WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

БАРАНОВ Александр Владимирович

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СИНТЕЗА ПСЕВДОПЕПТИДОВ

И МОНОМЕРОВ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02.00.10 Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2008

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель академик РАМН, доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович кандидат химических наук Тевяшова Анна Николаевна

Ведущая организация Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится июня 2008 года в : ч. на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан мая 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А. И. Лютик

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Создание аналогов природных пептидов, содержащих в своем составе восстановленную пептидную связь (), представляет интерес с точки зрения изучения их взаимодействия с протеолитическими ферментами с целью применения данных пептидомиметиков в медицине. В связи с изучением сигнальных пептидов мозга особый интерес представляют псевдопептиды типа ProGly--Pro. Регулярное чередование пептидной и псевдопептидной связи является основой для другого важного класса аналогов биополимеров пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК).

Такая модификация природной пептидной связи позволяет получать не подверженные биодеградации структуры, подобные НК, что в сочетании с аффинностью к олигонуклеотидам определяет их перспективность в различных областях биотехнологии.

Таким образом, является актуальной проблема поиска наиболее оптимального подхода к созданию псевдопептидной связи, а также рациональных способов дериватизации псевдопептидов и синтез на их основе новых биологически активных соединений.

Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории, позволяют говорить о высоком сродстве декамеров ОЗ ПНК с регулярной структурой, построенной из тиминсодержащих мономеров на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu, к комплементарным олигонуклеотидам, и о возможности управлять степенью этого сродства посредством изменения состава буферной среды (Боярская, 2007 ). Таким образом, актуальной становится задача разработки путей синтеза новых мономеров, содержащих остатки других нуклеиновых оснований, и препаративное получение уже 1В руководстве работой принимала участие к.х.н., доц. Кириллова Ю. Г.

Список используемых сокращений: НК нуклеиновая кислота, ПНК пептиднонуклеиновая кислота, ОЗ ПНК отрицательно заряженная пептидно-нуклеиновая кистрет-бутилоксикарбонил, t Bu лота, All аллил, Boc трет-бутил, Bzl бензил, Cbz бензилоксикарбонил, DCM дихлорметан, DMF диметилформамид, DEAD диэтилазодикарбоксилат, DME диметоксиэтан, ECF этилхлорформиат, IBCF изо-бутилхлорформиат, Im имидазол, NMM N-метилморфолин, Ns орто-нитробензолсульфонил, Ph фенил, Piv пивалоил, Py пиридин, STAB триацетоксиборгидрид натрия, TEA триэтиламин, THF тетрагидрофуран, TFA трифторуксусная кислота.

синтезированных ранее мономеров для получения олигомеров ОЗ ПНК.

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии), а также в рамках РНП Развитие научного потенциала высшей школы (проект № 2.1.1.3243), госконтрактов с Роснаукой №№ 02.445.11.7355, 02.512.11.2144, 02.522.11.20011.

Цель настоящего исследования заключалась в синтезе псевдопептидов и их производных.

Основными задачами

настоящего исследования явились:

1. Оптимизация подходов к созданию псевдопептидной () связи между остатками различных по строению аминокислот и синтез псевдопептида состава ProGly--Pro.

2. Разработка и препаративный синтез новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК из псевдопептидов различного строения.

3. Подтверждение структуры тимин-, цитозин- и аденинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly-Glu.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан новый метод восстановления производных дикарбоновых -аминокислот до соответствующих -аминоспиртов, являющихся амино-, карбокси- и гидроксилсодержащими трифункциональными хиральными синтонами с ортогональными защитными группами. Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида ProGly--Pro. В ходе этого этапа работы была показана принципиальная возможность конструирования псевдопептидов, содержащих остатки пролина.

В результате проведенной работы найден и оптимизирован способ получения, впервые осуществлен синтез в препаративных количествах, а также полностью охарактеризованы два цитозинсодержащих мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu. Разработанный подход был применен к синтезу ранее полученных двух тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu и одного аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида GlyGlu. В результате работы были показаны преимущества разработанной схемы по сравнению с использовавшейся ранее для синтеза различных мономеров ОЗ ПНК.

Методами двумерной ЯМР-спектроскопии изучена региоселективность реакции алкилирования нуклеиновых оснований (цитозина, тимина и аденина) бромацилированными псевдопептидами Gly--Glu и Glu--Gly.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изучение восстановления производных дикарбоновых -аминокислот.

2. Препаративный синтез псевдопептида ProGly--Pro.

3. Препаративный синтез двух новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu.

4. Оптимизация схемы синтеза двух тимин- и одного аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly-Glu.

5. Изучение региоселективности реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами Gly--Glu и Glu--Gly тимина и защищенных цитозина и аденина методами двумерной ЯМРспектроскопии.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 3 тезисов на Всероссийских и международных конференциях. Результаты настоящего исследования были представлены на следующих научных конференциях: Научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им. М. В. Ломоносова Наукоемкие химические технологии (2007, Москва), Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (2005, Москва), Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития– 2005 (2005, Москва).

