к значительному снижению скорости ферментативного гидролиза и может быть принято за ее остановку. Далее измеряли количество продукта (холина или фенола) накопившегося к моменту остановки реакции разбавлением, используя соответствующий биосенсор. Отклик биосенсора на образовавшийся в инкубационной смеси продукт пропорционален активности соответствующего фермента в гемолизате.

Подбор оптимальных условий измерения продуктов ферментативного гидролиза. Для всех исследуемых ферментов были подобраны оптимальные условия по концентрации субстрата и содержанию гемолизата в инкубационной смеси, времени инкубации с субстратом, а также степени разбавления инкубационной смеси в электрохимической ячейке. Данные по оптимизации измерений суммированы в Табл. 7.

Таблица 7. Оптимизированные условия определения активностей ферментов-маркёров в крови Оптимальная концентрация Время инкубации с субстратом, мин Разведение гемолизата в инкубационной Разбавление смеси в ячейке, раз Таким образом, используя подобранные условия, можно измерять активности ферментов-маркёров в формате «конечной точки» по количеству холина либо фенола, накопившегося в инкубационной смеси в течение фиксированного периода времени, и его последующего определения с использованием соответствующего планарного биосенсора.

Оценка влияния матрикса на аналитический сигнал при определении активностей ферментов-маркёров. Для исследования матрикс-эффекта (то есть возможного мешающего вклада иных, не связанных с целевыми ферментами, компонентов крови) были получены калибровочные зависимости по концентрациям коммерческих препаратов этих же ферментов в чистых растворах, а также в присутствии гемолизата. Полученные зависимости представляют собой параллельные прямые, что свидетельствует о вкладе в отклик только собственной ферментативной активности гемолизата и отсутствии влияния матрицы на амперометрический сигнал. На Рис. представлена типичная зависимость ферментативного гидролиза фенилацетата от концентраций коммерческого препарата параоксоназы в чистых растворах и в присутствии гемолизата.

Отклик биосенсора, нA Из полученных зависимостей откликов сенсоров от концентраций коммерческих препаратов ферментов в буферном растворе были рассчитаны пределы обнаружения этих ферментов на основании минимально определяемых концентраций аналитов (холина и фенола), вычисленных при соотношении сигнал/шум = 3. Результаты представлены в сравнении с активностями выбранных ферментов в норме в крови человека Табл. 8.

Как видно из таблицы пределы обнаружения, полученные с использованием разработанных биосенсоров, во много раз превосходят минимальное значение активности этих ферментов в крови человека, что позволит использовать для анализа большие разведения и соответственно малые объемы крови (несколько мкл).

Верификация биосенсорных измерений стандартной спектрофотометрической методикой. Для верификации биосенсорных измерений активности ферментов-маркёров с использованием стандартного спектрофотометрического метода были проведены опыты по селективному in vitro ингибированию наблюдаемых активностей каждого фермента в цельной крови (гемолизате).

Селективное ингибирование in vitro активностей АХЭ, БХЭ и КЭ в цельной крови проводили с использованием гемолизата крови мышей и следующих ингибиторов: изоОМПА для БХЭ, (-)-гуперзина А – для АХЭ и параоксона – для КЭ. Измерение остаточной активности ПОН1 в препарате гемолизата крови мыши проводилось после 20ти минутного ингибирования параоксоном и 10-ти минутного ингибирования ЭДТА.

Измерение активности эстераз проводилось электрохимически в оптимальных условиях согласно разработанному формату анализа и спектрофотометрически по стандартным методикам. В спектрофотометрическом методе для определения активностей АХЭ и БХЭ использовали тиоаналоги субстратов: ацетилтиохолин и бутирилтиохолин, для определения активностей КЭ и ПОН1 использовали ФА.

Кривые титрования ферментативных активностей (зависимости % ингибирования от концентрации ингибитора), полученные биосенсорным и спектрофотометрическим методами, оказались достаточно близки, даже при условии использования разных субстратов (Рис. 8).

