WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Сидорова Ольга Вениаминовна

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РЕКОМБИНАНТНОГО OMPF ПОРИНА YERSINIA

PSEUDOTUBERCULOSIS И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ

02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток – 2011 -2Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН), г. Владивосток.

Научные руководители: Новикова О.Д., доктор химических наук, старший научный сотрудник;

Исаева М.П., кандидат медицинских наук, доцент.

Официальные оппоненты: Монастырная М.М., доктор химических наук, старший научный сотрудник;

Гаврилова Е.М., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт ДВО РАН

Защита состоится 23 июня 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ). Текст автореферата размещен на сайте диссертационного совета http://www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан 23 мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Черников О. В.

кандидат биологических наук, научный сотрудник

-3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Порины наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий существуют в интактной мембране в виде гомотримеров, образуют водонаполненные поры, или каналы, через которые осуществляется транспорт низкомолекулярных веществ.

Особенности структуры поринов и их поверхностная локализация обуславливают наличие у них многочисленных функций, отличных от транспортной. С одной стороны, порины представляют собой молекулымишени для иммунной системы организма-хозяина, с другой – выступают как факторы вирулентности и патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в организме.





Получение рекомбинантных белков в клетках E. coli в виде телец включения (ТВ), которые представляют собой ассоциаты нерастворимых интермедиатов белка – широко распространенный подход, используемый для получения индивидуальных белков в препаративных количествах.

Недостатком данного метода является то, что белки в составе подобных ассоциатов не обладают функциональной активностью, поэтому для использования рекомбинантных белков в практических целях требуется восстановление их пространственной структуры.

Изменяя структуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно определить функциональную значимость тех или иных участков белковой молекулы. Известно, что поверхностно локализованные структурные элементы молекулы порина, так называемые наружные петли, входят в состав антигенных детерминант, а также участвуют в стабилизации тримеров белка и модуляции проводимости пориновых каналов.

Получение рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм, несущих делеции участков наружных петель, является актуальной научной задачей. Изучение взаимосвязи между структурой, функциональными и антигенными свойствами мутантных белков позволит, во-первых, расширить фундаментальные представления о свойствах поринов и, во-вторых, открыть новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иерсиниями.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось установление взаимосвязи между отдельными элементами (участками наружных петель) пространственной и антигенной структуры OmpF порина из Y. pseudotuberculosis и его функциональными свойствами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга рекомбинантного порина. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга (мономера и тримера) белка.

рекомбинантного порина. Апробация возможности его использования в качестве антигена для диагностики псевдотуберкулеза.

2. Расчет антигенных В- и Т-клеточных эпитопов, входящих в состав аминокислотной последовательности поринов, патогенных для человека иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enterocolitica), и синтез соответствующих этим участкам пептидов. Характеристика синтетических пептидов как иммуногенов и диагностических антигенов.

3. Сайт-направленный мутагенез белок-кодирующего участка ompF гена порина с целью создания экспрессионных конструкций, несущих в себе делеции петельных участков аминокислотной последовательности OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга мутантных белков. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга (мономера и тримера) мутантных поринов. Изучение их функциональных и иммунохимических свойств.





Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено структурно-функциональное исследование рекомбинантного OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Показана возможность его использования в качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулеза.

С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные В- и Тклеточные эпитопы, входящие в состав аминокислотной последовательности поринов патогенных для человека иерсиний (Y.

pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enterocolitica) и синтезированы соответствующие этим участкам пептиды. Впервые изучены их иммуногенные свойства и возможность использования как потенциальных антигенов для диагностики иерсиниозов.

Проведён сайт-направленный мутагенез ompF гена и созданы экспрессионные конструкции для получения OmpF поринов Y.

pseudotuberculosis, несущих делеции участков наружных петель L1, L6 и L8. Впервые получены мутантные OmpF порины с указанными мутациями, а также охарактеризованы их физико-химические, порообразующие и иммунохимические свойства.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены автором на следующих конференциях и симпозиумах:

III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007; 1-st FarEastern International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, 2008; XIII Всероссийской школе-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010.

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 4 статьи в отечественных журналах и 8 тезисов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов работы, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 140 ссылoк. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 5 таблиц.

Благодарности за научное сотрудничество и помощь в работе.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научным руководителям д.х.н. Новиковой О.Д. и к.м.н. Исаевой М.П., сотрудникам ЛМОАБИ к.х.н. Хоменко В.А., к.б.н. Портнягиной О.Ю. и аспиранту Чистюлину Д.К., а также зав. лабораторией д.х.н. Соловьёвой Т.Ф. за постоянное внимание к работе, ценные замечания и полезные советы на всех этапах исследования. Автор чрезвычайно благодарен сотрудникам других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в работе и обсуждении полученных результатов: к.ф.-м.н. Лихацкой Г.Н., н.с. Ким Н.Ю., к.б.н. Стенковой А.М., м.н.с. Гузеву К.В.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 4-х разделов, обобщены литературные данные о нативных и рекомбинантных поринах НМ грамотрицательных бактерий. Представлены сведения об их структуре, функции и иммунобиологических свойствах, а также о механизмах фолдинга in vivo и методах рефолдинга in vitro. Проанализированы литературные данные о методах сайт-направленного мутагенеза и экспрессии белков, а также о свойствах мутантных поринов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и рефолдинг рекомбинантного OmpF порина Для экспрессии ompF гена Y. pseudotuberculosis была использована плазмида pET41а-m55, сконструированная нами. После экспрессии белка в лизате трансформированных клеток E.coli штамма BL21 (DE3) с помощью метода иммуноблоттинга была обнаружен белок с подвижностью 40 кДа, который взаимодействовал со специфическими антителами к термостабильному мономеру (ТМ) порина псевдотуберкулезного микроба.

В лизате клеток, не подвергшихся трансформации, подобный белок не был выявлен (рис. 1). Таким образом обнаруженный белок с мол. массой 40 кДа является порином из Y. pseudotuberculosis. Поскольку последовательность зрелого порина не содержит сигнальной последовательности, при (ТВ).