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 93 источника. Диссертация иллюстрирована 31 рисунком и содержит 8 схем и 6 таблиц.

Результаты работы и их обсуждение Восстановленная амидная связь (CH2 -NH) встречается в различных структурах, среди которых следует выделить пептидомиметики и пептидно-нуклеиновые кислоты. Первые представляют собой аналоги природных пептидов, в которых произведена структурная замена пептидной связи на -связь, используемые для изучения механизмов действия различных ферментов. Вторые являются НК-миметиками, в которых основой для мономерного звена служит дипептид с восстановленной амидной связью.

Синтез псевдопептидов Существует три основных метода создания псевдопептидной связи (CH2 NH): реакция восстановительного аминирования с участием альдегидов и аминов в присутствии мягких восстановителей (Ahmed, 1996), реакция Мицунобу между спиртами и модифицированными с помощью электроноакцепторных заместителей по NH2 -группе аминами (Mitsunobu, 1981), а также восстановление уже имеющейся амидной (пептидной) связи. В нашей лаборатории широко используют первые два метода для создания коротких псевдопептидов с целью их дальнейшей дериватизации до мономеров ОЗ ПНК и аналогов биологически активных пептидов.

Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот Восстановление защищенных -аминокислот до соответствующих аминоспиртов является ключевой стадией в синтезе многих аналогов биологически активных пептидов. Из -аминоспиртов получают важные в химическом отношении синтоны:, -диаминодикарбоновые кислоты, 3-(S)амино--бутиролактон, (S)--фторлейцин, различные -аминокислоты через -иодамины. В случае использования дикарбоновых аминокислот возможно получать амино-, карбоксил- и гидроксилсодержащие трифункциональные оптически активные синтоны, использующиеся, в частности, в синтезе мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (Боярская, 2005 ). Стандартный способ селективного восстановления -карбоксильной группы до спиртовой действием 1 М раствора борана в THF (Схема 1 ) позволяет получать такие соединения, однако невысокий выход (не более 50%), необходимость осуществления реакции при 78, токсичность и высокая стоимость используемого реагента заставили нас искать более дешевый и воспроизводимый способ синтеза -аминоспиртов 3 из производных дикарбоновых аминокислот 1.

В качестве дешевого селективного восстановителя, способного превратить карбоксильную группу в спиртовую, часто используют боргидрид натрия или лития, растворенный в воде или водно-спиртовой среде, поскольку в ходе гидролиза боргидрид-иона образуется комплекс борана с водой, аналогичный комплексу борана с молекулой THF. Однако действие NaBH в условиях реакции восстановления на N-ацилированные аминокислоты приводит к расщеплению амидной связи. Поэтому карбоксильную группу предварительно активируют, превращая ее чаще всего в смешанный ангидрид. Таким образом, одностадийная в случае восстановления комплексом борана в THF реакция превращается в двухстадийную: на первой стадии получают активированное производное защищенной аминокислоты 2, которое in situ восстанавливают раствором боргидрида натрия.

Все известные методики восстановления -карбоксильной группы в защищенных аминокислотах до спиртовой основываются на двух работах (Rubini, 1984; Kokotos, 1990 ) и являются их незначительными модификациями. Согласно этим работам, стадию образования смешанного ангидСхема –78°C рида необходимо осуществлять прибавлением к охлажденному раствору аминокислоты в DME или THF третичного основания (NMM или TEA) с последующим добавлением хлорангидрида моноэфира угольной кислоты (IBCF или ECF). Далее в большинстве случаев гидрохлорид третичного основания удаляют фильтрованием, после чего либо к раствору боргидрида натрия прибавляют раствор интермедиата, либо, наоборот, к раствору интермедиата добавляют раствор NaBH4. В ряде работ после смешивания реагентов по каплям добавляют метанол.

В ходе настоящей работы для препаративного синтеза соединения 3a из -бензилового эфира N-Boc-L-глутаминовой кислоты (1a) были опробованы различные комбинации третичных оснований (TEA и NMM) и растворителей (THF и DME) с использованием IBCF в качестве активирующего агента. Во всех случаях образовывался липкий осадок соли 4a, препятствующий перемешиванию реакционной массы. Из литературы следовало, что наибольшие выходы при восстановлении защищенных дикарбоновых аминокислот наблюдали в случае использования DME в качестве растворителя и NMM в качестве третичного основания, поэтому все дальнейшие эксперименты мы проводили с использованием именно этих веществ. Известно, что в ходе образования смешанного ангидрида необходимо поддерживать постоянный избыток IBCF по отношению к аминокислоте с целью подавления побочного процесса образования симметричного ангидрида аминокислоты. Поэтому нами было предложено изменить порядок добавления реагентов, а именно: к охлажденному раствору IBCF в THF добавлять одновременно и с одинаковой скоростью эквимолярные растворы аминокислоты и третичного основания.

