WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Сильченко Артем Сергеевич

Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T

и морского моллюска Lambis sp.

02.00.10 – Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Владивосток – 2014

Работа выполне в Тихоо а ена океанском институте биоорган е нической хи имии им Г Елякова ДВО РА Г.Б. АН Нау учный кандида биологических нау доцент ат ук, рук ководител ль: Кусайки Михаил Игореви ин л ич Оф фициальны ые Имбс Ан ндрей Боррисович опп поненты: доктор б биологичесских наук, зам. дирек ктора по на ауке, зав.

лаборатторией сра авнительно биохими Институ биолог ой ии ута гии моря им А.В. Жир м. рмунского Д ДВО РАН Ильина Анна Паввловна кандидат химических наук, с старший на аучный сот трудник лаборат тории физииологическ активны биополи ки ых имеров Институт элементоорганических соед та динений им А.Н.

м.

Несмеяннова РАН Вед дущая Петербу ургский инсститут ядерной физи им. Б.П ики П.

орг ганизация я: Констант тинова, г. Санкт-Пет тербург

Защита состоится «4» и я июля 201 14 года в 10 ч часов на заседан нии дисссертационнного совет Д 005. та 05.01 при Тихоокеанском инсти Т итуте биоо органическкой хими им Г.Б. Елякова Д ии ДВО РАН п адресу: 690022, г Владиво по : г. осток, прос спект 100 л лет ovet@pibocc.dvo.ru  С диссе ертацией можно о ознакомитьься в филиале Ц Центральн ной научн ной библлиотеки ДВ РАН (г Владиво ДВО РАН).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение уникальных ферментов морских организмов, расщепляющих полисахариды бурых водорослей, характеристика их каталитических свойств и структуры – актуальная задача современной энзимологии. Объектами нашего исследования являются фукоиданазы и альгинат-лиазы морских беспозвоночных и бактерий, принимающие участие в катаболизме полианионных полисахаридов морских водорослей. Эти ферменты исследованы недостаточно, поэтому их изучение расширит наши теоретические знания о структурнофункциональных свойствах этих ферментов и позволит направленно использовать их для установления структуры природных полисахаридов.





Субстратами для исследуемых ферментов являются альгиновые кислоты (гетерополисахариды, состоящие из остатков маннуроновых и гулуроновых кислот) и фукоиданы (высокосульфатированные гомо- и гетерополисахариды). Эти полисахариды бурых водорослей относят к так называемым «поливалентным биомодуляторам», так как они обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, радиопротекторной, антиопухолевой, антивирусной, антимикробной, антикоагулянтной, гепатозащитной и другими. Все эти свойства делают возможным использование полисахаридов бурых водорослей в медицине. Однако лекарства на их основе еще не созданы. Это связано с недостатком информации о взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов водорослей и отсутствием простых и воспроизводимых методов стандартизации препаратов. Существуют трудности в установлении структуры этих биополимеров, характеризующихся большим структурным разнообразием, гетерогенностью получаемых фракций, сложным построением молекул. Для стандартизации природных полисахаридов, установления их структуры, увеличения биологической активности и снижения побочных эффектов наиболее перспективным является использование ферментов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является установление первичной структуры и характеристика каталитических свойств фукоиданаз и альгинат-лиаз морских организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать методы поиска продуцентов фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских организмов; 2) Выбрать продуценты фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских бактерий и беспозвоночных; 3) Разработать схемы выделения индивидуальных фукоиданаз и альгинат-лиаз из выбранных объектов; 4) Изучить каталитические свойства, специфичность и тип действия выделенных ферментов; 5) Установить структуры продуктов ферментативной трансформации фукоиданов и альгиновых кислот; 6) Определить аминокислотные последовательности выделенных ферментов; 7) Получить рекомбинантные аналоги исследуемых ферментов и провести их сравнительное изучение.

Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан простой метод поиска продуцентов фукоиданаз среди микроорганизмов. Впервые выделены:

внутриклеточная фукоиданаза из штамма морской бактерии Formosa algae KMM 3553T, фукоиданаза и альгинат-лиаза из печени морского моллюска Lambis sp.

Определены их основные биохимические свойства, специфичность и тип действия.

Установлены структуры основных низкомолекулярных продуктов трансформации фукоидана и полигулуроновой кислоты, полученных под действием выделенных ферментов. Установлены первичные структуры двух фукоиданаз из штамма морской бактерии F. algae KMM 3553T. Получены две рекомбинантные фукоиданазы F. algae KMM 3553T и проведено сравнительное исследование их каталитических свойств.

Показаны особенности действия новых ферментов и возможности их дальнейшего применения для исследования структур фукоиданов и альгиновых кислот. Рекомбинантные фукоиданазы могут найти свое применение в биотехнологии, для получения сульфатированных фукоолигосахаридов, которые имеют перспективы использования их в качестве биологически активных добавок и лекарственных препаратов.





Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод обнаружения фукоиданаз в бактериях применим для масштабного поиска продуцентов этих ферментов.

2. Внутриклеточная фукоиданаза (FFA), выделенная из морской бактерии F. algae KMM 3553Т, является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из Fucus evanescens.

3. Геном морской бактерии F. algae KMM 3553Т содержит два гена, кодирующих внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы.

4. Фукоиданазы FFA1 и FFA2 относятся к 107 структурному семейству О-гликозидгидролаз.

5. Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и катализируют расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

6. Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

7. Альгинат-лиаза из морского моллюска Lambis sp., является ферментом эндо-типа действия, и имеет редкую для альгинат-лиаз морских беспозвоночных специфичность: катализирует расщепление -14-гликозидных связей между поли-14--L-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11).

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на:

Первом международном симпозиуме «Marine Enzymes and Polysaccharides», Вьетнам, 2012; конференции молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», Россия, 2013 и пятом Российско-Корейском форуме «The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application», Корея 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из списка ВАК РФ и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы:

Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 213 источников.

Диссертация изложена на 141 странице и содержит 41 рисунок, 24 таблицы и 4 приложения.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю к.б.н. Кусайкину Михаилу Игоревичу за помощь в выполнении диссертационной работы. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН: проф. Т.Н. Звягинцевой, к.х.н. В.В. Сова, к.х.н.

А.М. Захаренко, к.х.н. Р.В. Меньшовой, к.х.н. М.С. Автушенко, д.х.н. С.П. Ермаковой, к.х.н. О.С. Вищук, к.х.н Н.М. Шевченко, к.х.н. Т.И. Имбс, к.б.н. Ю.В. Дубровской, д.х.н.

И.Ю. Бакуниной, н.с. М.И. Киселевой за всестороннюю поддержку и обсуждение полученных результатов в ходе выполнения работы. Автор также благодарен к.х.н.

В.В. Исакову и к.х.н. П.С. Дмитренку за получение и помощь в обработке спектральных данных; к.б.н. В.В. Куриленко и д.б.н. О.И. Недашковской за выполнение некоторых микробиологических экспериментов; к.б.н. С.Н. Ковальчук, проф. Nils Peder Willassen, Ph.D. Bjerga Gro Elin Kjreng за помощь в проведении отдельных экспериментов в области молекулярной биологии и генной инженерии.

