WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

МОРОЗОВА ВАЛЕРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

PENICILLIUM VERRUCULOSUM И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ

ОСАХАРИВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ

02.00.15 – катализ

03.00.23 – биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2009

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын А.П.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков И.А.

доктор химических наук, профессор Попов В.О.

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, г.Пущино

Защита состоится « » апреля 2009 года в 1600 часов на заседании совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан марта 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день перед человечеством стоит проблема потенциального исчерпывания традиционного углеводородного сырья, из которого производят моторное топливо и продукты химического синтеза. Кроме того, с каждым годом увеличивается объем антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу, что приводит к изменению климата на Земле. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии, а именно к возобновляемому растительному сырью и целлюлозосодержащим отходам промышленности и сельского хозяйства. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо – этанол или бутанол.





Эффективность процесса получения сахаров зависит в значительной степени от состава целлюлолитического комплекса и взаимодействия индивидуальных ферментов в нем, стабильности целлюлаз и ингибирующего влияния на них продуктов. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma играют ведущую роль, что обусловлено их высокой секреторной способностью. Тем не менее, ферментный комплекс Trichoderma имеет недостатки, среди которых можно отметить невысокую удельную активность целлюлаз и низкое содержание -глюкозидазы. В отличие от Trichoderma, грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляющие целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты Penicillium обладают высокой удельной активностью и операционной стабильностью.

Ключевые ферменты целлюлазного комплекса – эндоглюканазы и целлобиогидролазы, способные гидролизовать главным образом высокоупорядоченные области целлюлозы. К сожалению, сведения, касающиеся пеницильных ферментов-карбогидраз, весьма противоречивы, при этом аминокислотных последовательностей, транслированных из генов P. verruculosum, практически нет в белковых базах данных. Ранее в нашей лаборатории были изучены некоторые ферменты, продуцируемые P. verruculosum. Создание новых мутантных штаммов привело к секреции новых ферментов: целлобиогидролазы 60 кДа и эндоглюканазы 70 кДа.

Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось изучение молекулярных и каталитических свойств целлобиогидролаз и эндоглюканаз, секретируемых высокопродуктивным мутантным штаммом гриба P. verruculosum В221-151, полученным в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, а также разработка подхода для создания на основе ферментов P. verruculosum смесей, способных осуществлять глубокий гидролиз растительной биомассы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Выделить все секретируемые целлюлазы P. verruculosum;

• Исследовать биохимические и каталитические свойства целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа в сравнении с ранее описанными целлобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента;

• Разработать подход для создания мультиферментных смесей на основе целлюлаз P. verruculosum для эффективного гидролиза различных целлюлозосодержащих субстратов.

Научная новизна работы. Впервые выделены целлобиогидролаза ЦБГ II 60 кДа и эндоглюканаза ЭГ I 70 кДа из P. verruculosum, исследованы их биохимические и физико-химические свойства в сравнении с остальными целлобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента. На основе анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей ЦБГ I, ЦБГ II, ЭГ II 39 кДа и -глюкозидаза 116 кДа классифицированы по их принадлежности 7-й, 6-й, 5-й и 3-й семьям гликозид-гидролаз соответственно.





Выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активном центре перечисленных выше ферментов.

Разработан подход для создания ферментных смесей для глубокого гидролиза различных лигноцеллюлозных субстратов.

Практическая значимость работы. Усовершенствована схема аналитического разделения ферментов P. verruculosum, основанная на использовании высокоэффективной белковой хроматографии среднего давления. Выделены и исследованы высокоактивные целлобиогидролаза ЦБГ II и эндоглюканаза ЭГ I P. verruculosum, способные осуществлять глубокую деструкцию лигноцеллюлозных материалов. Выявлены «ключевые»

целлюлазы P. verruculosum, ответственные за эффективный гидролиз целлюлозного сырья. Продемонстрирована принципиальная возможность создания смесей на основе ферментов из P. verruculosum для эффективного осахаривания различных видов целлюлозосодержащих отходов. Показано превосходство гидролитической эффективности искусственно составленных композиций из целлюлаз P. verruculosum не только над ферментными препаратами P. verruculosum и T. reesei, но и над искусственными смесями, составленными из наиболее активных индивидуальных целлюлаз T. reesei и Chrysosporium lucknowense. Предложены способы увеличения выхода глюкозы при осахаривании лигноцеллюлозных материалов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях “Биокатализ-2007” (Москва – Санкт-Петербург, 2007), “Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях” (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения;

литературного обзора (две главы); отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены результаты и их обсуждение; выводов; списка литературы, содержащего 183 ссылки на публикации в отечественных и зарубежных журналах, и приложения. Объем диссертации составляет 159 страниц и включает 63 рисунка и 24 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор посвящен описанию состава и структуры целлюлозосодержащих материалов, а также способам предобработки лигноцеллюлозной биомассы. Подробно рассматриваются вопросы, связанные с особенностями молекулярного строения и субстратной специфичностью целлобиогидролаз и эндоглюканаз. Особое внимание уделено обсуждению механизма действия целлюллазного комплекса и факторов, влияющих на его эффективность. Рассмотрены методы ферментативной конверсии целлюлозосодержащих материалов в этанол. Представлен современный взгляд на вопрос о возможности реализации программы по производству биоэтанола в России, а также описаны достижения и опыт других стран. В заключительной части характеризуется штамм P. verruculosum и приводится анализ ферментов, входящих в его состав Отдельная глава посвящена описанию использованных в работе методов исследования, в ней приводится также список субстратов, реактивов, ферментов и ферментных препаратов.

В последующих главах изложены результаты исследований и их обсуждение. Необходимо отметить, что на основе впервые полученных аминокислотных последовательностей целлобиогидролаз (ЦБГ I и II), эндоглюканазы II 39 кДа (ЭГ II 39 кДа) и -глюкозидазы 116 кДа (БГЛ кДа) P. verruculosum были определены их структурные домены, а также аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах перечисленных ферментов.

1. Выделение и очистка ферментов целлюлазного комплекса Ферменты целлюлазного комплекса выделяли из препарата P. verruculosum В221-151 с помощью различных видов хроматографии (ионообменной, гидрофобной), используя систему FPLC. В результате были выделены 5 эндоглюканаз – ЭГ III 25 кДа, ЭГ II 33 кДа, ЭГ II 39 кДа, ЭГ I кДа и ЭГ I 70 кДа, причем ЭГ I 70 кДа выделенна впервые; целлобиогидролазы – ЦБГ I 66 и 55 кДа, ЦБГ II 60 и 50 кДа, причем ЦБГ II 60 кДа выделена впервые; две ксилоглюканазы 25 и 70 кДа (КГ); ксиланаза 23 кДа (Ксил); -глюкозидаза 116 кДа (БГЛ). По результатам ДДСэлектрофореза (рис. 1) и изоэлектрофокусирования ферменты были гомогенными.

Все выделенные ферменты P. verruculosum были идентифицированы методом масс-спектрометрии.

Рисунок 1. ДДС-электрофорез основных очищенных ферментов P. verruculosum.

1 – ЦБГ II 60 кДа, 2 – ЦБГ II 50 кДа, 3 – ЭГ III 25 кДа, 4 – Ксил II 23 кДа, 5 – ЦБГ I 55 кДа, 6 – ЭГ II 33 кДа, 7 – ЦБГ I 66 кДа, 8 – БГЛ 116 кДа, 9 – ЭГ I 52 кДа, 10 – ЭГ I 70 кДа, 11 – КГ 70 кДа, 12 – ЭГ II 39 кДа, 13 – КГ 25 кДа.

2. Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз, эндоглюканаз и -глюкозидазы P. verruculosum и их Для идентификации и классификации ферментов P. verruculosum использовали метод MALDI-TOF масс-спектрометрии, в результате чего для выделенных белков были получены пептидные «фингерпринты» белков.