В ходе исследования стадии восстановления in situ полученного интермедиата 2 мы обнаружили, что оптимальным является трехкратный избыток восстановителя. Важен также порядок прибавления: к охлажденному раствору смешанного ангидрида порциями следует добавлять раствор восстановителя. В противном случае мы наблюдали продукты деблокирования соединения 3a. В качестве среды для растворения боргидрида мы выбрали водно-метанольную систему (1 : 1), поскольку в ходе пробных экспериментов ее использование давало лучшие результаты по сравнению с водным раствором NaBH4.

Нами было установлено, что флеш-хроматография растворенного в этилацетате продукта через слой окиси алюминия освобождает его от примесей, являющихся, вероятно, органическими соединениями бора. Без этого этапа очистки соединения 3a и 3c не вступали в дальнейшие реакции конденсации по Мицунобу.

Полученные таким образом соединения 3a-c были охарактеризованы с помощью 1 H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты подтверждали данными элементного анализа, а энантиомерную чистоту проверяли по значениям удельных углов оптического вращения, которые были аналогичны описанным в литературе.

Таким образом, в ходе работы была проведена оптимизация реакции восстановления -карбоксильной группы защищенных производных дикарбоновых аминокислот 1 на следующих этапах: (1) стадии получения смешанного ангидрида с моноэфиром угольной кислоты, (2) стадии восстановления in situ этого интермедиата и (3) стадии очистки полученных -аминоспиртов от примесей, препятствующих протеканию последующей конденсации в условиях реакции Мицунобу. Следует: (1) одновременно прибавлять два раствора (NMM и защищенной аминокислоты) к охлажденному раствору IBCF; (2) к отфильтрованному от гидрохлорида N-метилморфолина и охлажденному раствору смешанного ангидрида следует в несколько приемов добавлять свежеприготовленный раствор NaBH в водно-метанольной смеси; (3) обезвоженный этилацетатный слой, содержащий продукт восстановления, следует пропускать через окись алюминия.

Синтезированные приведенным способом -аминоспирты 3a и 3c были использованы для получения защищенных псевдопептидов BocGlu(OBzl)--GlyOAll (6) и CbzGlu(-Ot Bu)-(Ns)-His(Ns)OMe (12).

Boc-L-Glu(-OBzl)--GlyOAll (6) Синтез защищенного псевдопептида Boc-L-Glu(-OBzl)--GlyOAll (6) осуществляли по разработанной ранее схеме (Боярская, 2005, Схема 2 ), используя в качестве спиртовой компоненты -аминоспирт 3a, полученный по методу, предложенному в настоящей работе. Это позволило повысить общий выход соединения 6 исходя из N-Boc--бензилового эфира L-глутаминовой кислоты (1a) примерно в два раза. Структуру всех полученных соединений подтверждали данными 1 H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа. Псевдопептид 6 использовали далее для синтеза мономеров ОЗ ПНК 30a,b.

BocGly--L-Glu(-OBzl)OAll (12) Синтез защищенного псевдопептида 12 осуществляли по известной схеме (Боярская, 2005 ). Ранее N-Boc--аллиловый, -бензиловый эфир Lглутаминовой кислоты (7) получали из соединения 1a с помощью аллилового спирта в условиях реакции Мицунобу. При этом выход соединения

DMF DCM

K2CO CH3CN 7 составлял 45%, а сама реакция протекала с образованием большого числа побочных продуктов, из-за наличия которых производное 7 выделяли при помощи колоночной хроматографии на силикагеле. Для оптимизации этой стадии нами был использован другой метод введения аллильной защитной группы в соединение 1a: вместо аллилового спирта нами был использован аллилбромид. Реакцию осуществляли в безводном DMF в присутствии Cs2 CO3. В результате полученное соединение 8 возможно было использовать в следующей стадии без дополнительной очистки, а выход на данной стадии составил 72% (Схема 3 ). Таким образом, предложенная нами модификация увеличивает общий выход псевдопептида 12 исходя из соединения 1a примерно в два раза. Структуры всех полученных соединений подтверждали данными 1 H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа.

Cbz-L-Glu(-Ot Bu)-(Ns)-L-His(Ns)OMe (15) Полностью защищенный псевдопептид 15 синтезировали с целью подтверждения возможности использования защищенных -аминоспиртов, полученных из соответствующих производных аминокислот восстановлением NaBH4, в реакциях конденсации по Мицунобу с Ns-производными аминокислот (Схема 4 ). Кислотную компоненту 14 получали из метилового

DCM HN COOMe DEAD

эфира L-гистидина (13) по стандартной методике. Спиртовую компоненту 3c получали двумя различными способами, как это было описано выше (Схема 1 ), в обоих случаях реакция конденсации по Мицунобу проходила с выходом порядка 30%. Структуры всех полученных соединений подтверждали данными 1 H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа.