кДа ТВ выделяли из микробной массы центрифугированием в присутствии ферментов (лизоцим, ДНКаза), ингибитора протеаз (PMSF) и детергентов (ЭДТА, ДОХ). Осадок ТВ экстрагировали 8 М водным раствором мочевины при озвучивании (частота 44 МГц) (рис. 2). Мочевину удаляли с помощью диализа (в течение 4-х суток) против Tris-HCl буфера (pH 7.8), содержащего 0.1%-ный Zwittergent 3-14 (Zw 3-14). Полученный образец белка (26 мг/мл) по данным SDS, ПААГ-электрофореза содержал целевой рекомбинантный белок (РБ-1) (рис. 3). Электрофоретическая подвижность РБ-1 совпадала с подвижностью ТМ порина. Рефолдинг белка проводили последовательной ионообменной хроматографией: на КМ Сефарозе DEAE CL 6B (анионообменник) и на Сефарозе CL 4B (катионообменник). Наличие белка контролировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза. Фракции, полученные после двух циклов хроматографии, содержали олигомерную форму (тример) рекомбинантного порина (РБ-2).

2. Пространственная структура полученных рекомбинантных белков Пространственная структура полученных рекомбинантных белков была охарактеризована с помощью методов оптической спектроскопии.

Как видно из данных рис. 4, а-2, спектр КД образца РБ-2 в ближней УФ области не имеет четко разрешенных положительных полос, свидетельствующих, как правило, о жестко фиксированной третичной структуре белка. Тем не менее, величина амплитуды спектра указывает на достаточно сформированную пространственную структуру полученного олигомера порина. Подобные спектры характерны для частично свернутых интермедиатов фолдинга мультидоменных белков. Спектр КД РБ-1 в ближней УФ области имеет отрицательный максимум, что может указывать на значительную степень денатурации (качественно отличающуюся структуру) мономера порина по сравнению с олигомером.

В спектре КД РБ-2 в пептидной области (рис.4, б-2) наблюдается отрицательная полоса небольшой интенсивности с максимумом при 217 ± нм, форма которой свидетельствует о значительной доле -структуры в молекуле белка. Подобный спектр имел нативный порин НМ Y.

pseudotuberculosis в присутствии неионного детергента октил--Dглюкопиранозида (ОГ). В спектре КД РБ-1 отрицательная полоса с максимумом при 217 ± 1 нм имеет значительно большую интенсивность (рис. 4, б-1), что указывает на присутствие в полипептидной цепи белка как –структурированных, так и -спирализованных участков.

Качественный анализ спектров был подтверждён расчётами элементов вторичной структуры с использованием программы COTIN/LL-CONTIN (табл. 1). Как видно из таблицы, тримеры поринов, как нативного изолированного (ИТ), так и рекомбинантного (РБ-2), имеют практически одинаковое соотношение элементов вторичной структуры, тогда как ТМ порин, по сравнению с РБ-1, имеет почти втрое большее количество спирализованных участков. Возможно, это связано с более жесткими условиями (кипячение в присутствии SDS) получения ТМ.

Таблица 1. Элементы вторичной структуры (в единичных долях) рекомбинантных и изолированных поринов, рассчитанные по программe COTIN/LL-CONTIN (пакет программ CDPro) Образец -структура -структура - Неупоряд. Кол-во Тип изгиб cтруктура реперных структурир Особенности третичной структуры рекомбинантных поринов были исследованы методом собственной белковой флуоресценции. Обнаружено, что значительный вклад в суммарную флуоресценцию РБ-1 вносят остатки тирозина. Так, максимум суммарной флуоресценции РБ-1 смещен в коротковолновую область спектра на 20 нм по сравнению с максимумом в спектре ТМ порина. Известно, что коротковолновый сдвиг максимума спектра флуоресценции связан с увеличением вклада в эмиссию белков остатков тирозина за счет уменьшения их тушения боковыми группами аминокислотных остатков и/или за счет уменьшения передачи энергии возбуждения от тирозина к триптофану в результате увеличения расстояния между ними. В то же время, максимум суммарной флуоресценции РБ-2 смещен в длинноволновую область на 7 нм по сравнению с максимумом суммарной эмиссии ИТ, а 1/2 спектра РБ- больше соответствующего значения спектра ИТ на 12 нм. Таким образом, различаются. Структура последнего носит черты денатурированного белка, возможно, она недостаточно сформирована.

Проведенные исследования подтвердили сделанные нами ранее выводы о различной степени стабильности пространственной организации поринов на уровне вторичной и третичной структуры белка. Вторичная структура поринов отличается высокой стабильностью и способностью к ренатурации. Для третичной структуры порина характерна высокая степень пластичности, и её формирование в значительной степени зависит от условий выделения и/или рефолдинга белка.

3. Функциональная активность рекомбинантного порина Методом реконструкции белка в бислойные липидные мембраны (БЛМ) проведено изучение порообразующей активности полученных рекомбинантных белков (РБ-1, РБ-2). В присутствии РБ-2 (концентрация белка 10 нг/мл) наблюдались единичные включения белка и ступенчатое изменение проводимости мембраны поринового типа (рис. 5, а). Увеличение концентрации порина до 16 нг/мл приводило к увеличению интегральной проводимости мембраны (рис. 5, б). Наиболее вероятная величина проводимости пор составляет 280-300 пСм.

Флуктуации тока поринового типа обнаружены также в присутствии РБ-1. Наличие порообразующей активности у этого образца белка можно объяснить либо присутствием незначительного количества олигомерной формы порина (не выявляемой в условиях SDS, ПААГэлектрофореза), либо способностью мономера в присутствии липидного бислоя образовывать активные тримеры. Таким образом, впервые получен рекомбинантный тример порина Y. pseudotuberculosis в функционально активной конформации.