Далее в белковых базах данных (SWISS-PROT, NCBI, MSDB) был проведен поиск белков, дающих пептиды с идентичными молекулярными массами.

Масс-спектрометрическим анализом пептидных фингерпринтов установлено, что ЦБГ II 60 и 50 кДа являются изоформами одного и того же фермента, гомологичного целлобиогидролазе II Acremonium cellulolyticus Y-94. Масс-спектры трипсиновых гидролизатов белков с молекулярными массами 52 и 70 кДа были практически идентичными, что позволило утверждать – это изоформы одного и того же фермента. Для них в базах данных не удалось обнаружить аналогичных белков. Ранее в нашей лаборатории методом тандемной (TOF-TOF) масс-спектрометрии с последующим поиском в белковых базах данных с помощью программы BLAST было установлено, что белок с массой 52 кДа принадлежит 7-й семье гликозид-гидролаз, поэтому эндоглюканаза с более высокой молекулярной массой была идентифицирована как эндоглюканаза 7-й семьи гликозидгидролаз – ЭГ I 70 кДа. Подобным образом были идентифицированы все остальные выделенные ферменты.

В табл. 1 суммированы биохимические и физико-химические характеристики очищенных целлюлаз P. verruculosum. Следует отметить, что из всех целлюлаз только ЦБГ II 60 кДа, ЦБГ I 66 кДа и ЭГ I 70 кДа обладали целлюлозосвязывающим модулем (ЦСМ), в то время как у остальных ферментов такой модуль отсутствовал, т.е. они состояли только из каталитического домена. Отсутствие ЦСМ было установлено экспериментами по адсорбции ферментов на микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), а также с помощью ограниченного протеолиза выделенных целлобиогидролаз и эндоглюканаз папаином (см. раздел 3).

Таблица 1. Молекулярные характеристики целлюлаз P. verruculosum.

Фермент Молек. масса, pI Семья гликозид- Систематическое Наличие * нм и вм - низкомолекулярная и высокомолекулярная форма фермента соответственно, н/о – не определено Путем прямой трансляций с соответствующих генов были получены аминокислотные последовательности ЦБГ II и ЦБГ I, ЭГ II 39 кДа и БГЛ кДа P. verruculosum, далее мы проверяли соответствие пептидных «фингерпринтов» этим аминокислотным последовательностям с помощью программы FindPept (http://cn.expasy.org/tools/). Необходимо отметить, что молекулы белков ЦБГ I и II, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа обеднены остатками Lys и Arg. Поэтому в результате гидролиза трипсином образуются тяжелые пептиды со значениями молекулярных масс более 4000 m/z, которые не регистрируются прибором, и степень покрытия аминокислотной последовательности белков не превышает 30%. Белок принято считать надежно идентифицированным, если по данным масс-спектрометрии удается обнаружить не менее 4-5 специфических «трипсиновых» пептидов, согласующихся с аминокислотной последовательностью белка, и эти пептиды покрывают не менее 15% последовательности. Например, специфические пептиды из двух форм ЦБГ II покрывали 23,8% полной аминокислотной последовательности белка, при этом 9 пептидов (из них 7 общих для данных форм фермента с одинаковым значением m/z в диапазоне молекулярных масс 743,4-3290,3), соответствовали теоретически возможным специфическим «трипсиновым» пептидам из аминокислотной последовательности белка.

Далее в базе данных SwissProt (UniProtKB) с помощью программы BLAST2 (http://kr.expasy.org/tools/blast/) был проведен поиск белков, гомологичных изучаемым ЦБГ II и ЦБГ I, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа P. verruculosum. Гомологичные белки, найденные для каждого фермента, представлены в таблице 2. Впервые удалось установить принадлежность БГЛ 116 кДа к 3-й семье гликозид-гидролаз.

Путем сравнения (выравнивания) аминокислотных последовательностей изучаемых белков с ферментами, для которых известны их структуры, можно было выявить местоположение основных структурных доменов (модулей) в молекулах ферментов P. verruculosum. Найденные таким образом структурные модули ЦБГ II и ЦБГ I, ЭГ II 39 кДа приведены в табл. 3. Несмотря на то, что в базах данных имеется значительное количество аминокислотных последовательностей -глюкозидаз 3-й семьи гликозид-гидролаз, нет практически никакой информации об их кристаллической структуре. Поэтому структурные домены БГЛ 116 кДа выявлены не были.

Таблица 2. Результаты BLAST-анализа для целлюлаз P. verruculosum.

P. verruculosum * Для белков, помеченных звездочкой, известна их кристаллическая структура.

Таблица 3. Предполагаемые структурные домены целлюлаз P. verruculosum.

Каталитический ЦСМ всех известных грибных целлюлаз относятся к первой семье полисахарид-связывающих модулей (http://www.cazy.org/fam/CBM1.html):

ЦСМ этой семьи обычно состоят из 36 аминокислотных остатков, включая, как правило, 4 консервативных остатка цистеина, которые образуют две S-S связи. Именно такая структура у ЦСМ ЦБГ II и ЦБГ I P. verruculosum.

Пептидные линкеры ЦБГ II и ЦБГ I содержат много остатков Ser, Thr, и, вероятно, сильно О-гликозилированы. Этим можно объяснить различие теоретических и экспериментальных масс белков. Заметной гомологии линкеров ЦБГ II и ЦБГ I с соответствующими участками молекул других ЦБГ не обнаружено.

аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активном центре целлобиогидролаз 6-й и 7-й семьи и эндоглюканаз 5-й семьи, оказалось возможным определить соответствующие остатки в молекулах ЦБГ II и ЦБГ I и ЭГ II 39 кДа P. verruculosum, анализируя при этом выравненные аминокислотные последовательности белков и сравнивая трехмерные модели ферментов P. verruculosum с известными кристаллическими структурами.

Наиболее важные аминокислоты абсолютно консервативны, включая каталитическое трио Asp-Asp-Asp у ферментов 6-й семьи, Glu-Asp-Glu – 7-й семьи и диаду Glu-Glu у эндоглюканазы 5-й семьи, а также остатки триптофана, осуществляющие т. н. «стэкинг-взаимодействие» с гликозидными кольцами молекул целлюлозы внутри «туннеля» активного центра ферментов.

Следует отметить, что в результате сравнительного моделирования трехмерных структур каталитических доменов ЦБГ II и ЦБГ I было установлено, что расстояние между петлями, образующими «туннель» – характерную особенность активного центра целлобиогидролаз, в ЦБГ II больше по сравнению с ЦБГ I P. verruculosum, и они не полностью закрывают «ущелье» активного центра, по-видимому, оставляя возможность проникновения полимерной цепи глюкана в «туннель» не с конца молекулы, а напрямую (по типу действия эндоглюканаз). Такое строение активного центра ЦБГ II, вероятно, объясняет наличие КМЦазной активности у этого фермента (см. раздел 3).

3. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз P. verruculosum.

3.1. Субстратная специфичность. Для всех выделенных целлюлаз P. verruculosum была определена активность по отношению к широкому кругу субстратов (табл. 4).

Все эндоглюканазы P. verruculosum обладали высокими активностями по отношению к КМЦ и -глюкану, причем наибольшими активностями характеризовались ЭГ I 70 кДа и 52 кДа и ЭГ II 33 кДа. Значение КМЦазной активности, измеренной вискозиметрическим методом, для ЭГ II 33 кДа, ЭГ II 39 кДа и ЭГ III 25 кДа было значительно выше, чем для ЭГ I 70 кДа и 52 кДа.