Синтез защищенных псевдопептидов, содержащих остатки пролина Короткие пептиды на основе глицина и пролина (глипролины) обладают широкой физиологической активностью. Одним из способов изучения их субстратной активности является замена пептидной связи на псевдопептидную, в частности восстановленную пептидную связь (CH2 -NH). Для исследования возможности конструирования псевдопептидов на основе пролина нами было предложено синтезировать псевдопептид ProGly--Pro. В отличие от других псевдопептидов, полученных в ходе настоящей работы, для образования псевдопептидной связи между остатками глицина и пролина не подходила реакция Мицунобу, поскольку в пролине содержится вторичная аминогруппа. Поэтому нами был выбран способ восстановительного аминирования.

Синтез двух защищенных псевдопептидов ProGly--Pro, содержащих различные защитные группы (23a,b), осуществляли согласно общей схеме (Схема 5 ). В качестве исходных соединений были выбраны L-пролин и аминопропандиол (16). Защищенные производные L-пролина 19, 22a RPro 22a R = Boc 54% (25b) – BzlOH и 22b получали по стандартным методикам (Гершкович, Кибирев, 1992).

Boc-Аминопропандиол (17) окисляли периодатом калия с образованием Boc-аминоацетальдегида (18) (Kim L. et al., 1993). Реакция протекала быстро и с высоким выходом (78%). Ввиду неустойчивости соединения 18, его без дополнительной очистки сразу вводили в следующую стадию.

Реакцию восстановительного аминирования проводили в DCM при комнатной температуре с использованием STAB и TEA с выходом защищенного псевдопептида 20 75%. При удалении Boc-группы в интермедиате 20 раствором HCl в диоксане или свежеприготовленными одно- и двухмолярными растворами HCl в абсолютном метаноле наблюдали частичное осмоление продукта, поэтому стадии удаления Boc-защитных групп в соединениях 20 и 23a проводили действием 50% раствора TFA в DCM при 0, получая маслообразные трифторацетаты 21 и 24a.

Стадии конденсации псевдопептида 21 c защищенными по аминогруппе производными пролина 22a,b проводили по методу смешанных ангидридов с использованием IBCF или PivCl. В первом случае наблюдали образование ряда побочных продуктов, неразделяемых хроматографически, что приводило к низкому выходу соединений 23a,b (порядка 20%), в то время как использование PivCl приводило к бльшим выходам (порядка 50%).

С помощью ТСХ-контроля было показано, что активация BocPro (22a) и CbzPro (22b) при действии PivCl протекает довольно быстро примерно за минуту при загрузке 1 г BocPro. В случае использования соединения 22a увеличение времени активации приводило к разрушению или модификации смешанного ангидрида защищенного пролина, а также сопровождалось протеканием побочной стадии циклизации нейтрализованной соли с образованием лактама 25. Поэтому, с одной стороны, следовало избегать большого избытка третичного основания (TEA) в начальный момент времени в реакционной смеси, с другой стороны, недостаточное количество TEA приводило к неполной конверсии активированного производного пролина, что также снижало выход. Поэтому мы предложили использовать шестикратный избыток третичного основания, однако для уменьшения скорости реакции циклизации TEA добавляли порциями. Ввиду хорошей растворимости защищенных псевдопептидов 23a,b в воде, количество водно-органических обработок сводили к минимуму с целью избежания дополнительных потерь на стадии выделения.

Полностью защищенные соединения 20 и 23a,b с псевдопептидным фрагментом обладают основными свойствами из-за наличия свободной аминогруппы и третичного атома азота, что осложняет их выделение. Поэтому для хроматографической очистки этих соединений нами были подобраны системы элюентов, содержащие TEA. Удаление Boc-защитной группы в соединении 23a осуществляли действием 50% раствора TFA в DCM с количественным выходом. Структуры всех полученных соединений подтверждали данными 1 H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа.

Таким образом, в ходе данного этапа работы была показана принципиальная возможность синтеза псевдопептидов, содержащих пролин.

Синтез мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu Первоначально для синтеза цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК была опробована разработанная ранее схема получения тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК из защищенных псевдопептидов Boc-L-Glu(-OBzl)-GlyOAll (6) и BocGly(-OBzl)--L-GluOAll (12) (Боярская, 2005 ).

Однако выход менее 10% на стадии конденсации псевдопептида 12 с карбоксиметилированным производным Cbz-цитозина 28b оказался неприемлемым для дальнейшего препаративного получения мономера 33b (Схема 8 ). Другая стратегия синтеза, разработанная для получения незаряженных мономеров ПНК (Meltzer et al., 1995), предполагала N-алкилирование защищенных нуклеиновых оснований 27 бромацильными производными псевдопептидов 26 и 31. Последние, в свою очередь, получали, действуя на псевдопептиды 6 и 12 бромацетилбромидом в DCM в присутствии TEA. Выходы бромацилированных псевдопептидов 26 и 31 составили 78 и 86%, соответственно (Схемы 7, 8 ).