4.1. Изучение иммуногенной активности РБ-1. Как правило, для иммунизации экспериментальных животных используют либо белки в смеси с полным адьювантом Фрейнда, либо белки в растворах неионных детергентов. Для изучения иммуногенной активности РБ-1 использовали мышей линии CBА. Уровень образования специфических антител определяли с помощью иммунизации мышей белком в водных растворах Zw 3-14 и ОГ, в смеси с адьювантом Фрейнда и в индивидуальном виде (суспензия в физиологическом растворе) (рис. 6). Титры антител пуловых иммунных сывороток (в -lg), определенные с помощью ИФА, находились в интервале от 1.90 до 3.55. Полученные результаты свидетельствуют о том, что рекомбинантные белки в растворах неионных детергентов могут быть использованы для получения специфических иммунных сывороток без добавления адъюванта Фрейнда, применение которого в последнее время вызывает много споров ввиду его токсичности и аллергенности.

Наибольший уровень антителообразования наблюдался при иммунизации животных порином в растворе Zw 3-14 (рис. 6).

Для всех полученных сывороток были определены значения индекса авидности (ИА), который характеризует способность гетерогенной смеси антител связываться с конкретным антигеном и зависит от прочности комплекса антиген/антитело. Обнаружено, что значения ИА всех сывороток к рекомбинантному порину, находятся в интервале от 79 до %. Это свидетельствует о высокой специфичности антител, полученных при иммунизации животных РБ-1 как в индивидуальном виде, так и в смеси с адъювантом или детергентом (рис. 7).

4.2. Применение рекомбинантнго мономера порина в качестве диагностического антигена. Известно, что применение рекомбинантных белков или синтетических пептидов в качестве компонентов диагностических тест-систем позволяет повысить чувствительность последних, а также избежать неспецифической гипердиагностики. В связи с этим была изучена возможность применения РБ-1 в качестве антигена в ИФА тест-системе для диагностики острых кишечных и вторично-очаговых форм псевдотуберкулёза. Необходимо отметить, что в настоящее время в клинической практике нет достаточно эффективных диагностических тестов для выявления острых кишечных форм иерсиниозов. Кроме того, полностью отсутствует систематическая диагностика вторично-очаговых форм (или иммунопатологий) псевдотуберкулеза, которые отличаются полиорганностью поражения организма и сопровождаются нарушениями функции сердечно-сосудистой и нервной систем, опорно-двигательного аппарата, мочевыделительной системы и желудочно-кишечного тракта.

ОП 492 нм

ТСБ РБ ТСБ РБ

Рис. 8. ИФА сыворотки больного псевдотуберкулезом при взаимодействии с различными антигенами: 1- ТМ и 2 – РБ (а). Выявление специфических антител к РБ в ИФА с сыворотками больных вторично-очаговыми формами псевдотуберкулеза: ряд 2- сыворотка крови больного с симптомами поражения опорно-двигательного аппарата; ряд 1, 4 – сыворотки крови больных с симптомами поражения периферической нервной системы; ряд 3 – контроль (б).

Было показано, что РБ-1 взаимодействует с антителами в сыворотках крови больных острой кишечной формой псевдотуберкулеза в активностью ТМ порина (рис. 8, а). Последний используется как антиген в разработанной нами ИФА тест-системе для диагностики псевдотуберкулеза.

При анализе сывороток крови больных с симптомами вторичноочаговой формы псевдотуберкулеза (поражения опорно-двигательного аппарата и периферической нервной системы) также были обнаружены специфические антитела к рекомбинантному порину Y. pseudotuberculosis.

Показано, что РБ-1 выявляет специфические антитела в среднем в 1.3 раза эффективнее по сравнению с порином, изолированным из НМ псевдотуберкулезного микроба (рис. 8, б).

5. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включающих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических Для поиска с помощью компьютерных программ консервативных участков, содержащих В- и Т-клеточные эпитопы, были использованы аминокислотные (АК) последовательности OmpF и OmpC поринов патогенных иерсиний. Последовательности OmpF поринов Y.

pseudotuberculosis (UniProt KB/Tr EMBL Q5EMM5) и Y. enterocolitica ранее были определены нами из нуклеотидной последовательности их генов. АК последовательности OmpF (Swiss-Prot Q8Zg94) и OmpC (NCBI NP 404824) поринов Y. pestis, а также последовательности OmpC поринов Y.

pseudotuberculosis (NCBI YP069796) и Y. enterocolitica (UniProt KB/TrEMBL A1JU47) были взяты из баз данных.

Сайты связывания с В-клетками для неспецифических поринов Y.

pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis были рассчитаны с помощью программы ADEPT. Для расчетов Т-эпитопов использовали программы ProPred, SYFPEITHI и RANKPEP. Указанные программы предназначены, в основном, для выявления эпитопов, специфичных к рецепторам лимфоцитов человека и имеют определенные ограничения в отношении экспериментальных животных. Поэтому при выборе эпитопов учитывали гипотезу Вольпиной с соавт. о том, что для эффективного взаимодействия с МНС II мыши и успешной индукции синтеза специфических антител у мышей инбредных линий пептиды должны содержать девятичленный фрагмент, имеющий в 1-м положении гидрофобный АК остаток, а в 9-м – положительно заряженный АК остаток В результате были выбраны 4 пептида с различной степенью гомологии по отношению к соответствующим фрагментам молекул OmpC и OmpF поринов патогенных иерсиний (табл. 2). В - клеточные эпитопы представляли собой участки наружных петель, а примыкающие к ним консервативные трансмембранные участки - барреля соответствовали Тхелперным эпитопам. Предсказанные пептиды были синтезированы в АК последовательности (соответствующие рассчитанным эпитопам), ковалентно связанные с иммунохимически инертным лизиновым кором.

Таблица 2. Степень гомологии (в %) АК последовательностей антигенных пептидов и фрагментов поринов патогенных видов иерсиний.

МАП Соответствующая МАП

YTQTYNLTRFGDFSNRSSDA

LQYQGKNDRSEVKEANGDGF

RTLDQKYGSTAEGDKAQAWN

Наличие в составе МАП В-клеточных эпитопов было подтверждено с помощью взаимодействия пептидов с кроличьими антителами, полученными к тримерам OmpC поринов НМ Y. рseudotuberculosis и Y.