Это свидетельствует о менее упорядоченном типе действия ЭГ II и ЭГ III на полимерный субстрат по сравнению с ЭГ I. ЭГ I 70 кДа и 52 кДа обладали активностью к ксилоглюкану, причем она превышала активность к -глюкану примерно в два раза. Такая особенность характерна и для ЭГ I T. reesei.

Наличие такой активности объясняется строением активного центра молекул ферментов. Наибольшее число сайтов связывания остатков глюкозы у ЭГ I 7, у ЭГ II их меньше 5. Боковые заместители (карбоксиметильные группы у КМЦ или олигосахаридные разветвления у ксилоглюкана), взаимодействуя с этими сайтами, координируют субстрат для каталитической атаки.

ЭГ II 33 кДа обладала активностью по отношению глюкуроноксилану.

Обе ЭГ II имели крайне низкую активность к МКЦ. В отличие от них, обе ЭГ I проявляли значительную (для эндоглюканаз) авицелазную активность, причем наибольшая была у ЭГ I 70 кДа. Как будет показано ниже, в структуру ЭГ I кДа входит ЦСМ, вследствие чего этот белок может специфически связываться с субстратом и совершать бльшее количество гидролитических актов из-за увеличения эффективной концентрации фермента на поверхности целлюлозы.

Эндоглюканазы 7-й семьи гликозид-гидролаз отщепляли лактозу и целлобиозу от соответствующих п-НФ-производных.

Целлобиогидролазы P. verruculosum ЦБГ I и ЦБГ II обладали высокой активностью к МКЦ, сравнимой с этой активностью для соответствующих целлобиогидролаз из T. reesei. Ферменты, содержащие ЦСМ (ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа), обладали бльшей авицелазной активностью, чем белки без ЦСМ. Активности к МКЦ у высоко- и низкомолекулярной форм ЦБГ I различались в 1,4 раза, для ЦБГ II такое различие было незначительным. В отличие от них для целлобиогидролаз T. reesei такое различие было более существенным – в 2-2,5 раза. Удельные активности целлобиогидролаз P. verruculosum по отношению к КМЦ и -глюкану, как и следовало ожидать, были небольшими (1,5-3,2 ед/мл), причем для ЦБГ II эти значения были выше, чем для ЦБГ I, что объясняется особенностями строения ферментов.

Таблица 4. Биохимические характеристики и субстратная специфичность целлюлаз P. verruculosum.

ЦБГ ЦБГ ЦБГ ЦБГ ЭГ ЭГ ЭГ ЭГ БГЛ

Семья гликозидгидролаз Систематическое Cel6 Cel6 Cel7 Cel7 Cel7 Cel7 Cel5 Cel5 Cel1 Cel Доля секретируемого белка, % Удельная активность (ед/мг) к различным субстратам, рН 5, Глубина гидролиза МКЦ, % (pH 5,0, [МКЦ]=5 г/л, 40°С, 96 ч) * G2 – целлобиоза, ** G - глюкоза Активность к синтетическим хромогенным производным целлобиозы и лактозы проявляли только целлобиогидролазы 7-й семьи гликозид-гидролаз.

Наличие или отсутствие ЦСМ не влияло заметным образом на активность.

При этом для ЦБГ I P. verruculosum значения активности к п-НФ--D-Целл и п-НФ--D-Лак были ниже, чем для ЦБГ I из T. reesei.

3.2. Кинетические параметры гидролиза КМЦ и -глюкана эндоглюканазами (Кm и Vmax) были определены из зависимотей начальных скоростй реаций (при 50°С и оптимальных значениях рН) от концентрации субстрата (табл. 5). С учетом концентрации белка в реакционной смеси и молекулярных масс ферментов из значений Vmax были рассчитаны каталитические константы (kcat). Из-за невозможности определить молекулярную массу субстрата Кm выражали в г/л.

При гидролизе КМЦ ЭГ I 70 кДа характеризовалась высоким значением kcat и низким значением Кm по сравнению с остальными ферментами. Для ЭГ II 33 кДа наблюдалось наименьшее значение Кm и достаточно высокое значение kcat. Для обеих эндоглюканаз отношение kcat/Кm было близкое.

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза КМЦ и -глюкана, катализируемого эндоглюканазами P. verruculosum.

При гидролизе -глюкана для всех эндоглюканаз значения kcat были выше, чем при гидролизе КМЦ. Значения Кm значительно отличались от соответствующих констант, характеризующих гидролиз КМЦ. Для ЭГ II кДа и 33 кДа увеличение каталитических констант не вызвало изменения отношения kcat/Кm; это говорит о том, что для гидролиза эндоглюканазами 5-й семьи гликозид-гидролаз данные субстраты не очень заметно отличаются.

Отметим, что эти эндоглюканазы слабее связывались с -глюканом, чем с КМЦ. -Глюкан состоит из остатков глюкозы, связанных между собой -1,4 и -1,3-связями в соотношении 3:1, поэтому можно утверждать, что присутствие -1,3-связей в субстрате значительно снижает связывание с ним этих эндоглюканаз.

Для ЭГ I 70 кДа и 52 кДа при гидролизе -глюкана были получены близкие значения kcat, при этом Кm для ЭГ I 70 кДа была в два раза ниже, чем для ЭГ I 52 кДа, и в семь раз ниже, чем Кm при гидролизе КМЦ. В молекуле КМЦ в среднем на каждые 10 остатков глюкозы приходится одна карбоксиметильная группа, которая, вероятно, препятствует эффективному связыванию субстрата в активном центре ЭГ I.

3.3. Адсорбционные характеристики. Способность целлюлаз к адсорбции на МКЦ зависит от наличия или отсутствия у них ЦСМ. В качестве адсорбционных характеристик изучаемых ферментов были определены степень их адсорбции на МКЦ и коэффициенты распределения (Кр) ферментов между поверхностью нерастворимого субстрата (МКЦ) и водной фазой.

Кр (л/г) рассчитывали как отношение адсорбированного и находящегося в растворе фермента на участке линейности изотермы адсорбции. Его определяли по тангенсу наклона прямой, построенной в координатах ([E]0/[E];

[S]), где [E]0 – содержание фермента (или его активность) в исходном растворе фермента, [E] – содержание фермента (или активность) в супернатанте после адсорбции, [S] – концентрация МКЦ. Чем больше Кр, тем сильнее связывание фермента с субстратом. Адсорбцию проводили в течение 15 мин при 40°С, рН 5,0, концентрацию МКЦ варьировали от 5 до 40 г/л, концентрация ферментов при этом составляла 0,2 г/л. Полученные коэффициенты распределения приведены в табл. 6.

Условия эксперимента при определении степени адсорбции белка (%) были отличными от условий определения коэффициента распределения: 4°С, рН 5,0, концентрация ферментов – 0,1 г/л (белок по Лоури), концентрация МКЦ – 25 г/л, время адсорбции – 30 мин. Степень адсорбции определяли по разнице между исходной концентрацией белка и его концентрацией после адсорбции. Степень адсорбции выражали в процентах (табл. 6).

Таблица 6. Коэффициенты распределения и степень адсорбции целлобиогидролаз и эндоглюканаз на МКЦ.

ЦБГ I ЦБГ II ЭГ I ЭГ II ЭГ II ЭГ III

Степень адсорбции, % Полученные данные свидетельствуют о том, что из всех эндоглюканаз только у ЭГ I 70 кДа, характеризовавшейся высокой адсорбционной способностью, в структуре белка имеется ЦСМ. Изучаемые целлобиогидролазы также значительно различались по адсорбционной способности: ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа в большей степени связывались с МКЦ, благодаря наличию в их структуре ЦСМ. Как и следовало ожидать, ЦБГ I 55 кДа и ЦБГ II 50 кДа более слабо сорбировались на МКЦ и состояли только из каталитического домена.

3.4. Ограниченный протеолиз ферментов папаином. В условиях ограниченного протеолиза папаином обычно гидролизуется область линкера, соединяющая каталитический и целлюлозосвязывающий домены фермента.