Способ, использовавшийся ранее для получения тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК, основан на реакции ацилирования псевдопептидов карбоксиметилированными производными нуклеиновых оснований 28a-c, полученных из соответствующих гетероциклических нуклеиновых оснований (Схема 6 ), как это было описано ранее (Nielsen, 1991 ). Ввиду невозможности селективной защиты этилового эфира (аденил-9)уксусной кислоты (37) CbzCl, защита экзоциклической аминогруппы была проведена с помощью тетрафторбората N-(бензилоксикарбонил)-N'-этилимидазолия (реагента Рапопорта), который, в отличие от бензилоксикарбонилхлорида, позволяет провести ацилирование экзоциклической аминогруппы в соединении 37 с более высоким выходом. Суммарные выходы для соединений 28a-c составляли 70, 15 и 17%, соответственно.

Путь, включающий реакцию алкилирования соединений 27a-c бромацильными производными защищенных псевдопептидов 26 и 31, требует меньшего числа стадий для модификации исходных гетероциклов. Cbzпроизводное цитозина 27b получали в одну стадию из цитозина (34) с помощью CbzCl в Py с выходом 75%, а Ade (27c) действием на аденин Thy

N O N O N O

Ade (36) CbzCl и NaH в DMF с выходом 26%. Невысокий выход реакции получения Ade (27c) был связан с образованием побочных продуктов взаCbz имодействия бензилоксикарбонилхлорида c аденином по N-9 положению.

Целевые продукты 27b,c выделяли с помощью кристаллизации. Структуру Cyt (27b) подтверждали данными элементного анализа. Структуру Ade (27c) подтверждали данными 1 H-ЯМР-спектроскопии.

Cbz Синтез полностью защищенных цитозинсодержащих мономеров 29b и лученными бромацилированными псевдопептидами 26 и 31 (Схемы 7, 8 ).

Пробные реакции проводили в DMF, используя K2 CO3 и NaH в качестве оснований, при этом выходы оказались сравнимы. На стадии конденсации Cyt (27b) с бромпроизводным псевдопептида Glu--Gly 26 мы исCbz пользовали K2 CO3, что давало продукт 29b с выходом 39% и в расчете на исходный псевдопептид 6 составляло 30%. Конденсацию Cyt (27b) с бромпроизводным псевдопептида Gly--Glu 31 осуществляли в присутствии NaH и K2 CO3 в DMF с выходами 60% и 55%, соответственно. В расчете на исходный псевдопептид 12 выход соединения 32b составил 52% при использовании NaH в качестве основания на стадии алкилирования.

Цитозинсодержащие мономеры ОЗ ПНК 30b и 33b получали удалением -аллильной защитной группы с помощью палладиевого катализатора тетракис(трифенилфосфин)палладия (0) [Pd(PPh3 )4 ]. Выход в реакциях составил 92 и 47% для соединений 30b и 33b, соответственно.

С целью проверки универсальности разработанной для получения цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК схемы мы провели синтез двух ранее полученных в нашей лаборатории тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК 30a и 33a (Схемы 7, 8 ). Стадии алкилирования бромацилированными псевдопептидами 26 и 31 тимина (27a) проводили в DMF, используя K2 CO3 и NaH в качестве оснований. Выходы в случае использования обоих оснований оказались сравнимы, поэтому полупрепаративные синтезы осуществляли в присутствии K2 CO3, чтобы избежать возможных побочных процессов в случае использования более реакционноспособного NaH. Полностью защищенные тиминсодержащие мономеры 29a и 32a были получены через стадию алкилирования тимина бромацильными производными и 31 с выходами 56 и 91%, соответственно, что в расчете на исходные псевдопептиды 6 и 12 давало суммарные выходы 43 и 78%. Для сравнения, конденсация по ранее использованной схеме, включающей реакцию ацилирования псевдопептидов 6 и 12 карбоксиметилированным производным тимина 28a, давала полностью защищенные тиминсодержащие мономеры ОЗ ПНК 29a и 32a с выходами 56 и 64%, соответственно. Тиминсодержащие мономеры ОЗ ПНК 30a и 33a получали удалением -аллильной защитной группы с помощью [Pd(PPh3 )4 ] с выходами 99 и 45%.

Разработанная в ходе настоящей работы для пиримидиновых нуклеиновых оснований схема была также опробована для получения ранее синтезированного аденинсодержащего мономера 33c на основе защищенноСхема BCH2CO2H (28a,b) IBCF DMF го псевдопептида Gly--Glu 12 (Прохоров, 2005 ), который первоначально получали реакцией ацилирования карбоксиметилированным производным Cbz-аденина (28c) псевдопептида 12 с выходом 26% (Схема 8 ). Конденсацию по альтернативной схеме, включающей алкилирование соединения 27c бромацилированным псевдопептидом 31, проводили в безводном DMF, используя в качестве оснований NaH, K2 CO3, а также K2 CO3 в присутствии Cs2 CO3. Наилучшие результаты наблюдали в третьем случае. В ходе реакции образовывался побочный продукт алкилирования по N-7 положению соединения 27c, что было подтверждено данными 1 Н-ЯМР-спектроскопии и LC-MS. Идентификация и оценка количества побочного продукта были затруднены в связи с возможностью существования различных конформационных форм продукта относительно амидной связи. Примерное соотношение продуктов алкилирования по N-9 и N-7 положениям составило 4:1.