Сокращения и условные обозначения: а.о. – аминокислотный остаток;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДСН – додецилсульфат натрия; ПААГ-электрофорез – электрофорез в полиакриламидном геле;

Р.И. - рефрактометрический индекс; ЯМР-спектроскопия – спектроскопия ядерного магнитного резонанса; Gal – галактоза; FFA1 – внеклеточная фукоиданаза из морской бактерии F. algae; FFA2 – внутриклеточная фукоиданаза из морской бактерии F. algae; FFA1-SD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA1 без С концевого домена; FFA2-SD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA без С-концевого домена; FFA1-KD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA1 без С-концевого и кадгериноподобных доменов; FFA2-KD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA2 без С-концевого и кадгериноподобных доменов;

Fucp – фукопираноза; MALDI масс-спектрометрия – масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; Xyl – ксилоза.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз Для обнаружения фукоиданаз в микроорганизмах нами был разработан простой метод определения утилизации фукоидана бактериями, растущими на агаризованной питательной среде.

Штаммы бактерий выращивали на стандартной агаризованной питательной среде с добавлением фукоидана из F. evanescens, затем удаляли клетки бактерий с поверхности агара и проводили его обработку раствором цетавлона. При взаимодействии цетавлона с фукоиданом образуется нерастворимый комплекс, который, выпадая в осадок, окрашивает агар в молочно-белый цвет. Фукоиданазная активность была обнаружена по формированию прозрачных зон (обедненных фукоиданом) в месте посева штаммов-продуцентов фукоиданаз (рис.1 А).

На основании проведенного ранее скрининга в качестве продуцентов фукоиданаз нами были выбраны штаммы бактерий F. algae KMM 3553Т (рис. 1, номер 4) и штамм МФ-2-3 (рис. 1, номер 2), в качестве контролей были использованы штаммы Coheasibacter sp. SF 2-8, Cytophaga sp. ZBS 33F и МФ 4-5, не продуцирующие фукоиданазы (рис. 1, номера 1, 3 и 5). Оптимальная концентрация фукоидана в питательной среде составляла 0,5 %.

Для скрининга и изучения свойств фукоиданаз мы использовали также электрофоретический метод. Результаты, полученные в агаре, были подтверждены присутствием продуктов гидролиза фукоидана, обнаруженных с помощью электрофореза в ПААГ. Этим методом было показано, что штаммы 2 и 4, выращенные на жидкой питательной среде с добавлением фукоидана, утилизировали его в процессе роста клеток (рис. 1 Б). Фукоиданазная активность также была обнаружена в клеточных экстрактах этих штаммов (2 и 4), что подтверждается образованием хорошо видимых на электрофореграмме полос фукоолигосахаридов – продуктов ферментативного гидролиза фукоидана (рис. 1 В).

Метод Нельсона, который регистрирует восстанавливающие сахара и используется для определения активности О-гликозидгидролаз, не выявил присутствия фукоиданазной активности в штаммах 2 и 4. По-видимому, эти фукоиданазы расщепляют фукоидан на большие фрагменты, незначительно повышая содержание восстанавливающих сахаров в реакционной смеси.

Разработанный нами экспресс-метод поиска продуцентов фукоиданаз менее трудоемкий, чем метод Нельсона и электрофоретический метод. Кроме того, возможности метода могут быть расширены. Например, использование фукоиданов различной структуры может дать предварительную информацию о субстратной специфичности фукоиданаз, продуцируемых исследуемыми штаммами.

работки 1 % водным расствором цеттавлона. Зон посева ш (Б) - ПААГ-эле (В) - ПААГ-электрофореграмма проду уктов гидрол укоиданаз морско бактери F. algae KMM По резул льтатам с скрининга среди мо орских баактерий в качестве продуцен нта фуко оиданазы нами был выбран ш штамм 3553 из колл КММ принад иден нтифициро ован как F. algae.

бакттерии F. a algae KMM 3553T, изучена динамика роста ба углееводных ко омпоненто питател инду укторами б биосинтеза фукоиданаз являлись полиса кисллота, дейст твие котор рых проявл лялось на самых ран нних этапа роста ба даль ьнейшей р работы бак ктерии вырращивали 24 ч в прис Клеточны экстрак F. algae служил источником для выд FFA. В качестве субс страта пр рименяли высокооч чищенный фукоидан из бур рой Рису унок 2 – ДС ПААГ-эле (1) – Клеточны экстракт F. algae;

(2) – фракция ббелков посл очистки экстракта на DEAE-Mac (3) – маркеры молекулярн массы белков; (4) – фуукоиданаза из F. algae Cu+2 и Zn+2 оказывало выраженное ингибирующее действие на ферментативную активность (рис. 3 Б).

Изучена кинетика гидролиза фукоидана частично очищенной фукоиданазой.

Образование сульфатированных олигосахаридов было заметным на электрофореграмме после 12 ч инкубирования реакционной смеси, максимальный выход продуктов ферментативного гидролиза фукоидана наблюдался через 48 ч Рисунок 3 – Электрофореграммы продуктов гидролиза фукоидана фукоиданазой из F. algae:

(А) – оптимум рН фукоиданазы; (Б) – Влияние ионов металлов на активность фукоиданазы, Р - реакционная смесь без добавления солей металлов, Кс – фукоидан; (В) – кинетика Показано, что длительное (более 60 мин) выдерживание раствора фермента при температуре 45 °С заметно снижало ферментативную активность FFA, полностью Рисунок 4 – Электрофореграмма продуктов фукоиданазы в качестве субстрата гидролиза фукоидана фукоиданазой из F. algae, был использован фукоидан из которая предварительно выдерживалась в течении различного времени (мин) при 45, 55 или 65 С.

сульфатированных по второму положению. Добавочный сульфат занимает в нем преимущественно из остатков сульфатированной фукозы, молярное соотношение Fuc:Gal:Xyl:OSO3- составило 1:0,03:0,01:1,2, соответственно. Для определения специфичности фукоиданазы к типу расщепляемой им связи необходимо установить изменение соотношения -13- и -14-гликозидных связей в фукоидане и продуктах его ферментативного гидролиза. Определение соотношения этих типов связи проводили методом ЯМР-спектроскопии. Высокомолекулярные (ВМФ) продукты ферментативного гидролиза отделяли от низкомолекулярных (НМФ) осаждением 75 %-ным водным этанолом. Выход НМФ составил 49 %. Моносахаридные составы НМФ, ВМФ и исходного фукоидана были практически идентичны и включали преимущественно остатки фукозы. 1H и 13C ЯМР спектры ВМФ фракции также были аналогичны спектрам исходного фукоидана. Спектры 1H ЯМР фракции НМФ имели хорошее разрешение, что позволило провести сравнение интегральных интенсивностей сигналов, соответствующих Н6 остатков фукозы. 1H ЯМР спектр фракции НМФ заметно отличался от спектров исходного фукоидана (рис. 5).

Сравнительный анализ интегральных интенсивностей сигналов в области 1,24 – 1, и 1,38 – 1,41 м.д., соответствующих Н6 13- и 14-связанных остатков фукозы, показал, что соотношение 13- и 14-связей в НМФ составило 3:1. Соотношение этих типов связей в исходном фукоидане было практически 1:1. Уменьшение содержания 14-О-гликозидных связей в продуктах гидролиза говорит об их расщеплении. Кроме того, в 1Н спектре низкомолекулярной фракции отсутствовал сигнал Н4, соответствующий остаткам 2,4 дисульфатированной фукозы, что может свидетельствовать в пользу расщепления 14-связей внутри фрагмента следующей структуры: [3--L-Fucp(2OSO3-)-14--L-Fucp(2OSO3-)-1].

