WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«ЛИПИДЫ НЕКОТОРЫХ НАЗЕМНЫХ И МОРСКИХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ КАК ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ЭНДОТОКСИНОВ ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КРАСИКОВА Инна Николаевна

ЛИПИДЫ НЕКОТОРЫХ НАЗЕМНЫХ И МОРСКИХ

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ КАК ФАКТОРЫ

ПАТОГЕННОСТИ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ

АНТАГОНИСТЫ ЭНДОТОКСИНОВ

02.00.10 — биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток 2009

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Васьковский Виктор Евгеньевич академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Беседнова Наталья Николаевна доктор химических наук, профессор Книрель Юрий Александрович

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита состоится “ _ ” 2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, пр. 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ.

Факс: (4232) 314050; e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр. 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан “ ” 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Авилов С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На протяжении всей истории человечества инфекционная патология является одной из самых распространенных причин болезней с летальным исходом. По официальным данным ВОЗ с нею связано 25% смертности в мире. Доля инфекций в структуре смертности населения планеты существенно увеличивается и достигает 35%, если принимать во внимание результаты научных исследований последних лет, которые свидетельствуют об участии одного или нескольких инфекционных агентов в хронических заболеваниях легких (включая астму), развитии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, а также болезней дыхательной, нервной и пищеварительной систем организма человека.





Большой проблемой в инфекционной патологии является снижение эффективности использования традиционных методов лечения и профилактики бактериальных инфекций. Это связано с тем, что в результате генетической изменчивости бактерий появляются штаммы, устойчивые к действию лекарственных препаратов, или штаммы с измененным антигенным составом, например, так называемые госпитальные штаммы, которые формируются во время внутрибольничных инфекций. Антропогенная трансформация среды обитания человека, которая привела к выходу на эпидемическую «орбиту» более 30 патогенов, возбудителей так называемых “новых” инфекционных болезней, также значительно усложняет ситуацию.

Одним из широко распространенных проявлений заболеваний, ассоциированных с инфекциями различной этиологии, являются бактериемия и септический шок. Острота заболеваний и количество летальных исходов при бактериальном сепсисе значительно увеличиваются (до 45%), если в качестве возбудителя инфекции выступают грамотрицательные бактерии (ГОБ)* из-за присущей им повышенной устойчивости к антибиотикам.

Септический шок возникает в результате накопления в крови человека эндотоксинов, уникальных компонентов наружной мембраны ГОБ, что приводит к неконтролируемой активации иммунной системы, синтезу эффекторными клетками организма хозяина большого количества эндогенных цитокинов и, в конечном итоге, к серьезным нарушениям в организме, таким как гипотония и полиорганная дисфункция.

Используемые сокращения: АсОН - уксусная кислота; ГОБ – грамотрицательные бактерии;

GlcN – глюкозамин; ДПС – деградированный полисахарид; ДФГ – дифосфатидилглицерин; ДЭФЭ – диметиловый эфир фосфатидилэтаноламина; ЖК – жирные кислоты; Кdo - 3-дезокси-D-манно-окт-2улозоновая кислота; КПС - капсульный полисахарид; ЛА – липид А; ЛПС – липополисахарид; ЛФЭ – лизофосфатидилэтаноламин; ЛФ – логарифмическая фаза роста; ЛX – липид X; МС – масс-спектрометрия; НЛ – нейтральные липиды; МЭФЭ – монометиловый эфир фосфатидилэтаноламина; О-ПС – О-полисахарид; ПА – питательный агар; ПБ – питательный бульон; ПСФ – поздняя стационарная фаза; РСФ – ранняя стационарная фаза; СА – степень ацилирования; СП – степень полимеризации;

СФ – стационарная фаза; ФНО- - фактор некроза опухоли альфа; ФГ – фосфатидилглицерин; ФЛ – фосфолипиды; ФЛР – фаза линейного роста; ФЭ – фосфатидилэтаноламин; ХС — химический сдвиг.

Высокая частота тяжелого течения грамотрицательного сепсиса делает жизненно необходимой разработку новых нестандартных подходов для его предотвращения и/или лечения. Научные проблемы, связанные с развитием таких подходов, среди прочих включают изучение экологии патогенов, эволюции эпидемического процесса грамотрицательных инфекций и факторов патогенности микроорганизмов.

Особое место среди возбудителей грамотрицательных инфекций занимают факультативные патогены, обладающие двойственной (паразитической и сапрофитной) природой. Изучение экологии таких бактерий, позволяющее получать сведения о возможности обитания некоторых из них в окружающей среде, накоплении их в ее объектах, из которых происходит заражение людей, рассматривается сегодня как необходимое звено для понимания механизмов запуска и развития инфекционных заболеваний.





Типичным примером таких бактерий является Yersinia pseudotuberculosis (сем. Enterobacteriaceae), внутриклеточный паразит, способный к эффективному размножению как в организме теплокровных, так и в объектах окружающей среды. Эта умеренно патогенная бактерия довольно интенсивно исследуется во всем мире, во многом потому, что в филогенетическом плане она является близким родственником и прародителем другой бактерии рода Yersinia, Y. pestis, возбудителя бубонной, легочной и септической чумы.

Устойчивость к факторам внешней среды и способность расти при низких температурах являются наиболее важными в эпидемиологическом отношении свойствами бактерий псевдотуберкулеза, которые приводят к возрастанию вирулентности популяции. Высокая приспособляемость факультативных паразитов, необходимая для выживания в столь различных внешних условиях, достигается, по-видимому, за счет наличия у них комплексных адаптивных реакций, отличных от таковых у облигатных патогенных бактерий. Отражением адаптационных процессов, в частности, является вариабельность химического состава бактериальной клетки.

Важную роль в экологической пластичности бактерий играют липиды – основные компоненты мембран, обеспечивающие структурно-функциональное соответствие клетки изменяющимся условиям среды обитания. Однако детальные исследования влияния экзогенных и эндогенных факторов на липидный состав псевдотуберкулезного микроба не проводились. Мало известно и о химической природе факторов патогенности бактерий псевдотуберкулеза, связанных с их психрофильными свойствами. Среди прочих это могут быть ЛПС, известные как О-антигены и эндотоксины ГОБ, и ФЛ, наряду с ЛПС формирующие барьер проницаемости бактериальных клеток для различных химических веществ, в том числе антибиотиков.

Несмотря на значительный прогресс в антимикробной химиотерапии, количество летальных исходов при эндотоксикозе остается неприемлемо высоким. Решение этой важной проблемы инфекционной патологии должно предусматривать разработку и внедрение в практику новых антибактериальных препаратов. Основой для создания препаратов, эффективных при лечении грамотрицательного сепсиса, является понимание того, что медиатором септических заболеваний, вызванных ГОБ, являются эндотоксины, в норме проявляющие себя активаторами клеточных и гуморальных компонентов защитной системы хозяина, а при неконтролируемой стимуляции иммунных реакций приводящие к эндотоксикозу.

В связи с этим весьма актуальным становится использование антагонистов эндотоксинов, ограничивающих выделение или иммунологическую реактивность последних. Потенциальным кандидатом на роль антагонистов эндотоксинов являются сами эндотоксины. В химическом плане они представляют собой ЛПС, включающие наряду О-ПС и олигосахаридом кора липидный домен, называемый ЛА, который считается эндотоксическим центром ЛПС.

Наиболее распространенным структурным вариантом ЛА, проявляющим ярко выраженные эндотоксические свойства («золотой стандарт» эндотоксинов), является дифосфорилированный дисахарид GlcN, имеющий шесть остатков ЖК. С другой стороны, производные ЛА с низкими степенями фосфорилирования и ацилирования проявляют слабую эндотоксическую активность (или не проявляют вовсе), что делает возможным их использование в качестве антагонистов эндотоксинов.

Особенности строения ЛА во многом определяются условиями роста ГОБ. В этом плане большой интерес представляют морские бактерии, которые в силу особых условий обитания (повышенное содержание солей, низкая температура, высокое гидростатическое давление, неравномерное поступление питательных веществ) могут синтезировать ЛА с низким эндотоксическим потенциалом. До начала нынешнего века химии «морских» ЛА, как научного направления, практически не существовало. Единичные работы по изучению ЛА морских бактерий, датированные 2-ой половиной 20-го века, касались, в основном, характеристики состава их ЖК. Мало кто подозревал тогда, какое структурное разнообразие характерно для «морских» ЛА и какие широкие возможности открываются для структурно-функциональных исследований в этой области.

Цель и задачи исследования. Цель работы — установление корреляции между условиями культивирования бактерий псевдотуберкулеза, их липидным составом и патогенными свойствами и поиск потенциальных антагонистов эндотоксинов среди ЛА морских ГОБ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

•Исследовать влияние температуры, источника углерода, способа культивирования и фазы роста на липидный состав (ФЛ, ЖК, ЛПС, ЛА) бактерий псевдотуберкулеза.

•Выяснить роль плазмидных ДНК в адаптационной изменчивости основных липидных компонентов Y. pseudotuberculosis.

•Изучить характеристики патогенного потенциала псевдотуберкулезного микроба в зависимости от условий его культивирования и изменений липидного состава.

•Изучить химический состав и структуру ЛА морских бактерий различной видовой принадлежности.

•Определить эндотоксические свойства (острая токсичность. способность индуцировать синтез ФНО- в клетках цельной крови человека) ЛА и ЛПС некоторых морских ГОБ.

•Изучить способность нетоксичных форм ЛА и ЛПС морских ГОБ ингибировать индуцированный эндотоксинами синтез ФНО-.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение роли липидных компонентов в адаптации и патогенности психротрофной бактерии Y. pseudotuberculosis. Показано, что липиды бактерий псевдотуберкулеза представляют собой динамичную систему, способную изменяться в широких пределах под воздействием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Установлено, что патогенный потенциал Y. pseudotuberculosis коррелирует с изменением липидного состава клеток и в большой степени зависит от условий культивирования.

Проведено первое систематическое исследование состава и структуры ЛА морских ГОБ различных родов и семейств, которое расширило представление о структурном разнообразии этих соединений. Установлены структуры некоторых из них. В составе молекул ЛА бактерий рода Marinomonas обнаружена необычная ацилоксиалкановая кислота, состоящая из двух остатков 3гидроксидекановой кислоты. Впервые описан ЛА (ЛА Marinomonas mediterranea), не содержащий нормальных ЖК. Впервые из клеток природных штаммов Chryseobacterium indoltheticum и C. scophthalmum выделен ЛА моносахаридной структуры. Показано, что бактерии рода Chryseobacterium имеют необычный состав полярных липидов и, по-видимому, не содержат ЛПС. Установлено, что ЛПС и ЛА ряда морских бактерий имеют низкую токсичность, являются слабыми индукторами ФНО- и представляют теоретический и практический интерес как потенциальные антагонисты эндотоксинов универсального типа действия.

Практическая ценность работы. Новые данные о характере изменений в составе ФЛ, ЛПС и ЛА факультативных паразитов под воздействием различных экологических факторов, полученные в ходе настоящего исследования, вносят вклад в понимание механизмов запуска и развития инфекционных заболеваний, что можно использовать для получения микроорганизмов с заданным липидным составом (например, при культивировании штаммов-продуцентов О-антигенов).