Защищенный по -карбоксильной группе аденинсодержащий мономер 32c был выделен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (система метанол вода, 75 : 5). Полностью защищенный аденинсодержащий мономер 32c получали с выходом 41%, что в расчете на исходный BCH2CO2H псевдопептид 12 составило 35%. Удаление аллильной защитной группы в соединении 32c осуществляли с помощью [Pd(PPh3 )4 ]. Выход соединения 33c составлял 53%.

Сравнивая два метода синтеза мономеров ОЗ ПНК, можно сделать вывод о том, что в целом способ, основанный на реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами 26 и 31 нуклеиновых оснований 27a-c, дает лучшие выходы в расчете на исходные псевдопептиды 6 и 12.

Кроме того, отпадает необходимость получения карбоксиметилированных производных нуклеиновых оснований, что особенно актуально в случае модификации аденина. Следует также отметить, что бромацилированные псевдопептиды 26 и 31 удобно хранить, в отличие от соответствующих псевдопептидов 6 и 12, склонных к циклизации при хранении.

Таким образом, была подобрана и отработана оптимальная схема синтеза цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов и 12, пригодная также, на наш взгляд, для получения и других мономеров заряженных ПНК. Впервые получены и охарактеризованы два цитозинсодержащих мономера ОЗ ПНК.

ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Gly--Glu и Glu--Gly Для подтверждения структуры полностью защищенных мономеров ОЗ ПНК 29 и 32, полученных в ходе реакции алкилирования бромацильными производными 26 и 31 нуклеиновых оснований 27, данных одномерных 1 H- и C-ЯМР-спектров недостаточно. Поэтому были проведены ЯМР-эксперименты по соотнесению сигналов ядер C и 1 H в полностью защищенных мономерах ОЗ ПНК 32a-c на основе псевдопептида Gly-Glu, а также цитозинсодержащего мономера ОЗ ПНК 29b на основе псевдопептида Glu--Gly с привлечением двумерных методик 1 H/1 H-спектров COSY и C/1 H-спектров HSQC, показывающих ближние взаимодействия ядер атомов, и 13 C-1 H-спектров HMBC, основанной на дальних взаимодействиях. Спектры регистрировали1 в дейтерированном ацетоне при 303K на и 600.13 МГц для ядер H. В качестве реперных использовали сигналы ядер C входящих в состав полностью защищенных мономеров ОЗ ПНК защитных групп (Boc, Cbz, Bzl) и гетероциклических нуклеиновых оснований (Thy, Cyt, Ade).

На Рис. 1 приведены общие формулы всех синтезированных в ходе настоящей работы мономеров ОЗ ПНК и указана нумерация атомов углерода и водорода, которым соответствуют соотнесенные на фрагментах HMBCспектров сигналы в C- и 1 H-ЯМР-спектрах (Рис. 2–4).

Вследствие наложения друг на друга в спектрах 13 C и 1 H ЯМР сигналов ядер атомов одного бензольного кольца в тиминсодержащем мономере 32a и двух бензольных колец в двух цитозин- и одном аденинсодержащем мономерах ОЗ ПНК (29b и 32b,c), соотнесение сигналов внутри этих групп не осуществлялось. Суммарная интенсивность сигналов этих фенильных групп соответствовала ожидаемой (5H для тиминсодержащего мономера 32a и 10Н для цитозин- и аденинсодержащих мономеров 29b и 32b,c).

Для тимин-, цитозин- и аденинсодержащего мономеров на сигналы 1 ЯМР-спектрометрический ГНИИХТЭОС при участии Чешкова Д. А.

HN O HN O

Рис. 1: Нумерация атомов псевдопептидного фрагмента в мономерах ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu.

остатков соответствующих гетероциклов в спектрах HMBC имеются кросспики только от одной метиленовой группы, а именно СH2 -25.

Структуру цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК 29b и 32b подтверждали наличием в HMBC-ЯМР-спектрах (Рис. 2, 3) корреляций H25– C26, H25–C29 и H26–C25. Корреляция H25–C28, возможная в случае алкилирования бромацильным производным защищенного цитозина по положению N-3, на обоих спектрах отсутствует.

Структуру тиминсодержащего мономера ОЗ ПНК 32a подтверждали наличием в HMBC-ЯМР-спектре (Рис. 4a) корреляций H25–C26, H25–C и H26–C25. Корреляция H25–C29, возможная в случае алкилирования бромацильным производным тимина по положению N-3, отсутствует.