Таблица 1 – Специфичность фукоиданазы из F. algae **F. dAcS - дезацетилированное и десульфатированное производное фукоидана из F. evanescens (Fuc:OSO3- = 1:0,2, моль/моль); *** - Отношение содержания сахаров в низкомолекулярных продуктах ферментативного гидролиза к содержанию сахаров в реакционной смеси. Содержание сахаров определяли фенол-сернокислотным методом Фракционирование низкомолекулярных продуктов проводили на колонке с биогелем Р-6 и последующей хроматографией на колонке с биогелем Р-2. Было получено 4 фракции, только для одной из них (фракция 2) спектры имели достаточное разрешение для надежного отнесения сигналов. Выход низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза относительно общего количества сахаров в реакционной смеси для фракций 1, 2, 3 и 4 составили 27,6, 8,3, 5,7, и 5,2 % соответственно.

Для очищенной фракции 2 были получены спектры 1Н и 13С, а также двумерные:

COSY, TOCSY, HMBC и HSQC ЯМР спектры. Анализ 1Н, 13С, COSY и HSQC ЯМР спектров фракции 2 показал наличие четырех различных остатков -L-фукопиранозы (А, Б, В и Г). ЯМР спектры, полученные методами COSY, TOCSY и HMBC, позволили соотнести сигналы всех остатков фукозы в олигосахариде. Положение сульфатных групп в остатках фукозы было определено по химическому сдвигу сигналов Н2 в слабое поле = 0,7 м.д. Это означает, что все остатки фукозы в олигосахариде сульфатированы по положению С2. В одном из остатков фукозы (В) был идентифицирован сигнал с химическим сдвигом 4,7 м.д., указывающим на замещение гидроксильных групп в остатках фукозы (В) сульфатными группами в положении С3.

Кросспик в спектрах HMBC между аномерным протоном (5,32 м.д.) остатка фукозы А и С3 (73,9 м.д.) остатка Б, а также Н1 (5,34 м.д.) остатка В и С3 (75,2 м.д.) остатка Г указывают на тот факт, что данные остатки связаны 13-О-гликозидными связями (таблица 2). Отношение интегральных интенсивностей сигналов протонов Н остатков А и В составило 1:0,5. Таким образом, можно сделать вывод о том, что фракция 2 - это смесь дисахаридов -L-Fucp(2OSO3-)-13--L-Fuc(2OSO3-) и -L-Fucp(2,3OSO3-)-13--L-Fucp(2OSO3-) в молярном соотношении 2: соответственно (рис. 6).

Рисунок 5 - 1H ЯМР спектры фукоидана и продуктов его ферментативного гидролиза фукоиданазой FFA. (А) – Спектр НМФ ферментативнго гидролиза фукоидана; (Б) - увеличенная область спектра НМФ ферментативного гидролиза фукоидана; (В) - спектр фкоидана ;

( ) - сигнал, соответствующий протонам фрагмента структуры: 3--L-Fucp(2,4OSO3-)-1;

( ) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры:

4--L-Fucp(2OSO3-)-1; ( ) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента Таблица 2 - Химические сдвиги (м.д.) в ЯМР спектрах фракции продуктов (фракция 2) ферментативного гидролиза фукоидана фукоиданазой FFA Рисунок 6 - Структуры олигосахаридов фракции 2, полученной ферментативным гидролизом 2.1 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз) Данные об аминокислотных последовательностях фукоиданаз были получены в результате секвенирования нуклеотидной последовательности генома морской бактерии F. algae, выполненного в Норвежском центре структурной биологии города Тромсё. В базах данных NCBI, UniProt, TIGRFam, Pfam, PRIAM, KEGG, COG, и InterPro был проведен поиск гомологов продуктов генов, содержащихся в геноме F. algae. Результаты поиска позволили сделать вывод о наличии в геноме F. algae двух генов, кодирующих фукоиданазы (FFA1 и FFA2). Расчетные молекулярные массы продуктов генов FFA1 и FFA2 составили 111 кДа (1008 а.о.) и 97,9 кДа ( а.о.) соответственно. Сравнение аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA посредством множественного выравнивания при помощи сервиса Clustal Omega показало 57 % их идентичности. Поиск в базе данных BLASTp (NCBI) выявил высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 с уже известной фукоиданазой FcnA из морской бактерии Mariniflexile fucanivorans (GenBank номер CAI47003.1). Идентичность аминокислотных последовательностей FcnA с FFA и FFA2 составила 67 % и 57 % соответственно.

Меньшая идентичность наблюдалась при сравнении аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 с аминокислотными последовательностями других известных фукоиданаз: из Alteromonas sp. SN-1009 (Fda1 (GenBank AAO00508.1) и Fda2 (GenBank AAO00509.1)) и из Shewanella violacea DSS (SVI_0379 (GenBank BAJ00350.1)). Гипотетическая последовательность последней была установлена при прогнозировании функции генов по гомологии нуклеотидных последовательностей (таблица 3).

Таблица 3 - Степень идентичности известных к настоящему времени аминокислотных последовательностей фукоиданаз FFA1, FFA2, FcnA, Fda1, Fda2, SVI_ Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей FFA1, FFA2 и других известных фукоиданаз (рис.7), показало наличие общих для этих ферментов консервативных участков, что позволило отнести FFA1 и FFA2 к семейству гликозидгидролаз (CAZy), в которое входят четыре фукоиданазы. В некоторых консервативных участках фукоиданаз обнаружены точечные замены аминокислотных остатков. Характер этих замен в молекулах фукоиданаз условно делит их на две группы, которые соответствуют специфичности ферментов.

Например, в одном из консервативных участков фукоиданаз были выявлены точечные замены аминокислот Ala308 и Cys310, содержащихся в молекулах FFA1, FFA2 и FcnA, на аминокислотные остатки Gly308 и Trp310 в последовательностях Fda1, Fda2 и SVI_03739 (рис. 7). Известно что, фукоиданазы FFA1, FFA2 и FcnA катализируют гидролиз -14-O-гликозидных связей, в то время как Fda1, Fda2 и, вероятно, SVI_03739 расщепляют -13-O-гликозидные связи в молекулах фукоиданов. К сожалению, накопленные на сегодняшний день немногочисленные данные о структуре и каталитических свойствах фукоиданаз не дают возможность предположить функции, выполняемые этими консервативными участками:

каталитические, субстрат-связывающие или др.

При помощи сервиса InterProScan обнаружено наличие сигнальной последовательности у FFA1 (Met1-Gln26), которая характерна для внеклеточных белков, в то время как у FFA2 такая последовательность отсутствовала.

Аминокислотные последовательности FFA1 и FFA2 имели в своем составе повторяющиеся кадгериноподобные (К) домены (рис. 8 А и Б). У фукоиданазы FFA кадгериноподобный домен K1 включал последовательность Pro428-Gly519, домен K - Asn533-Phe626, домен K3 - Trp636-Glu730. У фукоиданазы FFA2 домен K1 включал последовательность Pro408-Gly509, домен К2 - Gly522-Val616 (SUPERFAMILY номер SSF49313). Похожие повторяющиеся кадгериноподобные домены были обнаружены у FcnA. Функции кадгериноподобных белков разнообразны. Отмечено участие кадгериноподобных белков, ассоциированных с клеточной стенкой бактерий, в адгезии клеток. Стоит отметить, что общими для всех описанных в литературе функций этих доменов является связывание с тем или иным биополимером при помощи ионов кальция (кальций-зависимое связывание).

