WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

на правах рукописи

Ямскова Ольга Васильевна

Свойства мутантов пенициллинацилазы из Escherichia coli по

положению 145 и 149 альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета

субъединицы в реакциях ацилирования аминосоединений и

стереоселективного гидролиза амидов

02.00.15 – кинетика и катализ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2011

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М.В. Ломоносова и в отделе биокинетики НИИ физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского Научные руководители: профессор, д.х.н. Швядас В.К.

к.х.н., ст.н.с. Гуранда Д.Ф.

Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. Кочетков К.А.

профессор, д.б.н. Ефременко Е.Н.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «» марта 2011 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Использование биокатализаторов в тонком органическом синтезе находит все более широкое применение.

Привлекательность биокаталитических превращений заключается в уникальной субстратной и стереоспецифичности действия ферментов, возможности проведения реакций в “мягких”, экологически благоприятных условиях. Успешным примером является применение пенициллинацилазы из Еscherichia coli для модификации беталактамных антибиотиков как на стадии гидролиза природного пенициллина с целью получения ядра пенициллинов 6аминопенициллановой кислоты, так и на стадии ферментативного ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты с целью получения новых «полусинтетических» антибиотиков этого класса. На основании исследований последних лет, показавших высокую стереоселективность пенициллинацилазы, следует предположить, что этот фермент найдет широкое применение при получении энантиомерно чистых соединений.





Детальные исследования выявили, что пенициллинацилаза обладает широкой субстратной специфичностью и высокой стереоселективностью в реакциях ферментативного гидролиза Nфенилацетильных производных аминокислот. В то же время было установлено, что каталитическая эффективность и стереоселективность фермента дикого типа в реакциях ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также в реакциях гидролиза соответствующих N-фенилацетильных производных недостаточна для сколько-нибудь эффективного расщепления рацематов этих соединений. На основании анализа научной литературы наиболее эффективным способом улучшения свойств пенициллинацилазы дикого типа представляется введение мутаций в структуру фермента. В случае пенициллинацилазы из Еscherichia coli ранее было показано, что введением мутаций удается добиться улучшения способности фермента катализировать синтез беталактамных антибиотиков. Следует отметить, что поиск мутантных форм пенициллинацилазы с улучшенной способностью катализировать ферментативный ацильный перенос на первичные амины не может быть сведен к использованию мутаций, которые улучшали способность к синтезу антибиотиков из-за принципиальных отличий в структуре субстратов и в условиях проведения соответствующих реакций. Более того, наряду с целью улучшения каталитической эффективности, стереоселективности действия фермента, принципы регуляции которой в настоящее время практически не изучены.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось поиск мутантных препаратов пенициллинацилазы из Е.coli с увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, и в реакциях стереоселективного гидролиза соответствующих N-ацильных производных. В соответствии с этим, задачами явились исследование пенициллинацилазы по положению 145, 149 альфа цепи, а также 71, 384, 385 бета цепи, в частности, получение очищенных препаратов мутантных форм пенициллинацилазы, первичная характеристика их стабильности и каталитической активности, детальные исследования каталитических свойств перспективных препаратов в реакциях стереоселективного ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, и гидролиза соответствующих N-ацильных проиводных.

Научная новизна. Впервые показана возможность улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Е.coli в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза их N-ацильных производных путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента. В частности, замена аминокислотного остатка в положении 145 альфа цепи и 71 бета цепи пенициллинацилазы приводит к существенному увеличению стереоселективности и каталитической эффективности фермента в названных ферментативных превращениях.





Практическая значимость работы. Выявлены точечные мутанты пенициллинацилазы из E.coli, характеризующиеся увеличенной стереоселективостью, эффективностью ацильного переноса на добавленный нуклеофил и каталитической активностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза соответствующих N-ацильных производных. Применение исследованных мутантов представляет интерес для целей разделения рацематов первичных аминов и аминоспиртов, а также для синтеза соответствующих энантиомерно чистых N-ацильных производных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 2006 г., на 4 Международном конгрессе «Биотехнология-2007», Москва, 2007 г., на Международной конференции «Ломоносов-2007», Москва, 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень международных конференциях и 1 заявка на патент.

Объем и структура работы. Дисертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 141 ссылку. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 25 рисунков.