еnterocolitica, а также с сыворотками крови людей, переболевших псевдотуберкулезом или кишечным иерсиниозом. Как видно из графических данных (рис. 9, а, б), эффективность взаимодействия МАП с кроличьими антителами к тримерам и мономерам порина существенно ниже, чем эффективность реакции указанных антител с гомологичными антигенами. Тем не менее, все МАП реагируют с антителами в сыворотках крови пациентов при разведении 1:800 (диагностический титр в ИФА тестсистеме на основе ТМ порина) (рис. 9, в). Полученные результаты (рис. 9, б) позволяют предположить, что теоретически рассчитанные эпитопы принимают минимальное участие в формировании гуморального иммунного ответа в организме животных при иммунизации обеими (ИТ и ТМ) молекулярными формами порина. Однако эти эпитопы проявляются как антигенные детерминанты и стимулируют выработку антител в организме человека при естественном течении заболевания (рис. 9, в).

Наибольшая эффективность МАП-1 в ИФА обусловлена, вероятно, наличием в составе данного пептида фрагмента АК последовательности, «универсального» для поринов патогенных иерсиний, на который в теплокровном организме вырабатываются антитела как при иммунизации (рис. 9, а), так и при естественном течении инфекции (рис. 9, в).

Обнаружено существование взаимосвязи между конформацией порина, к этих антител с МАП. Так, МАП-1, в состав которого включены антигенные детерминанты петли L2, играющей важную роль в стабилизации тримерной структуры порина в НМ, максимально активно взаимодействует с антителами к комплексу пептидогликан-белок (ПГ-б), в составе которого порин сохраняет нативное окружение (рис. 9, г).

Рис. 9. ИФА взаимодействия МАП с антителами в сыворотках крови (разведение 1:800): а - кроликов, иммунизированных изолированными тримерами поринов Y.pseudotuberculosis и Y. еnterocolitica; б - кроликов, иммунизированных изолированными тримерами и мономерами порина Y.pseudotuberculosis; в - больных кишечным иерсиниозом (Y. еnterocolitica) и псевдотуберкулезом (Y.

pseudotuberculosis); г – кроликов, иммунизированных поринами Y.

pseudotuberculosis: мономером (АТ/ТМ), комплексом ПГ-б (АТ/ПГ-б) и изолированным тримером (АТ/ИТ).

Наличие в АК последовательности синтезированных МАП участков, соответствующих Т-клеточным эпитопам, определяли по способности пептидов индуцировать образование антител у экспериментальных животных. В результате трехкратной иммунизации мышей линии BALB/с были получены сыворотки, содержащие специфические антитела ко всем пептидам. Наиболее сильными иммуногенами оказались МАП-2 и МАП-4:

титры антисывороток к ним в 1.3 раза и более превышали таковые к МАПи МАП-3.

Таким образом показано, что пептиды, предсказанные с помощью компьютерных программ как антигенные детерминанты поринов патогенных иерсиний, вызывают синтез антител в организме. Данные Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов формирования специфического иммунитета против патогенных для человека иерсиний.

6. Получение мутантных OmpF поринов Y. pseudotuberculosis 6.1 Компьютерное моделирование мутантных форм OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Методами компьютерного моделирования построены теоретические модели рекомбинантных мутантных поринов Y.

pseudotuberculosis и получены данные об их пространственной структуре и свойствах. Оптимизация структуры молекул проводилась методом минимизации энергии с потенциалом сил AMBER99 в программе МОЕ.

Для оценки энергии образования олигомеров мутантных форм порина были проведены расчеты энергии в вакууме для мономеров и тримеров белка с помощью программы GROMACS 3.3 и потенциалом сил G43b1 (табл. 3).

Таблица 3. Потенциальная энергия мономеров и тримеров мутантных поринов и энергия образования тримеров белка (в вакууме).

мутаций 6.2. Сайт-направленный мутагенез. Для получения мутантных поринов использовали плазмиду pET41а-m55, сконструированную для экспрессии полноструктурного рекомбинантного OmpF порина. Плазмида была трансформирована в клетки E. coli штамма XL-1 Blue и затем выделена методом щелочного лизиса. Амплификацию со специально подобранными олигонуклеотидными праймерами проводили согласно протоколу для полимеразы Pfu Ultra II (Stratagene, США). Полученную после амплификации смесь мутантных и исходных плазмид обрабатывали эндонуклеазой рестрикции DpnI (Fermentas, Литва) для расщепления исходной («родительской») плазмидной ДНК. С целью оптимизации процесса получения мутантных рекомбинантных белков апробировали различных подхода.

мутантных белков по данному методу был проведен сайт-направленный мутагенез петель L6 и L8.

Последовательность стадий получения мутантных белков:

• трансформация полученной мутантной плазмидной ДНК • выделение плазмидных ДНК из положительных колоний и трансформация ими экспрессионного штамма Rosetta E.

• поиск «функциональных» колоний, экспрессирующих целевой белок, с помощью данных SDS, ПААГэлектрофореза;

• секвенирование «функциональных» плазмид.

Трансформация и ПЦР колоний. Трансформацию клеток Top-10 E.

coli проводили полученной после сайт-направленного мутагенеза (делеции петель L6 и L8) плазмидной ДНК. Наличие делеций проверяли при помощи ПЦР колоний. Для контроля мутаций использовали по 2 пары праймеров для каждой петли. Для петли L8: праймеры L6-for/L8-rev (проверка колоний на наличие делеции) и праймеры L6-for/OmpF-cds-rev (положительный контроль реакции, ожидаемый фрагмент 307 п.н.).

Результаты ПЦР показали, что для выделения плазмидной ДНК наиболее подходящими являются колонии 4 и 5 (рис.10). Для петли L6 проверка проводилась аналогичным образом с теми же праймерами (ожидаемый фрагмент 342 п.н.).

Рис. 10. Результаты ПЦР-скрининга на наличие делеции петли L8. А: проверка колоний на наличие делеций; Б: положительный контроль.

Выделение и трансформация плазмидной ДНК. Выделенными плазмидами трансформировали клетки E. coli штамма Rosetta, которые затем помещали на чашки с питательной средой, содержащей канамицин (50 мг/мл) и хлорамфеникол (34 мг/мл). Выросшие колонии были отобраны для экспрессии.