Рисунок 7 – Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей фукоиданаз из F. algae KMM3553 (FFA1, FFA2), M. fucanivorans SW5 (FcnA), Alteraminas sp.

SN-1009 (Fda1 и Fda2), Shewanella violacea DSS12 (SVI_03739); ( * ) - точечные замены а.о. в Известно, что фукоиданы и другие анионные полисахариды в водорослях содержатся именно в виде кальциевых солей. Возможно, что по этому механизму происходит связывание фукоиданазы непосредственно с субстратом или связь самих бактерий, продуцирующих фукоиданазу, с поверхностью клеток водорослей, являющихся объектом их питания. С-Концевые участки FFA1 (Leu940-Arg1007) и FFA2 (Leu822-Arg889) составляли высококонсервативный домен, включающий аминокислотных остатков. Эти участки демонстрировали высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей (от 26 % до 41 %) с С-концевыми доменами различных белков, в основном, гликозидгидролаз и протеиназ, синтезируемых бактериями типа Bacterioidetes, в частности представителями родов Porphyromonas, Cytophaga, Zobellia, Flavobacterium, Microscilla и Rhodothermus (рис. 8).

Таким образом, в аминокислотной последовательности исследуемых нами фукоиданаз (FFA1 и FFA2) присутствуют все домены, ранее найденные в структуре продуцентов.

Рисунок 8 – Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз FFA1 (А), FFA2(Б) из F. algae KMM 3553T и FcnA (В) из M. fucanivorans при помощи сервера InterProScan. K1-, K2-, K3- кадгериноподобные домены фукоиданаз, С - С-концевые домены фукоиданаз, СИ- сигнальная 2.2 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae KMM 3553T Для подтверждения прогнозируемой функции генов FFA1 и FFA2 морской бактерии F. algae были получены рекомбинантные продукты этих генов. С целью определения функции того или иного домена были получены 6 генетических конструкций по три для каждой из фукоиданаз FFA1 и FFA2. В качестве вектора использовалась плазмида pCold-Tev II (разработанная и любезно предоставленная Норвежским центром структурной биологии). Генетические конструкции содержали нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные фукоиданазы FFA и FFA2, а также их усеченные производные FFA1-SD и FFA2-SD без С-концевого домена и FFA2-KD и FFA1-KD без повторяющихся последовательностей кадгериноподобных доменов. Все конструкции содержали нуклеотидную последовательность, кодирующую полигистидиновый участок (6His) и участок для расщепления Tev-протеазой. В качестве систем экспрессии генов FFA1 и FFA2 были использованы коммерческие штаммы E. coli: BL21 star (DE3)pLysS, Rosetta-gami (DE3)pLysS, BL21 (DE3)GroEL. Практически все рекомбинантные белки:

полноразмерные фукоиданазы (FFA1, FFA2) и их усеченные производные (FFA1-SD, FFA2-SD) экспрессировались в растворимой форме. Исключение составляли усеченные производные FFA1-KD и FFA2-KD, которые экспрессировались как в виде телец включений, так и в растворимой форме. Наилучшим штаммом-продуцентом рекомбинантных фукоиданаз был штамм E. coli BL21 star (DE3)pLys. Наибольшее содержание целевых рекомбинантных белков для всех исследованных штаммов наблюдалось при температуре культивирования +20 С.

Обе полноразмерные рекомбинантные фукоиданазы и все их усеченные производные катализировали расщепление фукоидана (рис. 9 А). Фукоиданазная активность рекомбинантных ферментов, так же как и нативного, проявлялась только в присутствии некоторых ионов двухвалентных металлов. Это дает основание предположить, что фукоиданазы, синтезируемые морской бактерией F. algae, являются металлозависимыми. Наличие фукоиданазной активности у усеченных производных рекомбинантных фукоиданаз FFA1-SD и FFA2-SD указывает на то, что С-концевой домен, вероятно, не участвует в каталитическом акте. Фукоиданазы FFA1-KD и FFA2-KD также обладали способностью гидролизовать фукоидан, однако в значительно меньшей степени (рис. 9 А). Возможно, подобная модификация белков приводила к уменьшению способности связываться с молекулами субстрата.

Аналогичный результат мог быть получен за счет уменьшения устойчивости молекулы, если кадгериноподобные домены играли стабилизирующую роль. Функция, выполняемая кадгериноподобными доменами, входящими в состав структуры фукоиданаз, остается неизвестной.

Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 были очищены до гомогенного состояния. Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на ферментативную активность фукоиданаз FFA1 и FFA2 показало, что наиболее эффективными активаторами для обоих ферментов служили ионы Ca2+ и Ba2+, ионы Mg2+ активировали фукоиданазы в меньшей степени. Ионы Co2+ и Mn2+ являлись активаторами фукоиданазы FFA2, но не активировали FFA1. Ионы Zn2+ и Cu2+, в отличии от ионов Ca2+ и Ba2+, не активировали фукоиданазы (рис. 9 Б).

Оптимальными для проявления ферментативной активности фукоиданаз были рН 6,5 – 8 для FFA1, 6,5 – 9 для FFA2.

Рисунок 9 – Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана из F. evanescens рекомбинантными фукоиданазами: А – FFA1 (1), FFA2 (2), FFA1-SD (3), FFA2-SD (4), FFA1-KD (5), FFA2-KD (6); P- продукты гидролиза фукоидана фукоиданазами (1-6); Kс – смесь фукоидана и денатурированных фукоиданаз (1-6); Б – Влияние ионов двухвалентных металлов на Специфичность рекомбинантных фукоиданаз была изучена на серии фукоиданов различной структуры (рис. 10). Оба фермента с высокой скоростью гидролизовали фукоидан из F. evanescens, цепь которого построена из чередующихся -13- и -14-связанных остатков сульфатированной фукозы. Фукоиданы из S. cichorioides и Undaria pinnatifida, содержащие в своем составе -13-связанные остатки сульфатированной L-фукозы, ферментативному гидролизу не подвергались.

Рисунок 10 – Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоиданов из 5,35/73,5 м.д., H1(Б)/C4(В) при 5,29/83,8 м.д. и F. evanescens (F.e), S. cichorioides (S.c), U. pinnatifida (U.p) рекомбинантными фукоиданазами FFA1 и FFA2; Kс - фукоиданы образом, основным компонентом фракции 1 является сульфатированный линейный тетрасахарид (рис. 12, таблица 4).

Исследование кинетики накопления продуктов ферментативного гидролиза полисахарида позволяет установить тип и особенности механизма действия ферментов. Гидролиз фукоидана фукоиданазами (при данной концентрации белков) останавливался после 24 ч инкубирования. Дальнейший гидролиз субстрата проходил только при добавлении новых порций ферментов, что свидетельствует о возможном ингибировании фукоиданаз конечными продуктами ферментативной реакции или, что более вероятно, потере активности ферментов при длительном инкубировании.