Изучение ЛА морских ГОБ продемонстрировало возможность использования бактерий морского происхождения в качестве источника нетоксичных форм ЛА - потенциальных антагонистов эндотоксинов, и перспективность их комплексного исследования с целью разработки препаратов для терапии грамотрицательного сепсиса и эндотоксикоза.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены лично автором в виде устных сообщений на: VI Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Ростов-на Дону, 1977); Всесоюзном симпозиуме «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980); XII Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Баку, 1981); 2nd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Moscow, 2002); 3rd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Wroclaw, Poland, 2004); IV-th European Conference on Natural Products (Paris, France, 2005), Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (Rostock, Germany, 2006).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 28 статей в ведущих отечественных и международных журналах, 19 тезисов докладов в сборниках трудов Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференций, получено 2 авторских свидетельства.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 499 источников. Диссертация изложена на 239стр. машинописного текста, содержит 24 таблицы и 62 рисунка.

Автор выражает глубокую признательность д.х.н. Т.Ф. Соловьевой, академику В.А. Стонику и академику Ю.С. Оводову за всестороннюю поддержку на всех этапах работы. Автор благодарит к.х.н. В.В. Исакова и к.х.н. А.С.

Дмитренка за проведение ЯМР-экспериментов, к.х.н. П.С. Дмитренка за проведение масс-спектрометрических исследований, д.б.н. А.Л. Дроздова и д.б.н.

А.В. Реунова за консультации при проведении электронно-микроскопических исследований, д.б.н. О.И. Недашковскую за наращивание микробной массы, к.х.н. В.А. Хоменко за полезные советы при проведении ДСН-ПААГ-электрофореза, д.х.н. П.А. Лукьянова и к.х.н. И.В. Чикаловец за консультации при проведении экспериментов по индукции ФНО-, а также проф. C.R.H. Raetz (Department of Biochemistry, Duke University Medical Center, Durham, USA) за обсуждение работ по ЛА бактерий рода Chryseobacterium. Автор выражает искреннюю благодарность своим коллегам по работе к.б.н. С.И. Бахолдиной, к.х.н. Е.В. Воробьевой, Н.В. Капустиной, асп. А.С. Волк, сотрудникам лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ к.х.н. В.И.

Горбачу, д.х.н. И.М. Ермак, д.х.н. О.Д. Новиковой, а также сотрудникам лаборатории химии углеводов за предоставление образцов ЛА из некоторых морских бактерий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 02-04-49466, № 05-04-48504), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” и ДВО РАН (гранты № 03-3-A-05-081, № 05-3-A-05-061).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В литературном обзоре представлена информация о структуре клеточной стенки ГОБ, дана характеристика липидного состава ГОБ, рассмотрены особенности строения ЛА бактерий различной видовой принадлежности, приведены данные о влиянии структуры ЛА на биологические свойства эндотоксинов, описаны механизмы действия эндотоксинов на иммунокомпетентные клетки человека и способы нейтрализации эндотоксинов.

В работе использовались дикие и лабораторные штаммы Y. pseudotuberculosis О:Ib серовара с различным плазмидным профилем и морские ГОБ из Коллекции Морских Микроорганизмов (KMM) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Бактерии псевдотуберкулеза выращивали в аэробных условиях при температуре 4-8 («холодовой» вариант) или 37 °С («тепловой» вариант) в жидкой питательной среде различного состава и агаризованном питательном бульоне. Морские бактерии выращивали в аэробных условиях при комнатной температуре с интенсивным перемешиванием в жидкой питательной среде, содержащей морскую воду.

Выделение липидов, ЛПС, КПС и ЛА проводили, используя стандартные методы. Характеристику экстрактов и индивидуальных соединений осуществляли с помощью одномерной и двумерной ТСХ, ДСН-ПААГ-электрофореза с последующим окрашиванием солями серебра, гель-хроматографии на различных носителях, ГЖХ, ГЖХ-МС, FABMS, ESIMS, MALDI-TOFMS, спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 31Р (используя методики COSY, TOCSY, NOESY, HMBC и HSQC), а также иммуноферментного анализа.

Содержание ЛПС определяли по количеству 3-гидрокситетрадекановой (3-ОН-C14:0) кислоты в щелочных гидролизатах клеток. Модификации в структуре ЛПС оценивали по изменению СП О-специфических полисахаридов и СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты. СП рассчитывали из отношения числа молей маннозы, моносахарида, входящего в состав О-специфической боковой цепи ЛПС Y. pseudotuberculosis O:1b серовара, к сумме числа молей L-глицеро-Dманно- и D-глицеро-D-манно-гептоз, моносахаридов олигосахарида кора в ЛПС этого микроорганизма, в гидролизатах ЛПС по формуле:

СП=2(число молей маннозы/число молей гептозы).

СА ЛПС определяли по отношению додекановой (C12:0) и 3-ОН-C14: кислот, входящих в состав липидного фрагмента ЛПС псевдотуберкулезного микроба, по формуле:

СА=W12:0/W3OHx100, где W = содержание (в %) ЖК в гидролизатах ЛПС.

Для электронной микроскопии использовали клетки C. indoltheticum, негативно окрашенные фосфорно-вольфрамовой кислотой, и ультратонкие срезы клеток.

Токсичность ЛПС и ЛА проверяли на мышах линий С-57 и BALB/c, сенсибилизированных D-галактозамином. 50%-ные летальные дозы (LD50) рассчитывали по методу Новотного.

Индукцию синтеза ФНО- изучаемыми препаратами проводили in vitro на цельной крови человека. Содержание ФНО- определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тестсистем. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью tкритерия Стьюдента.

3.1 Влияние экзогенных и эндогенных факторов на липидный состав Y.

В жизненном цикле бактерий - факультативных паразитов, типичным представителем которых является Y. pseudotuberculosis, обязательна реализация двух фаз: фазы пребывания в организме хозяина (паразитической) и фазы существования во внешней среде (сапрофитной). Важная роль в адаптации бактерий к изменяющимся условиям роста принадлежит липидам.

Сравнительный анализ липидов бактерий псевдотуберкулеза, испытывающих влияние различных абиотических (температура, источник углерода, способ культивирования и фаза роста) и биотических (плазмидные ДНК) факторов, был начат с характеристики липидного состава клеток холодовой культуры природного штамма, выращенных в жидкой питательной среде.

3.1.1 Характеристика липидного состава Y. pseudotuberculosis Основными липидными компонентами ГОБ являются свободные липиды, которые легко извлекаются при экстракции бактерий органическими растворителями, и ЛПС, выделение которых требует особых подходов. В холодовых культурах бактерий псевдотуберкулеза на долю первых приходилось около 5% (в пересчете на сухую массу). Большая часть из них (90%) относилась к классу ФЛ и состояла из ФЭ (89%), ФГ (6,7%) и ДФГ (1,9%). Меньшая часть суммарной фракции липидов (10%) представляла собой НЛ, основными компонентами которых были ЖК: С16:0, (31,4%), Е(9)-С16:1, (39,4%), Е(11)-С18:1 (27,5%) и С17:0cy (1,5%).

Анализ клеточного лизата с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза показал, что ЛПС выращенных на холоду бактерий псевдотуберкулеза представляют собой семейство молекул различной молекулярной массы. Они состоят из ЛПС S-формы (им соответствуют полосы в верхней части геля), ЛПС переходных SR-форм и ЛПС R-формы (интенсивно окрашенные зоны в нижней части геля) (рис. 1, линия 1). Последовательная экстракция клеток смесью 90%-ный водный фенол-хлороформ-петролейный эфир (РСР-экстракция) и горячим 45%-ным водным раствором фенола (PW-экстракция) привела к выделению двух образцов ЛПС (ЛПС-РСР и ЛПС-PW соответственно; рис. 1, линии 4, 5;

табл. 1). Они имели идентичные составы моносахаридов и ЖК (характерные для ЛПС Y. pseudotuberculosis О:1b серовара), близкие значения СП О-полисахаридов и отличались по величине СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты.

Выход и химическая характеристика различных молекулярных типов ЛПС Y.

Рис. 1. Электрофореграмма лизатов клеток и ЛПС Y. pseudotuberculosis: необработанные клетки (1), клетки после PW-экстракции (2), клетки после обработки 10%-ной АсОН (3), ЛПС-PCP (4), ЛПС-РW (5). Здесь и далее окрашивание солями серебра.

Несмотря на применение двух методов экстракции, бактерии все еще содержали ЛПС. Возможной причиной неполного извлечения ЛПС может быть взаимодействие части его молекул с белками наружной мембраны клеток с образованием липополисахарид-белковых комплексов. Действительно, обработка бактерий, остающихся после выделения ЛПС, 5%-ной трихлоруксусной кислотой (метод, используемый для извлечения комплексов ЛПС с белком), привела к получению препарата, который по своим химическим характеристикам (содержание белка -22,6%, углеводов - 43,5%) и поведению в условиях ДСН-ПААГ-электрофореза был подобен образцу, выделенному из нативных клеток.

Таким образом, ЛПС «холодового» варианта суспензионных культур Y. pseudotuberculosis различаются не только по длине цепи О-специфического полисахарида и степени гидрофобности, но и по способу существования в клетке (в комплексе с белком или в свободном виде), т.е. имеют высокую степень гетерогенности, что делает реакцию на них организма-хозяина более дифференцированной и тем самым способствует сохранению их патогенности в течение более длительного времени.

3.1.2 Новые подходы к исследованию состава ЛПС Одной из задач настоящей работы была оценка изменений в составе липидных компонентов бактерий псевдотуберкулеза, в том числе ЛПС, при изменении условий культивирования. Высокая степень гетерогенности ЛПС псевдотуберкулезного микроба, невозможность добиться их полного извлечения могли значительно затруднить характеристику изучаемых соединений и исказить полученные результаты. Для более точной оценки диапазона качественной и количественной вариабельности ЛПС под воздействием различных факторов среды были разработаны новые, менее деструктивные методы выделения и анализа его структурных элементов: О-полисахарида, ЛА и жирных кислот.

Состав ЖК ЛПС определяли, анализируя щелочные гидролизаты клеток, предварительно обработанных смесью хлороформ-метанол для удаления свободных липидов. Такая обработка значительно облегчила последующий анализ ЖК ЛПС, чему способствовало то обстоятельство, что ЛПС псевдотуберкулезного микроба не содержат ЖК, входящих в состав других мембранных липидов.

Характеристику углеводных фрагментов ЛПС проводили на препаратах ДПС, полученных путем гидролиза микробной массы 10%-ной АсОН. Такой подход обеспечивает практически полное извлечение ДПС (электрофореграмма лизата клеток, обработанных 10%-ной АсОН (рис. 1, линия 3), не содержит полос ЛПС), повышает их выход и упрощает процедуру выделения. Сравнение ДПС, полученных гидролизом бактериальных клеток и ЛПС, показало, что они имеют идентичный моносахаридный состав, содержат равные количества высокомолекулярных фракций с близкими значениями СП (12,7 и 15,0 соответственно) и не подвергаются деградации в процессе выделения.

Упрощенная схема получения ЛА включала гидролиз обезжиренных бактерий 10%-ной АсОН и последующую экстракцию клеток смесью хлороформметанол. В результате был получен препарат (ЛАAcOH, выход 0,14%, табл. 2), который по своим характеристикам оказался подобным ЛА, выделенному из ЛПС (ЛАЛПС).

Характеристики образцов липида А Y. pseudotuberculosis Препарат Содержание (мкмоль) * - Р — содержание фосфора Дополнительное, значительно большее количество ЛА (0,49%) было получено при последующей более жесткой обработке бактерий 1 М НСl (ЛАHCl).

Эта часть молекул ЛА претерпевала более существенную деградацию (потеря гликозидносвязанного фосфата и части ЖК, табл. 2).