Ограниченный протеолиз ЦБГ I 66 кДа и ее формы с более низкой молекулярной массой приводил к уменьшению массы ЦБГ I 66 кДа, в то время как масса ЦБГ I 55 кДа оставалась неизменной (рис. 2). При этом белковая полоса, отображающая подвергшуюся протеолизу ЦБГ I 66 кДа, частично стала соответствовать полосе ЦБГ I 55 кДа. Аналогичная картина наблюдалась для ферментов ЦБГ II 60 кДа и 50 кДа и ЭГ I 70 кДа и 52 кДа.

В ходе протеолиза происходило уменьшение активности ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа по отношению к МКЦ, хотя их активности по КМЦ и п-НФ--D-Целл (для ЦБГ I 66 кДа и ЭГ I 70 кДа) не менялись, т.е.

целлюлазы, лишенные ЦСМ, сохраняют свою активность по отношению к растворимым субстратам, но обладают существенно более низкой активностью по отношению к нерастворимой целлюлозе (МКЦ). Полученные данные подтверждают, что ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа имеют двудоменную структуру.

3.5. Влияние температуры и рН на активность и стабильность целлюлаз. В табл. 7 приведены некоторые физико-химические свойства выделенных целлюлаз.

Таблица 7. Физико-химические свойства целлюлаз P. verruculosum.

ЦБГ II ЦБГ I ЦБГ I ЭГ I ЭГ I ЭГ II ЭГ II ЭГ III БГЛ

рН-оптимум рН50% Т-оптимум Т50% Остаточная рН активность 5, после 3 ч 50°С Остаточная активность после 3 ч инкубации, 60°С, рН 5, Влияние рН среды на способность целлюлаз гидролизовать специфические субстраты – МКЦ в случае целлобиогидролаз и -глюкан в случае эндоглюканаз – изучали при 40 и 50°С соответственно. Все ферменты имели рН-оптимумы активности в области рН 3,5–4,5. Для целлобиогидролаз оптимальным было значение рН 4,0, такое же было у ЭГ III 25 кДа, для ЭГ I 70 кДа и 52 кДа и ЭГ II 39 кДа – 4,5. ЭГ II 33 кДа характеризовалась более низким оптимальным значением рН – 3,5. Кроме того, она имела самый широкий диапазон значений рН, в котором сохраняла более половины от своей максимальной активности (рН50%), – от 3 до 6,3. Для БГЛ 116 кДа значение оптимального рН было самым высоким – 5,5.

Эндоглюканазы характеризовались температурным оптимумом, лежащим в области более высоких значений по сравнению с целлобиогидролазами. Температурные профили активности ЦБГ 6-й семьи и ЭГ 5-й семьи гликозид-гидролаз были сдвинуты в область более высоких температур по сравнению с таковыми для ЦБГ и ЭГ 7-й семьи соответственно.

Все целлобиогидролазы и эндоглюканазы, как и большинство грибных целлюлаз, обладали высокой стабильностью при 50°С и значении рН 5,0. При увеличении значения рН до 6,0 (50°С) эти ферменты теряли 20–40% активности. ЦБГ I 55 кДа, ЦБГ II 50 кДа и ЭГ I 52 кДа, состоящие только из каталитического домена при повышенных температурах (рН 5,0) оказались менее стабильными по сравнению с их высокомолекулярными формами. Повидимому, стабилизирующий эффект в полноразмерных формах целлюлаз оказывает гликозилированный линкер.

3.6. Выявление ключевых гидролитических ферментов. Для глубокого гидролиза целлюлозосодержащих материалов необходимо разрушить высокоупорядоченную (кристаллическую) форму целлюлозы. Для выявления ключевых ферментов, способных осуществлять деструкцию кристаллической целлюлозы с образованием растворимых сахаров, проводили гидролиз МКЦ индивидуальными целлобиогидролазами и эндоглюканазами.

Для того чтобы исключить возможное ингибирование целлобиозой, процесс осуществляли в условиях избытка гомогенной целлобиазы (-глюкозидазы) A. japonicus. На рис. 3 представлены кинетические кривые образования глюкозы из МКЦ под действием индивидуальных ферментов.

Глюкоза, г/л Рисунок 3. Кинетические кривые образования глюкозы из МКЦ (5 г/л) очищенными целлобиогидролазами и эндоглюканазами (20 мг/г субстрата) в присутствии БГЛ 120 кДа A. japonicus (0,14 мг/г субстрата) при 40°С и рН 5,0.

Среди целлобиогидролаз наибольшая глубина гидролиза наблюдалась в случае ЦБГ I 66 кДа: через 4 суток образовалось 3,6 г/л глюкозы, что соответствует 66% конверсии целлюлозы. ЦБГ II 60 кДа была менее эффективна: выход глюкозы составил 3 г/л (или 54% конверсии целлюлозы).

Целлобиогидролазы без ЦСМ (ЦБГ I 55 кДа и ЦБГ II 50 кДа) проявили относительно небольшую гидролитическую способность: через 4 суток содержание глюкозы не превышало 1,9 и 2,4 г/л соответственно (или 34% и 44% конверсии МКЦ).

Эндоглюканазы обеспечивали меньшую глубину гидролиза МКЦ, причем наибольший выход глюкозы наблюдали в случае ЭГ I 70 кДа – 1,1 г/л (или 20% глубины гидролиза). Как и следовало ожидать, остальные эндоглюканазы, не содержащие ЦСМ, менее эффективно разрушали целлюлозу: для них степень конверсии составляла 9–16%. Отметим, что при гидролизе МКЦ БГЛ 166 кДа через 4 суток содержание глюкозы в реакционной смеси составило 0,15 г/л, или 2,7% от максимально возможного.

Следовательно, ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа наряду с ЭГ I 70 кДа представляют «ключевые» ферменты для осахаривания кристаллических форм целлюлозы.

4. Создание ферментных комплексов для эффективного гидролиза Данный раздел посвящен сравнению осахаривающей способности целлюлазных комплексов, продуцируемых различными штаммами Trichoderma sp. и P. verruculosum, а также выявлению факторов, оказывающих влияние на эффективность ферментативного гидролиза. В табл. 8 приведены активности использованных ферментных препаратов.

Таблица 8. Активности ферментных препаратов, использованных для гидролиза целлюлозосодержащих материалов, по отношению к разным субстратам (ед/г препарата).

B221- F TW- Целловиридин Г20х BioACE Spezyme CP Multifect XL Novozym 188 A. niger 4.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз. Гидролиз МКЦ. На рис. 4 представлены результаты ферментативного гидролиза МКЦ (50 г/л) под действием ферментных препаратов P. verruculosum (B221-151, F10), T. reesei (TW-307, BioACE, Spezyme CP). Содержание белка целлюлазных препаратов в реакционной среде составляло 5 мг/г субстрата. Существенное влияние на эффективность ферментативного осахаривания целлюлозы оказывает -глюкозидаза, увеличивая концентрацию глюкозы в реакционной среде и уменьшая концентрацию целлобиозы, которая является сильным ингибитором целлюлолитических ферментов, особенно целлобиогидролаз. Поэтому в экспериментах лабораторные целлюлазные препараты P. verruculosum В221и T. reesei TW-307 использовались не только в индивидуальном виде, но и в смеси с -глюкозидазным препаратом P. verruculosum F10, а коммерческие BioACE и Spezyme CP – с -глюкозидазным препаратом Novozym 188 (в обоих случаях дозировка белка -глюкозидазного препарата составляла 1, мг/г субстрата).