Ингибирование, % Рис. 8. Кривые титрования активности АХЭ (-)-гуперзином А (А), БХЭ изо-ОМПА (Б), КЭ параоксоном (В), ПОН1 ЭДТА в крови мышей (Г), полученные при использовании спектрофотометрической () и биосенсорной () методик. На вставке: корреляция между результатами измерения, полученными электрохимическим и спектрофотометрическим В Табл. 9 приведены величины IC50 для каждого фермента, полученные двумя методами. Из таблицы видно, что сравниваемый аналитический параметр имеет близкие значения при использовании спектрофотометрической и биосенсорной методик, что подтверждает достоверность и корректность определяемых активностей ферментов и является успешным результатом первого этапа верификации разработанного формата анализа.

Таблица 9. Значения IC50 для in vitro ингибирования ферментов-маркёров крови мышей по данным спектрофотометрической и электрохимической методик Селективное in vivo ингибирование активностей АХЭ, БХЭ и КЭ в цельной крови (гемолизате). Для исследования возможности применения биосенсорного определения активностей АХЭ, БХЭ и КЭ при отравлениях ФОС c использованием спектрофотометрической и биосенсорной методик было проведено измерение активностей этих ферментов в крови мышей через 1 час после в/бр введения возрастающих доз модельного фосфорорганического соединения – дибутилфосфата (C4H9O)2P(O)OCH(CF3)2 (ЛД50 2000 мг/кг). Эта часть работы выполнена при сотрудничестве с лабораторией Молекулярной токсикологии Института физиологически активных веществ РАН, Черноголовка. Результаты дозозависимого ингибирования АХЭ и БХЭ в крови мышей, полученные двумя методами, представлены на Рис. 9 в виде % ингибирования эстераз (в сравнении с контролем) от дозы дибутилфосфата.

Рис. 9. Дозозависимое ингибирование БХЭ и АХЭ в крови мышей через 1 час после в/бр введения дибутилфлосфата (C4H9O)2P(O)OCH(CF3)2, N=4-6. Активности эстераз в цельной крови определяли спектрофотометрически (открытые символы) и биосенсорными методами (заштрихованные символы) и представляли в виде % ингибирования активности соответствующей эстеразы у контрольных животных.

Показано, что БХЭ и КЭ являются более чувствительными биомаркерами по сравнению с АХЭ (EД50 = 26,4±2,4, 6,1±0,2 и 132,5±8,7 мг/кг (N=6), соответственно).

Наблюдается хорошее соответствие между результатами, полученными обоими методами: зависимости между величинами активностей АХЭ, БХЭ и КЭ, измеренными спектрофотометрически и с использованием биосенсора, характеризуются высокими коэффициентами корреляции - 0,99, 0,98 и 0,98, соответственно. Полученные данные подтверждают достоверность биосенсорных измерений и демонстрируют применимость разработанных планарных биосенсоров на холин и фенол для мониторинга воздействия ФОС на живые организмы, в том числе на человека.

Определение активности параоксоназы в крови человека. Так как в крови содержится ряд ферментов, также способных гидролизовать фенилацетат, то для выделения вклада параоксоназы необходимо использовать специфические ингибиторы.

Как было показано, ЭДТА в концентрации 2,5 мМ способен полностью и селективно ингибировать активность ПОН1. Поэтому мы предлагаем использовать следующий формат анализа активности ПОН1: измерение полной активности ферментов крови по фенилацетату и измерение остаточной активности пробы после преинкубации с ЭДТА.

Далее по разности полученных значений находится активность ПОН1.

Для демонстрации практического применения разработанного метода определения активности ПОН1 были проведены эксперименты по определению активности параоксоназы в крови человека. Для анализа использовали капиллярную кровь 5 человек в возрасте от 21 до 53 лет. Затем готовили препараты гемолизатов, в которых определяли активность ПОН1 биосенсорным и спектрофотометрическим способами (Рис. 10).

Коэффициент корреляции двух методов составил 0,989.

Рис. 10. Определение активности ПОН1 в образцах крови 5 человек.

Таким образом, с использованием планарных холинового и фенольного биосенсоров разработан высокочувствительный метод определения активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови. Высокая чувствительность биосенсоров позволяет определять ферменты-маркёры в низких концентрациях, что обуславливает использование малых количеств (несколько мкл) пробы для анализа. Также была показана применимость новых биосенсоров для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы.

Применение фенольного биосенсора для определения активности НАГазы в молоке. Для определения мастита коров на ранних стадиях заболевания необходимо с высокой чувствительностью определять активность НАГазы в цельном молоке. В данной работе предлагается измерять активность целевого фермента по концентрации фенола, выделяющегося при гидролизе специфического субстрата фенил-N-ацетил--Dглюкозаминида (ФНАГ) под действием НАГазы, с использованием разработанного тирозиназного сенсора планарного типа.