Достоинствами описанных выше подходов к исследованию состава ЛПС Y. pseudotuberculosis являются упрощение процедуры выделения и сокращение времени анализа, что оказалось очень полезным для последующей характеристики состава и структуры липидов бактерий псевдотуберкулеза, культивируемых в различных условиях.

3.1.3 Влияние фазы роста и способа культивирования на липидный состав холодовых культур Y. pseudotuberculosis Сравнение параметров роста бактерий псевдотуберкулеза на ПБ и ПА выявило существенную разницу между ними: суспензионные культуры имели меньшее время генерации, большую удельную скорость роста и более высокий выход биомассы. Учитывая, что понятие «лучший рост» включает в себя укороченную продолжительность генерации и получение большего количества клеток в конце культивирования, можно сделать вывод, что более благоприятной средой для роста Y. pseudotuberculosis является ПБ.

При обоих способах культивирования экспоненциально растущие клетки Y. pseudotuberculosis характеризовались максимальным содержанием свободных липидов (рис. 2а), причем во всех фазах роста уровень НЛ в клетках превышал уровень ФЛ (рис. 2б). У суспензионных и колониальных культур изменение содержания ФЛ по мере старения клеток имело противоположную направленность: при росте клеток в ПБ наблюдалось уменьшение количества ФЛ, на ПА — увеличение.

Рис. 2. Cодержание (а) липидов в клетках (в % на сухую массу) и относительное содержание (б) НЛ и ФЛ в липидных экстрактах (в % от суммы липидов) Y. pseudotuberculosis, выращенных на ПА и в ПБ и находящихся в разных фазах роста.

Суспензионные и колониальные культуры имели одинаковый качественный состав ФЛ (табл. 3). ФЭ был основным ФЛ на протяжении всего периода роста культур только на ПА.

Влияние способа культивирования и фазы роста на содержание ФЛ и ЖК в клетках Y. pseudotuberculosis.

Е(2)-С14: - U/S+C - Индекс ненасыщенности ЖК, определяли как отношение ненасыщенных ЖК (U) к насыщенных (S) и циклопропановых (C).

При росте клеток на ПБ, начиная с середины стационарной фазы, преобладающим ФЛ становился ДФГ. По мере старения клеток доля ФГ в общей фракции липидов уменьшалась. Обращает на себя внимание низкое содержание ФЭ на всех стадиях роста (25-44 и 26-51% для ПБ и ПА соответственно).

Частично это компенсировалось высоким уровнем производных ФЭ, причем в суспензионных культурах их содержание было в 2-4 раза больше, чем в колониальных.

При культивировании иерсиний псевдотуберкулеза на плотной среде в фазе линейного роста и в ранней стационарной фазе наблюдался аномально высокий уровень ЛФЭ (35,9 и 18,2% соответственно, табл. 3). Присутствие ЛФЭ в липидных экстрактах, как известно, является результатом действия эндогенной фосфолипазы, активность которой зависит от возраста культуры и наиболее высока в конце экспоненциальной фазы и при переходе к стационарной фазе. Высокое содержание ЛФЭ в клетках, растущих на агаре, видимо, связано с более высокой ферментативной активностью колониальных культур и может способствовать повышению проницаемости клеточных мембран в период интенсивного деления клеток.

Преобладающими ЖК в клетках обеих культур были С16:0, Е(9)-С16:1, Е(11)-С18:1, С17:0cy и 3-ОН-С14:0 кислоты (табл. 3). Общее содержание ненасыщенных ЖК на обеих средах и на всех стадиях роста заметно превышало содержание насыщенных, что, видимо, связано с низкой температурой культивирования бактерий в этих экспериментах. Колониальные культуры имели более высокий индекс ненасыщенности ЖК, чем суспензионные.

При обоих способах культивирования максимальное количество ненасыщенных ЖК наблюдалось в фазе линейного роста. Напротив, клетки в логарифмической фазе имели низкий индекс ненасыщенности. Таким образом, в клетках быстро растущих культур Y. pseudotuberculosis при переходе от одной стадии роста к другой липидный состав клеточных мембран и, по-видимому, их свойства, претерпевают существенные изменения.

Содержание ЛПС в клетках (его определяли по количеству 3-ОН-С14: кислоты в щелочных гидролизатах бактерий, табл. 3) зависело от фазы роста, при этом динамика изменений у колониальных и суспензионных культур была различной (рис. 3).

кислоты в клетках Y. pseudotuberculosis, выращенных в питательном бульоне и на питательном агаре, в зависимости от фазы роста.

У бактерий, растущих на ПБ, наблюдалось постепенное увеличение количества 3-ОН-С14:0 кислоты, которое достигало максимального значения в ранней стационарной фазе. В колониальных культурах ее содержание (с незначительными колебаниями) оставалось постоянным, но и в фазе линейного роста и в стационарной фазе было выше, чем в суспензионных культурах. В результате, в клетках, растущих на агаре, содержание ЛПС было выше, чем в клетках, растущих в ПБ.

Лизаты клеток суспензионных и колониальных культур Y. pseudotuberculosis при проявлении их солями серебра давали подобные электрофореграммы (рис. 4). По мере старения клеток у обеих культур наблюдалось увеличение количества высокомолекулярной фракции ЛПС, о чем свидетельствует усиление интенсивности окрашивания полос ЛПС в верхней части геля (рис. 4, линии 6-10 и 1-5 соответственно).

ФЛР РСФ СФ ПСФ

Рис. 4. Электрофореграммы лизатов клеток Y. pseudotuberculosis, выращенных в питательном бульоне (1-5) и на питательном агаре (6-10) в разных фазах роста: логарифмической (1, 6), линейного роста (2, 7), ранней стационарной (3, 8), стационарной (4, 9), поздней стационарной (5, 10).

Рис. 5. Степень полимеризации ДПС бактерий Y. pseudotuberculosis, выращенных в питательном бульоне и на питательном агаре, в различные фазы роста.

У лизатов колониальных культур интенсивность окрашивания полос ЛПС была выше, чем у суспензионных. Из этого следует, что клетки, растущие на агаре, синтезируют ЛПС с более длинными углеводными цепями, чем суспензионные. Действительно, ДПС бактерий псевдотуберкулеза, выращенных на плотной среде, имели более высокие значения СП (в среднем в 2 раза), чем ДПС клеток, растущих в жидкой питательной среде (рис. 5). При обоих способах культивирования максимальные значения СП были у ДПС, выделенных из клеток, находящихся в стационарной фазе роста.

Сравнительную характеристику ЛПС суспензионных и колониальных культур проводили на образцах, выделенных из клеток, находящихся в ранней стационарной фазе. Хотя содержание ЛПС у обеих культур в этой фазе роста было приблизительно одинаковым (рис. 3), из клеток, растущих в виде колоний, ЛПС выделялся с более высоким выходом (табл. 4).

ЛПС имели идентичный набор моносахаридов и близкие значения СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты. СП О-полисахаридов ЛПС, выделенных из клеток, растущих в виде колоний, в среднем более чем в два раза превышали СП полимеров, полученных из клеток, растущих на ПБ (табл. 4). Видимо поэтому из бактерий, растущих на плотной среде, ЛПС выделялись с более высоким выходом.

Характеристики ЛПС Y. pseudotuberculosis, выращенной на ПБ и ПА

ПБ ПА ПБ ПА ПБ ПА

- В расчете на сухую микробную массу.

Таким образом, в колониальных культурах Y. pseudotuberculosis липидный синтез проходит более интенсивно, чем в суспензионных: в них выше доля общих липидов и ФЛ; они имеют более высокий индекс ненасыщенности ЖК; ЛПС, выделенные из них, характеризуются более высокими значениями СП О-полисахаридов. При обоих способах культивирования содержание свободных липидов и ЛПС в клетках зависит от фазы роста бактерий.

3.1.4 Влияние температуры культивирования и плазмидного профиля на липидный состав бактерий псевдотуберкулеза Роль температуры и плазмидных ДНК в биосинтезе липидов Y. pseudo- плазмидой р57 (57 ), с плазмидой pVM82 (82 ) и штамм, содержащий плазмиды pVM82 и pYV (82+48+). Все эксперименты, описанные в этой главе, проводились на суспензионных культурах, находящихся в стационарной фазе роста, за исключением экспериментов по изучению роли плазмиды вирулентности, в которых использовались колониальные культуры в фазе линейного роста, выращенные на холоду.

“Холодовые” варианты всех изогенных производных давали более высокие выходы биомассы, чем соответствующие “тепловые” варианты (табл. 5).

Тем не менее, на фоне общего для всех «тепловых» вариантов угнетения роста выход биомассы у штамма (82+) был на 25% выше.

Бесплазмидный штамм и штамм (57+), выращенные при 37 °С, имели высокое содержание ФЛ (табл. 5, колонки I, II и IV, V соответственно). При обеих температурах роста преобладающим ФЛ был ФЭ. Однако у «тепловых» вариантов бактерий его относительное содержание было значительно ниже. Количество ФГ в клетках оставалось постоянным при обеих температурах роста, в то время как уровень ДФГ увеличивался вдвое при повышении температуры до 37 °С. Напротив, количество ФЭ, а также отношение ФЭ к сумме ФГ и ДФГ в клетках штамма (82+) не зависело от температуры культивирования (табл. 5, колонки III, VI). Полученные данные позволяют говорить, что плазмида pVM отменяет отмеченную выше температурную регуляцию биосинтеза липидов у бактерий псевдотуберкулеза.

Выход биомассы и состав липидов изогенных штаммов Y. pseudotuberculosis при различных температурах культивирования

I II III IV V VI VII VIII

•* - Выход биомассы рассчитывали в г на 1 л культуральной жидкости.

Важную роль в способности бактерий приспосабливаться к смене температуры играют ЖК. У бактерий Y. pseudotuberculosis (табл. 6) наблюдалась обычная для ГОБ адаптивная реакция на повышение температуры роста: понижение уровня ненасыщенных ЖК и повышение содержания циклопропановых и насыщенных кислот.

Степень ненасыщенности ЖК бактерий, культивируемых при 37 °С, зависела от их плазмидного профиля: плазмидосодержащий штамм (82+) имел в раза более высокий индекс ненасыщенности ЖК, чем штаммы (57+) и (82-).

Учитывая, что у иерсиний увеличение текучести и проницаемости бактериальных мембран для гидрофобных агентов коррелирует с инвазивностью бактерий, можно предположить, что плазмида pVM82, повышающая индекс ненасыщенности ЖК, играет важную роль в способности бактерий псевдотуберкулеза проникать в организм хозяина и в их вирулентности.

Влияние температуры и плазмидного профиля на состав жирных кислот Y. pseudotuberculosis.

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV

* - Количество 3-ОН-С14:0 кислоты определяли по сумме 3-ОН-С14:0 и Е(2)–С14:1 кислот.

- U/S+C - Индекс ненасыщенности ЖК определяли как отношение ненасыщенных ЖК (U) к сумме насыщенных (S) и циклопропановых (C) кислот.

Изменение температуры культивирования оказывает значительное влияние на ЛПС. В клетках «тепловых» вариантов Y. pseudotuberculosis не синтезируются ЛПС с длинной углеводной цепью (рис. 6, линии 4-6). Это отличает их от других представителей сем. Enterobacteriaceae, синтезирующих при °С длинноцепочечные ЛПС и, видимо, вызвано разной стратегией выживания различных патогенов в организме теплокровных.