В качестве объектов исследования был выбран ряд мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета субъединицы, в качестве предмета исследования – стереоселективность и каталитическая эффективность действия мутантных ферментов в реакциях ацилирования первичных аминосоединений, в особенности аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза соответствующих амидов. Выбранные замены аминокислот (рис.1) представляют собой наиболее перспективные точки введения мутаций исходя из ранее накопленного опыта исследований пенициллинацилазы, а также из экспертного анализа структуры фермента и ориентации субстратов в его активном центре.

Рис. 1. Модельная структура фермент-субстратного комплекса нативной пенициллинацилазы и её природного субстрата – бензилпенициллина. Остатки Arg145, Phe71, Gly385 и Thr384 непосредственно участвуют в формировании участка связывания уходящей группы субстрата; Ser149 расположен на короткой петле, соединяющей Ca-связывающий участок и активный центр фермента.

пенициллинацилазы могут обладать более высокой каталитической активностью и стереоселективностью в исследуемых реакциях по сравнению с ферментом дикого типа.

Получение ферментных препаратов (факультет биохимии Гронингенского Института биомолекулярных наук и биотехнологии, Гронингенский Университет, Нидерланды).

Культуры клеток продуцентов мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli Gly385Ser Phe71Leu, Gly385Ser Phe71Leu Arg325Cys, Gly385Leu Phe71Leu, Thr384Asn Ser149Arg были получены в энзимологии Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова). Для получения мутантных форм пеницилинацилазы культуральной жидкости около 0,8 ед. ОП ( 600 нм) в объёме 250 мл (питательная среда 2YT, объём колбы 1 л) в присутствии 0,2 мМ хлорамфеникола и 0,1 мМ индуктора изопропил--Dтиогалактопиранозида, 2 мМ ионов кальция, 5 г/л глицерина и глюкозы, при 15°С. Клетки отделяли центрифугированием. Фермент выделяли из клеток методом осмотического шока. Выход составлял 230 мг активного фермента с 1 литра среды.

Дальнейшую очистку препаратов пенициллинацилазы проводили методом гидрофобной хроматографии. К полученному раствору концентрации 1,5 М. Образец наносили на колонку Butyl-Toyopearl содержащий 1,5 М сульфата аммония. Элюирование проводили в линейном градиенте 1,5-0 М (NH4)2SO4 при использовании 50 мМ представлена на рис. 2.

Рис. 2. Хроматограмма очистки прерарата пенициллинацилазы Ser149Lys методом гидрофобной хроматографии. Привитая фаза: Butyl-Toyopearl 650M (пик пенициллинацилазы указан стрелкой).

Фракции, обладающие пенициллинацилазной активностью, объединяли, обессоливали и концентрировали примерно до содержания активных центров пенициллинацилазы равного около 10 мкмоль/л.

Концентрацию активных центров мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием препарата фермента необратимым ингибитором (рис. 3).

Рис. 3. Титрование активных центров препарата мутантной формы пенициллинацилазы Ser149Glu необратимым ингибитором подтверждали высокую чистоту препаратов фермента (рис. 4). Фактор очистки для стадии хроматографии составлял около 6,9, выход фермента около 65%. Фактор очистки на последующей стадии Рис. 4. Фотография гель-электрофореза в денатурирующих условиях препаратов пенициллинацилазы. Дорожка 1 – клеточный лизат, дорожка 2 – контрольный образец пенициллинацилазы дикого типа, дорожка 3 – маркёры молекулярного веса белков 97 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 30 кДа, 20,1 кДа; дорожки 4, 5, – очищенные препараты мутантных форм Ser149Ala, Ser149Lys, Ser149Glu соответственно, дорожка 7 – препарат мутантной формы пенициллинацилазы Ser149Ala, полученный после экстракции осмотическим шоком.

обессоливания составлял около 2,1, а общий выход пенициллинацилазы в результате проведения всех стадий выделения и очистки составлял около 50%.

Каталитическая активность мутантных форм ферментативного гидролиза цветного субстрата п-нитро-мкарбоксианилида фенилуксусной кислоты (табл. 1). Было найдено, что все полученные мутантные формы фермента являются высоко активными. Более того, большинство препаратов мутантных форм превосходят по каталитической эффективности нативный фермент в 2- раза. Наиболее активными в исследуемом ряду являются ферменты с точечными мутациями Phe71Leu и Ser149Arg. Все полученные препараты мутантов пенициллинацилазы обладали достаточно высокой каталитической активностью и представляли интерес для дальнейших исследований.

