WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ ТРАНСПОРТНО -МАТРИЧНОЙ РНК ...»

-- [ Страница 1 ] --

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ

РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ШПАНЧЕНКО Ольга Валерьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ

ТРАНСПОРТНО -МАТРИЧНОЙ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

Москва - 2010 г.

2

Работа выполнена на кафедре Химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Лаврик Ольга Ивановна доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Кочетков Сергей Николаевич доктор биологических наук, профессор Колб Вячеслав Адамович

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии им. академиков Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН

Защита состоится 26 октября 2010 г. в 16 часов на заседании совета Д 501.001. по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, стр. 40, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_сентября 2010 г.

Учёный секретарь совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биосинтез белка на рибосомах является ключевым этапом реализации генетической информации в клетке. Этот процесс, получивший название трансляция, изучают уже более полувека. За прошедшие годы накоплен огромный объём информации о структуре как самой рибосомы, так и других молекул, необходимых для синтеза белка, исследовано взаимодействие различных компонентов аппарата трансляции, охарактеризованы все этапы прохождении функционального цикла. Значение этих работ для развития современного естествознания высоко оценивается мировым научным сообществом, в 2009 году Нобелевская премия по химии была присуждена за исследования в области изучения структуры и функции рибосом. В последнее время всё больший интерес учёных вызывают вопросы, связанные с механизмами регуляции экспрессии генов, в том числе, и ролью трансляции в этом процессе.





Одним из путей, осуществляющих контроль качества белкового синтеза и регулирующих экспрессию генов на уровне трансляции в клетках прокариот, является транс-трансляция.

Транс-трансляция – уникальный механизм переключения синтеза полипептидной цепи с мРНК на матричную область тмРНК, молекулы, соединяющей в себе черты матричной РНК и транспортной РНК. Транстрансляция позволяет, с одной стороны, освободить для новых раундов трансляции рибосомы, заблокированные при трансляции мРНК без стоп-кодона, а с другой, направить на деградацию проблемную мРНК и синтезированный с неё полипептид. Активность тмРНК необходима для выживания бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды и для регуляции некоторых физиологических процессов в клетках.

Молекулу тмРНК активно исследуют на протяжении многих лет.

Способность тмРНК объединять в одной молекуле функции тРНК и мРНК, узнавать А-участок рибосомы без обычного кодон-антикодонового взаимодействия, переключать рибосому с повреждённой мРНК на открытую рамку считывания тмРНК, делает тмРНК интересным объектом исследований.

Изучение пространственной структуры тмРНК и механизма её взаимодействия с рибосомой внесет большой вклад в понимание процесса трансляции в целом.

К настоящему времени накоплен большой объём информации о процессе транс-трансляции: известны первичная и вторичная структуры тмРНК, выяснен состав системы транс-трансляции, охарактеризовано взаимодействие тмРНК с различными белковыми факторами, определена структура комплексов тмРНК с рибосомой, соответствующих начальным этапам транс-трансляции. Однако детальный механизм взаимодействия тмРНК с рибосомой неизвестен, равно как и молекулярный механизм протекания транс-трансляции.

Цель работы. Понять механизм процесса транс-трансляции и создать модель его протекания.

Задачи:

1. Выявить особенности взаимодействия тмРНК с белковыми партнерами – участниками транс-трансляции.

2. Охарактеризовать пространственную организацию тмРНК.

3. Установить роль отдельных элементов тмРНК в осуществлении различных этапов транс-трансляции.

4. Создать систему выделения тмРНК-рибосомных комплексов, остановленных на разных этапах транс-трансляции.

5. Исследовать выделенные комплексы тмРНК с рибосомой с помощью химических и физических подходов.

6. Предложить механизм прохождения тмРНК через рибосому в процессе транс-трансляции.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе работы было показано существование неканонического комплекса деацилированной тмРНК с EF-Tu•GDP, в формировании которого принимают участие нуклеотидные остатки U308 спирали 2 и U268 псевдоузла 4 тмРНК.





На основе результатов, полученных с помощью фотоаффинного химического сшивания и метода сайт-направленного мутагенеза, была предложена двухдоменная модель пространственной организации тмРНК, которая позволяет объяснить, как такая объёмная и высокоструктурированная молекула, содержащая 4 псевдоузла, проходит через рибосому в ходе транстрансляции.