Анализ кинетики расщепления фукоидана из F. evanescens рекомбинантными Рисунок 11 – Анионообменная хроматография НМФ на колонке с носителем DEAE-Sepharose только спустя 3 ч. При действии ферментов на фукоидан образуется набор сульфатированных фукоолигосахаридов, имеющих различные молекулярные массы.

Обе фукоиданазы FFA1 и FFA2 проявили свойства эндо-ферментов. Однако основные продукты гидролиза фукоидана фукоиданазами FFA1 и FFA2 имели различия в молекулярных массах. Так, время удерживания на колонке основного пика продуктов реакции FFA1 составило 36,02 мин (молекулярная масса около 5 кДа), а для FFA2 37,25 мин (молекулярная масса меньше 4 кДа). Сульфатированная фукоза в продуктах в обоих случаях обнаружена не была.

Таблица 4 – Химические сдвиги (м.д.) в ЯМР спектрах низкомолекулярных фракций продуктов (фракции 1) ферментативного гидролиза фукоидана фукоиданазой FFA А -L-Fucp(2OSO3-)-(13)- 5,35/95,0 4,47/76,6 4,11/68,8 3,89/73,2 4,51/68,0 1,25/16, Б 3)--L-Fucp(2OSO3-)-(14)- 5,29/100,6 4,60/74,7 4,18/73,5 4,12/70,0 4,41/68,6 1,26/16, В 4)--L-Fucp(2OSO3-)-(13)- 5,34/95,3 4,49/76,7 4,19/69,0 4,00/83,8 4,52/68,9 1,39/16, Г 3)--L-Fucp(2OSO3-) 5,49/91,8 4,52/74,7 4,05/73,9 4,08/69,9 4,23/67,1 1,24/16, Рисунок 12 – Структура основного олигосахарида фракции 1, полученной ферментативным гидролизом фукоидана из F. evanescens рекомбинантной фукоиданазой FFA Полученные данные свидетельствуют о том, что гидролиз фукоидана фукоиданазой FFA2 проходит с образованием более низкомолекулярных олигосахаридов, по сравнению с FFA1, что вполне согласуется с известными фактами. Считается, что некоторые внеклеточные ферменты проводят «предварительное» расщепление крупных молекул субстрата для проникновения их в клетки, а затем полученные фрагменты расщепляются на более мелкие продукты внутриклеточными ферментами.

Рисунок 13 – ВЭЖХ продуктов гидролиза, полученных при различном времени инкубирования фукоидана из F. evanescens и рекомбинантных фукоиданаз FFA1 и FFA На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и специфичны к гидролизу -14-О-гликозидных связей в молекуле фукоидана из F. evanescens. Нужно отметить, что свойства и специфичность фукоиданазы FFA2 близки свойствам нативной фукоиданазы (FFA), выделенной из клеточного экстракта F. algae.

3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp.

Фукоиданаза была выделена из печени морского брюхоногого моллюска Lambis sp. Экстракт печени моллюска содержал большое количество ферментов, катализирующих гидролиз поли- и олигосахаридов.

Схема выделения фукоиданазы из Lambis sp. включала 7 стадий очистки с применением классических методов хроматографии белков (таблица 5). Гомогенная фукоиданаза была выделена с выходом 0,75 %. По результатам ДСН-ПААГ электрофореза молекулярная масса фукоиданазы составила 50±1 кДа (рис. 14).

В качестве субстрата нами был использован фукоидан из F. evanescens. Для регистрации ферментативной активности использовали методы Нельсона и электрофореза в ПААГ.

Были изучены основные каталитические свойства фермента. Оптимальными условиями для проявления ферментативной активности фукоиданазы были рН 5 и температура 45 С, что характерно для ферментов из беспозвоночных. Время полуинактивации фермента (снижение активности на 50%) составило 20 мин при Таблица 5 – Схема выделения фукоиданазы из печени Lambis sp.

насыщения) Гидрофобная хроматография на Phenyl Sepharose 6 fast flow Гель-фильтрация на Sephacryl Ионообменная хроматография на DEAE-MacroPrep Ионообменная хроматография на CM-MacroPrep ВЭЖХ на колонке TSK gel Фукоиданаза из Lambis sp. увеличивала свою активность в присутствии ионов Ca2+ и Ba2+, ионы Мg2+ не влияли на активность фермента, а ионы Cu2+, Zn2+ и Hg2+ оказывали ингибирующее действие. Вероятно, ионы металлов не входят в активный центр фукоиданазы, поскольку добавление в раствор фермента натриевой соли ЭДТА не влияло на уровень её активности.

Кинетика накопления низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза фукоидана из F. evanescens была изучена при помощи электрофореза в ПААГ. Образование сульфатированных олигосахаридов наблюдалось на электрофореграмме спустя 30 мин инкубирования реакционной смеси, максимальный выход продуктов ферментативного гидролиза фукоидана наблюдался через 48 ч (рис. 15).

Специфичность действия фукоиданазы была изучена с использованием фукоиданов различной структуры, а также их химических производных. Было показано, что фукоиданаза расщепляла фукоиданы из F. evanescens и F. vesiculosus, содержащие -13- и -14-связанные остатки сульфатированной -L-фукопиранозы. Фукоидан, выделенный из S. cichorioides, который состоял из -13-связанных остатков сульфатированной L-фукопиранозы, не подвергался ферментативному гидролизу (рис. 16).

Рисунок 14 – ДСН ПААГ- примесей анионных полисахаридов различной структуры, электрофорез очищенной часть из которых, по-видимому, не подвергается фукоиданазы из печени ферментативному гидролизу. Для подтверждения Lambis sp. (1) - маркеры молекулярной массы (2) - фукоиданаза из осаждения высокомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (ВМФ) 75 % раствором этанола в воде, проводили при помощи ЯМР-спектроскопии.

Рисунок 15 - Кинетика гидролиза фукоидана фукоиданазой из Lambis sp.

Выход НМФ составил 73 %. Был проведен анализ 1Н-ЯМР спектров исходного фукоидана и суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (НМФ) (рис. 17).

Таблица 6 - Специфичность фукоиданазы из печени Lambis sp.

**F. dAcS - дезацетилированное и десульфатированное производное фукоидана из F. evanescens (Fuc:OSO3- = 1:0,2, моль/моль) Сравнение интегральной интенсивности сигналов при 1,24-1,32 и 1,38-1,41 м. д., соответствующих протонам при Н-6 -13- и -14-связанных остатков фукозы, показало, что соотношение -13- и -14-связей в суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза составило 2:1 (рис. 17).

Соотношение этих типов связей в исходном фукоидане было практически 1:1. Таким образом, уменьшение количества -14-связей говорит об их расщеплении, а отсутствие сульфатов в 4 положении при -13-связанных остатках фукозы в НМФ позволяет заключить, что расщепление идет внутри повторяющегося структурного фрагмента [3--L-Fucp(2OSO3-)-14--L-Fucp(2OSO3-)-1] молекулы фукоидана.

Рисунок 17 - 1H ЯМР спектры продуктов гидролиза фукоидана фукоиданазой из Lambis sp.