Таблица 1. Кинетические параметры ферментативного гидролиза п-нитро-мкарбоксианилида фенилуксусной кислоты Препарат пенициллинацилазы * мутация по положению 325 -субъединицы произошла случайно в процессе проведения сайт-направленного мутагенеза.

Стабильность мутантных форм пенициллинацилазы в реакциях стереоселективного гидролиза амидов и ацилирования аминосоединений, наряду с каталитической активностью препаратов важное значение имеет их стабильность в области нейтральных значений pH – в оптимуме каталитической активности, а также в щелочной среде (pH около 10), где достигаются условия депротонирования аминогрупп высокоосновных аминосоединений.

В ходе выделения и очистки препаратов мутантных форм пенициллинацилазы было выявлено, что ферменты с двойными и тройными заменами (Gly385Ser Phe71Leu, Gly385Ser Phe71Leu Arg325Cys, Gly385Leu Phe71Leu) являются весьма нестабильными, поэтому дальнейшее исследование их каталитических свойств не проводилось.

каталитической активности (pH 7-8) при пониженных температурах, поэтому для сравнения их стабильности инактивацию проводили при температуре (табл. 2), соответствующей температурному рассмотренных случаях инактивация фермента протекала согласно кинетике реакции первого порядка. Величины константы скорости инактивации отличались в 2-3 раза разнонаправлено относительно величины для нативного фермента. Если при комнатной температуре ферменты в течение суток сохраняли 100% активности, то при 50оС нативный препарат пенициллинацилазы терял половину активности примерно за 25 минут, а наиболее стабильный мутантный фермент Ser149Glu – за 55 минут.

В области высоких значений pH (pH 10,3, 25oC) инактивация исследуемых ферментов также подчинялась кинетике реакции первого порядка. В этих условиях исследуемые препараты пенициллинацилазы были значительно менее стабильны – период полуинактивации нативного фермента составлял приблизительно 7 минут, а для наиболее стабильного препарата Ser149Glu – приблизительно 11 минут (табл. 2).

Можно заметить, что замена аминокислотного остака в положении Ser149 на положительно заряженные статки Lys и Arg приводит к наиболее сильному эффекту дестабилизации структуры фермента в увеличивается в 2-3,5 раза) и, напротив, введение отрицательно заряженного остатка в данном положении приводит к наибольшей стабилизации пенициллинацилазы с понижением констант рН- и термоинактивации приблизительно в 2 раза.

Таблица 2. Стабильность мутантных форм пенициллинацилазы в условиях оптимума каталитической активности и в щелочной среде.

Введение же алифатического аланина не влияет на стабильность электростатическое взаимодействие с положительно заряженной группой фермента в окружении остатка 149 альфа-цепи способствует конформации пенициллинацилазы.

Каталитические свойства мутантных форм пенициллинацилазы в реакции гидролиза амидов В литературе субстратная специфичность и стереоселективость пенициллинацилазы из E.coli по отношению к N-фенилацетильным производным аминокислот объясняется в рамках трёхцентровой модели связывания субстрата в активном центра фермента, согласно которой выделяют участок связывания ацильной группы субстрата (1), участок связывания бокового радикала (2) и участок связывания карбоксильной группы при взаимодействии с N-фенилацетильными производными S-аминокислот (3). На участке 1 реализуются чрезвычайно эффективные гидрофобные взаимодействия, на участке – относительно слабые гидрофобные взаимодействия, а на участке 3 – электростатические взаимодействия карбоксильной группы с положительно заряженным аминокислотным остатком фермента. При связывании R-энантиомеров N-фенилацетильных производных аминокислот происходит «неправильное» связывание фрагментов амидной части субстрата на участках 2 и 3. Этим объясняется, с одной стороны, высокая каталитическая эффективность и стереоселективность фермента в ряду N-ацильных производных аминокислот и, с другой стороны, низкая каталитическая активность и стереоселективность ферментативного гидролиза N-ацильных производных аминов и аминоспиртов.

Проведенные исследования показали, что исследуемые мутантные формы пенициллинацилазы не имеют ощутимых преимуществ по сравнению с нативным ферментом в реакциях ферментативного гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, в частности, производного аспарагиновой кислоты, для которого наблюдаются наименьшие значения стереоселективности и константы специфичности в ряду N-фенилацетильных производных -аминокислот. Однако при ферментативном гидролизе N-ацильных производных первичных аминов и аминоспиртов стереоселективность мутантных форм Arg145Leu и Phe71Leu в ряде случаев существенно превышала стереоселективность нативной пенициллинацилазы.