В ходе выполнения работы была создана система, позволяющая блокировать транс-трансляцию in vivo на разных этапах прочтения ОРС тмРНК, и выделять соответствующие комплексы тмРНК с рибосомой. Использование данной системы позволило выделить комплексы, содержащие тмРНК, белок SmpB и рибосомы в стехиометрическом количестве, и доказать, что белок SmpB, который, как предполагалось ранее, необходим на стадии инициации транстрансляции, входит также в состав элонгационного и терминационного комплексов.

Методом криоэлектронной томографии была продемонстрирована конформационная подвижность петли тмРНК, состоящей из псевдоузлов, что объясняет сложности, возникающие при изучении структуры элонгационных комплексов тмРНК с рибосомой методом криоэлектронной микроскопии.

Исследование спектров модификаций нуклеотидов тмРНК в различных комплексах с рибосомой с помощью метода химического пробинга показало, что структура и контакты тмРНК (за исключением мРНК-подобного домена и спирали 5) практически не изменяются в ходе транс-трансляции, что подтвердило адекватность двухдоменной модели и позволило создать динамическую модель транс-трансляции.

Динамическая модель транс-трансляции позволила выявить структурный элемент (сформированный псевдоузлом 1 и петлёй А79-А86 тмРНК, и белком SmpB), который, совершая поворот при транслокации TLD тмРНК из А-участка рибосомы в Р-участок, задаёт правильное позиционирование кодона возобновления синтеза в А-участке рибосомы.

Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют не только фундаментальную научную ценность, но и могут быть использованы для прикладных разработок. Поскольку механизм транс-трансляции существует только в бактериальных клетках и необходим для проявления вирулентности некоторыми патогенными организмами, он представляется хорошей мишенью для синтеза новых антибиотиков, направленных на подавление активности тмРНК или белка SmpB. Известно, что активная концентрация для многих уже известных и широко используемых антибиотиков может быть существенно снижена при одновременном ингибировании транс-трансляции.

Результаты работы опубликованы в виде 14 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах.

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как способ остановки транс-трансляции in vivo и метод аффинного выделения полученных комплексов, могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии, как в нашей стране, так и за рубежом. Компоненты разработанной нами системы уже были предоставлены ряду коллег из зарубежных лабораторий.

Работа была поддержана грантами РФФИ, HHMI, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции: The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark; The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июня, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия; International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа – 1 сентября, 2001, Пущино, Россия; The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 – February 1, 2002, Queenstown, New Zealand; The 6th International Conference on Ribosome Synthesis “Ribosome Synthesis 2003”, June 6-10, 2003, Arcachon, France; RNA 2003, 8th Annual meeting of the RNA society, July 1–6, 2003, Vienna, Austria; The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protein Interactions", 19- августа, 2006, Московская обл., Россия; Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation, May 3-7, 2006, Roscoff, France; EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control – partnered with Cold Spring Harbor Laboratories, September 12-16, 2007, Heidelberg, Germany;

Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation, April 4-8, 2009, Roscoff, France; 34th FEBS Congress Life’s Molecular Interactions, July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic; 21st IUBMB and 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Biomolecules for Quality of life, August 2-7, 2009, Shanghai, China; Ribosome 2010, May 3-7, 2010, Orvieto, Italy.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы, приложения. Материал иллюстрирован 64 рисунками, 9 таблицами и приложениями. Библиографический указатель включает 226 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Неканоническое взаимодействие тмРНК с элонгационным фактором Tu Синтез модифицированной тмРНК Известно, что при выполнении своих функций молекулы РНК в клетке взаимодействуют с разнообразными белками. Для поиска клеточных партнеров тмРНК нами был выбран метод фотоаффинного химического сшивания. При использовании этого метода в исследуемую молекулу РНК необходимо ввести фотоаффинные аналоги нуклеотида, образующие ковалентную связь с белком и/или РНК при облучении УФ-светом. Это можно осуществить путем транскрипции РНК с соответствующей ДНК-матрицы с помощью РНКполимеразы фага Т7, заменяя один из рибонуклеозид-трифосфатов его фотоаффинным аналогом.