В настоящей работе была использована следующая схема определения активности НАГазы (Рис. 11). Требуемое количество цельного молока инкубировали с субстратом ФНАГ в течение определенного времени. Здесь и далее такую смесь (молоко, субстрат) называли инкубационной смесью. Далее инкубационную смесь центрифугировали, отбирали аликвоту и добавляли в электрохимическую ячейку. Стократное разбавление инкубационной смеси, происходящее в электрохимической ячейке (как было показано в предварительных экспериментах) также приводило к значительному снижению скорости ферментативного гидролиза и может быть принято за ее остановку. Далее измеряли количество фенола, накопившегося к моменту остановки реакции разбавлением, используя тирозиназный биосенсор. Отклик сенсора на наработавшийся в инкубационной смеси фенол пропорционален активности НАГазы в молоке.

Рис. 11. Схема биосенсорного измерения активности НАГазы в молоке.

Подбор оптимальных условий измерения продукта ферментативного гидролиза. Условия определения активности НАГазы в молоке суммированы в Табл. 10.

Таблица 10. Оптимизированные условия определения активности НАГазы в молоке.

Поскольку казеин составляет большую часть белков молока, в среднем 2,7%, было исследовано его влияние на активность фермента в растворе. Было показано, что уже при малых концентрациях казеина (0,05%) достигается увеличение активности НАГазы по сравнению с активностью в чистом буферном растворе более чем в 4 раза. При дальнейшем увеличении концентрации казеина активность фермента изменяется незначительно.

Измерение активности НАГазы в молоке коров. Для выявления влияния матрикс-эффекта молока на измерение активности НАГазы были сняты зависимости отклика электрода от активности фермента, вводимого в инкубационную смесь, содержащую или не содержащую пастеризованное молоко (нет НАГазной активности).

При измерении активности коммерческого препарата НАГазы, растворенного в молоке, был также обнаружен эффект увеличения активности фермента по сравнению с раствором в цитратном буфере (Рис. 12).

Как видно из графика, активность НАГазы в молоке (за счет стабилизации белковыми компонентами) такая же, как и в 0,05% растворе казеина. Так как молоко не имело собственной ферментативной активности, совпадение построенных зависимостей для молока и раствора казеина показывает, что молоко не мешает определению активности коммерческого препарата НАГазы. Рассчитанный предел обнаружения НАГазы в инкубационной смеси, содержащей разбавленное в 4 раза молоко, составил 0, мЕд/мл, при линейном диапазоне 0,2-125 мЕд/мл. В цельном молоке эти характеристики составили 0,8 мЕд/мл и 0,8-500 мЕд/мл, соответственно.

Верификация биосенсорных измерений. Для проверки применимости метода к решению проблемы ранней диагностики мастита коров, было проведено биосенсорное измерение активности НАГазы в образцах молока, взятых от здоровых и больных маститом коров в одном из подмосковных хозяйств. Активности НАГазы в образцах молока, измеренные электрохимическим и спектрофотометрическим методами, представлены на Рис. 13. Из литературы известно, что молоко принято делить на 3 класса в зависимости от содержания в нем соматических клеток. Активность НАГазы выше мЕд/мл свидетельствует о начальной стадии заболевания животного маститом. Было выявлено только два образца молока, относящиеся ко второму классу качества и два образца с высоким содержанием НАГазы, свидетельствующее о прогрессирующем мастите. Эти данные были также подтверждены результатами качественного калифорнийского теста. Коэффициент корреляции двух методов составил 0,972.

Рис. 13. Корреляция разработанного метода со спектрофотометрическим измерением Таким образом, был разработан биосенсорный формат определения активности НАГазы в молоке коров для диагностики мастита на ранней стадии заболевания на основе планарных фенольных сенсоров.

Исследовано влияние галогенид анионов (F-, Cl-, Br-, I-) на адсорбцию ПДДА и последующее нанесение отрицательно заряженных частиц (холиноксидазы и золотых наночастиц). Установлено, что нанесение ПДДА из растворов, содержащих йодид-анион приводит к формированию поверхности, обеспечивающей пятикратное увеличение чувствительности холинового биосенсора на основе графитовых стержней, вида MnO2/ПДДАKI/ХО.