Таблица 3. Стереоселективность ферментативного гидролиза Nфенилацетильных производных аминоспиртов под действием нативной пенициллинацилазы и ее мутантной формы Phe71Leu (pH 7,5, 25C, 0,01 M KH2PO4, 0,1 M KCl).

*В скобках указан активный энантиомер субстрата.

Таблица 4. Стереоселективность нативной пенициллинацилазы и ее мутантных форм Phe71Leu и Arg145Leu в реакциях гидролиза N-(R)манделил-производных аминосоединений (pH 7,5, 25oC) аминобутанол фенилаланинол Исследование субстратной специфичности и стереоселективности мутантных форм Arg145Leu и Phe71Leu показало, что данные замены стереоселективность фермента по потношению к N-ацильным стереоселективности достигало 2-6 раз, а в отдельных случаях наблюдали смену активного энантиомера.

пенициллинацилазы в реакции ацильного переноса пенициллинацилазой из E.coli, была определена «минимальная»

кинетическая схема (рис. 5) и количественные критерии, которые следует использовать при скрининге каталитических свойств и характеристике препаратов мутантных ферментов с улучшенными свойствами.

Рис. 5. “Минимальная” кинетическая схема активированного ацильного переноса, катализируемого пенициллинацилазой из E.coli. E – фермент, S – донор ацильной части, N - нуклеофил; ES, EP – комплекс фермента с субстратом и продуктом синтеза; EA – ацилфермент, EAN – комплекс ацилфермент-нуклеофила; P1 – продукт, выделяющийся при образовании ацилфермента; P2 – продукт гидролиза ацилфермента.

Согласно данной схеме, при ферментативном ацильном переносе на нуклеофил, молекула воды выступает в качестве конкурентного нуклеофила. В результате переноса на молекулу воды образуется побочный продукт и, следовательно, эффективность синтеза целевого продукта снижается. Эффективность мутантных форм в качестве катализаторов ацильного переноса можно оценить путём определения соотношения начальных скоростей накопления продуктов синтеза (перенос на добавленный нуклеофил) и гидролиза (перенос на молекулу воды).

Особый интерес представляет реакция синтеза ампициллина в результате ферментативного ацильного переноса амида R-фениглицина на ядро пенициллинов 6-аминопенициллановую кислоту. Скрининг «синтетической» активности мутантных форм пенициллинацилазы путём определения соотношения начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза в реакции синтеза ампициллина (табл. 5) показал, что замена аминокислотного остатка Ser149 альфа цепи приводит к улучшению эффективности ферментативного ацильного переноса на 6-аминопенициллановую кислоту.

Таблица 5. Эффективность ацильного переноса амида R-фенилглицина на 6аминопенициллановую кислоту, катализируемого мутантными формами пенициллинацилазы (рН 6.3; 25C безбуферная среда, концентрация нуклеофила 93 мМ, ацильного донора 100 мМ).

Препарат Соотношение начальных скоростей накопления пенициллинацилазы продуктов синтеза и гидролиза Для наиболее эффективных мутантных форм пенициллинацилазы в реакции синтеза ампициллина были определены кинетические параметры синтеза в соответствии с «минимальной» кинетической схемой:, отражающий специфичность пенициллинацилазы к ампициллину в сравнению с ацильным донором, 0, отражающий относительную реакционную способность нуклеофила в отсутствие гидролиза ацилфермент-нуклеофильного комплекса, и параметр, превращении ацилфермент-нуклеофильного комплекса (см. табл. 6).

Таблица 6. Значения ключевых кинетических параметров ферментативного синтеза ампицилина, катализируемого пенициллинацилазой (рН 6.3; 25C, концентрация ацильного донора 100 мМ).

пенициллинацилазы Таблица 7. Синтез ампициллина в гомогенной системе, катализируемый пенициллинацилазой (рН 6,3; 25C, амид R-фенилглицина 50 мМ, 6аминопенициллановая кислота 50 мМ).

По сравнению с диким типом мутантные формы Ser149Arg и Ser149Arg Thr384Asn обладают более высокими значениями 0 и более низкими значениями. Параметр для обеих мутантных форм почти в 2 раза ниже, чем в случае нативного фермента, что свидетельствует о меньшей подверженности гидролизу тройного ацилфермент-нуклеофильного комплекса. Двухточечная мутантная форма Ser149Arg Thr384Asn превосходит другие формы по способности катализировать синтез ампициллина. Увеличение выхода ампициллина было подтверждено экспериментально, а также при математическом моделировании протекания реакции на основании определенных значений ключевых кинетических параметров реакции (табл. 7).