Структуру аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК 32c подтверждали наличием корреляции H25–C30 и H25–C26. Корреляция H26–C25 в HMBCЯМР-спектре (Рис. 4b) аденинсодержащего мономера (32c) есть, однако при указанной на рисунке интенсивности пиков она не видна. Корреляция H25–C27 на этом спектре не проявляется, что позволяет судить об отсутствии в образце изомерного целевому соединению продукта алкилирования мономера ОЗ ПНК (32b) на основе псевдопептида Gly--Glu.

мономера ОЗ ПНК (29b) на основе псевдопептида Glu--Gly.

18– Рис. 4: Фрагменты HMBC-спектров полностью защищенных (a) тимин- и (b) аденинсодержащих мономеров ОЗ ПНК (32a,c) на основе Выводы 1. Разработан новый метод восстановления дикарбоновых -аминокислот.

2. Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида ProGly--Pro.

3. Впервые осуществлен синтез двух цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu.

4. Проведена оптимизация схемы синтеза полученных ранее двух тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов GluGly и Gly--Glu и одного аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly--Glu.

5. Проведен анализ структуры полученных по разработанной в ходе настоящей работы схеме тимин-, цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu--Gly и Gly--Glu, а также аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly--Glu с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бромацильными производными защищенных псевдопептидов Glu-Gly и Gly--Glu.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Баранов А. В., Прохоров Д. И., Боярская Н. П., Есипова О. В., Кириллова Ю. Г. Синтез нового аналога пептида ProGlyPro. // Вестник МИТХТ. – 2006. – Т. 1, № 6. – С. 77–80.

2. Баранов А. В., Цвид Н. С., Лукьянченко В. И., Прохоров Д. И., Кириллова Ю. Г., Швец В. И. Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. // Вестник МИТХТ. – 2007. – Т. 2, № 5. – С. 28–32.

3. Боярская Н. П., Прохоров Д. И., Баранов А. В. Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. // III Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития.

Москва, 2005. – Ч. 1. – С. 142–143.

4. Баранов А. В., Льянов М. А., Лукьянченко В. И., Прохоров Д. И.

Синтез хиральных мономеров пептидно-нуклеиновых кислот. // II молодежная научно-техническая конференция Наукоемкие химические технологии. Москва. 2007. Т. 1. С. 34.

5. Баранов А. В., Кириллова Ю. Г. Синтез псевдопептидных фрагментов для получения негидролизуемых аналогов физиологически активного пептида СЕМАКС. // Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. Москва. 2005. С. 31–32.



 


Похожие работы:

«ЧАЩИН Иван Сергеевич СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ХИТОЗАНОВЫХ ПЛЕНОК И ПОКРЫТИЙ, ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ РАСТВОРИТЕЛЕЙ НА ОСНОВЕ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА ПОД ВЫСОКИМ ДАВЛЕНИЕМ Специальность 02.00.06 высокомолекулярные соединения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва– 2013 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова. Научный руководитель :...»

«Певная Ольга Сергеевна ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРУКТУРИРОВАНИЕ В РАСТВОРАХ МАКРОМОЛЕКУЛ СЛОЖНОГО СТРОЕНИЯ Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2008 Работа выполнена на физическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : кандидат физико-математических наук Крамаренко Елена Юльевна Официальные оппоненты : доктор...»

«Грицевич Андрей Валерьевич Некоторые новые эффекты структурной и пространственной неоднородности в полимерных системах Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета...»

«ВАСИЛЕВСКИЙ Сергей Витальевич СИНТЕЗ И ТРАНСФОРМАЦИИ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ИМИДАЗОЛИДИНОВЫЕ И ТИОСЕМИКАРБАЗИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ (02.00.03 - органическая химия) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2010 г. Работа выполнена в лаборатории азотсодержащих соединений Учреждения Российской академии наук Института органической химии...»

«БЕРЕЗИНА Надежда Михайловна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ ТЕТРАПИРИДИЛПОРФИНА И ИХ КОМПЛЕКСОВ С Сo(II), Cu(II) и Zn(II) 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново - 2009 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ивановский государственный химико-технологический университет. Научный руководитель : доктор...»

«Екимова Ирина Анатольевна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ОКСИДОВ И ФТОРИДОВ ЩЕЛОЧНОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ И СИСТЕМ НА ИХ ОСНОВЕ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2011 Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Томского государственного университета Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент, профессор кафедры физической и коллоидной химии Минакова Тамара Сергеевна...»

«ВЯЛОВА АННА НИКОЛАЕВНА ПОЛИЭТИЛЕН НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ И ИЗОТАКТИЧЕСКИЙ ПОЛИПРОПИЛЕН КАК МЕТАСТАБИЛЬНЫЕ МИКРОГЕТЕРОГЕННЫЕ ЖИДКОСТИ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии растворов им. Г.А. Крестова РАН (г. Иваново) Научный руководитель : Почивалов Константин Васильевич доктор химических наук, ст.н.с. Официальные...»