Исследовано влияние предварительной подготовки поверхности сенсора с использованием наноструктурированных объектов (мультистенные углеродные нанотрубки и наностержни, белковые нанотрубки, наночастицы золота) на активность холинового и фенольного биосенсоров. Показано, что подготовка поверхности увеличивает активность холинового и фенольного биосенсоров в 7,6 и 3,5 раза, соответственно.

Разработаны планарные холиновые и фенольные биосенсоры на основе холиноксидазы и тирозиназы, соответственно. Исследовано влияние условий адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация, время высушивания слоев) и определены параметры, влияющие на активность биосенсоров: анионный состав буферного раствора, присутствие растворителя, количество циклов нанесения слоев ПДДА/фермент, присутствие многозарядных нанообъектов. Аналитические характеристики разработанного холинового биосенсора: предел обнаружения по холину - 50 нМ, воспроизводимость - 4,1%, чувствительность – 102 мА·М-1 см-2. Аналитические характеристики фенольного биосенсора: предел обнаружения по фенолу – 2,6 нМ, воспроизводимость - 6,3%, чувствительность – 1760 мА·М-1 см-2.

Разработан биосенсорный формат определения активностей ацетил- и бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы и N-ацетил--Dглюкозаминидазы в биологических жидкостях на основе холиновых и фенольных сенсоров планарного типа. Пределы обнаружения АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 и НАГазы составили 4,5, 2, 2, 0,2 и 0,2 мЕд/мл, соответственно.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Gromova M.S., Sigolaeva L.V., Fastovets M.A., Evtushenko E.G., Babin I.A., Pergushov D.V., Amitonov S.V., Eremenko A.V., Kurochkin I.N. Improved adsorption of choline oxidase on a polyelectrolyte LBL film in the presence of iodide anion. // Soft Matter, 2011.

V.7. P. 7404-7409.

2. Курочкин И.Н., Еременко А.В., Сиголаева Л.В., Громова М.С. Донцова Е.А., Торгонская А.А., Крайнова Н.А., Дубачева Г.В., Порус М.С., Махаева Г.Ф., Рудакова Е.Н., Пергушов Д.В., Будашов И.А, Евтушенко Е.Г., Зезин А.Б., Варфоломеев С.Д.

Фермент-полимерные нанокомпозиты как основа диагностической платформы для медико-биологических исследований. // Постгеномные исследования и технологии, под. ред. Варфоломеева С.Д., 2011. С. 219-295.

3. Еременко А.В., Курочкин И.Н., Осипова М.С. (Громова М.С.), Сиголаева Л.В., Донцова Е.А., Варфоломеев С.Д., Донченко В.К., Жаковская З.А., Зигель В.В., Пилип А.Г. Биосенсорные системы – как средства ранней диагностики экологической безопасности. // Научно-информационный бюллетень «Экологическая безопасность», 2009. №1-2. Т. 21-22. С. 16-24.

4. Осипова М.С. (Громова М.С.), Никитина С.Е., Соколовская Л.Г., Сиголаева Л.В., Курочкин И.Н. Оптимизация конструкции холинчувствительного биосенсора в анализе ингибиторов холинэстераз. // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», секция «Химия», Москва, 5. Дубачева Г.В., Соколовская Л.Г., Порус М.В., Осипова М.С. (Громова М.С.).

Влияние природы полиэлектролитов на каталитические свойства ферментов, иммобилизованных на поверхности сенсоров, Материалы четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Секция «Биокатализ и биокаталитические технологии», Москва, 2007, С. 272.

6. Осипова М.С. (Громова М.С.) Разработка сенсора на холин с использованием технологии последовательного нанесения полиэлектролитов, Тезисы Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии:

проблемы и перспективы», Белгород, 2008, С. 120.

7. Krainova N.A., Gromova M.S. Carbon nanomaterials for choline oxidase biosensor based on polyelectrolyte self-assembling nanofilms, Материалы международной научной конференции «BIOCATALYSIS-2009», Arkhangelsk, Russia, 2009, P. 91.

8. Громова М.С. Использование углеродных наноматериалов для создания холиноксидазного биосенсора с использованием технологии последовательного нанесения полиэлектролитов, Материалы пятого Московского международного конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Секция «Биокатализ и биокаталитические технологии», Москва, 2009, С. 282.