ЛПС “холодовых” вариантов плазмидосодержащего (82+) штамма и бесплазмидного производного были во многом подобны. Лизаты клеток обоих штаммов давали идентичные ЛПС профили в ДСН-ПААГ электрофорезе (рис.

6, линии 1, 2), они содержали и из них извлекались равные количества ДПС, ЛПС-PW и ЛПС-РСР, характеристики которых (СП, СА, высокая активность в реакции с антителами к О-ПС) также были довольно близки (табл. 7).

Характеристики ДПС и ЛПС изогенных штаммов Y. pseudotuberculosis теристика Образец * - В % на сухую массу бактерий;

** - ЛПС = ЛПС-РСР+ЛПС-РW.

извлекались только ЛПС-PW, клетки (82+) штамма содержали оба типа ЛПС молекул. «Тепловой» вариант плазмидосодержащего штамма (82+) характеризовался более высоким содержанием ЛПС и более высоким выходом ДПС и ЛПС, которые имели в своем составе короткие О-ПС, благодаря чему проявляли умеренную активность в реакции с антителами к О-специфическому полисахариду. ЛПС бесплазмидного производного были неактивны в этом тесте.

Следует сказать, что с повышением температуры культивирования штаммов (82+) и (82-) уменьшалась СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты как в составе бактерий (С12:0/3-OH-С14:0 и Е(2)-С14:1/3-OH-С14:0, табл. 6), так и в составе ЛПС (табл. 7). Это объясняет, почему из тепловых культур не извлекались (или извлекались с низким выходом) ЛПС-РСР.

Наименьшее влияние температуры на ЛПС было обнаружено у штамма (57+). Оба температурных варианта этих бактерий характеризовались низким содержанием и низким выходом ЛПС, которые практически не содержали О-полисахаридов (СП ЛПС этих бактерий составляла всего 0,5-1,1) и имели низкие значения СА остатков 3-ОН-С14:0 (табл. 7).

Таким образом, низкая температура культивирования создает более благоприятные условия для репродукции бактерий псевдотуберкулеза, что может способствовать выживанию внеорганизменных популяций этого микроорганизма. Синтез липидов является термозависимым процессом и контролируется хромосомными генами. В присутствии плазмиды pVM82 зависимость липидного биосинтеза от температуры не обнаружена. Наблюдаемые различия в составе ФЛ “тепловых” вариантов штаммов (57+) и (82-), с одной стороны, и производного, содержащего плазмиду pVM82, с другой, позволяют сделать заключение, что за отмену терморегуляции отвечает фрагмент плазмидной ДНК с молекулярной массой 25 мДа. Влияние температуры на синтез ЛПС снижалось в ряду: штаммы (82-) (82+) (57+). На этом основании был сделан вывод, что гены, подавляющие зависимость синтеза ЛПС от температуры, находятся на 57 мДа фрагменте плазмиды pVM82, фрагмент 25 мДа частично восстанавливает терморегуляцию.

Что касается плазмиды вирулентности, сравнение липидных экстрактов штаммов (82+) и (82+48+) показало между ними мало различий, за исключением необычно низкого для колониальных культур в фазе линейного роста содержания ЛФЭ в клетках штамма (82+48+) (табл. 5, колонки VII, VIII). По-видимому, плазмида pYV не участвует в синтезе липидов бактерий псевдотуберкулеза (по крайней мере, при выращивании их на холоду), что согласуется с данными, полученными ранее для другой бактерии рода Yersinia, Y. enterocolitica. Присутствие плазмиды вирулентности не оказывало влияния и на ЛПС “холодовых” вариантов бактерий псевдотуберкулеза: содержание, выход и структурные характеристики (СА и СП) ЛПС, выделенных из штаммов (82+48+) и (82+), оказались идентичными (табл. 7).

3.1.5 Влияние глюкозы на состав липидов Y. pseudotuberculosis «Холодовые» варианты бактерий псевдотуберкулеза, культивируемые на белковом гидролизате (ПБ) и на белковом гидролизате с добавлением глюкозы (ПБ+Glc), содержали примерно равные количества свободных липидов (табл. 8). Однако относительное содержание ФЛ и НЛ в липидных экстрактах было разным. Максимальное количество ФЛ (4,6%) синтезировалось в клетках, культивируемых на среде, содержащей глюкозу (табл. 8). Преобладающим ФЛ, на долю которого приходилось 78,9% от суммарной фракции ФЛ, был ФЭ.

Выход микробной массы, свободных липидов и ЛПС и относительное содержание индивидуальных ФЛ для Y. pseudotuberculosis, выращенных на глюкозосодержащем и безглюкозном питательном бульоне при различных температурах ФЭ/ФГ+ДФГ На среде, не содержащей глюкозы, наблюдалось подавление синтеза ФЛ, количество которых уменьшалось до 1,7% (табл. 8). Доля ФЭ снижалась до 44%, уровень ФГ оставался неизменным, количество ДФГ увеличивалось. В результате в клетках, растущих на ПБ, отношение незаряженных цвиттерионных ФЛ к сумме отрицательно заряженных оказалось более чем в три раза меньше, чем в клетках, выращенных на глюкозосодержащем ПБ.

В клетках «тепловых» вариантов бактерий присутствие глюкозы в среде роста ингибировало синтез ФЛ, количество которых значительно (в 2 раза по сравнению с клетками, растущими на безглюкозной среде) уменьшалось (табл. 8). Кроме ФЭ, ФГ и ДФГ, присутствующих в липидных экстрактах бактерий, выращенных на ПБ, в липидных экстрактах Y. pseudotuberculosis, культивируемой на среде ПБ+Glc, были обнаружены ЛФЭ и ФЛ-Х.

Липидные экстракты этих клеток содержали значительно меньше ФЭ, количество ДФГ оставалось постоянным, доля ФГ увеличивалась с 2,4% (ПБ) до 8,9% (ПБ+Glc) (табл. 8). Отношение нейтральных липидов к кислым падало до величины, характерной для клеток, растущих на холоду в отсутствие глюкозы.

На обеих средах уменьшение общего количества ФЛ происходило в основном за счет ингибирования синтеза ФЭ.

Присутствие глюкозы в среде роста не влияло на синтез ЛПС: на обеих средах синтезировалось одинаковое количество молекул ЛПС, которые извлекались с одинаковым выходом, имели один и тот же моносахаридный состав и близкие значения СП О-полисахарида (табл. 8). Сохранялась и обычная для Y. pseudotuberculosis зависимость состава ЛПС от температуры: при 37 °С в клетках синтезировалось несколько больше молекул ЛПС, преобладающим становился синтез ЛПС с укороченной углеводной цепью.

3.2 Структура липида А Y. pseudotuberculosis: влияние температуры Как следует из представленных выше данных, условия культивирования бактерий псевдотуберкулеза оказывают большое влияние на состав ЖК липидного фрагмента ЛПС, ЛА. Изучение химического состава ЛА из холодовой культуры показало, что он содержит два остатка глюкозамина (GlcN), ~ два (1,8 моля) остатка фосфорной кислоты, два остатка 3-ОН-С14:0 кислоты с амидным типом связи и по одному остатку 3-ОН-С14:0 и 3-додеканоилокситетрадекановой кислот, имеющих сложноэфирный тип связи.

В спектре ЯМР 13С монофосфорилированного производного ЛА Y. pseudotuberculosis область резонанса аномерных атомов С представлена синглетом при 92,4 м.д. (атом С1 GlcNI, находящегося в -конфигурации и не имеющего заместителя при этом атоме углерода; табл. 9).

Данные спектров ЯМР 1Н и 13С монофосфорилированного ЛА «холодового»

варианта суспензионной культуры Y. pseudotuberculosis * - Для этих сигналов JC, P = 7,2 Гц.

Сигналы при 102,1, 102,2 и 102,5 м.д. соответствуют атомам С1' трех молекулярных форм ЛА, невосстанавливающий конец которых имеет -ориентацию. Анализ спектра ЯМР 13С в области резонанса атомов С2 3-гидрокси- и 3-ацилоксиалкановых кислот и данные корреляционных спектров ЯМР 1Н и 13С демонстрируют присутствие в ЛА остатков 3-гидроксикислот, имеющих сложноэфирный (43,0 - 43,5 м.д., ацилируют гидроксильные группы при атомах С и С3' дисахаридной молекулы) и амидный (44,3 — 44,8 м.д., ацилируют аминогруппы при атомах С2 и С2') тип связи, а также сложноэфирносвязанной 3-ацилоксикислоты (39,0 м.д., ацилирует, предположительно, гидроксильную группу при атоме С3' глюкозаминобиозы).

(-) ESI масс-спектр монофосфорилированного производного ЛА (рис. 7а) содержит серию отличающихся по величине m/z гомологичных пиков, соответствующих гекса-, пента-, тетра-, три- и диацильным молекулам (табл. 10), что указывает на высокую степень гетерогенности изучаемого образца.

Рис. 7. (-) ESI (а) и (-) MS2 ESI (б) масс-cпектры монофосфорилированного ЛА «холодового» варианта Y. pseudotuberculosis.

Состав ионов в (-) ESI и MS2 ESI масс-спектрах липида А [M (2•GlcN + 6•3-OH-C14:0 + 1•H3PO4) – H]M (2•GlcN+4•3-OH-C14:0 + 1•C12:0 + 1•C13:0 + 1•H3PO4) – H]- 1758,9 1688,7 1563,4 1507,0 1325,0 1280,8 1098,7 1261, 1061,6 *- Интенсивность сигнала Анализ состава фрагмент-ионов, образующихся при распаде молекулярного иона с m/z 1506,0, в спектре MS2 ESIMS (рис. 7б, табл. 10) показывает, что три из пяти остатков ЖК ЛА Y. pseudotuberculosis имеют сложноэфирный тип связи, два (остатки 3-ОН-С14:0 кислоты, ион при m/z 872,1) — амидный.

Присутствие в спектре пиков ионов с m/z 835 и 508, которые образуются при фрагментации молекулы ЛА по типу 04А2, доказывает, что 3-додеканоилокситетрадекановая кислота находится при атоме С3' GlcNII.

На основании полученных данных предлагается вариант структуры ЛА Y. pseudotuberculosis, изображенный на рис. 8.

Анализ монофосфорилированного ЛА, выделенного из клеток «теплового» варианта, методом ESIMS (рис. 7б) показал, что основной молекулярной формой этого образца является тетраацильное производное, не содержащее остатков ацилоксиалкановой кислоты. Таким образом, повышение температуры культивирования бактерий псевдотуберкулеза приводит к уменьшению СА ЛА и ЛПС в целом.

Следует сказать, что в отличие от ЛПС некоторых других бактерий сем.

Enterobacteriaceae, в которых на холоду синтезируется С16:1 кислота, ЛПС и ЛА обоих температурных вариантов Y. pseudotuberculosis не содержат ненасыщенных ЖК. Можно предположить, что в ЛПС этих бактерий функции мононенасыщенных ЖК, препятствующих плотной упаковке углеводородных цепей и способствующих уменьшению температуры фазовых переходов, выполняют 3ацилоксиалкановые кислоты, количество которых в холодовых культурах значительно увеличивается.

3.3 Влияние условий культивирования на патогенный потенциал Значительные изменения в составе липидных компонентов бактерий псевдотуберкулеза, происходящие под воздействием различных факторов, дают основание предполагать, что клетки, выращенные в разных условиях, будут отличаться по своему патогенному потенциалу. Степень патогенности бактерий рода Yersinia характеризуют, используя С12:0/С16:0 и С14:0/С16: отношения ЖК. При этом бактерии с максимальным патогенным потенциалом имеют минимальные значения этих отношений.