проводили в 30 мл среды. Отбор экспрессионных колоний осуществляли с помощью SDS, ПААГ - электрофореза (в качестве контроля был использован полноструктурный мономер рекомбинатного OmpF порина) (рис. 11). Как видно из рисунка, белок экспрессировался в двух формах, одна из которых имеет подвижность несколько большую, нежели у контрольного белка. Мы предположили, что именно эта полипептидная зона (колонии 3, 8 и 9) соответствует порину с целевыми мутациями.

6.2.2. Второй метод получения рекомбинантного белка. Для получения мутантных белков по данному методу был проведён сайт-направленный мутагенез по петлям L1, L6 и L8.

Последовательность стадий получения рекомбинантных белков:

• трансформация полученной после мутагенеза плазмидной ДНК экспрессионного штамма Rosetta E. coli DpnI-обработанной смесью полученных после мутагенеза плазмид;

• экспрессия белка с целью отбора колоний, экспрессирующих мутантный целевой порин;

• наработка ПЦР-фрагментов с помощью стандартных Т7-праймеров для идентификации мутаций в отобранных «функциональных»

• очистка и секвенирование ПЦР-продукта плазмид.

мутантные плазмиды, была проведена аналитическая экспрессия белков в 30 мл среды. Результаты экспрессии оценивали с помощью SDS, ПААГэлектрофореза (рис. 12). Колонии 1 и 2 (рис. 12, А), а также колонии 6 и 8рис. 12, Б) были отобраны для дальнейшей работы.

Рис. 12. А. Результаты экспрессии мутантного OmpF порина, несущего делецию петли L1. 1 - 6 – колонии с делецией петли L1; 7 – полноструктурный OmpF порин Y. pseudotuberculosis (контроль). Б. Результаты экспрессии мутантного OmpF порина, несущего делеции петли L6 (колонии 8-12) и L8 (колонии 5, 6).

ПЦР колоний, выделение ПЦР-фрагментов и их секвенирование.

Колонии, предположительно экспрессирующие белки с мутациями, были отобраны для выделения ПЦР-фрагментов и их секвенирования с помощью праймеров T7prom/Т7term. Амплификация проводилась согласно протоколу для Go Taq полимеразы (Fermentas, Литва). ПЦР-фрагменты очищали с помощью набора DNA Extraction Kit (Fermentas, Литва) и секвенировали (рис. 13) на автоматическом ДНК анализаторе 3130XL (Applied Biosystems, США). С помощью секвенирования устанавливали не только наличие мутаций (рис. 13), но и целостность остальной части белоккодирующей последовательности ompF.

Рис. 13. Результаты секвенирования (на примере образцов с делецией петли L6).

Выравнивание олигонуклеотидной последовательности выполнено в программе MEGA4.

Таким образом, показано, что «функциональные» колонии, продуцирующие целевые мутантные белки, имеются в экспрессионных конструкциях, полученных обоими методами. Это позволяет считать оба способа результативными и эффективными, но второй метод существенно более экономичен как по времени (меньшее число этапов эксперимента), мутантных белков.

6.3. Выделение и рефолдинг мутантных форм рекомбинантного OmpF Выделение белков с мутациями петель L1, L6 и L8 (далее – образцы del 1, del 6 и del 8) проводили аналогично выделению полноструктурного рекомбинантного OmpF порина за исключением того, что при этом использовали удвоенное количество лизоцима и ДНКазы. В качестве контроля параллельно с мутантными белками выделяли и полноструктурный рекомбинантный OmpF порин Y. pseudotuberculosis (рис. 14 и 15).

Очистку ТВ, содержащих мутантные порины, от мочевины проводили методом диализа против Tris-HCl буфера (рН 7.8), содержащего 0.1% Zw 3-14. После длительного (в течение 4-х суток) диализа были получены целевые мутантные белки в мономерной форме. Их совпадала с подвижностью РБ-1. Результаты рефолдинга мономеров мутантных поринов были подтверждены с помощью иммуноблоттинга в реакции с кроличьими антителами к нативному мономеру порина и с мышиными антителами к РБ-1.

Тримеры мутантных поринов получали, как описано выше (раздел 1). Результаты сборки олигомерной формы белков были подтверждены данными SDS, ПААГ – электрофореза (рис. 16).

120 кДа 6.4. Пространственная структура мутантных поринов Круговой дихроизм. Для спектров КД мутантных поринов по сравнению со спектром полноструктурного рекомбинантного тримера РБ- наблюдается более низкая амплитуда (del 6 и del 8) и меньшая степень разрешенности (del 1, del 6 и del 8) полос, что указывает на более рыхлую третичную структуру тримеров мутантных белков.

Спектры КД образцов мутантных поринов в области поглощения пептидных связей являются характерными для -структурированных белков + типа. Однако форма спектров белков с делециями различных петель (интенсивность отрицательных и положительных полос) несколько различаются. Расчет содержания элементов вторичной структуры исследованных поринов, выполненный по программе CDPro, позволил выявить указанные различия. Так, мутантные порины с делециями петель L1 и L6 содержат насколько большее (соответственно в 1.8 и 2.5 раза) количество -спиральных участков по сравнению с РБ-2 и мутантным порином del 8. Мутантный порин с делецией петли L6, несмотря на высокое содержание -спирали (характерного признака денатурации поринов), содержит наименьшее количество неупорядоченной структуры.

Именно этот образец порина имеет сходное с РБ-2 соотношение двух типов -структуры ( денат./ неденат.): 0.5 и 0.55 соответственно. Для других мутантных белков (del 1 и del 8) эти соотношения имеют большую величину и равны, соответственно, 0.66 и 0.70. Таким образом, отсутствие регулярной вторичной структуры порина.