9. Kondrashina A.V., Tarhonskaya H.A., Gromova M.S., Sigolaeva L.V., Kurochkin I.N. The method of layer-by-layer formation of active bioanalytical surfaces based on choline oxidase and polyelectrolytes, 1st Russian-Helenic Symposium «Biomaterials and bionanomaterials:

resent advantage and safety-toxicology issues», (Крит, Греция), 2010, P. 10. Громова М.С. Контролируемое формирование фермент – полиэлектролитных тонких пленок на основе холиноксидазы, Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Химия», подсекция «Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнология», 2010, 59_953_18217.

11. Кондрашина А.В., Громова М.С., Сиголаева Л.В., Курочкин И.Н. Биосенсорный способ определения нагазы в коровьем молоке для ранней диагностики мастита коров, Материалы шестого Московского международного конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 2011, Т.1., С. 68.

12. Кондрашина А.В., Громова М.С., Сиголаева Л.В., Курочкин И.Н. Тирозиназный биосенсор для высокочувствительного определения ферментов-маркеров патологических состояний, Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», секция «Химия», подсекция «Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнология», 2011, 21230_а17а.

13. Makhaeva G., Rudakova E., Sigolaeva L., Krainova N., Gromova M., Eremenko A., Kurochkin I., Richardson R. J. Blood cholinesterases assay and detection of exposure to organophosphorus compounds (OPC) by a new screen-printed choline oxidase biosensor, Материалы международной научной конференции 14th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference, Интерлакен, Швейцария, 2011, P.72.



 
Похожие работы:

«БАУМАН ВАЛЕНТИНА ТРОФИМОВНА МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ 7,8-АННЕЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ДИГИДРО- И ТЕТРАГИДРОТЕБАИНА С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИЙ КРОСС-СОЧЕТАНИЯ (02.00.03 – органическая химия) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск - 2008 2 Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Шульц Э.Э. Официальные оппоненты : доктор химических наук,...»

«ГАБДУЛЛИНА Гульнара Тимерхановна ДИТИОФОСФОРИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ КРЕМНИЯ, ГЕРМАНИЯ, ОЛОВА И СВИНЦА НА ОСНОВЕ ТЕРПЕНОЛОВ И ДИОЛОВ 02.00.08 - химия элементоорганических соединений Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Казань - 2014 Работа выполнена в Химическом институте им. А.М. Бутлерова Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский (Приволжский) федеральный...»

«Певная Ольга Сергеевна ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРУКТУРИРОВАНИЕ В РАСТВОРАХ МАКРОМОЛЕКУЛ СЛОЖНОГО СТРОЕНИЯ Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2008 Работа выполнена на физическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : кандидат физико-математических наук Крамаренко Елена Юльевна Официальные оппоненты : доктор...»

«ТУРИЦЫНА Елена Алексеевна БИОМИМЕТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ АЛКАНОВ ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА ПРИ КАТАЛИЗЕ МОДЕЛЯМИ НЕГЕМОВЫХ ОКСИГЕНАЗ 02.00.04. – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2007 Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии Наук доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Штейнман Альберт Александрович доктор химических наук Официальные оппоненты : Лермонтов Сергей...»

«Казбанова Анастасия Валериевна ФОРМИРОВАНИЕ ДИОКСИДА ЦИРКОНИЯ, МОДИФИЦИРОВАННОГО ВОЛЬФРАМАТ-АНИОНАМИ, И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА В РЕАКЦИИ ИЗОМЕРИЗАЦИИ АЛКАНОВ С6-С7 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Красноярск 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии и химической технологии Сибирского отделения РАН и ГОУ ВПО Сибирский государственный технологический университет Научный...»

«Кутлубаев Денис Зуфарович Электронная структура углеродных нанотрубок, карбина и металлических нанопроводов с точечными дефектами замещения 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова Российской академии наук. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор,...»

«ВОРОЖЦОВ ДМИТРИЙ ЛЕОНИДОВИЧ КОМПЛЕКСЫ РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ С O,O- И N,O-ХЕЛАТНЫМИ ЛИГАНДАМИ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ЭЛЕКТРОЛЮМИНОФОРЫ 02.00.08 – химия элементоорганических соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Нижний Новгород – 2013 Работа выполнена в лаборатории полиядерных металлоорганических соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева РАН Научный...»