«Холодовые» варианты Y. pseudotuberculosis имеют более низкие значения отношения С14:0/С16:0 (табл. 6, рис. 9а), что свидетельствует об их более высоком патогенном потенциале в сравнении с бактериями, выращенными при 37 °С. Это хорошо согласуется с ранее полученной информацией о том, что бактерии псевдотуберкулеза, выращенные на холоду, имеют значительно более низкую LD50, чем их «тепловые» варианты.

При культивировании на ПА наибольший патогенный потенциал псевдотуберкулезный микроб имел в фазе линейного роста, ранней стационарной и стационарной фазах роста (табл. 6, рис. 9б). Бактерии, выращенные на ПБ, обладали высоким патогенным потенциалом, сравнимым с таковым для колониальных культур, только в стационарной фазе роста.

Рис. 9. Графическое изображение степени патогенности Y. pseudotuberculosis как отношение жирных кислот С12:0/С16:0 и С14:0/С16:0 в зависимости от (а) плазмидного профиля бактерий и температуры культивирования («х» и «т» -«холодовой» и «тепловой» варианты соответственно) и (б) способа культивирования и фазы роста.

Роль эндотоксически активного фрагмента ЛПС выполняет ЛА, который для проявления максимального токсического эффекта должен иметь гексаацильный тип структуры (СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты в таких молекулах близка к 50%). Определение острой токсичности ЛПС различного состава показало, что ЛПС-1, 2 и 3, имеющие высокие значения СА (55, 41, 45% соответственно), были более токсичны (в 28, 5 и 1,5 раза соответственно), чем ЛПС-4, СА которого составляет всего 28,5%) (табл. 11).

Влияние различных факторов на величину LD50 ЛПС Y. pseudotuberculosis Несмотря на довольно близкие значения СА, ЛПС-1, 2 и 3 проявляли различную токсичность, которая усиливалась по мере увеличения СП О-полисахарида (табл. 11). Максимальной токсичностью обладал ЛПС-1, имеющий самую длинную углеводную цепь (СП=16). Следовательно, длина цепи О-ПС играет важную роль в проявлении ЛПС токсических свойств.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что низкая температура и рост Y. pseudotuberculosis на плотных агаризованных средах, условия, при которых клетки быстрее достигают максимального патогенного потенциала и дольше его сохраняют, являются селективными факторами, усиливающими патогенность этих бактерий. Способность колониальных культур, растущих на холоду, синтезировать ЛПС с длинной О-специфической цепью, высокой СА остатков 3ОН14:0 и высокой токсичностью делает клетку более устойчивой к действию защитных факторов макроорганизма и, следовательно, более вирулентной.

Таким образом, показано, что липиды Y. pseudotuberculosis представляют собой динамичную систему, способную изменять свой состав и свойства под влиянием различных факторов среды. Особый интерес вызывает структурная модификация ЛПС и его липидного фрагмента, поскольку именно они участвуют в развитии процессов, приводящих к эндотоксическому шоку. Анализ литературы показывает, что природные штаммы ГОБ синтезируют нетоксичные формы ЛА, способные ингибировать эндотоксические реакции патогенных микроорганизмов, т.е. выступать в роли антагонистов эндотоксинов, поиск которых в последнее время значительно активизировался. Перспективным источником антагонистов эндотоксинов на основе ЛА необычной структуры могли бы быть морские бактерии, которые стали объектом представленных ниже исследований.

3.4 Липиды А морских грамотрицательных бактерий 3.4.1 Общая характеристика липидов А морских ГОБ Первичная характеристика ЛА разнообразных морских бактерий (17 видов, принадлежащим трем семействам и одном роду), типичных обитателей морской среды, проводилась с помощью ТСХ (рис. 10), которая выявила существенные различия между ними.

В зависимости от хроматографического поведения и степени гетерогенности изучаемые ЛА условно можно разделить на четыре группы. Максимальную хроматографическую подвижность проявляют ЛА бактерий рода Chryseobacterium (рис 10, линия 2). Вторая группа включает ЛА бактерий рода Marinomonas (M. communis и M. vaga, рис. 10, линии 4,5), которые также имеют высокую подвижность. ЛА бактерий родов Alteromonas, Idiomarina и Pseudoalteromonas с низкой хроматографической подвижностью (рис. 10, линии 7-15) образуют третью группу. В отличие от относительно гомогенных ЛА трех вышеперечисленных групп бактерий, ЛА четвертой группы (в ее состав входят ЛА Marinomonas mediterranea, Shewanella algae и Vibrio fluvialis), проявляют высокую степень гетерогенности (рис. 10, линии 3, 1, 16).

Рис. 10 ТСХ липидов А морских грамотрицательных бактерий, где 1 — S. algae, 2 — C. indoltheticum, 3 - M. mediterranea, 4 - M. communis, 5 - M. vaga, 6 - Y. pseudotuberculosis, 7 - A. macleodii, 8 – P. nigrifaciens, 9 - P. tetraodonis, 10 -P. atlantica, 11 — I. zobellii, 12 - P. espejiana, 13- P. haloplanktis, 14 - P. elyakovii, 15 - P. undina, 16 - V. fluvialis.

Как было сказано выше, морские бактерии, из которых были выделены изучаемые ЛА, принадлежат трем семействам (Alteromonadaceae, Flavobacteriaceae и Vibrionaceae) и одному роду (Marinomonas), что соответствует количеству (четыре) наблюдаемых ТСХ-профилей. По-видимому, существует корреляция между таксономическим положением бактерий и поведением выделенных из них ЛА в условиях ТСХ. С другой стороны, многообразие ТСХ-профилей ЛА морских бактерий предполагает разнообразие соответствующих им химических структур, что делает перспективным их дальнейшее более детальное исследование.

«Морские» ЛА содержат GlcN, фосфатные группы и ЖК (табл. 12). Состав ЖК зависит от видовой принадлежности микроорганизмов. ЛА бактерий рода Marinomonas оказались гомогенными по составу 3-гидроксиалкановых кислот. ЛА бактерий рода Chryseobacterium содержали два вида кислот этого типа. Другие ЛА имели более сложные профили 3-гидроксиалкановых кислот.

Особенно сложный состав этих кислот (до шести ЖК этого типа) был обнаружен в ЛА бактерий рода Pseudoalteromonas.

Химический состав ЛА некоторых морских протеобактерий Компонент Кислота С12:0 была основной и единственной нормальной кислотой в большинстве изучаемых образцов. ЛА бактерий рода Chryseobacterium и ЛА M. mediterranea не содержали нормальных ЖК. Гидролизаты ЛА морских бактерий практически не содержали транс-E(2)-ненасыщенные ЖК, что является косвенным доказательством отсутствия ацилоксиалкановых кислот со сложноэфирным типом связи в составе молекул «морских» ЛА.

3.4.2 Липиды А бактерий рода Pseudoalteromonas IAM 14160T В настоящем исследовании представлены данные структурного изучения ЛА трех видов бактерий рода Pseudoalteromonas: P. haloplanktis IAM 127915T, P. nigrifaciens IAM 13010T и P. tetraodonis IAM 14160T.

Как следует из данных, представленных в табл. 12, ЛА P. haloplanktis содержит два остатка GlcN, две фосфатные группы и пять остатков ЖК. Анализ спектра ЯМР 13С в области резонанса карбонильных атомов С (табл. 13а) подтвердил наличие пяти остатков ЖК. Четыре сигнала в области резонанса атомов С2 3-гидроксиалкановых кислот (41 - 44 м.д.) указывают на присутствие в молекуле ЛА четырех остатков упомянутых кислот. Три из них имеют свободные гидроксильные группы (в спектре присутствует по три сигнала в области резонанса атомов С3 (~ 68 м.д.) и С4 (~ 37 м.д.) 3-гидроксиалкановых кислот).

Данные спектров ЯМР 13C и 1Н липида А P. haloplanktis а).

Сигналы атомов С3 и С4 четвертого остатка 3-гидроксикислоты смещены в слабое и сильное поля (71 и 34 м.д. соответственно), что доказывает присутствие ацильного заместителя в этом остатке кислоты. Ацилоксикислота имеет амидный тип связи, о чем свидетельствует величина ХС сигнала ( м.д.) одного из атомов С2 3-гидроксиалкановых кислот.

В спектрах ЯМР ЛА P. haloplanktis в области резонанса аномерных атомов С (табл. 13б) и Н (табл. 13в) GlcN присутствует по два сигнала, величины ХС которых свидетельствуют об - (94,9 и 5,5 м.д., JH1, H2 = 3,0 Гц) и - (100,8 и 4,7 м.д.; JН1', Н2' = 7,9 Гц) конфигурациях остатков GlcNI и GlcNII соответственно. Сдвиг сигнала атома С1 в слабое поле, мультиплетность сигналов атомов С1 (JС1, Р = 4,6 Гц), С2 (JС2, Р = 8,4 Гц) и Н1 (JH1, P = 6,5 Гц) указывают на присутствие фосфатной группы при атоме С1.

Положение второго остатка фосфорной кислоты определяли, анализируя область резонанса кольцевых атомов С3 - С5 GlcN в спектре ЯМР 13С (табл. 13б). Расщепление сигналов при 72,4 (JС3’,P = 4,6 Гц), и 75,1 м.д. (JС5’,Р = 2,3 Гц), которые были отнесены к атомам С3' и С5, указывает на присутствие остатка фосфорной кислоты в положении С4' (73,8 м.д.). Более узкие сигналы при 73,3, 71,2 и 68,0 м.д. принадлежат атомам С3, С5 и С4 GlcNI, который имеет гидроксильную группу при атоме С4. Величина ХС метинового протона H4 (3,57 м.д., табл. 13в) также указывает на отсутствие заместителя в этом положении.

Значения ХС атомов H2, H2', Н3, Н3' и Н4' показывают, что обе аминогруппы, а также гидроксильные группы при атомах С3, С3' и С4' глюкозаминобиозы имеют замещение. Анализ области резонанса атомов С2 GlcN (52- м.д., табл. 13б) спектра ЯМР 13С подтверждает выводы о замещении гидроксильных групп при атомах С2 и С3 обоих остатков GlcN. Область резонанса атомов С6 GlcN со свободной гидроксильной группой представлена одним сигналом (60,6 м.д.). Сигнал второго атома С6, согласно данным DEPT-135 экспериментов, смещен в область 68,2 м.д., что демонстрирует наличие -1,6-связи в ЛА P. haloplanktis.

Расположение ЖК в дисахаридной молекуле определяли с помощью масс-спектрометрии (рис. 11), используя образец ЛА, полученный обработкой 0,1 М HCl для удаления гликозидносвязанного фосфата.

Рис. 11 (слева). (-) FAB масс-спектр монофосфорилированного производного липида А P. haloplanktis АТСС 14399Т.

Рис. 12 (справа). Структуры липидов А (а) P. haloplanktis, (б) P. nigrifaciens и (в) P. tetraodonis, где (а) R = 3-OH-11:0, 3-OH-12:0, 3-OH-13:0, 3-OH-iso-11:0, 3-OH-iso-12:0, (б) R = 3-OH-10:0, 3-OH-11:0, 3-OH-12:0, 3-OH-13:0, 3-OH-14:0, 3-OH-iso-12:0, (в) R = 3-OH-10:0, 3-OH-11:0, 3-OH-12:0, 3-OH-13:0, 3-OH-iso-11:0, 3-OH-iso-12:0.