Эффективность и стереоселективность мутантных форм пенициллинацилазы в реакции ацильного переноса на высокоосновные первичные аминосоединения Важной задачей настоящего исследования был поиск мутантных форм пенициллинацилазы с увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью в реакциях ацилирования высокоосновных первичных аминосоединений, в частности, первичных аминов и аминоспиртов. Скрининг ацилтрансферазной способности исследуемых мутантов в реакциях ацилирования таких соединений выявил две наиболее перспективные формы пенициллинацилазы – Arg145Leu и Phe71Leu.

Таблица 8. Кинетические параметры ацильного переноса на высокоосновные аминосоединения, катализируемого пенициллинацилазой (0,1 М фенилацетамида; 0,1 М H3BO3, рН 9,5, 25°С).

S-Фенилглицин S-Фенилглицинол S-Метиловый эфир S-Фенилэтиламин *Реакцию проводили при рН 8,0.

ферментативного ацилирования аминосоединений (табл. 8) показывают, что при использовании мутантной формы Arg145Leu в качестве катализатора для всех аминосоединений наблюдается увеличение нуклеофильности в 2-17 раз. Наименьшее увеличение наблюдается в случае аминокислоты, а наибольшее – в случае аминоспирта и метилового эфира аминокислоты. Следует отметить, что в случае всех исследуемых препаратов пенициллинацилазы для аминосоединений, за ислючением аминокислот, в исследуемом интервале концентраций параметр равен 0. Этот факт имеет принципиальное значение, поскольку в этом случае эффективность ацильного переноса можно увеличивать пропорционально увеличению концентрации аминокомпонента в реакционной среде и таким образом добиваться наиболее высоких выходов целевого продукта.

Тем не менее, несмотря на высокую способность мутантной формы Arg145Leu катализировать ацильный перенос на различные высокоосновные аминосоединения (таблица 9), улучшения стереоселективности ацилирования эфиров аминокислот по сравнению Таблица 9. Энантиоселективность ацилирования эфиров аминокислот R- и Sамидом миндальной кислоты (10 мМ KH2PO4, рН 8,0, 25°С) (±)-Метиловый эфир аланина (±)-Этиловый эфир валина (±)-Метиловый эфир лейцина (±)-Метиловый эфир *В скобках указаны активные энантиомеры.

с нативным препаратом не достигается. Хотя начальные скорости синтеза целевого продукта в данных реакциях в случае мутантной формы Arg145Leu, как правило, выше, чем для нативного фермента (в отдельных случаях в сотни раз), стереоселективность реакции ацилирования ниже в 1,5-5 раз, чем в случае нативного фермента.

Таблица 10. Кинетические параметры ферментативного стереоселективного ацилирования рацемата 2-аминобутанола амидом R-миндальной кислоты (pH 9,5, 25oC).

Наиболее существенного улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из E.coli путем введения одиночных мутаций в структуру удалось добиться в случае ферментативного ацилирования аминоспиртов (табл. 10). Мутантные формы пенициллинацилазы Phe71Leu и Arg145Leu значительно превосходили нативный фермент стереоселективности, эффективности ферментативного переноса ацильной группы на аминоспирт и скорости синтеза целевого продукта, причем улучшение вышеперечисленных параметров достигало десятки раз.

1. Показана возможность значительного улучшения каталитических свойст пенициллинацилазы из E. coli путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента.

каталитическую активность и стереоселективность в реакциях ферментативного гидролиза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективность ацильного переноса и стереоселективность в реакциях ацилирования аминоспиртов.

3. Путем замены Arg145Leu можно увеличить нуклеофильную реакционную способность аминов, аминоспиртов и эфиров аминокислот в реакциях ферментативного ацильного переноса.

4. Путем замены Ser149Arg можно увеличить нуклеофильную реакционную способность 6-аминопенициллановой кислоты в реакции ферментативного синтеза ампициллина.

5. Путем введения глутамата в положении 149 альфа-цепи можно увеличивать стабильность пенициллинацилазы.

Список публикаций 1. А.С. Ясная, О.В. Ямскова, Д.Ф. Гуранда, Т.А. Щербакова, В.И.