Собственная белковая флуоресценция. Спектры суммарной эмиссии тримеров исследованных поринов и их аппроксимация спектральными формами излучения остатков триптофана и тирозина указывают на значительные различия в микроокружении ароматических флуорофоров. Отсутствие петли L8 в наименьшей степени приводит к изменениям в третичной структуре рекомбинантного тримера (РБ-2) порина. В то же время в случае мутантных поринов с делециями петель L и L6 по сравнению с РБ-2 наблюдается существенное увеличение доли триптофановых остатков спектральной формы I (в 1.8 и 2.2 раза соответственно). Тем не менее, в отличие от нативного порина все мутантные белки имеют более длинноволновое положение максимумов как суммарной, так и триптофановой флуоресценции. Это может быть обусловлено увеличением вклада триптофана спектральной формы II и уменьшением вклада триптофана спектральной формы S в эмиссию мутантных белков.

Таким образом, пространственная структура полученных мутантных белков по сравнению с таковой полноструктурного рекомбинантного порина имеет свои особенности на уровне как вторичной, так и третичной структуры белка.

Изучение термоустойчивости мутантных поринов методом SDS, ПААГ-электрофореза показало, что в случае отсутствия петли L диссоциация тримеров белка начинается при температуре 60°С, что на 10°С ниже, чем в случае полноструктурного рекомбинантного и мутантных (del 6 и del 8) поринов.

6.5. Функциональная активность мутантных поринов Функциональная активность мутантных поринов была охарактеризована с помощью техники БЛМ. При добавлении белков (10- нг/мл) в водную фазу наблюдались ступенчатые изменения проводимости мембраны, характерные для порообразующих белков. Анализ записей тока через БЛМ показал, что величины наиболее вероятного уровня проводимости пор рекомбинантного и мутантных поринов близки и составляют 360±60 пСм. Это значение соответствует проводимости канала тримера нативного порина из НМ Y. pseudotuberculosis. Таким образом, отсутствие петель L1, L6 и L8 не влияет на размер каналов OmpF порина псевдотуберкулезного микроба.

Антигенная структура мутантных белков была охарактеризована с помощью ИФА. Обнаружено, что мутантные порины с делециями наружных петель взаимодействуют со специфическими антителами к полноструктурному рекомбинантному и к нативному OmpF поринам (рис.

17).

Результаты реакции связывания полноструктурного OmpF порина и мутантных белков с антисывороткой к РБ-1 аналогичны (рис. 18, А). Это свидетельствует о том, что участки последовательности порина, соответствующие наружным петлям L8, L1, L6, не участвуют в формировании антигенных детерминант мономера полноструктурного рекомбинантного порина. Подобная картина наблюдается и при взаимодействии мутантных поринов del 1 и del 6 с антителами к нативному OmpF порину (рис. 18, Б). Напротив, белок del 8 взаимодействует с этими антителами на 30-40% менее эффективно.

Как было показано ранее, структура антигенных детерминант рекомбинантного и нативного поринов имеет лишь частичное соответствие за счет недостаточно сформированных конформационных детерминант, образующихся в результате сближения отдельных участков молекулы в процессе сборки третичной и четвертичной структуры белка. Полученный результат может свидетельствовать о том, что участки последовательности белка, соответствующие петле L8, входят в состав конформационных антигенных детерминант нативного порина.

ОП 492 нм Рисунок 17. ИФА взаимодействия мутантных поринов со специфическими антителами к полноструктурному рекомбинантному (А) и к нативному (Б) OmpF поринам.

Таким образом, отсутствие в структуре белка наружных петель, за исключением L8, мало изменяет антигенную структуру OmpF порина НМ Y. pseudotuberculosis. Этот результат согласуется с данными теоретических расчётов антигенных детерминант OmpF порина. Использование таких программ, как ProPred, SYFPEITHI и RANKPEP, показало, что менее 20% - 23 от общего количества рассчитанных пептидов, взаимодействующих с Трецепторами на поверхности человеческих лимфоцитов, приходится на участки наружных петель. Среди них, в свою очередь, более 70% пептидов приходится на петлю L8.

ВЫВОДЫ

1. Из трансформированных клеток E. coli получен рекомбинантный OmpF порин наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis в мономерной форме (РБ-1). С помощью ионообменной хроматографии в присутствии детергента Zwittergent 3-14 осуществлена сборка полученного мономера в олигомерную структуру (рекомбинантный тример РБ-2).

2. Методами оптической спектроскопии охарактеризована пространственная структура полученных рекомбинантных белков.

Показано, что вторичная структура поринов отличается высокой стабильностью и способностью к ренатурации. Для третичной структуры этих белков характерна высокая степень пластичности, и её формирование в значительной степени зависит от условий выделения и/или рефолдинга.

3. Изучены иммунобиологические свойства рекомбинантного мономера порина. Установлено, что РБ-1 вызывает продукцию IgG антител как в смеси с адъювантом Фрейнда, так и в растворе неионного детергента Zwittergent 3-14. Продемонстрирована эффективность использования РБв качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулёза.

4. С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные Т- и Вэпитопы поринов патогенных видов иерсиний и синтезированы иммунобиологические свойства полученных пептидов и показана возможность их использования как диагностических антигенов для верификации иерсиниозов.

5. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены плазмиды, несущие мутантные ompF гены порина Y. pseudotuberculosis. Наличие делеций петель L1, L6 и L8 подтверждено секвенированием.

6. Проведена экспрессия мутантных белков с делециями петель L1, L6 и L8. Из трансформированных клеток E. coli штамма Rosetta получены белки с данными мутациями. Подобраны условия выделения и рефолдинга мономерной и тримерной форм мутантных белков.

7. Выявлены особенности пространственной структуры мутантных поринов. Показано, что все мутантные белки имеют выраженную, но OmpF порином) третичную структуру. Отсутствие наружных петель петель L1, L6 и L8 приводит к изменению соотношения элементов регулярной вторичной структуры порина. Обнаружено, что только отсутствие петли L1 снижает термоустойчивость мутантного белка.

8. Фунциональная активность полученных полноструктурного и мутантных поринов изучена с помощью техники бислойных липидных мембран.

Показано, что отсутствие петель L1, L6 и L8 не влияет на размер каналов OmpF порина псевдотуберкулезного микроба.