«ВАСИЛЬЕВ Владимир Петрович СПЕКТРАЛЬНО – ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ do МЕТАЛЛОЦЕНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ Zr и Hf в РАСТВОРАХ 02.00.04. – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН и Педагогическом институте Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат химических наук ЛУКОВА Галина Викторовна Официальные...»

«Липатов Денис Станиславович ПОЛУЧЕНИЕ СТЕКОЛ СИСТЕМЫ Er2O3-P2O5-Al2O3-SiO2 ХИМИЧЕСКИМ ОСАЖДЕНИЕМ ИЗ ГАЗОВОЙ ФАЗЫ ДЛЯ ВОЛОКОННЫХ ЛАЗЕРОВ И УСИЛИТЕЛЕЙ 02.00.01 – неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Нижний Новгород – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии высокочистых веществ РАН Научный руководитель : член-корреспондент РАН Гурьянов Алексей Николаевич Научный консультант : доктор...»

«Левченко Алексей Владимирович Процессы в низкотемпературных суперионных сенсорах H2S 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Черноголовка - 2006 Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии Наук. Научный руководитель : кандидат химических наук Добровольский Юрий Анатольевич Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Михайлова Антонина Михайловна доктор технических...»

«Валаева Валентина Николаевна Реакции сочетания арилгалогенидов, катализируемые комплексами никеля с диазабутадиеновыми лигандами Специальность 02.00.04 – Физическая химия 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 1 Работа выполнена на кафедре физической химии ФГБОУ ВПО Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) и в...»

«Варнавская Ольга Алексеевна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ НЕОДИМА (III) И ЕВРОПИЯ (III) С 2,2-ДИПИРИДИЛОМ В ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ РАЗЛИЧНОЙ ПОЛЯРНОСТИ 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2010 Работа выполнена в Алтайском государственном университете, г. Барнаул Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент Смагин Владимир Петрович Официальные оппоненты : доктор...»

«Волков Иван Леонидович СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ДНК-СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ КЛАСТЕРОВ СЕРЕБРА 02.00.06 - высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Санкт-Петербург – 2014 Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете. Научный...»

«Курочкин Николай Николаевич N-(Тозилметил)замещенные карбаматы и мочевины в синтезе азот- и кислородсодержащих гетероциклических соединений 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2011 Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н. Назарова Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор Шуталев...»

«БУРОВ Сергей Владимирович НОСИТЕЛИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИПЕПТИДОВ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Санкт-Петербург 2008 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте высокомолекулярных соединений РАН. Научный консультант : член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Евгений...»

«КАРИМОВ Дмитрий Рустамович СИНТЕЗ, СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ КОРРОЛОВ С РАЗЛИЧНЫМ ТИПОМ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ 02.00.03 – Органическая химия 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново – 2011 Работа выполнена на кафедре органической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Ивановский государственный...»

«СИМОНОВ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 3-(ИНДОЛ-1-ИЛ)МАЛЕИНИМИДОВ И ДИАЗЕПИНОВ[1,4], АННЕЛИРОВАННЫХ С МАЛЕИНИМИДНЫМ И ИНДОЛЬНЫМИ ЦИКЛАМИ 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА, 2012 Работа выполнена в лаборатории химической трансформации антибиотиков Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе...»

«КРАСИКОВА Инна Николаевна ЛИПИДЫ НЕКОТОРЫХ НАЗЕМНЫХ И МОРСКИХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ КАК ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ЭНДОТОКСИНОВ 02.00.10 — биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Владивосток 2009 Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН Официальные оппоненты : член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Васьковский Виктор...»

«БАСОВА ЕВГЕНИЯ ЮРЬЕВНА ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 02.00.02. – Аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов – 2010 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Горячева Ирина Юрьевна Официальные...»

«Мартемьянова Юлия Алексеевна КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ОДИНОЧНОЙ ЖЕСТКОЦЕПНОЙ МАКРОМОЛЕКУЛЫ В ОБЪЕМЕ И ВБЛИЗИ АДСОРБИРУЮЩЕЙ ПОВЕРХНОСТИ МЕТОДОМ МОНТЕ-КАРЛО В ОБОБЩЕННЫХ АНСАМБЛЯХ Специальность 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2008 Работа выполнена на физическом факультете Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова Научный руководитель : кандидат...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.