Наиболее высокий выход восстанавливающих сахаров (ВС) при гидролизе МКЦ (72 ч) в отсутствие дополнительного количества -глюкозидазы обеспечивал препарат P. verruculosum В221-151, все препараты T. reesei обладали меньшей осахаривающей способностью. В присутствии дополнительного количества -глюкозидазы (Novozym 188 или P. verruculosum F10) происходило увеличение содержания ВС в реакционной среде в 1,7–3 раза. При этом наиболее эффективно гидролизовали МКЦ смеси лабораторных целлюлазных препаратов P. verruculosum В221-151 и T. reesei TW-307 с -глюкозидазным препаратом P. verruculosum F10. Отметим, что вклад -глюкозидазы наиболее заметен в случае препарата T. reesei TW-307, для которого скорость гидролиза на начальном этапе (3 ч) возросла в 5 раз, для остальных препаратов – в 2,1–2,5 раза. Смеси коммерческих препаратов целлюлаз в присутствии -глюкозидазы образовывали на 2–4 г/л ВС меньше, чем смеси соответствующих лабораторных препаратов.

BC, г/л Гидролиз предобработанных паровым взрывом стеблей кукурузы (ПСК) и делигнифицированных после парового взрыва стеблей кукурузы (ДСК). Нами были использованы стебли кукурузы, предобработанные паровым взрывом (ПСК), а также подвергнутые после парового взрыва дополнительной делигнификации с помощью щелочной обработки (ДСК). Мы сравнивали эффективность действия четырех целлюлазных препаратов:

коммерческих – BioACE и Spezyme CP и лабораторных – P. verruculosum B221-151 и T. reesei TW-307 (без добавления препаратов -глюкозидазы).

Через 72 ч ферментативного гидролиза как ПСК, так и ДСК наибольший выход ВС и глюкозы наблюдали в случае препарата P. verruculosum B221- (рис. 5). Из препаратов на основе T. reesei лучшей осахаривающей способностью характеризовался Spezyme CP. Реакционная способность ДСК (определенная по конечному выходу ВС) при гидролизе всеми ферментными препаратами была несколько выше, чем у ПСК, поскольку содержание лигнина в ПСК составляло 30%, в ДСК – 16%. В случае препаратов на основе T. reesei, особенно TW-307, обедненного -глюкозидазой, среди растворимых продуктов гидролиза, кроме глюкозы, наблюдали высокое содержание целлобиозы. Поэтому на следующем этапе к данным препаратам добавляли -глюкозидазу (Novozym 188 или P. verruculosum F10) в количестве 1,5 мг белка на 1 г субстрата. В результате этого выход глюкозы при действии препарата TW-307 на ДСК увеличился в 3,2 раза, на ПСК – в 3 раза, для других препаратов – в 1,6-2 раза (рис. 6). В присутствии дополнительного количества -глюкозидазы препарат P. verruculosum B221-151 был эффективнее остальных. Максимальная степень конверсии целлюлозы в ДСК составляла 57%, в ПСК – 55% (от теоретического).

г/л

ПСК ДСК

Рисунок 5. Выход глюкозы и ВС через 72 ч гидролиза ПСК и ДСК (50 г/л) под действием различных препаратов целлюлаз (белок – мг/г субстрата) при 50С и рН 5,0.

Гидролиз пергамента, свекловичного жома, пшеничных отрубей, рисовой шелухи и обессмоленных измельченных сосновых опилок. Для увеличения реакционной способности лигноцеллюлозной биомассы требуется предварительная обработка, направленная на разрушение кристаллической структуры целлюлозы и полное или частичное удаление лигнина. Отходы целлюлозно-бумажной промышленности – обрезки пергамента – это ценный источник предобработанной целлюлозы (с содержанием целлюлозы более 95%), волокна которой в результате химической обработки потеряли кристалличность и стали доступными для целлюлолитических ферментов.

механоактиваторного типа. В зависимости от способа и степени измельчения СО разделялись на четыре вида (I-IV): I – не измельченные СО, II, III – степень измельчения различной интенсивности, IV – очень тонкий порошок СО. Такой способ измельчения приводит к значительному уменьшению размера частиц субстрата и увеличению его поверхности, уменьшает степень кристалличности субстрата, а также позволяет создавать реакционные смеси с большой плотностью измельченного субстрата.

Кроме того, использовали свекловичный жом, отмытые от крахмала пшеничные отруби и рисовую шелуху. Мы провели сравнительное исследование эффективности гидролитического действия отечественного коммерческого ферментного препарата Целловиридина Г20х, полученного на основе T. reesei, и лабораторного препарата P. verruculosum B221-151 при разных дозах белка – 2, 5 и 10 мг/г субстрата. К целлюлазным препаратам добавляли дополнительное количество -глюкозидазы P. verruculosum F (содержание белка – 0,6, 1,5 и 3 мг/г субстрата соответственно).

По реакционной способности субстраты можно расположить в следующем порядке: пергамент – свекловичный жом – обессмоленные сосновые опилки IV вида – пшеничные отруби – обессмоленные сосновые опилки III вида – обессмоленные сосновые опилки II вида – рисовая шелуха – обессмоленные сосновые опилки I вида (табл. 9).

Таблица 9. Выход глюкозы и ВС через 48 ч гидролиза различных целлюлозосодержащих материалов (100 г/л) ферментными препаратами P. verruculosum B221-151 и Целловиридин Г20х в присутствии -глюкозидазы (P. verruculosum F10) при 50С и рН 5,0.

Субстрат Свекловичный Пшеничные отруби * Содержание белка целлюлазных препаратов P. verruculosum B221-151 или Целловиридин Г20х + P. verruculosum F По осахаривающей способности лабораторный препарат P. verruculosum B221-151 не уступал, а в некоторых случаях превосходил промышленный препарат Целловиридин Г20х. При гидролизе свекловичного жома, рисовой шелухи, пшеничных отрубей применение дозы белка целлюлазного препарата P. verruculosum В221-151 или Целловиридина Г20х более 5 мг/г в присутствии 1,5 мг белка -глюкозидазного препарата P. verruculosum F10 не приводило к увеличению выхода сахаров. В случае пергамента значительное увеличение выхода сахаров наблюдали при увеличении дозы целлюлазных препаратов по белку до 10 мг/г.

В целом, в большинстве случаев ферментный препарат P. verruculosum В221-151 при осахаривании целлюлозосодержащих субстратов был более эффективным, чем коммерческие ферментные препараты, полученные на основе T. reesei. После добавления -глюкозидазы к препаратам T. reesei их осахаривающая способность становилась близкой к таковой для препарата P. verruculosum В221-151.

4.2. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов гомогенными ферментами и их смесями. Выявление ключевых ферментов P. verruculosum, отвечающих за гидролиз целлюлозосодержащих материалов, является необходимым шагом для создания оптимального («идеального») ферментного комплекса, по эффективности превосходящего существующие коммерческие ферментные препараты. При создании такого комплекса необходимо учитывать особенности и свойства конкретного субстрата.

Процесс создания комплекса может быть разделен на несколько этапов.

На первом этапе проводится гидролиз определенного целлюлозосодержащего субстрата индивидуальными ферментами, в результате чего выявляются определенные наиболее важные ферменты (целлюлазы, гемицеллюлазы), необходимые для гидролиза данного субстрата. На втором этапе с учетом эффектов синергизма составляются различные смеси из выбранных индивидуальных ферментов. При оценке эффективности действия таких смесей в качестве контроля проводят гидролиз того же субстрата различными коммерческими и лабораторными препаратами.

С помощью описанного подхода нами были созданы смеси из индивидуальных ферментов P. verruculosum (для сравнения использовали смеси индивидуальных ферментов T. reesei и C. lucknowense, табл. 10) для эффективного гидролиза различных отходов сельского хозяйства, целлюлозобумажного производства и деревоперерабатывающей промышленности, которые рассматриваются как потенциальное сырье для биоконверсии сахаров в этанол, бутанол и другие полезные продукты.