В (-) FAB масс-спектре полученного препарата присутствуют пики фрагмент-ионов (m/z 626, 640, 654, 668), которые состоят из одного остатка GlcN, одного остатка фосфорной кислоты и двух остатков 3-гидроксиалкановых кислот. Поскольку все четыре иона имеют в своем составе фосфатную группу, был сделан вывод, что они принадлежат GlcNI, который, таким образом, содержит два из пяти присутствующих в ЛА остатков ЖК. Три других ацильных заместителя локализуются на восстанавливающем конце ЛА.

Мягкая щелочная обработка с последующим более жестким щелочным гидролизом полученного частично дезацилированного препарата позволила установить, что аминогруппы ЛА ацилированы остатками 3-ОН-С12:0 и 3-додеканоилоксидодекановой кислот, остальные ЖК имеют сложноэфирный тип связи.

С учетом этой информации был предложен вариант структуры ЛА P. haloplanktis, изображенный на рис. 12а. Согласно данным общего химического анализа (табл. 12), спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии липиды А P. nigrifaciens и P. tetraodonis имеют аналогичные структуры, но отличаются набором ЖК (рис. 12б и 12в соответственно).

3.4.3 Липид А бактерии Idiomarina zobellii KMM 231T Рис. 13. MALDI-TOFMS спектр липида А I. zobellii ЛА I. zobellii содержит два остатка GlcN, один остаток фосфорной кислоты и пять остатков ЖК (табл. 12). В (-) MALDI-TOFMS спектре этого ЛА (рис.

13) присутствуют серии пиков, соответствующие его пента-, тетра- и триацильным формам. Частично дезацилированные производные образуются в результате последовательной потери двух остатков 3-ОН-С11:0 кислот, что свидетельствует о сложноэфирном типе связи этой кислоты. Остатки более длинной 3-гидрокси-изо-тридекановой кислоты, по-видимому, ацилируют аминогруппы глюкозаминобиозы. Присутствие в спектре иона с m/z 654,1 позволяет сделать заключение, что фосфорилированный остаток GlcN несет два остатка ЖК, 3-ОН-С11:0 и 3-ОН-С13:0, нефосфорилированный - три.

3.4.4 Липид А бактерии Shewanella algae ЛА бактерии S. algae состоит из двух остатков GlcN, одного остатка фосфорной кислоты и шести остатков ЖК (табл. 12) и, таким образом, в отличие от ранее изученных «морских» ЛА имеет гексаацильный тип структуры.

Он характеризуется высокой степенью гетерогенности как по составу 3-гидроксиалкановых ЖК, так и по разнообразию молекулярных форм (рис. 14).

Анализ (-) ESIMS спектра ЛА S. algae подтверждает его дисахаридную природу, наличие одной фосфатной группы и гексаацильный тип структуры (рис.

14).

Рис. 14. (-) ESI масс-спектр липида А S. algae.

В масс-спектре присутствуют также ионы пента- и тетраацильных форм ЛА. Они образуются в результате потери остатков С13:0 и 3-ОН-С13:0 кислот, которые, по-видимому, являются вторичными ЖК, ацилирующими сложноэфирносвязанные 3-гидроксиалкановые кислоты.

3.4.5 Липиды А бактерий рода Marinomonas В рамках данной работы было предпринято изучение ЛА трех видов бактерий рода Marinomonas: M. communis ATCC 27118T (ЛА M.c.), M. mediterranea АТСС 700492Т (ЛА M.m.) и M. vaga ATCC 27119T (ЛА M.v.).

Общий химический анализ (табл. 12) изучаемых соединений показал, что каждое из них содержит два остатка GlcN, пять остатков ЖК и одну (ЛА M.c. и ЛА M.v.) или две (ЛА M.m.) фосфатных группы.

3.4.5.1 Липиды А бактерий M. communis и M. vaga Спектры ЯМР 31P ЛА M.c. и M.v. содержат по одному сигналу, значения ХС которых (-0,36 и -2,0 м.д. соответственно) предполагают, что фосфатные группы являются монофосфатами и находятся при атоме С1 глюкозаминобиозы. Дублетные сигналы атомов Н1, С1 и С2 в спектрах ЯМР 1Н и 13С (табл. 14) также указывают на присутствие гликозидносвязанного фосфата. Восстанавливающий и невосстанавливающий концы глюкозаминобиозы имеют - и -пиранозидные конфигурации, о чем свидетельствуют величины ХС аномерных атомов Н и С ЛА M.c. и M.v.

Данные спектров ЯМР 1H и 13C липидов А M. сommunis и M. vaga GlcNII * - Отнесения этих сигналов могут быть взаимообратимыми.

Поскольку спектры ЯМР 1H и 13С ЛА M.c. и M.v. оказались очень похожи (табл. 14), дальнейшее их описание проводилось на примере ЛА M.c. Величины ХС сигналов протонов H2 и H2' (4,16 и 3,66 м.д. соответственно) указывают на присутствие в ЛА двух ациламиногрупп. В 1H-13C HSQC спектре эти сигналы коррелируют с сигналами атомов С2 GlcN, положение которых (52,6 м.д. и 56,6 м.д. соответственно) подтверждает наличие связей углерод – азот, а также позволяет сделать заключение, что гидроксильная группа при атоме C восстанавливающего конца ЛА M.c. имеет заместитель, в то время как гидроксильная группа при атоме C3' GlcNII не замещена Положение сигналов атомов Н3 и Н3' хорошо согласуется с таким предположением.

Сигналы метиновых H4, H3', и H4' и двух метиленовых протонов H6' находятся в области 3–4 м.д., что свидетельствует об отсутствии заместителей при атомах C4, C3', C4' и C6'. Корреляция протонов H6a и H6э с атомом С6' указывает на 1',6-гликозидную связь между остатками GlcN.

ЛА M.c. и M.v. содержат по пять остатков ЖК (табл. 12). Три (один – двойной интенсивности) -CH2-мультиплета в спектре 1H–13C HSQC указывают на присутствие четырех остатков 3-гидроксиалкановых кислот. Два из них не имеют замещения (им соответствует сигнал атома Н2 двойной интенсивности при 4,05 м.д., образующий COSY кросс-пики с мультиплетами протонов -CH2-звена при 2,46 м.д. и сигналами протонов -CH2-звена при 1,51 м.д. Сигналы при 5,19 и 5,28 м.д., перекрестно взаимодействующие с мультиплетами протонов -CH2-звена (2,50 и 2,62 м.д.) и сигналами протонов -CH2-звена (1,60 и 1, м.д.), принадлежат протонам -CH-звеньев от двух остатков 3-ацилоксидекановой кислоты. Обе ацилоксиалкановые кислоты имеют амидный тип связи.

Более точно положение остатков ЖК было определено с помощью MС (рис. 15). В (-) FABMS спектрах обоих ЛА присутствуют фрагмент-ионы, которые соответствуют монофосфорилированным производным GlcNI, ацилированным одним (фрагмент-ионы с m/z 428,3 и 410,9) или двумя (фрагмент-ионы с m/z 598,4 и 580,7) остатками 3-OH-С10:0 кислоты и одним остатком негидрокси кислоты (C10:0 или C12:0; фрагмент-ионы с m/z 751,7, 752,5).

Рис. 15. FAB-масс-спектры (а) отрицательных и (б) положительных ионов липида А M. communis.

Следовательно, три из пяти присутствующих в ЛА ЖК находятся на восстанавливающем конце молекулы. Одна из них (3-OH-С10:0) имеет амидный тип связи, две других (С12:0 (С10:0) и 3-OH-С10:0) – cложноэфирный.

В (+) FAB масс-спектрах ЛА M.c. (рис. 15б) и M.v. присутствуют важные для их структурной оценки диагностические пики ионов с m/z 520,56 (ЛА M.v.) и 502,43 и 502,59 (для ЛА M.c. и M.v. соответственно). Они состоят из одного остатка GlcN и двух остатков 3-OH-С10:0 кислоты и являются оксониевыми ионами, получающимися из невосстанавливающего конца дисахаридной молекулы (GlcN II) в результате разрыва гликозидной связи. Оба остатка 3-OHС10:0 кислоты находятся при атоме C2', поскольку, как следует из данных спектроскопии ЯМР (табл. 14), гидроксильные группы при атомах C3', C4' и C6' GlcN II являются свободными. Присутствие в (+) FAB масс-спектре ЛА M. vaga пиков с m/z 332,41 и 314,41, которые получаются из фрагмент-ионов с m/z 520,56 и 502,59 в результате потери остатка 3-OH-С10:0 кислоты, показывает, что этот остаток кислоты имеет сложноэфирный тип связи и ацилирует гидроксильную группу амидносвязанной 3-OH-С10:0 кислоты.

Исходя из совокупности полученных данных, предлагается следующий вариант структуры для ЛА M. communis и M. vaga (рис. 16а и 16б соответственно).

3.4.5.2 Липид А бактерии M. mediterranea АТСС 700492Т ЛА M.m. состоит из двух остатков GlcN, двух остатков фосфорной кислоты и пяти остатков (R)-3-ОН-С10:0 кислоты (табл. 12). MALDI-TOF и FAB массспектры отрицательных ионов этого ЛА (рис. 17) содержат пик молекулярного иона (m/z 1350), состав которого хорошо согласуется с данными химического анализа. Ионы низкой интенсивности с m/z 1546 и 1530 указывают на присутствие в анализируемом образце некоторого количества гексаацильных молекул.

Величины ХС атомов С1 (95,0 м.д.) и С1' (101,3 м.д.) в спектре ЯМР 13С (рис. 18а) предполагают, что GlcNI и GlcNII ЛА M.m. имеют - и -конфигурации соответственно. Присутствие в области резонанса атомов С6 одного сигнала (62 м.д.) свидетельствует о том, что атом С6' участвует в образовании связи между остатками GlcN. ХС сигналов атомов С2 (51,8 м.д.) и С2’ (53,9 м.д.) указывают на присутствие в данном ЛА двух ациламиногрупп, а также позволяет сделать заключение, что гидроксильная группа при атоме C восстанавливающего конца ЛА M.m. ацилирована остатком ЖК, в то время как гидроксильная группа при атоме C3' GlcNII не имеет заместителя.

Рис. 17. (-) MALDI-TOF (а) и (-) FAB (б) масс-спектры липида А M. mediterranea.

В спектре ЯМР 31Р ЛА M.m. (рис. 18б) присутствуют два сигнала, что предполагает наличие двух фосфатных групп в составе его молекул. Одна из фосфатных групп находится при атоме С1 молекулы ЛА (в спектре ЯМР 31Р присутствует сигнал с величиной ХС -1,60 м.д.), другая, предположительно, фосфорилирует атом С4 дисахаридной молекулы.

Рис. 18. Спектры ЯМР (а) 13С и (б) 31Р липида А из M. mediterranea Анализ спектра ЯМР 13С в области резонанса атомов С2 3-гидроксиалкановых кислот (рис. 18а) подтвердил наличие пяти остатков ЖК такого типа.

Три из них имеют сложноэфирный тип связи (в спектре присутствуют три сигнала при 41,6, 41,9 и 42,0 м.д.), два других – амидный (сигнал двойной интенсивности при 40,5 м.д. для атомов С2 3-гидроксикислот с амидным типом связи). Отсутствие в спектре ЛА сигнала с величиной ХС 44 м.д. позволяет сделать вывод о том, что обе амидносвязанные ЖК имеют замещение по гидроксильной группе. Гидроксильная группа ЖК со сложноэфирным типом связи не замещена (в спектре нет сигнала с величиной ХС 38 м.д.).