«СОКОЛОВА ВИКТОРИЯ ИВАНОВНА СИНТЕЗ НОВЫХ ФОСФОРСОДЕРЖАЩИХ КАЛИКСАРЕНОВ НА ОСНОВЕ -ФОСФОНИЙЗАМЕЩЕННЫХ АЦЕТАЛЕЙ И ТИОФОСФОРИЛИРОВАННЫХ БЕНЗАЛЬДЕГИДОВ 02.00.08 – Химия элементоорганических соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ – 2013 Работа выполнена в лаборатории Элементоорганического синтеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского...»

«Барри Мамаду Самба Исследование влияния смешанных водно-органических растворителей на характеристики реакции с участием палладиевых интермедиатов Специальность 02.00.04 - Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2006 г. 2 Работа выполнена на кафедре физической химии им. Я.К.Сыркина Московской государственной академии тонкой химической технологии (МИТХТ) им. М.В.Ломоносова Научный руководитель : кандидат химических...»

«Евстигнеева Мария Александровна СТРУКТУРА И СВОЙСТВА СМЕШАННЫХ ТЕЛЛУРАТОВ (АНТИМОНАТОВ) ЩЕЛОЧНЫХ И ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ Специальность 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону 2014 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Южный федеральный университет. Научный руководитель :...»

«Захаров Андрей Валерьевич КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПОВЕРХНОСТНОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПОЛИЭТИЛЕНИМИНА ДЛЯ РЕАКЦИЙ НУКЛЕОФИЛЬНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ В ЭФИРАХ КИСЛОТ ФОСФОРА 02. 00. 15 – катализ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2009 Работа выполнена на кафедре общей химической технологии ГОУ ВПО Казанский государственный технологический университет Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Харлампиди Харлампий...»

«Подколзин Иван Владимирович МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С ИНДУКТИВНО СВЯЗАННОЙ ПЛАЗМОЙ И ДИСПЕРСИОННАЯ ЖИДКОСТНО-ЖИДКОСТНАЯ МИКРОЭКСТРАКЦИЯ НЕКОТОРЫХ РЕДКИХ ЭЛЕМЕНТОВ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2013 2 Работа выполнена на кафедре химии Владимирского государственного университета имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых Научный руководитель...»

«Баранов Денис Сергеевич Изучение многоканальных реакций 1-ацетиленил-9,10-антрахинонов с гуанидином 02.00.03 – органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск - 2010 2 Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН Научный руководитель : доктор химических наук, Василевский Сергей Францевич Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Филимонов Виктор Дмитриевич кандидат химических...»

«Охлупин Юрий Сергеевич ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА И ДИФФУЗИИ КИСЛОРОДА В КОМПОЗИЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ La0.8Sr0.2Fe0.7Ni0.3O3– – Ce0.9Gd0.1O1.95 МЕТОДОМ РЕЛАКСАЦИИ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск — 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения РАН доктор химических наук Научный руководитель : старший...»

«Бейрахова Ксения Андреевна Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом специальность - 02.00.10 - биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Федерального...»

«БОБРИЦКАЯ ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА МЕЗОМОРФНЫЕ, ФИЗИЧЕСКИЕ И ОРИЕНТАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА БИНАРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ЦИАНОПРОИЗВОДНЫХ НЕМАТИЧЕСКИХ ЖИДКИХ КРИСТАЛЛОВ 02.00.04. – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Иваново – 2009 Работа выполнена на кафедре химии и технологии высокомолекулярных соединений Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ивановский государственный...»

«Астахов Александр Владимирович СИНТЕЗ 1,2,4-ТРИАЗОЛОПИРИМИДИНОВ НА ОСНОВЕ РЕАКЦИЙ 1-ЗАМЕЩЕННЫХ 3,5-ДИАМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛОВ С 1,3-БИЭЛЕКТРОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ Специальность 02.00.03 – “Органическая химия” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Южно-Российском государственном техническом университете (Новочеркасском политехническом институте) на кафедре Технология неорганических и органических...»

«Корчагина Евгения Викторовна АГРЕГАЦИЯ ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ В РАЗБАВЛЕННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения, физико-математические наук и Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов Физического факультета Московского государственного университета...»

«Кособоков Михаил Дмитриевич Функционализированные (дифторметил)триметилсилильные реагенты 02.00.03 химические наук и Д 002.222.01 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук 119991, Москва, Ленинский проспект, 47 тел. (499) 137-13-79 e-mail: sci-secr@ioc.ac.ru Предполагаемая дата защиты: 17 июня 2014 года Дата размещения полного текста диссертации на сайте Института aid.ioc.ac.ru: 8 апреля 2014 года Дата...»

«Беликов Николай Евгеньевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ НОВЫХ ФОТОХРОМНЫХ МЕТОК (02.00.10 – Биоорганическая химия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова. Научный руководитель : доктор химических наук Ходонов Андрей Александрович Официальные оппоненты :...»







 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.