Таблица 10. Индивидуальные ферменты, использованные для гидролиза целлюлозосодержащих субстратов.

P. verruculosum T. reesei C. lucknowense A. japonicus * БКС -ксилозидаза Гидролиз измельченных обессмоленных сосновых опилок. На первом этапе СО IV вида (50 г/л) гидролизовали индивидуальными целлюлазами и ксиланазой P. verruculosum (2 мг/г субстрата) и для сравнения индивидуальными ферментами T. reesei и C. lucknowense в той же дозировке (рис. 7а). Наибольший выход сахаров обеспечили ЦБГ I и ЦБГ II P. verruculosum и C. lucknowense, а также ЭГ I T. reesei и ЭГ II и ЭГ III C. lucknowense. При этом в гидролизатах целлюлозы, полученных под действием данных ферментов, содержание целлобиозы оказалось достаточно высоким (до 4045%). Поэтому мы провели осахаривание сосновых опилок гомогенными ферментами в присутствии гомогенной -глюкозидазы A. japonicus в количестве 0,14 мг/г субстрата (к Ксил II добавляли -ксилозидазу – БКС – T. reesei). В результате выход глюкозы и ВС значительно возрос (в среднем в 1,8 раза, рис. 7б).

Продукты гидролиза, г/л Продукты гидролиза, г/л Оказалось неожиданным, что некоторые эндоглюканазы (ЭГ I 70 кДа P. verruculosum, ЭГ I 57 кДа и ЭГ II 50 кДа T. reesei, ЭГ II 51 кДа и ЭГ III кДа C. lucknowense) проявляли сравнимую с целлобиогидролазами гидролитическую активность. Следует отметить, что целлобиогидролазы 7-й семьи гликозид-гидролаз обеспечивали более высокий выход сахаров по сравнению с целлобиогидролазами 6-й семьи. Отметим также, что ферменты с ЦСМ (ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа P. verruculosum) были эффективнее ферментов без ЦСМ (ЦБГ I 55 кДа, ЦБГ II 50 кДа и ЭГ I 52 кДа P. verruculosum).

На следующем этапе из наиболее эффективных индивидуальных ферментов были составлены смеси (табл. 11). В качестве контроля проводили гидролиз сосновых опилок коммерческим ферментным препаратом Целловиридин Г20х и лабораторным – P. verruculosum В221-151 (рис. 8).

Таблица 11. Состав лучших ферментных смесей, использованных для гидролиза обессмоленных сосновых опилок IV вида (50 г/л).

P. verruculosum lucknowense * БГЛ 120 кДа A. japonicus, ** БКС 80 кДа T. reesei, *** Ксил II 21 кДа T. reesei Продукты гидролиза, г/л Смеси №1.41.9 из индивидуальных целлюлаз P. verruculosum обеспечивали выход глюкозы на уровне ферментных препаратов и были сравнимы или превышали по эффективности гидролиза смеси, составленные из ферментов T. reesei (№2.12.3) и C. lucknowense (№3.13.3). Лучшие результаты показали смеси, в составе которых преобладала ЦБГ I, содержавшая ЦСМ, а также присутствовали Ксил II и БКС, ЦБГ II (с ЦСМ), ЭГ I (с ЦСМ), ЭГ II, -глюкозидаза (БГЛ) (№1.9, №2.3 и №3.2). В смеси №3. вместо ЭГ I была ЭГ III. Такие же высокие выходы глюкозы и ВС наблюдали для смеси №1.8, содержавшей ЭГ II 33 кДа с высокой собственной ксиланазной активностью, незначительно ниже – для смеси №1.5, содержавшей наибольшее количество слабо сорбирующихся ферментов в дополнение к прочно сорбирующимся.

Гидролиз предобработанных кукурузных початков (ПКП).

Используя такой же подход, как и выше в случае гидролиза СО, были созданы искусственные смеси для ферментативного гидролиза ПКП (в табл. представлены наиболее эффективные смеси P. verruculosum). В каждую смесь добавляли БКС T. reesei для полной конверсии ксилана в ксилозу, причем содержание Ксил II, БГЛ и БКС было постоянным. В качестве контроля использовали предварительно оптимизированную для гидролиза ПКП смесь коммерческих ферментных препаратов, полученных на основе T. reesei (Spezyme CP и Multifect XL).

Таблица 12. Состав ферментных смесей, использованных для гидролиза ПКП.

P.v.

T. r.

C. l.

* БКС 80 кДа T. reesei, ** Ксил II 21 кДа T. reesei, *** БГЛ 120 кДа A. japonicus Все составленные композиции индивидуальных ферментов приводили к более высокому выходу продуктов (глюкозы и ВС), чем смесь коммерческих препаратов Spezyme CP + Multifect XL (рис. 9). Смеси ферментов P. verruculosum №3 и №4 по эффективности гидролиза превосходили смеси ферментов T. reesei (№6 и №7) и были эквивалентны смесям ферментов C. lucknowense (№8 и №9). Лучшая из комбинаций ферментов P. verruculosum (смесь №3) имела «минимальный» состав: ЦБГ I 66 кДа и ЭГ I 70 кДа (оба фермента с ЦСМ) в соотношении 8:1. В отличие от P. verruculosum для смесей ферментов T. reesei и C. lucknowense увеличение числа целлюлаз разных семей в композиции приводило к более глубокому гидролизу субстрата.

Используя аналогичный подход, были составлены смеси из индивидуальных ферментов P. verruculosum для эффективного гидролиза ряда других целлюлозосодержащих субстратов. Смеси, которые приводили к наиболее глубокому гидролизу субстратов, представлены в табл. 13.

Таблица 13. Состав ферментных смесей P. verruculosum, приводивших к наиболее глубокому гидролизу различных целлюлозосодержащих субстратов.

Кукурузные стебли ЦБГ I 66 кДа + ЦБГ II 60 кДа + БГЛ 120 кДа 65 : 28 : 7 и 28 : 65 : Делигнифицированная ЦБГ I 66 кДа + ЦБГ II 60 кДа + ЭГ I 70 кДа + 50 : 25 : 10 : 10 : пшеничная солома ЭГ II 39 кДа + БГЛ 120 кДа Предобработанные ЦБГ I 66 + ЭГ I 70 + БГЛ 116 + Ксил II 21** + 63 : 8 : 5 : 21 : кукурузные початки БКС 80*** * БГЛ 120 кДа A. japonicus, ** Ксил II 21 кДа T. reesei, *** БКС 80 кДа T. reesei Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что ключевой компонент всех смесей – ЦБГ I 66 кДа; как правило, необходимо, чтобы ее содержание в ферментных смесях превышало 50%. Важными компонентами являлись ЦБГ II 50 и 60 кДа, ЭГ I 70 кДа и ЭГ II 39 кДа, а также БГЛ.

Отметим, что присутствие в реакционной среде ферментов без ЦСМ наряду с ферментами с ЦСМ способствовало усилению гидролиза. При осахаривании лигноцеллюлозных субстратов с высоким содержанием гемицеллюлозы возрастала роль ксиланаз, а также ЭГ II 33 кДа с высокой собственной ксиланазной активностью. При этом для достижения одинаково высокого выхода ВС ЭГ II 33 кДа требовалось в 1,7 раза меньше, чем ксиланаз, таким образом, использование ЭГ II 33 кДа позволяло увеличить концентрацию целлобиогидролаз в реакционной среде.

4.3. Изучение влияния различных эффекторов на гидролитическую способность целлюлаз. Влияние поверхностно-активных веществ. Мы изучили, как влияют неионогенные ПАВ Triton X-100 и Неонол на гидролиз делигнифицированной пшеничной соломы (ДПС) и ДСК промышленными препаратами и индивидуальными ферментами.