На основании полученных данных для ЛА M. mediterranea предлагается структура, изображенная на рис. 16в, которая отличается от структуры ЛА двух других бактерий рода Marinomonas наличием двух (а не одной, как у других ЛА) фосфатных групп и отсутствием нормальных ЖК. Следует отметить одну особенность, общую для всех изученных ЛА бактерий рода Marinomonas:

присутствие в составе их молекул необычной амидносвязанной ацилоксиалкановой кислоты, состоящей из двух остатков 3-ОН-С10:0 кислоты, которая ранее в составе ЛА не встречалась.

3.4.6 Липиды А бактерий рода Chryseobacterium Объектами исследований в этой части работы стали ЛА типовых штаммов C. indolthеticum CIP 103168T (ЛА C.i.) и C. scophthalmum CIP 104199Т (ЛА C.s.) Попытки выделить ЛА из бактерий C.i. и C.s стандартным для этого класса соединений подходом, в основе которого лежит гидролиз ЛПС, изолированных из клеток фенол-содержащими системами различной степени гидрофобности, разбавленной АсОН, оказались неудачными. Обработка клеток 10%ной АсОН (100 °С) с последующей экстракцией смесью хлороформ-метанол была более эффективной и привела к выделению препаратов (выходы 0,65 и 0,60% для C.i. и C.s. соответственно), содержащих фосфор, D-GlcN и ЖК ((R)-3-ОН-изо-15:0 и (R)-3-ОН-изо-17:0, табл. 12), что указывает на принадлежность полученных соединений к ЛА.

В (-) FAB масс-спектрах ЛА C.i. и C.s. (рис. 19а и 19б соответственно) присутствуют пики молекулярных ионов с m/z 766,3 и 766,2, содержащих по одному остатку GlcN, по одной фосфатной группе, а также 3-ОН-изо-С15:0 и 3-ОН-изо-С17:0 кислоты. Молекулярная масса 767,4948 Да, рассчитанная для формулы C38H74O12NP, хорошо согласуется с данными FABMS. CAD-Эксперименты с пиком молекулярного иона ЛА C.i., а также результаты обработки ЛА 0,12%-ным NН4OH указывают на сложноэфирный тип связи 3-ОН-изо-С15: кислоты. 3-ОН-изо-С17:0 кислота имеет амидный тип связи.

Рис. 19. FAB масс-спектры отрицательных ионов липидов А (а) C. indoltheticum и (б) C.

Более детальная структурная характеристика ЛА C.i. и C.s. была получена с помощью спектроскопии ЯМР (табл. 15), описание данных которой проводится на примере ЛА C.i. В спектре ЯМР 13C этого ЛА в области резонанса атомов С GlcN присутствуют шесть сигналов, что подтверждает его моносахаридную природу. Сдвиг в слабое поле сигналов протонов H1 (5,58 м.д.), H2 (4, м.д.) и H3 (5,20 м.д.) указывает на ацилирование гидроксильных и аминогрупп при атомах С1, С3 и С2. Сигналы остальных протонов GlcN (H4, H5, H6a и Н6э) находятся в области 3,60-3,90 м.д., что свидетельствует об отсутствии заместителей при соответствующих гидроксильных группах.

Данные спектров ЯМР 1H, 13C, и 31P* липидов А C. indoltheticum и C.

-2b 2,25 [дд, 9,7, 13,8] 2,23 [дд] -3b 2,45 [дд, 9,0, 15,5] 2,33 [дд] * - Спектры ЯМР 31Р: Р -0,83 и -0,61 м.д. для ЛА C. indoltheticum и C. scophthalmum соответственно.

Корреляция сигналов атомов Н3, Н4, Н5 с индивидуальными углеродными резонансами при 74,1, 68,8, 73,7 м.д. и сигналов атомов Н6а и Н6э с сигналом атома С6 при 62,0 м.д. подтверждает отсутствие заместителей в положениях С4 и С6. Сдвиг сигналов атомов С2 и С3 в сильное и слабое поля соответственно демонстрирует наличие ацильного заместителя при атоме С3. Малая (JC1, С2 = 5,3 Гц) и большие (JC2, С3, JC3, С4 и JC4, С5 = 8,7-10,0 Гц) величины констант расщепления указывают на то, что остатки GlcN имеют -аномерную конфигурацию с аксиальными протонами H2-H5. Положение сигналов атомов С1 (95,3 м.д.) и С2 (52,3 м.д.) подтверждает -конфигурацию остатка GlcN.

В спектре ЯМР 1Н-13С HSQC протон H2 коррелирует со сдвинутым в сильное поле сигналом при 52,3 м.д., что указывает на наличие связи углерод-азот при атоме C2. Сдвиг сигналов атомов С1 и Н1, а также расщепление сигналов атомов C1 (JC1, P = 5,5 Гц), C2 (JC2, P = 8,2 Гц) и Н1 (JН1, P = 6,7 Гц) указывают на присутствие фосфатной группы при атома С1 GlcN. Действительно, спектры ЯМР 31Р изученных ЛА содержат по одному сигналу с величинами ХС -0,83 и -0,61 м.д., что однозначно свидетельствует о присутствии гликозидносвязанных фосфатных групп в составе их молекул.

Два сигнала в области резонанса атомов С карбонильных групп (около 174 м.д.) и кросс-пики протонов -CH2-звена (2,45 и 2,51 м.д.; 2,25 и 2,33 м.д.), -CH-звена (3,93 и 3,99 м.д.) и -CH2-звена (1,45 и 1,48 м.д.) с сигналами атомов С при 44,0, 42,7, 69,3, 68,8,37,9 и 37,5 м.д. указывают на присутствие в ЛА 3-гидроксиалкановых кислот со сложноэфирным и амидным типом связи. Сигналы при 23,0 и 39,5 м.д. для терминальных СН3- и (-1)-СН-групп позволяют отнести их к ЖК изо-серии.

На основании полученных данных для ЛА C. indoltheticum. и C.

scophthalmum предлагается следующая структура (рис. 20).

3.5 Некоторые особенности состава наружной мембраны бактерий рода Как видно на рис. 20, ЛА C.i. и C.s. структурно подобны биосинтетическому предшественнику ЛА, так называемому ЛX. ЛХ накапливается в мутантных штаммах бактерий E. coli, у которых синтез ЛА блокируется на стадии моносахаридного предшественника. Присутствие ЛX в клетках коррелирует с дефицитом ФГ, анионного ФЛ, который является обязательным для нормального функционирования ГОБ. Можно предположить, что бактерии рода Chryseobacterium, синтезирующие ЛX-подобный ЛА, также не имеют ФГ в составе своих клеточных мембран. Чтобы убедиться в этом, был изучен липидный состав этих бактерий.

3.5.1 Характеристика липидного состава бактерий C. indoltheticum и С.

scophthalmum Общее содержание свободных липидов в клетках изучаемых бактерий оказалось довольно высоким (10,5 и 10,1% на сухую массу для C.i. и С.s. соответственно). Значительную часть из них (7 и 5%) составляли полярные липиды. Изучение фракции полярных липидов C.i. с помощью метода (-) ESIMS (рис. 21) показало наличие шести компонентов. В (-) ESIMS/MS спектрах двух из них (пики с m/z 688,46 и 714,48) присутствуют фрагмент-ионы с m/z 140 и 196, состав которых ([HPO4CH2CH2NH2]-) и ([CH2C(OH)CH2PO4CH2CH2NH2] соответственно) позволяет считать их производными ФЭ.

Рис. 21. ESIMS спектр отрицательных ионов фракции полярных липидов C. indoltheticum.

Три других компонента (ионы с m/z 618,45, 604,45 и 574,43) в условиях (-) ESIMS/MS образуют фрагмент-ионы с m/z 79, 333 и 350. Эти ионы являются диагностическими для редких, необычных в структурном отношении липидов, содержащих N-ацилсфингозин, замещенный остатком серной кислоты, и получивших название сульфобацинов А и Б. Ионы с m/z 604,7 и 618,7 были отнесены к двум молекулярным формам сульфобацина А (для них характерен распад с образованием фрагмент-ионов с m/z 350 (максимальная интенсивность), 392 и 333), имеющих в своем составе остатки 3-ОН-С17:0 и 3-ОН-С16: кислот. Общий вид ESIMS/MS спектра иона с m/z 574,7 и характер фрагментации доказывает принадлежность этого иона сульфобацину Б, аминогруппа которого ацилирована остатком С15:0 кислоты. Ионы, соответствующие ФГ и ДФГ, в спектрах фракции полярных липидов C.i. и C.s. обнаружены не были.

Таким образом, в отсутствие ФГ в клетках как мутантных (E. coli), так и диких бактерий (C.i. и C.s.) синтезируется ЛХ-подобный ЛА. Однако, если для E. coli отсутствие ФГ есть результат направленной мутации, то отсутствие ФГ в клетках C.i. и C.s. является особенностью липидного состава этих микроорганизмов и, возможно, бактерий рода Chryseobacterium в целом (близкородственная C. defluvii sp. также не содержит ФГ). Есть еще одна особенность, которая отличает бактерии рода Chryseobacterium от мутантных клеток E. coli:

первые, несмотря на отсутствие ФГ и ЛА (в его каноническом структурном варианте), сохраняют жизнеспособность, в то время как мутантные E. coli растут только при непермиссивных температурах.

3.5.2 Наружная мембрана бактерий рода Chryseobacterium не содержит ЛПС!?

Необычная моносахаридная структура ЛА C.i. и C.s. в сочетании с не совсем обычным способом их выделения ставит вопрос о наличии ЛПС в клетках бактерий рода Chryseobacterium. Надежным способом обнаружения ЛПС в составе ГОБ является электрофорез в полиакриламидном геле. На первый взгляд данные ДСН-ПААГ-электрофореза указывают на присутствие в клетках бактерий рода Chryseobacterium ЛПС R-формы: электрофореграммы лизатов исходных и обезжиренных клеток C.i. содержат одиночные полосы слабой интенсивности, совпадающие по подвижности с полосой R-ЛПС E. coli (рис. 22а, линии 2,3 и 9).

Рис. 22. Электрофореграмма лизатов клеток, ЛПС и КПС С. indoltheticum:

(а) 1 – лизат клеток Y. pseudotuberculosis, 2 – лизат исходных клеток С.i. 3 – лизат обезжиренных клеток С.i., 4 – лизат обезжиренных клеток С.i. после выделения из них ЛПС, – «ЛПС»-PСР С.i., 6 – «ЛПС»-PW С. i., 7 - ЛПС E. coli;

(б) 1 – «ЛПС»-PW С.i., 2 – КПС С.i.

Препараты, выделенные из клеток C.i. и C.s. традиционными для ЛПС методами экстракции (ЛПС-PW и ЛПС-РСР), дают полосы, совпадающие по подвижности между собой и с полосами клеточных лизатов (рис. 22а, линии 5, 6). Однако химический анализ PW- и PCP-экстрактов показал, что они не содержат гептоз и Кдо, практически не содержат ЖК, в том числе 3-гидроксиалкановых, и из них не выделяется ЛА, из чего можно заключить, что они не являются ЛПС (в дальнейшем они будут обозначаться как «ЛПС»). Что касается природы веществ, экстрагируемых из бактерий фенол-содержащими системами, они могут быть КПС, которые часто извлекаются вместе с ЛПС.