(А) и фукоидана (Б) 1H ЯМР спектры фукоидана и продуктов его ферментативного гидролиза фукоиданазой из Lambis sp. (А) – Спектр НМФ ферментативнго гидролиза фукоидана;

(Б) - увеличенная область спектра НМФ; (В) - спектр фкоидана; ( ) - сигнал, соответствующий протонам фрагмента структуры: 3--L-Fucp(2,4OSO3-)-1; ( ) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры: 4--L-Fucp(2OSO3-)-1; ( ) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры: 3--L-Fucp(2OSO3-)- низкомолекулярные продукты реакции (НМФ) были разделены с помощью анионообменной хроматографии (рис. 18). Выход низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза относительно общего количества сахаров в реакционной смеси для фракций 1, 2, 3, 4 и 5 составил 3,6; 4; 5,4; 13,7; 15,8 % соответственно.

Н и 13С ЯМР спектры фракций 3, 4 и 5 имели достаточное разрешение для детального изучения структуры олигосахаридов, входящих в их состав.

На спектрах COSY и TOCSY фракции 3 наблюдались два кросспика в аномерной области, что указывает на наличие двух типов остатков -фукопираноз (А и Б) в молекуле. Анализ HMBC спектров фракции 3 показал, что остатки фукозы А связаны по положению С3 с остатками Б (кросспик H1(A)/C3(Б) при 5,33/74,1 м.д.). Анализ спектров HSQC показал наличие сульфатных групп в положении С2 остатков A и Б (кросспики в слабом поле H2/C2 при 4,47/76,4 и при 4,52/74,7 м.д. соответственно).

По результатам анализа спектров ЯМР можно сделать вывод о том, что фракция 3 содержит в основном дисахарид (рис. 19). Химические сдвиги этого дисахарида представлены в таблице 7.

хроматография НМФ на колонке с носителем H1(В’’)/C4(Г’’) при 5,34/73,9 м.д H1(Д’’)/C4(Б’’) при 5,49/79,6 м.д.). Наличие кросспиков в слабом поле, соответствующих H2/C2 при 4,47/76,9 (A’’), 4,73/75,1 (Б’’), 4,47/76, (В’’) и 4,52/74,7 (Г’’) м.д. в спектрах HSQC, указывает на присутствие сульфатных групп в положении 2 этих остатков. На основании полученных данных можно предположить, что основным компонентом фракции 4 является разветвленный сульфатированный пентасахарид (рис. 19, таблица 7).

Структура фракции 5 была установлена с помощью одно- и двумерной спектроскопии ЯМР (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) (таблица 7). Она полностью совпадала со структурой фракции 1 (рис. 12), полученной при действии на фукоидан рекомбинантной фукоиданазы FFA2 из F.algae.

Таблица 7 – Химические сдвиги (м.д.) в ЯМР спектрах низкомолекулярных фракций продуктов (3, 4 и 5) ферментативного гидролиза фукоидана из F. evanescens фукоиданазой из Lambis sp.

Фракция/остаток Фракция A -L-Fucp(2OSO3-)-(13)- 5,33/95,4 4,47/76,4 4,02/68,5 3,89/73,3 4,46/68,1 1,23/16, Б 3)--L-Fucp(2OSO3-) 5,49/91,7 4,52/74,7 4,02/74,1 4,06/70,0 4,22/67,1 1,24/16, Фракция Б’’ 3,4)--L-Fucp(2OSO3 )- В’’ 4)--L-Fucp(2OSO3-)- Г’’ 3)--L-Fucp(2OSO3 ) Д ‘’ -L-Fucp-(14) Фракция А’ -L-Fucp(2OSO3-)-(13)- 5,35/95,0 4,47/76,6 4,11/68,8 3,89/73,2 4,51/68,0 1,25/16, Б’ 3)--L-Fucp(2OSO3-)В’ 4)--L-Fucp(2OSO3-)- Г’ 3)--L-Fucp(2OSO3-) 5,49/91,8 4,52/74,7 4,05/73,9 4,08/69,9 4,23/67,1 1,24/16, Рисунок 19 – Структура олигосахаридов фракций 3, 4 и 5, полученных ферментативным гидролизом фукоидана из F. evanescens фукоиданазой из Lambis sp.

Установление N-концевой аминокислотной последовательности гомогенной фукоиданазы методом Эдмана не было успешным из-за заблокированной NH2-группы N-концевой аминокислоты. Были установлены аминокислотные последовательности некоторых внутренних пептидов фукоиданазы, полученных при действии трипсина, методом MALDI масс-спектрометрии. Поскольку пептиды оказались короткими, создать специфические праймеры для поиска гена, кодирующего фукоиданазу в Lambis sp., не удалось. Работа по установлению первичной структуры фукоиданазы из Lambis sp. будет продолжена.

4 Альгинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp.

Часть наших исследований была посвящена поиску новых альгинат-лиаз из морских организмов. Экстракты из клеток морской бактерии F. algae и печени морского моллюска Lambis sp. анализировали на присутствие альгинат-лиаз. В качестве субстрата использовали полигулуроновую кислоту. Активность определяли методом Нельсона. Удельная активность альгинат-лиаз в экстракте печени Lambis sp.

была на порядок больше, чем в клеточном экстракте F. algae (0,08 ед/мг для Lambis sp. и 0,006 ед/мг для F. algae). Поэтому для детального изучения свойств альгинатлиазы в качестве источника был выбран морской моллюск Lambis sp. Из печени Lambis sp. была выделена альгинат-лиаза, гомогенная по данным ДСН ПААГэлектрофореза. Схема очистки представлена в таблице 8. Молекулярная масса выделенной альгинат-лиазы по результатам ДСН ПААГ-электрофореза составила 31±1 кДа (рис. 20).

Таблица 8 - Схема выделения альгинат-лиазы из печени Lambis sp.

ПААГ-электрофорез очищенной (рис. 21 А) и температуре 40-55 °С ферментативную активность, однако высокие концентрации солей вызывали ингибирующий эффект (рис. 21 Г). Ионы Ba2+ и Ca2+ увеличивали ферментативную активность, в то время как ионы Cu2+ и Hg2+ заметно её снижали.

Рисунок 21 – Каталитические свойства альгинат-лиазы из печени Lambis sp.: А -– рН-Оптимум альгинат-лиазы. ( ) - 0,025 М сукцинатный буфер; ( ) - 0,025 М трис-НСl буфер);

Б – Температурный оптимум альгинат-лиазы; В – Температурная стабильность альгинат-лиазы;

Г – Влияние ионов K+ ( ) и Na+ ( ) на ферментативную активность альгинат-лиазы Специфичность альгинат-лиазы устанавливали с помощью серии субстратов различной структуры. Выделенный фермент с высокой скоростью расщеплял полигулуронат натрия, в то время как альгинат натрия, выделенный из S. gurjanovae, состоящий преимущественно из остатков маннуроновой кислоты, подвергался ферментативной деградации в меньшей степени (таблица 9). Данный факт указывает на специфичность альгинат-лиазы из Lambis sp. к участкам альгиновых кислот, построенным из остатков гулуроновой кислоты, что позволяет классифицировать данный фермент как поли-14--L-гулуронат-лиазу (КФ 4.2.2.11).

Таблица 9 – Субстратная специфичность альгинат-лиазы из Lambis sp.