Тишков, Швядас В.К. «Клонирование пенициллинацилазы из Escherichia coli. Каталитические свойства рекомбинантных ферментов», Вестник московского университета, Химия, 2008, № 2, с. 127-133.

2. И.В. Шаповалова, В.Б.Л. Алкема, О.В. Ямскова, Э. де Врис, Д.Ф.

Гуранда, Д.Б. Янссен, В.К. Швядас. Мутация остатка F71 в структуре пенициллинацилазы из Escherichia coli приводит к улучшению энантиоселективности и каталитических свойств, Acta Naturae 2009, №3, 65-70.

3. О. В. Ямскова, С. В. Хороненкова С.В. Оптимизация условий культивирования, выделения и очистки мутантов пенициллинацилазы из E. сoli и исследование их каталитических свойств. Российская школаконференция «Гинетика микроорганизмов и биотехнология», МоскваПущино, 26 ноября – 2 декабря 2006.

4. O.V. Yamskova, S.V. Khoronenkova, D.F. Guranda, A.S. Yasnaya, Study of kinetic properties of different mutants of penicillin acylase from Escherichia coli. Proceedings of the 4-th Intern. Congress "Biotechnology – State of the Art & Prospects of Development", Moscow, Russia, March 12p.314-315.

5. Ясная А.С., Ямскова О.В., Хороненкова С.В. Изучение свойств мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli. «Ломоносов – 2007».

Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам, Москва, 11-14 апреля 2007, с. 502.

6. Гуранда Д. Ф., Ямскова О. В., Панин Н.В., Швядас В. К. Заявка на патент RU2009142994 «Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы», Бюллетень № 35 ФГУ ФИПС от 20 декабря 2010 г.



 
Похожие работы:

«Шамшин Дмитрий Викторович АЦИКЛИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ НУКЛЕОЗИДОВ И ИХ АМФИФИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 02.00.10 – Биоорганическая химия. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2006 Работа выполнена на кафедре Биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Василенко И.А. Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Юркевич...»

«ВАСЮТИН Олег Алексеевич ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЙ СИНТЕЗА НА АДСОРБЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ФЕРРОШПИНЕЛИ И ПОВЕРХНОСТНЫХ СВОЙСТВ ФЕРРОГРАНАТА ИТТРИЯ МЕТОДАМИ ПОТЕНЦИОМЕТРИИ И СМАЧИВАНИЯ Специальность 02.00.11 – коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного...»

«Быков Евгений Евгеньевич КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСФОРМАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛМАЛЕИНИМИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПРОТОННЫХ КИСЛОТ Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2009 Работа выполнена в лаборатории химической трансформации антибиотиков Института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе РАМН Научный руководитель : Доктор химических...»

«Романова Ирина Петровна ЭЛЕКТРОНОАКЦЕПТОРНЫЕ МОНО- И БИС-ЦИКЛОАДДУКТЫ ФУЛЛЕРЕНА С60. СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Казань – 2008 Работа выполнена в Институте органической и физической химии имени А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук...»

«Бакланова Яна Викторовна КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТАЛЛАТОВ ЛИТИЯ Li2MO3 И ОКСИГИДРОКСИДОВ MO(OH)2 (M = Ti, Zr, Hf) специальность 02.00.21 – химия твердого тела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии твердого тела Уральского отделения РАН Научный руководитель : доктор химических наук, ведущий...»

«Шоранова Ляна Олеговна ПОЖАРОБЕЗОПАСНЫЕ БЕЗГАЛОГЕННЫЕ КОМПОЗИТЫ ГИДРОИЗОЛЯЦИОННОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИОЛЕФИНОВ Специальность 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2014 г. Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский физикохимический институт имени Л.Я. Карпова, г. Москва. Научный руководитель : кандидат...»

«ТАЛИПОВ МАРАТ РИФКАТОВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ НИТРОЗООКСИДОВ 02.00.17 – Математическая и квантовая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук УФА 2006 2 Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра Российской Академии Наук Научный руководитель : доктор химических наук Сафиуллин Рустам Лутфуллович Официальные оппоненты : доктор химических наук Кузнецов Валерий Владимирович доктор...»