9. Изучение антигенных свойств мутантных поринов показало, что наружные петли L1, L6 и L8 не участвуют в формировании антигенных детерминант рекомбинантного порина. Тем не менее, участок аминокислотной последовательности белка, соответствующий петле L8, входит в состав конформационных антигенных детерминант нативного тримера порина.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В

СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. О.В. Сидорова, О.Ю. Портнягина, О.Д. Новикова, О.П. Вострикова, В.А.

Хоменко. Использование компьютерных программ для расчётов антигенных детерминант порообразующих белков наружной мембраны патогенных иерсиний // В: Сб. тезисов докладов II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток. 19-22 декабря 2006 г. С. 91.

2. Д.В. Антонец, А.Ю. Бакулина, О.Ю. Портнягина, О.B. Сидорова, О.Д.    Новикова, А.З. Максютов. Предсказание антигенно-активных районов OmpF-подобного порина // Доклады АН. 2007. Т. 414. № 4. С. 1-3.

3. О.Ю. Портнягина, В.А. Хоменко, О.П. Вострикова, М.П. Исаева, Н.Ю.

Ким, Г.Н.Лихацкая, О.В. Сидорова, О.Д. Новикова, Т.Ф. Соловьева.

Выделение, рефолдинг и практическое применение рекомбинантного порина наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // В: Сб тезисов дакладов III Российского симпозиума «Белки и пептиды». Пущино. г. С. 105.

4. О. Ю. Портнягина, В. А. Хоменко, О.В. Сидорова, О.Д. Новикова, О.П.

Вострикова, Т.Ф. Соловьева. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Рус. журн. иммунологии. 2008. № 2-3. Т.

2(11). С. 145.

5. O. Sidorova, O. Portnyagina, V. Khomenko, O. Novikova. Antigenic properties of the recombinant OmpF-like porin of Yersinia pseudotuberculosis Vladivostok. 2008, September, 2-7. P. 70.

6. O.Yu.Portnyagina, O.V. Sidorova, O.D. Novikova. Immunoactive synthetic fragments of the outer membrane porins of pathogenic Yersinia // In: Proceed of 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Part I, Vladivostok. 2008, September, 2-7. P. 62.

7. О.В. Сидорова. Obtaining of Yersinia pseudotuberculosis porin using biotechnology method // In: Proceed of 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Part II. Vladivostok. 2008, September, 2-7. P.

48. Конкурс «У.М.Н.И.К.».

8. О.Ю. Портнягина, О.В. Сидорова, В.А. Хоменко, О.Д. Новикова, О.П.

Вострикова, Т.Ф. Соловьева. Иммуногенные свойства рекомбинантного pseudotuberculosis // Бюлл. эксп. биол. мед. 2009. №7. С. 85-88.

9. О.В. Сидорова, М.П. Исаева, В.А. Хоменко, О.Д. Новикова.

Конструирование мутантных OmpF поринов наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis и отработка условий их экспрессии // В: Сб.

тезисов докладов XII Всероссийской молодёжной школы-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии.

Владивосток. 7-14 сентября 2009 г. С. 10. О.Ю. Портнягина, О.П. Вострикова, О.Д. Новикова, М.П. Исаева, А.М.

Стенкова, К.В. Гузев, В.Г. Малашенкова, В.А. Хоменко, О.В. Сидорова, высокоэффективных тест-систем для диагностики иерсиниозов // Тихоокеан. мед. журн. 2010. №3. С. 85-90.

11. О.Ю. Портнягина, О.В. Сидорова, О.Д. Новикова, О.П. Вострикова, В.А. Хоменко, Т.Ф. Соловьева. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включающих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний // Биоорган. химия.

2010. Т. 36. № 5. С. 1-10.

12. О.В. Сидорова, Д.К. Чистюлин, М.П. Исаева, О.Д. Новикова.

Получение мутантных OmpF поринов Yersinia pseudotuberculosis с делециями наружных петель // В: Сб. тезисов докладов XIII Всероссийской школы-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 7-14 сентября 2010 г. С. 65.

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РЕКОМБИНАНТНОГО OMPF ПОРИНА YERSINIA

PSEUDOTUBERCULOSIS И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ

Диссертации на соискание ученой степени Подписано в печать 19.05. Формат 60х84/16 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ДВГТУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская,

 
Похожие работы:

«Карачевцев Фёдор Николаевич СИНТЕЗ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СТЕКОЛ И ГЕТЕРОСТРУКТУР НА ОСНОВЕ СИСТЕМЫ Bi2O3 - B2O3 - MoO3 И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИХ ДЛЯ АНАЛИТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ Специальность: 02.00.01 - Неорганическая химия 02.00.02 - Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2008 г. Работа выполнена на кафедре Неорганической химии и кафедре Стандартизации и сертификации Московской государственной академии тонкой химической...»

«ИОЩЕНКО ЮЛИЯ ПАВЛОВНА ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ХИТОЗАНА С БЕЛКАМИ И ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИМИ ПОЛИМЕРАМИ Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Волгоград – 2006 2 Работа выполнена на кафедре Химическая технология полимеров и промышленная экология Волжского политехнического института (филиал) Волгоградского государственного технического университета. Научный...»

«Астахов Александр Владимирович СИНТЕЗ 1,2,4-ТРИАЗОЛОПИРИМИДИНОВ НА ОСНОВЕ РЕАКЦИЙ 1-ЗАМЕЩЕННЫХ 3,5-ДИАМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛОВ С 1,3-БИЭЛЕКТРОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ Специальность 02.00.03 – “Органическая химия” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Южно-Российском государственном техническом университете (Новочеркасском политехническом институте) на кафедре Технология неорганических и органических...»

«Масленникова Вера Ивановна ХИМИЯ ФОСФОКАВИТАНДОВ И РОДСТВЕННЫХ ИМ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ СИСТЕМ Специальность 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Московского педагогического государственного университета. Научный консультант : Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Нифантьев Эдуард Евгеньевич Официальные...»