Специфичность и механизм действия фермента подтвердили спектры 1H ЯМР исходного полигулуроната натрия и продуктов его ферментативного расщепления (рис. 22). На спектрах продуктов наблюдается появление сигналов при 5,85 и 5, м.д., соответствующих H4 и H1 модифицированного остатка гулуроновой кислоты, имеющего двойную связь на невосстанавливающем конце олигосахаридов, что говорит о механизме расщепления полисахарида ферментом по типу -элиминирования. В спектре были идентифицированы сигналы с химическими сдвигами 5,03 и 4,88 м.д., соответствующие H1 остатков гулуроновой кислоты, которые включены в основную цепь и находятся на восстанавливающих концах молекул олигоуронатов. Следует отметить, что ферменты аналогичной специфичности были найдены в бактериях и морских водорослях. К настоящему времени известна только одна полигулуронат-лиаза, выделенная из представителя морских беспозвоночных - моллюска Haliotis rufescens.

Рисунок 22 - 1H ЯМР спектры продуктов расщепления полигулуроната натрия альгинатлиазой из печени Lambis sp. (А) и полигулуроната натрия (Б) При исследовании состава продуктов исчерпывающего ферментативного гидролиза полигулуроновой кислоты методом MALDI масс-спектрометрии обнаружили олигоурониды со степенью полимеризации n = 2-5 (рис. 23). Таким образом, проведенное исследование показало, что в печени морского моллюска Lambis sp. содержится альгинат-лиаза редкой субстратной специфичности, которая катализирует расщепление -14-гликозидных связей между остатками L-гулуроновой кислоты.

Рисунок 23 - MALDI-TOF масс-спектр продуктов гидролиза полигулуроната натрия Фермент классифицирован нами как поли-14--L-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11).

ВЫВОДЫ

1. Для обнаружения фукоиданаз в микроорганизмах разработан простой метод определения утилизации фукоидана бактериями, растущими на агаризованной питательной среде.

внутриклеточная фукоиданаза FFA с молекулярной массой 96±1 кДа. Изучены классифицирован нами как эндо-14--L-фуканаза (КФ 3.1.1.-).

3. В геноме морской бактерии F. algae определены два гена, кодирующие внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы. Биоинформационный мультидоменную организацию. Молекулярные массы вне- и внутриклеточной фукоиданаз составили 111 и 97,9 кДа соответственно. На основании полученных нами данных об аминокислотной последовательности фукоиданаз FFA1 и FFA2 оба фермента отнесены к 107 структурному семейству О-гликозидгидролаз.

4. Получены рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 и их усеченные с С-конца производные (FFA1-SD, FFA1-KD, FFA2-SD и FFA2-KD). Способность усеченных производных фукоиданаз к гидролизу фукоидана свидетельствует о том, что С-концевой домен полипептидных цепей фукоиданаз не участвует в каталитическом 5. Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 различались каталитическими свойствами: FFA2 имела более широкий диапазон оптимума рН (6,5-9), чем FFA (6,5-8); ионы Co2+ и Mn2+ активировали фукоиданазу FFA2, но не влияли на активность FFA1; молекулярные массы основных продуктов гидролиза фукоидана составляли около 5 кДа для FFA1 и меньше 4 кДа для FFA2. Показано, что FFA1 и FFA2 способны расщеплять 14-гликозидные связи между остатками -L-фукозы в эндо-14--L-фуканазы (КФ 3.1.1.-).

молекулярной массой 50±1 кДа. Охарактеризованы каталитические свойства фукоиданазы. Показано, что продуктами ферментативного гидролиза фукоидана степенью полимеризации от 2 до 5. Установлено, что фермент способен расщеплять 14-гликозидные связи между остатками -L-фукозы в фукоидане из F. evanescens.

Фермент был классифицирован как эндо-14--L-фуканаза ( КФ 3.1.1.-).

7. Из печени морского моллюска Lambis sp. выделена новая альгинат-лиаза c молекулярной массой 31±1 кДа. Определены каталитические свойства альгинатлиазы, установлена структура продуктов ферментативного гидролиза полигулуроната натрия, степень полимеризации которых составляла от 2 до 5 остатков гулуроновой кислоты. Альгинат-лиаза из Lambis sp. отнесена к поли-14--L-гулуронат-лиазам (КФ 4.2.2.11).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОН России 1. Сильченко А.С., Кусайкин М.И., Захаренко А.М., Звягинцева Т.Н. Выделение и каталитические свойства альгинат-лиазы с редкой субстратной специфичностью из морского моллюска Lambis sp. // Химия природ. соедин. – 2013. – № 2. – С. 188190.

2. Silchenko A.S., Kusaykin M.I., Kurilenko V.V., Zakharenko A.M., Isakov V.V., Zaporozhets T.S., Gazha A.K., Zvyagintseva T.N. Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium, Formosa algae // Mar. Drugs. – 2013. – Vol. 11, N 7. – P.

3. Silchenko  A.S., Kusaykin  M.I., Zakharenko  A.M., Menshova  R.V., Huynh Hoang Nhu Khanh, Dmitrenok  P.S., Isakov  V.V., Zvyagintseva  T.N. Endo-1,4-fucoidanase from Vietnamese marine mollusk Lambis sp. which producing sulphated fucooligosaccharides // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. – 2014. – Vol. 102. – P. 154160.

1. Сильченко А.С., Кусайкин М.И. Каталитические свойства фукоидан-гидролазы из морской бактерии Formosa algae // 5-й Междунар. симп. «Химия и химическое образование», Владивосток, 12–18 сент. 2011 г. : сб. науч. тр. – Владивосток : Издво Дальневост. федерал. ун-та, 2011. – С. 38–39. – ISBN 978-5-7444-2568-5.

2. Silchenko A.S., Zakharenko A.M., Kusaykin M.I. Substrate specificity and catalytic properties of the fucoidanase from Formosa algae KMM 3553 // «1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, Vietnam, 10–17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. – Nha Trang : VAST, 2012. – P. 28. – ISBN 978-5-7442-1548- 3. Silchenko A.S., Zakharenko A.M., Khanh H.H.N., Ly B.M., Kusaykin M.I. Substrate specificity and catalytic properties of the fucoidanase from Lambis sp. // «1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, Vietnam, 10–17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. – Nha Trang : VAST, 2012. – P. 70. – ISBN 978-5-7442-1548- 4. Silchenko A.S., Zakharenko A.M., Khanh H.H.N., Hang C.T. T., Kusaykin M.I. The novel alginate lyase with rare specificity from the marine mollusk Lambis sp. // «1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, Vietnam, 10–17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. – Nha Trang : VAST, 2012. – P. 73. – ISBN 978-5-7442-1548-4.

5. Сильченко А.С., Захаренко А.М., Кусайкин М.И. Некоторые каталитические свойства рекомбинантных фукоиданаз из морской бактерии Formosa algae [Электронный ресурс] // Всероссийская молодежная конференция «Взгляд в будущее», Владивосток, 7–14 нояб. 2013 г.: сб. работ. – Владивосток, 2013. – С. 26–27.

Kusaykin M.I., Ermakova S.P., Zakharenko A.M., Silchenko A.S., Zvyagintseva T.N.

Marine polysaccharides with multiple activities // TU-SBRAS-FEBRAS-ISTC Seminar – Indigenous flora and marine fauna of Russia with health promoting ingredients, Sendai, Japan, 7 Nov. 2013 : progr. and abstr. – Sendai, 2013. – P. 10.

6. Silchenko A., Kusaykin M., Zakharenko A. Cloning and expression of fucoidanases from the marine bacterium Formosa algae KMM 3553 // 2nd International symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, Sept. 4-9, 2013 : progr. and abstrs. Vladivostok, 2013. – P.