«Астахов Александр Владимирович СИНТЕЗ 1,2,4-ТРИАЗОЛОПИРИМИДИНОВ НА ОСНОВЕ РЕАКЦИЙ 1-ЗАМЕЩЕННЫХ 3,5-ДИАМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛОВ С 1,3-БИЭЛЕКТРОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ Специальность 02.00.03 – “Органическая химия” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Южно-Российском государственном техническом университете (Новочеркасском политехническом институте) на кафедре Технология неорганических и органических...»

«КОЗЛОВСКИЙ Анатолий Анатольевич СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХЛОРИРОВАНИЯ И ПОЛИМЕРИЗАЦИИ МОНОМЕРОВ. ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ ТВЕРДОФАЗНОГО ХЛОРИРОВАНИЯ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте проблем химической физики РАН доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Михайлов Альфа Иванович доктор...»

«СЕМЕНОВ ВЯЧЕСЛАВ ЭНГЕЛЬСОВИЧ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ УРАЦИЛА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Казань – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук Научный консультант : доктор химических наук, профессор Резник...»

«БАСОВА ЕВГЕНИЯ ЮРЬЕВНА ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 02.00.02. – Аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов – 2010 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Горячева Ирина Юрьевна Официальные...»

«СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ L АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2011 2 Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, засл. деятель науки РФ, профессор Чернова Римма Кузьминична Официальные доктор химических наук,...»

«Воскресенский Леонид Геннадьевич ПРЕВРАЩЕНИЯ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ГИДРИРОВАННЫХ ПИРИДИНОВ И АЗЕПИНОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АКТИВИРОВАННЫХ АЛКИНОВ. РАЗРАБОТКА НОВОГО ПОДХОДА К СИНТЕЗУ АННЕЛИРОВАННЫХ АЗОЦИНОВ И АЗОНИНОВ. 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва - 2009 Работа выполнена на кафедре органической химии Российского университета дружбы народов Научный консультант : доктор химических наук, профессор Варламов...»

«Петров Александр Михайлович ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСНОГО СОСТАВА ЧИСТЫХ ЦВЕТНЫХ И РЕДКИХ МЕТАЛЛОВ МЕТОДОМ ДУГОВОГО АТОМНО-ЭМИССИОННОГО АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ МАЭС 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2012 1    Работа выполнена в Государственном научном центре Государственный научно-исследовательский и проектный институт редкометаллической промышленности Гиредмет Научный руководитель : член-корреспондент...»

«ЛИ ВИТАЛИЙ МОЕСЕЕВИЧ СИНТЕЗ АЗА-ДИАРИЛЭТИЛЕНОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОТОПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЕЙ И ЛОГИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2011 Работа выполнена в лаборатории органической и супрамолекулярной фотохимии отдела нанофотоники Института проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук Будыка Михаил Федорович Официальные оппоненты : доктор химических...»

«Путилов Лев Петрович ДЕФЕКТООБРАЗОВАНИЕ И РАСТВОРЕНИЕ ВОДОРОДА В АКЦЕПТОРНО-ДОПИРОВАННЫХ ПРОТОНПРОВОДЯЩИХ ОКСИДАХ Специальность: 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокотемпературной электрохимии Уральского отделения РАН (ИВТЭ УрО РАН), г. Екатеринбург. Научный руководитель : Цидильковский Владислав...»

«Неганова Маргарита Евгеньевна ПРОИЗВОДНЫЕ АЛКАЛОИДА СЕКУРИНИНА И ИЗОАЛАНТОЛАКТОНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ Специальность 02.00.10 – биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка 2012 Работа выполнена в лаборатории нейрохимии ФАВ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ Российской академии наук. Научный руководитель : кандидат...»

«Казакова Анна Владимировна НОВЫЕ НИЗКОРАЗМЕРНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПРОВОДНИКИ И СВЕРХПРОВОДНИКИ НА ОСНОВЕ КАТИОН-РАДИКАЛЬНЫХ СОЛЕЙ 02.00.04-физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Ягубский Эдуард Борисович Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Абашев Георгий Георгиевич...»

«ДЕВЯТОВА НАДЕЖДА ФЕДОРОВНА СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ПРОДУКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МУКОХЛОРНОЙ КИСЛОТЫ С СЕРОСОДЕРЖАЩИМИ НУКЛЕОФИЛАМИ 02.00.03 - органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2008 Работа выполнена на кафедре органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И.Ленина...»

«Шайтан Алексей Константинович Компьютерное моделирование и статистический анализ самоорганизующихся молекулярных систем на основе пептидов 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2010 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.