При осахаривании ДСК (50 г/л) смесями лабораторных целлюлазных препаратов P. verruculosum B221-151 и T. reesei TW-307 с -глюкозидазным P. verruculosum F10 в присутствии Неонола (2,5 г/л) наблюдалось значительное увеличение выхода глюкозы по сравнению с осахариванием без ПАВ (контроль, рис. 10).

Использование Неонола в концентрации 2,5 г/л помогло сократить дозу используемых ферментов в 1,52,5 раза. Достигнуть 100% глубины гидролиза целлюлозы, входившей в состав ДСК, удалось при концентрации белка целлюлазных препаратов 15 мг/г субстрата в присутствии 2,5 г/л Неонола.

Далее мы исследовали влияние Triton X-100 и Неонола в разных концентрациях (0,5 и 2,5 г/л) на осахаривание ДПС ключевыми ферментами P. verruculosum, T. reesei и C. lucknowense (в присутствии БГЛ A. japonicus, 0,14 мг/г субстрата). Концентрация ферментов составляла 2 мг/г субстрата.

Через 72 ч гидролиза ДПС выход глюкозы в реакционных системах в присутствии 0,5 и 2,5 г/л ПАВ увеличился по сравнению с контролем без ПАВ в среднем на 4065%. При этом Неонол и Triton X-100 способствовали возрастанию концентрации глюкозы в одинаковой степени. Наибольшее влияние оба ПАВ при концентрации 2,5 г/л оказали на процесс гидролиза ДПС индивидуальными целлюлазами T. reesei (выход глюкозы возрос в 1,8раза), меньшее – на гидролиз ферментами P. verruculosum и C. lucknowense.

Глубина гидролиза целлюлозы, % Влияние этанола. В последнее время большинство исследователей и разработчиков процесса биоконверсии растительного сырья склоняются к схеме одновременного осахаривания и сбраживания (SSF). Основное преимущество SSF метода заключается в том, что образующиеся в результате осахаривания моносахара, выступают в роли субстрата для дрожжевого брожения, и концентрация их в реакционной среде значительно снижается.

Концентрация этанола в реакционной среде при осуществлении SSF-процесса обычно не превышает нескольких процентов (3-10%). Поэтому мы изучили влияние этанола (5 и 10%) на гидролиз ДСК препаратами P. verruculosum B221-151 и T. reesei TW-307, BioACE и Spezyme CP в отсутствие и в присутствии -глюкозидазы. Концентрация белка целлюлазных и -глюкозидазных препаратов составляла 5 и 1,5 мг/г субстрата соответственно. Наименьшему негативному влиянию этанола была подвержена смесь препаратов P. verruculosum В221-151 и F10, в большей степени спирт воздействовал на промышленные и лабораторный препараты T. reesei и их смеси с -глюкозидазными препаратами (рис. 11).

В случае гидролиза ДСК (50 г/л) индивидуальными ферментами P. verruculosum, T. reesei и C. lucknowense (2 мг/г субстрата, БГЛ A. japonicus 0,14 мг/г) в присутствии в реакционной среде 5% этанола наблюдали уменьшение выхода глюкозы на 5-20%, при 10% этанола – на 14-50%.

Присутствие этанола в реакционной среде оказывало более сильное негативное воздействие на осахаривание субстрата индивидуальными целлюлазами T. reesei, значительно меньшее – на индивидуальные целлюлазы P. verruculosum и C. lucknowense. При 5% этанола в среде выход глюкозы для всех ферментов уменьшался на 11-20% по сравнению с контролем без этанола, кроме ЦБГ II 60 кДа P. verruculosum и ЦБГ Ia 65 кДа C. lucknowense.

Для них выход глюкозы снижался лишь на 5-7%. Такой же эффект наблюдали при 10% этанола в реакционной среде: выход глюкозы для целлюлаз T. reesei снизился на 50-55%, для целлюлаз P. verruculosum и C. lucknowense – на 22кроме ЦБГ II 60 кДа и ЦБГ Ia 65 кДа, для которых концентрация глюкозы уменьшилась на 14%.

Глюкоза, г/л B221-151 B221-151 TW-307 TW-307 + BioACE BioACE + Spezyme Spezyme

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены в гомогенном виде и изучены свойства внеклеточных целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа, продуцируемых грибом P. verruculosum. С помощью массспектрометрических методов осуществлена классификация этих ферментов как Cel6A и Cel7B соответственно.

2. На основе сравнения аминокислотных последовательностей выделенных ферментов P. verruculosum и известных гомологичных грибных целлюлаз, а также с использованием данных сравнительного моделирования трехмерной структуры белков, выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз I и II, а также эндоглюканазы II 39 кДа и -глюкозидазы 116 кДа.

3. Показано, что ЦБГ II 60 кДа и ЦБГ I 66 кДа P. verruculosum являются ключевыми ферментами для осахаривания целлюлозы: они обладают высокой гидролитической активностью и способны осуществлять глубокую конверсию кристаллической целлюлозы.

4. Разработан подход для формирования мультиферментных композиций, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов. Продемонстрирована принципиальная возможность создания на основе индивидуальных целлюлаз P. verruculosum мультиферментных композиций, которые превосходят по эффективности действия различные коммерческие ферментные препараты.

5. Установлено, что ключевыми компонентами ферментных смесей P. verruculosum, предназначенных для эффективного осахаривания целлюлозосодержащих субстратов, являются ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и кДа, ЭГ I 70 кДа, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа. При гидролизе субстратов с высоким содержанием гемицеллюлозы возрастает роль ЭГ II 33 кДа.

Присутствие в реакционной среде ферментов без ЦСМ наряду с ферментами, содержащими ЦСМ, способствует усилению гидролиза.

6. Показано, что при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов в присутствии в реакционной среде неионогенных поверхностно-активных веществ значительно возрастает выход глюкозы и восстанавливающих сахаров. Использование неионогенных ПАВ позволяет сократить дозу используемых ферментов в 1,52,5 раза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства грибных -глюкозидаз. Биохимия, 2009, т. 74, № 5, с. 699-709.

2. Семенова М.В., Синицына О.А., Морозова В.В., Федорова Е.А., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Соколова Л.М., Кошелев А.В., Бубнова Т.В., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Использование препарата грибной пектин-лиазы в пищевой промышленности. Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т. 42, № 6, с. 681-685.

3. Синицын А.П., Рожкова А.М., Синицына О.А., Федорова Е.А., Морозова В.В., Зоров И.Н., Семенова М.В., Саттрутдинов А.Д., Короткова О.Г., Осипов Д.А., Середа А.С., Цурикова Н.В., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Создание рекомбинантного штамма-продуцента целлобиазы (глюкозидазы) для увеличения эффективности процесса ферментативного осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. Сборник научных трудов под ред.

Полякова В.А., 2008, Москва, с. 10-13.

4. Skomarovsky A.A., Ustinov B.B., Zorov I.N., Morozova V.V., Korotkova O.G., Dzedzyulya E.I., Okunev O.N., Sinitsyn A.P. Hydrolytic potentials of cellulases from Penicillium verruculosum. Abstracts of International Conference “Biocatalysis2007: Fundamentals&Applications”, June 17-22, 2007, Moscow – St.Peterburg, Russia, p. 52-53.

5. Sinitsyna O.A., Fedorova E.A., Pravilnikov A.G., Morozova V.V., Kondratieva E.G., Okunev O.N., Vinetsky Y.P., Sinitsyn A.P. Application of the recombinantenzymes from Penicillium canescens in biotechnological processes.

Abstracts of International Conference “Biocatalysis2007:

Fundamentals&Applications”, June 17-22, 2007, Moscow – St.Peterburg, Russia, p. 54-55.

6. Koshelev A.V., Matys V.Yu., Nemashkalov V.A., Skomarovsky A.A., Ustinov B.B., Zorov I.N., Morozova V.V., Korotkova O.G., Okunev O.N., Sinitsyn A.P.