Исследование строения клеточной стенки бактерий C. indoltheticum с помощью электронной микроскопии (рис. 23) показало наличие наружной и цитоплазматической мембран, а также капсулы на поверхности клеток. Обработка бактерий горячей водой (один из способов получения КПС) привела к выделению препарата, который по своим характеристикам (поведение в условиях ДСН-ПААГ-электрофореза (рис. 22б, линии 2 и 1 соответственно), отсутствие ЖК и ЛА, идентичный моносахаридный состав) оказался подобным «ЛПС», выделенному ранее из этих клеток фенол-водной экстракцией.

Совокупность полученных данных показывает, что препараты, выделенные стандартными для ЛПС методами экстракции, на самом деле являются КПС. Этот факт косвенно подтверждает отсутствие (или очень низкое содержание, см. рис. 22) ЛПС в клетках изученных бактерий. Несмотря на отсутствие ЛПС, бактерии рода Chryseobacterium остаются жизнеспособными. Повидимому, присутствующие на поверхности клеток КПС берут на себя часть функций ЛПС, подобно тому, как это происходит у мутантной ЛПС-дефицитной N. meningitidis, содержащей КПС. Возможно также, что функции ЛПС (ЛА) частично выполняют сульфобацины.

3.6 Особенности структуры липидов ЛА морских ГОБ Исследование «морских» ЛА показало, что по своему химическому составу они подобны ЛА из наземных бактерий: и те, и другие содержат GlcN, фосфатные группы и ЖК, основными среди которых являются С12:0 и 3-гидроксиалкановые кислоты. В то же время «морские» ЛА имеют ряд специфических особенностей. Наиболее значимыми среди них являются пентаацильный тип структуры и низкая степень фосфорилирования многих из них (табл. 12).

Низкая степень ацилирования ЛА морских бактерий, по-видимому, обусловлена условиями их обитания. Большинство из них живет в открытом океане с его относительно низкой температурой и в силу этого проявляет свойства психротолерантных микроорганизмов, которые, как это было показано на других бактериях, синтезируют неполные, ацилдефицитные ЛА. Возможно, недоацилированый тип структуры ЛА морских бактерий определяется отсутствием ферментативных систем (или их ингибированием), участвующих в присоединении вторичных ЖК на одной из последних стадий биосинтеза ЛА и ЛПС.

Интересно, что наибольшее сходство с ЛА наземных бактерий кишечной группы проявляют ЛА S. algae и V. fluvialis, которые в отличие от других морских бактерий являются мезофилами и, как другие мезофилы, синтезируют ЛА с гексаацильным типом структуры. Некоторое сходство в структуре с ЛА наземных бактерий проявляет и ЛА M. mediterranea.

Особое место среди изученных морских микроорганизмов занимают бактерии рода Chryseobacterium, имеющие ряд особенностей, которые отличают их от большинства других ГОБ. Они не имеют ЛПС, не синтезируют ФГ и ДФГ, содержат значительные количества весьма редких сульфосодержащих липидов, ЛА, выделенный из них, обладает необычной моносахаридной структурой. Причина и биологический смысл столь значительных изменений в составе наружной мембраны бактерий рода Chryseobacterium остаются пока невыясненными.

3.7 Антиэндотоксические свойства ЛА и ЛПС некоторых морских Конечной целью структурных исследований ЛА морских бактерий был поиск потенциальных антагонистов эндотоксинов. Наличие у «морских» ЛА необычных структурных особенностей делает перспективным изучение их антиэндотоксической активности. В рамках настоящей работы были изучены некоторые биологические свойства ЛПС и ЛА морских бактерий и проведена оценка возможности их использования в качестве антагонистов эндотоксинов.

Известные к настоящему времени антагонисты эндотоксинов являются слабо токсичными или нетоксичными соединениями. Определение острой токсичности «морских» ЛА и ЛПС показало, что многие из них имели значительно более высокие 50%-ные летальные дозы для мышей, чем ЛПС энтеробактерий, а «ЛПС» и ЛА C. indoltheticum были нетоксичны во всех исследованных концентрациях (рис.24).



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«КОВАЛЕНКО ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ СОРБЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ И ИОНОВ МЕТАЛЛОВ НА УГЛЕРОДМИНЕРАЛЬНЫХ СОРБЕНТАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ САПРОПЕЛЕЙ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Тюмень – 2010 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского на кафедре...»

«ЖИТОВ Роман Георгиевич ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ПОЛИМЕР-БИТУМНЫХ КОМПОЗИТОВ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иркутск -2013 Работа выполнена в лаборатории полимеризационных процессов и органического синтеза Института нефте- и углехимического синтеза при ФГБОУ ВПО Иркутский государственный университет. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор, профессор кафедры органической химии...»

«Кулагина Галина Серафимовна ФАЗОВАЯ СТРУКТУРА В ОРГАНО-НЕОРГАНИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ ГИДРОФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ И ТЕТРАМЕТОКСИСИЛАНА Специальность 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2007 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН Научный руководитель : кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Герасимов Владимир...»

«РУСИНА ИРИНА ФЕДОРОВНА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ ИНГИБИРОВАННОГО ОКИСЛЕНИЯ 02.00.15 – кинетика и катализ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической физики им. Н.Н.Семенова РАН Научный руководитель доктор химических наук, профессор Касаикина Ольга Тарасовна Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Заиков Геннадий Ефремович...»

«Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте структурной макрокинетики и проблем материаловедения РАН (ИСМАН) Научный Кандидат химических наук, руководитель Борщ Вячеслав Николаевич Официальные Доктор химических наук, ПУГАЧЕВА Елена Викторовна оппоненты член-корреспондент РАН, Азатян Вилен Вагаршович Доктор химических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕТАЛЛИЧЕСКИХ Колесников Иван Михайлович КАТАЛИЗАТОРОВ...»

«Путилов Лев Петрович ДЕФЕКТООБРАЗОВАНИЕ И РАСТВОРЕНИЕ ВОДОРОДА В АКЦЕПТОРНО-ДОПИРОВАННЫХ ПРОТОНПРОВОДЯЩИХ ОКСИДАХ Специальность: 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокотемпературной электрохимии Уральского отделения РАН (ИВТЭ УрО РАН), г. Екатеринбург. Научный руководитель : Цидильковский Владислав...»

«МАСЯКОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СМЕСЕЙ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХЕМОМЕТРИЧЕСКИХ АЛГОРИТМОВ 02.00.02 - аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2009 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Омского государственного университета им. Ф.М.Достоевского и в лаборатории физиологии и биохимического анализа Государственного научного учреждения Сибирский...»

«КОШЕЛЕВА Екатерина Валентиновна ТВЕРДЫЕ ЭЛЕКТРОЛИТЫ В СИСТЕМАХ CaY2S4-Yb2S3 и CaYb2S4-Y2S3 Специальность: 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург - 2014 2 Работа выполнена на кафедре неорганической и физической химии ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет, г. Киров Калинина Людмила Алексеевна, Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет,...»

«ГЕРАСЬКО Ольга Анатольевна КУКУРБИТ[n]УРИЛЫ И КОМПЛЕКСЫ МЕТАЛЛОВ – СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АДДУКТЫ, КОМПЛЕКСЫ И СОЕДИНЕНИЯ ВКЛЮЧЕНИЯ 02.00.01 – неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте неорганической химии им. А.В. Николаева Сибирского отделения РАН Научный консультант доктор химических наук, профессор Федин Владимир Петрович Официальные...»

«Соловьев Павел Андреевич Синтез 5-ацилзамещенных пиримидин-2-иминов и пиримидин-2-онов 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2009 Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н.Назарова Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор Шуталев Анатолий Дмитриевич Официальные оппоненты : Доктор...»

«ГОЛЬДФАРБ ОЛЬГА ЭДУАРДОВНА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ДНК-СЕНСОР С ФЕРМЕНТАТИВНЫМ УСИЛЕНИЕМ СИГНАЛА 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2005 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина Министерства образования и науки Российской Федерации Научный руководитель...»

«Бредихин Роман Андреевич РЕАКЦИИ ПОЛИФТОРАРЕНТИОЛОВ С БРОМОМ И ГАЛОИДАЛКАНАМИ. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИФТОРАРЕНСУЛЬФОНИЛБРОМИДОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ НЕКОТОРЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ (02.00.03 – Органическая химия) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Новосибирск – 2013 1 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Полифторароматические серосодержащие соединения находят применение в оптике, электронике, технике, биохимии, медицине и сельском хозяйстве. Одним из...»

«ЛИС Алексей Валерьевич НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКОГО И ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ СО СВЯЗЬЮ КРЕМНИЙ-АЗОТ Специальность 02.00.08 – химия элементоорганических соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иркутск - 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН Научный руководитель доктор химических наук, профессор Рахлин...»

«Песенцева Мария Сергеевна ФЕРМЕНТЫ МОРСКОГО МОЛЛЮСКА Littorina sitkana: 13D-ГЛЮКАНАЗА, -D-ГЛЮКОЗИДАЗА, СУЛЬФАТАЗА И ТИРОЗИЛПРОТЕИН СУЛЬФОТРАНСФЕРАЗА 02.00.10 – Биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Владивосток – 2013   Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН и Национальном институте агрономических исследований...»

«Казакова Анна Владимировна НОВЫЕ НИЗКОРАЗМЕРНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПРОВОДНИКИ И СВЕРХПРОВОДНИКИ НА ОСНОВЕ КАТИОН-РАДИКАЛЬНЫХ СОЛЕЙ 02.00.04-физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Ягубский Эдуард Борисович Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Абашев Георгий Георгиевич...»

«БУРУХИНА ОКСАНА ВЛАДИСЛАВОВНА СИНТЕЗ ПОЛИ(СПИРО)ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ РЕАКЦИЙ 3-АРИЛМЕТИЛИДЕН-3Н-ФУРАН(ПИРРОЛ)ОНОВ С N,S- И N,N-БИНУКЛЕОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ, ДИАЗОУКСУСНЫМ ЭФИРОМ 02.00.03 – ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов - 2013 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный университет...»

«Дьяконов Владимир Анатольевич НОВЫЕ РЕАКЦИИ Al- И Mg-ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ОЛЕФИНАМИ, АЛЛЕНАМИ И АЦЕТИЛЕНАМИ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ КОМПЛЕКСАМИ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ 02.00.03 – органическая химия 02.00.15 – кинетика и катализ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук УФА – 2012 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте нефтехимии и катализа РАН Научный консультант : доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН...»

«ВАСИЛЬЕВА Марина Юрьевна ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ЭТИЛЕНА НА БИС(ФЕНОКСИИМИННЫХ) КОМПЛЕКСАХ ТИТАНА РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2009 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Санкт-Петербургском филиале Института катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения РАН Научный руководитель :...»

«Неганова Маргарита Евгеньевна ПРОИЗВОДНЫЕ АЛКАЛОИДА СЕКУРИНИНА И ИЗОАЛАНТОЛАКТОНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ Специальность 02.00.10 – биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка 2012 Работа выполнена в лаборатории нейрохимии ФАВ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ Российской академии наук. Научный руководитель : кандидат...»

«Парфенова Людмила Вячеславовна МЕХАНИЗМЫ РЕАКЦИЙ ГИДРО-, КАРБО- И ЦИКЛОМЕТАЛЛИРОВАНИЯ АЛКЕНОВ С ПОМОЩЬЮ АЛЮМИНИЙОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ 5-КОМПЛЕКСАМИ Zr 02.00.15- Кинетика и катализ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Уфа-2012 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте нефтехимии и катализа РАН член-корреспондент РАН, Научный консультант : доктор химических наук, профессор Джемилев Усеин...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.