90. – ISBN 978-5-8044-1400-0.

7. Zakharenko A.M., Kusaykin M. I., Silchenko A.S., Sova V.V., Zvyagintseva T.N.

Carbohydrate metabolism enzymes of marine organisms as a tools for production of new food supplements // The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application, Gangneung, Republic Korea, Oct. 25, 2013. – Gangneung, 2013. – P. 7989.



 
Похожие работы:

«Сидорова Ольга Вениаминовна ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО OMPF ПОРИНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ 02.00.10 – биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Владивосток – 2011 -2Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН), г. Владивосток. Научные руководители: Новикова...»

«Шоранова Ляна Олеговна ПОЖАРОБЕЗОПАСНЫЕ БЕЗГАЛОГЕННЫЕ КОМПОЗИТЫ ГИДРОИЗОЛЯЦИОННОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИОЛЕФИНОВ Специальность 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2014 г. Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский физикохимический институт имени Л.Я. Карпова, г. Москва. Научный руководитель : кандидат...»

«КОРШУН Владимир Аркадьевич МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПИРИМИДИНОВЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ И НЕНУКЛЕОЗИДНЫЕ РЕАГЕНТЫ В СИНТЕЗЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ, ИХ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Группе генетической инженерии интерлейкинов, Лаборатории механизмов экспрессии генов, Лаборатории химии нуклеиновых кислот, Лаборатории органического синтеза и Группе...»

«Трафимова Людмила Александровна СИНТЕЗ МОНОЦИКЛИЧЕСКИХ ГИДРИРОВАННЫХ 1,3-ДИАЗЕПИН-2-ОНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2013 Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н. Назарова Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор Шуталев Анатолий Дмитриевич Официальные...»

«Новикова Светлана Александровна СИНТЕЗ И ТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАННЫХ МАТЕРИАЛОВ С МЕТАЛЛСОДЕРЖАЩИМИ ЧАСТИЦАМИ (Co, Ni, Cu, Ag) 02.00.04-физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН Научный руководитель : член -корреспондент РАН, профессор Ярославцев Андрей Борисович Официальные оппоненты :...»

«ВОРОНИН Олег Геннадьевич ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗ ГИДРОГЕНАЗАМИ ДЛЯ КОНВЕРСИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ В ЭЛЕКТРИЧЕСТВО Специальности: 02.00.15 – кинетика и катализ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2010 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель :...»

«БЫЧКОВ Алексей Леонидович Механическая активация ферментативного гидролиза полимеров биомассы дрожжей 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения РАН доктор химических наук, профессор Научный руководитель Ломовский Олег Иванович доктор химических наук, профессор Официальные...»

«АЛЕКСЕЕВ Алексей Владимирович РАЗВИТИЕ МЕТОДА ДЕБАЯ–ШЕРРЕРА ДЛЯ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ФАЗ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ В МИКРОКОЛИЧЕСТВАХ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте неорганической химии им. А.В. Николаева Сибирского отделения РАН Научный руководитель доктор физико-математических наук Громилов Сергей Александрович...»

«Курочкин Николай Николаевич N-(Тозилметил)замещенные карбаматы и мочевины в синтезе азот- и кислородсодержащих гетероциклических соединений 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2011 Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н. Назарова Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор Шуталев...»

«Кучмин Игорь Борисович МИКРОДУГОВОЕ АНОДИРОВАНИЕ АЛЮМИНИЕВЫХ СПЛАВОВ В МАЛОКОНЦЕНТРИРОВАННОМ СИЛИКАТНО-ЩЕЛОЧНОМ ЭЛЕКТРОЛИТЕ Специальность 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Саратов 2014 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А. Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Соловьева Нина Дмитриевна Официальные оппоненты : Ракоч Александр...»

«Подгорбунский Анатолий Борисович ИОННАЯ ПРОВОДИМОСТЬ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ И АМОРФНЫХ ФТОРИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТАЛЛОВ IV И V ГРУПП 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Владивосток – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии Дальневосточного отделения Российской академии наук (ИХ ДВО РАН) Научный руководитель : доктор химических наук, доцент, старший научный...»

«Цюпко Татьяна Григорьевна Аналитические решения при определении некоторых показателей безопасности и качества пищевых продуктов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук 02.00.02 - аналитическая химия Краснодар – 2012 Работа выполнена на кафедре аналитической химии ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет Научный консультант : доктор химических наук, профессор Темердашев Зауаль Ахлоович Официальные оппоненты : чл.-корр. АНБ, доктор...»

«Путилов Лев Петрович ДЕФЕКТООБРАЗОВАНИЕ И РАСТВОРЕНИЕ ВОДОРОДА В АКЦЕПТОРНО-ДОПИРОВАННЫХ ПРОТОНПРОВОДЯЩИХ ОКСИДАХ Специальность: 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокотемпературной электрохимии Уральского отделения РАН (ИВТЭ УрО РАН), г. Екатеринбург. Научный руководитель : Цидильковский Владислав...»

«Самохин Андрей Сергеевич НОВЫЙ ПОДХОД К ИДЕНТИФИКАЦИИ КОМПОНЕНТОВ СЛОЖНЫХ СМЕСЕЙ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ/МАСССПЕКТРОМЕТРИИ 02.00.02 – Аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор...»

«Левит Галина Львовна АМИНОКИСЛОТЫ В РЕГИО- И СТЕРЕОНАПРАВЛЕННОМ СИНТЕЗЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ 02.00.03 - Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Екатеринбург – 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органического синтеза Уральского отделения РАН им. И.Я. Постовского (г. Екатеринбург). Научный консультант доктор химических наук, профессор Краснов Виктор Павлович Официальные...»

«ЖИТОВ Роман Георгиевич ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ПОЛИМЕР-БИТУМНЫХ КОМПОЗИТОВ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иркутск -2013 Работа выполнена в лаборатории полимеризационных процессов и органического синтеза Института нефте- и углехимического синтеза при ФГБОУ ВПО Иркутский государственный университет. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор, профессор кафедры органической химии...»

«БАСОВА ЕВГЕНИЯ ЮРЬЕВНА ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 02.00.02. – Аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов – 2010 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Горячева Ирина Юрьевна Официальные...»

«ПАХОМОВА Виктория Александровна РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2006 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН. доктор химических наук Научный руководитель : профессор Михайлов Альфа Иванович доктор физико-математических наук Официальные оппоненты : Харитонов Александр Павлович доктор...»

«РО Д ИО НО В ИГ О РЬ ВЛ АД ИМ ИР О В ИЧ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ФОРМИРОВАНИЯ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ОКСИДНЫХ ПОКРЫТИЙ НА ИЗДЕЛИЯХ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Специальность: 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Саратов 2011 2 Работа выполнена в Саратовском государственном техническом университете Научный консультант : доктор химических наук, профессор Попова Светлана Степановна Официальные оппоненты : доктор...»

«Крючков Максим Викторович ПОЛУЧЕНИЕ АЛИФАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИЗ РАЗБАВЛЕННОГО АЗОТОМ СИНТЕЗ-ГАЗА 02.00.13 – Нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА 2012 Работа выполнена на кафедре Газохимии ФГБОУ ВПО Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина. Научный руководитель : чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Лапидус Альберт Львович Официальные оппоненты : Гюльмалиев Агаджан Мирзоевич...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.