Biodegradation of paper parchment by mycelium fungi Penicillium and Trichoderma and possibility of their application for production of cellulose-lytic enzymes and bioethanol. Abstracts of International Conference “Biocatalysis2007:

Fundamentals&Applications”, June 17-22, 2007, Moscow – St.Peterburg, Russia, p. 114.



 
Похожие работы:

«ВИНОГРАДОВА Дарья Викторовна МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ТЕТРАГИДРОКАРБОЛИНОВ С МИТОХОНДРИЯМИ 02.00.10 – биоорганическая химия 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка - 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН) Научный руководитель : Шевцова Елена Феофановна кандидат химических наук,...»

«Дрожжин Олег Андреевич Новые сложные перовскитоподобные оксиды кобальта Специальность 02.00.04 - физическая химия 02.00.01 - неорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка - 2009 Работа выполнена в Институте Проблем Химической Физики РАН, на химическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научные руководители: доктор химических наук Добровольский Юрий Анатольевич, доктор...»

«Сачкова Мария Юрьевна Двудоменные токсины ядов пауков Специальность 02.00.10 – Биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2014 Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Научный руководитель : кандидат химических наук...»

«Шрагин Денис Игоревич Анионная сополимеризация,-дигидроксиолигодиметилсилоксана с органоциклосилоксанами 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2008 2 Работа выполнена на кафедре химии и технологии элементоорганических соединений Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Иванов Павел...»

«Власова Ирина Васильевна Спектрофотометрический анализ неразделенных смесей (лекарственных и витаминных препаратов) с применением хемометрических алгоритмов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук 02.00.02 аналитическая химия Томск – 2011 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Омского государственного университета им. Ф.М.Достоевского. Научный консультант доктор химических наук, профессор Вершинин Вячеслав Исаакович Официальные...»

«КАРЛИНСКИЙ ДАВИД МИХАЙЛОВИЧ ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ 02.00.10. – Биоорганическая химия 03.00.04. – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2009 1 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и лаборатории химии...»

«Глиздинская Лариса Васильевна СИНТЕЗ НЕСИММЕТРИЧНЫХ ПИРИДИНОВ ГАНЧА И ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЦИКЛИЗАЦИИ ИХ ЧЕТВЕРТИЧНЫХ СОЛЕЙ 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Омск – 2007 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Омский государственный университет им. Ф. М. Достоевского на кафедре органической химии Научные руководители: доктор химических наук,...»

«ГАДОМСКИЙ Святослав Ярославович ИЗУЧЕНИЕ ДИСПРОПОРЦИОНИРОВАНИЯ СЕМИХИНОННЫХ РАДИКАЛОВ ПО НЕСТАЦИОНАРНОЙ КИНЕТИКЕ ЦЕПНЫХ РЕАКЦИЙ ХИНОНИМИНОВ С ГИДРОХИНОНАМИ 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2010 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук Варламов Владимир Трофимович Официальные оппоненты : доктор химических наук Касаикина Ольга...»

«Пучина Гульфия Рашитовна СИНТЕЗ И ПРЕВРАЩЕНИЯ 6- И 6,8-ЗАМЕЩЕННЫХ 3-БЕНЗИЛ-3АЗАБИЦИКЛО[3.3.1]НОНАН-9-ОНОВ 02.00.03 - Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Уфа – 2007 2 Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра Российской Академии наук и Уфимской государственной академии экономики и сервиса. Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент Вафина Гузэль Фагимовна Официальные...»

«СОКОЛОВ ПЕТР СЕРГЕЕВИЧ СИНТЕЗ КУБИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ОКСИДА ЦИНКА И ТВЕРДЫХ РАСТВОРОВ НА ЕЁ ОСНОВЕ ПРИ ВЫСОКИХ ДАВЛЕНИЯХ И ТЕМПЕРАТУРАХ Специальность 02.00.21 – химия твердого тела Специальность 02.00.01 – неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2010 Работа выполнена в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии Химического факультета и на Факультете наук о материалах Московского...»

«АБУ ДАНИЭЛ ОЛУВАСЕГУН ТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ЖИДКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ В ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ДУГЕ С ПОЛУЧЕНИЕМ УГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ 02.00.13 – Нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2014 Работа выполнена на кафедре Технология нефтехимического синтеза и искусственного жидкого топлива имени А.Н. Башкирова федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский...»

«ИМБС Татьяна Игоревна ПОЛИСАХАРИДЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ НЕКОТОРЫХ МАССОВЫХ ВИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ МОРЕЙ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ. СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ВОДОРОСЛЕЙ. 02.00.10 биоорганическая химия Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Владивосток 2010 Диссертация выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток Научный руководитель : Звягинцева...»

«Галактионова Любовь Викторовна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИНТЕРМЕТАЛЛИЧЕСКИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ Ni и Al И ИХ АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИИ УГЛЕКИСЛОТНОЙ КОНВЕРСИИ МЕТАНА В СИНТЕЗ-ГАЗ 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Томский государственный университет Научный руководитель : Доктор химических наук,...»

«СЕМЕНОВ ВЯЧЕСЛАВ ЭНГЕЛЬСОВИЧ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ УРАЦИЛА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Казань – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук Научный консультант : доктор химических наук, профессор Резник...»

«Шоранова Ляна Олеговна ПОЖАРОБЕЗОПАСНЫЕ БЕЗГАЛОГЕННЫЕ КОМПОЗИТЫ ГИДРОИЗОЛЯЦИОННОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИОЛЕФИНОВ Специальность 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2014 г. Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский физикохимический институт имени Л.Я. Карпова, г. Москва. Научный руководитель : кандидат...»

«Абакаров Гасан Магомедович БЕНЗОТЕЛЛУРАЗОЛЫ И БЕНЗОТЕЛЛУРАЗИНЫ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физической и органической химии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону и Дагестанском государственном техническом университете, г. Махачкала. доктор химических наук Научный...»

«ЕЛИСЕЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ПОЛИМЕРАНАЛОГИЧНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ В ПОЛИ – N - ВИНИЛПИРРОЛИДОНЕ НАНОЧАСТИЦАМИ МЕДИ Специальности: 02.00.06 – высокомолекулярные соединения по химическим наук ам 02.00.11 – коллоидная химия и физико-химическая механика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2008 www.sp-department.ru Работа выполнена в Московском автомобильно-дорожном институте (государственном техническом университете)...»

«Чуракова Марина Васильевна СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ БЕНЗОАЗА-, БЕНЗОТИААЗАИ ДИБЕНЗОДИАЗАКРАУН-ЭФИРОВ (02.00.03 – Органическая химия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва – 2008 Работа выполнена в лаборатории синтеза и супрамолекулярной химии фотоактивных соединений Центра фотохимии Российской академии наук (ЦФ РАН, г. Москва) 2 Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Громов Сергей...»

«КОСОЛАПОВА ЛИЛИЯ СЕРГЕЕВНА СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА НОВЫХ ТИОПРОИЗВОДНЫХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ НА БАЗЕ 3-ПИРРОЛИН-2-ОНА 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2013 2 Работа выполнена на кафедре органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский (Приволжский)...»

«ЧУРИШША ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА РАДИКАЛЬИЛЯ СОПО.JПIМЕРНЗЛ ЦИЯ N-ВИНИЛКАПРОЛАКТАМА С N-ВИНИJ1АЗОЛАМИ И СВОЙСТВА ВОДНЫХ РАСТВОРОВ ПОЛИМЕРОВ Специальности:02.00.06- высокомолекулярные соединения 02.00.11 -коллоидная химия и физико-хими­ ческая механика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА, 2004 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений и кол лоидов химического факультета Воронежского...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.