«Агафонцев Александр Михайлович КИСЛОТНО-КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ ПЕРЕГРУППИРОВКИ -АМИНО- И -АЦИЛАМИНО- ОКСИМОВ ТЕРПЕНОВОГО РЯДА /02.00.03 – органическая химия/ Автореферат диссертации на соискание ученой стпени кандидата химических наук Новосибирск 2005 Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н. Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук Новосибирском государственном университете Научный руководитель : доктор химических наук Ткачев Алексей...»

«Меньшова Марина Анатольевна СИНТЕЗ И ПРЕВРАЩЕНИЯ АЛКИЛ-, АРИЛ-, (ГАЛОГЕН)ЗАМЕЩЕННЫХ-2-ПЕНТЕН-1,5-ДИОНОВ С N,N(O,S)-БИНУКЛЕОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов - 2011 Работа выполнена на кафедре химии и методики обучения ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Пчелинцева Нина Васильевна...»

«Кучмин Игорь Борисович МИКРОДУГОВОЕ АНОДИРОВАНИЕ АЛЮМИНИЕВЫХ СПЛАВОВ В МАЛОКОНЦЕНТРИРОВАННОМ СИЛИКАТНО-ЩЕЛОЧНОМ ЭЛЕКТРОЛИТЕ Специальность 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Саратов 2014 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А. Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Соловьева Нина Дмитриевна Официальные оппоненты : Ракоч Александр...»

«КОЗЛОВСКИЙ Анатолий Анатольевич СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХЛОРИРОВАНИЯ И ПОЛИМЕРИЗАЦИИ МОНОМЕРОВ. ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ ТВЕРДОФАЗНОГО ХЛОРИРОВАНИЯ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте проблем химической физики РАН доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Михайлов Альфа Иванович доктор...»

«Пучина Гульфия Рашитовна СИНТЕЗ И ПРЕВРАЩЕНИЯ 6- И 6,8-ЗАМЕЩЕННЫХ 3-БЕНЗИЛ-3АЗАБИЦИКЛО[3.3.1]НОНАН-9-ОНОВ 02.00.03 - Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Уфа – 2007 2 Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра Российской Академии наук и Уфимской государственной академии экономики и сервиса. Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент Вафина Гузэль Фагимовна Официальные...»

«Гречищева Наталья Юрьевна Взаимодействие гумусовых кислот с полиядерными ароматическими углеводородами: химические и токсикологические аспекты 02.00.03 –Органическая химия 11.00.11 –Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва-2000 4 Работа выполнена в лаборатории физической органической химии кафедры органической химии Химического факультета МГУ им. М.В....»

«Бакланова Яна Викторовна КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТАЛЛАТОВ ЛИТИЯ Li2MO3 И ОКСИГИДРОКСИДОВ MO(OH)2 (M = Ti, Zr, Hf) специальность 02.00.21 – химия твердого тела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии твердого тела Уральского отделения РАН Научный руководитель : доктор химических наук, ведущий...»

«Солодова Светлана Леонидовна РАДИКАЛЬНАЯ ХИМИЯ АРТЕМИЗИНИНА: ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка-2009 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Денисов Евгений Тимофеевич Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Раевский Олег Алексеевич Институт физиологически активных веществ РАН,...»

«РУДЕНКО АНДРЕЙ ОЛЕГОВИЧ Лигандообменное сорбционное концентрирование на сверхсшитых полистиролах при ВЭЖХ определении антибиотиков, аминокислот и витаминов Специальность 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета СанктПетербургского государственного университета. Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор...»

«Филиппова Мария Викторовна ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНИЛИНА И ЕГО ХЛОРПРОИЗВОДНЫХ В ВОДЕ С ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫМ БРОМИРОВАНИЕМ 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Сыктывкарский Государственный Университет и на базе экоаналитической лаборатории Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН. Научный руководитель : доктор химических...»

«МАШКОВСКИЙ ИГОРЬ СЕРГЕЕВИЧ БИМЕТАЛЛИЧЕСКИЕ Pd-СОДЕРЖАЩИЕ КАТАЛИЗАТОРЫ СЕЛЕКТИВНОГО ГИДРИРОВАНИЯ АЦЕТИЛЕНА НА ОСНОВЕ ГЕТЕРОМЕТАЛЛИЧЕСКИХ АЦЕТАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ 02.00.15 – катализ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА - 2009 Работа выполнена в Лаборатории катализа нанесенными металлами и их оксидами Учреждения Российской академии наук Института...»

«СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ L АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2011 2 Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, засл. деятель науки РФ, профессор Чернова Римма Кузьминична Официальные доктор химических наук,...»

«Цветков Дмитрий Сергеевич Термодинамика разупорядочения, электро- и массоперенос в перовскитоподобных оксидах GdBaCo2-xFexO6- (x=0, 0.2) 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2010 1 Работа выполнена на кафедре физической химии ГОУ ВПО “Уральский государственный университет им. А.М. Горького” Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент Зуев А.Ю. Официальные оппоненты : доктор...»

«Сорокина Наталья Викторовна ИЗУЧЕНИЕ РЕГИОНАЛЬНО-ФОНОВОЙ РАДИАЦИОННОЙ СИТУАЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ДОЗИМЕТРИИ И ИССЛЕДОВАНИЙ СОДЕРЖАНИЯ ПРИРОДНЫХ И ТЕХНОГЕННЫХ РАДИОНУКЛИДОВ В МАТЕРИАЛАХ И ПРОДУКТАХ КУЗБАССА Специальность 02.00.04. – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Кемерово 2006 2 Работа выполнена на кафедре физической химии ГОУ ВПО Кемеровский госуниверситет. Научный кандидат физико-математических наук, доцент...»

«Степанова Вероника Борисовна ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ПЕРЕНОСА 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2013 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский...»

«Цюпко Татьяна Григорьевна Аналитические решения при определении некоторых показателей безопасности и качества пищевых продуктов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук 02.00.02 - аналитическая химия Краснодар – 2012 Работа выполнена на кафедре аналитической химии ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет Научный консультант : доктор химических наук, профессор Темердашев Зауаль Ахлоович Официальные оппоненты : чл.-корр. АНБ, доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.