В данной работе в качестве реагента для фотоаффинной модификации был выбран 4-тиоуридин, который является близким аналогом уридина, хорошо включается в цепь РНК в ходе Т7-транскрипции и не вызывает существенных изменений конформации РНК. Так, молекулы 5S рРНК, содержащие 20% остатков 4-тиоуридина, успешно участвовали в реконструкции 50S рибосомных субчастиц in vitro. Полученные модифицированные 50S и субчастицы, реконструированные с использованием T7-транскрипта 5S рРНК без модификаций, проявляли одинаковую активность в синтезе полифенилаланина с использованием полиуридиновой РНК в качестве матрицы. При облучении мягким УФ-светом (330 нм) 4-тиоуридин образует так называемую «сшивку нулевой длины». Реагенты «нулевой длины» способны образовывать ковалентную связь с расположенными в непосредственной близости (на расстоянии 3-4 ) некоторыми группами РНК и белков. За редким исключением, детальный механизм фотохимических реакций неизвестен. Химическая «сшивка»

образуется преимущественно из одноцепочечного района РНК, а её образование жёстко детерминировано взаимной пространственной ориентацией фотоаффинной группы реагента и функциональных групп РНК или белка. Жёстко детерминированная пространственная структура РНК-белкового комплекса возможна только в случае их специфического взаимодействия. Таким образом, образование уникальной (по одному или немногим положениям) «сшивки»

тмРНК с белком свидетельствует об их специфическом взаимодействии.

тмРНК, содержащая по два статистически включённых остатка 4тиоуридина на молекулу, была синтезирована с помощью Т7-транскрипции по ДНК-матрице в присутствии dNTPs, 4-sUTP и -[Р32]UTP. ДНК-матрица была получена при обработке эндонуклеазой рестрикции MslI плазмиды pUC10Sa, содержащей ген тмРНК E. coli, клонированный под контроль Т7-промотора. При такой обработке получалась линейная ДНК, дающая при транскрипции 3’-конец тмРНК, соответствующий природному. Уровень включения 4-тиоуридина в молекулу тмРНК контролировали методом фингерпринтов после обработки РНКазой T2.

Выход аминоацилирования модифицированной тмРНК составлял 40%, что хорошо соотносится с данными, полученными другими исследователями.

Формирование и анализ ковалентного соединения тмРНК с белками S экстракта Для поиска белковых партнеров тмРНК использовали пост-рибосомный супернатант бактериального клеточного экстракта (S100 экстракт), дополнительно очищенный от молекул тРНК с помощью хроматографии на DEAE-сефарозе. Образование комплекса проводили в условиях, при которых тмРНК связывается с рибосомой, в присутствии GTP и системы регенерации GTP.

Радиоактивно меченую молекулу тмРНК, содержащую остатки 4-тиоуридина, облучали в реакционной смеси УФ-светом (330 нм).

Рисунок 1. Анализ продуктов реакции фотоаффинного химического сшивания в соединения тмРНК с белком от необлучённая модифицированная тмРНК; белков из S100 экстракта, его дорожка 2 – облучённая тмРНК в S100 экстрагировали из геля и после экстракте; дорожка 3 – облучённая тмРНК в S100 экстракте, обработанная Стрелками показаны полосы, соответ- разделению в тех же условиях. Только ствующие тмРНК и образовавшемуся «сшившийся» белок (или белки) изменит ковалентному соединению (Х). подвижность за счёт уменьшения молекулярной массы после удаления РНК части. Только одна белковая полоса была видна на геле после такой обработки в области миграции более легких, чем «сшивка» с тмРНК, белков. Район геля, содержащий белковую полосу, вырезали и обрабатывали трипсином. Полученные пептиды анализировали методом MALDI масс-спектрометрии 1. Большая часть пептидов соответствовала фрагментам элонгационного фактора Tu E. coli, причём идентифицированные пептиды покрывали 65% последовательности белка, что свидетельствует о том, что именно EF-Tu является основным белковым компонентом ковалентного соединения с тмРНК.

Комплекс деацилированной тмРНК с элонгационным фактором Tu в присутствии GTP или GDP При облучении УФ-светом модифицированной тмРНК в S100 экстракте выход ковалентного соединения составлял около 20%. Однако, по нашим данным Анализ проводили в сотрудничестве с М. Калкумом (Бекмановский исследовательский институт, Дуарт, США).

лишь незначительное количество тмРНК ацилировалось аланином в условиях проведения эксперимента. Высокий выход «сшивки» в отсутствие аминоацилирования позволил предположить возможность образования комплекса EF-Tu с деацилированной тмРНК. Действительно, при добавлении аланина в реакционную смесь выход аминоацилирования повышался до 10%, однако выход «сшивки» при этом не изменялся.

Взаимодействие деацилированной тмРНК с EF-Tu в присутствии GDP или GTP было исследовано методом фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры.

В контрольных экспериментах измеряли константы ассоциации комплексов PheтРНКPhe и Ala-тРНКAla с EF-Tu•GTP фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры и методом «торможения в геле». Константы ассоциации EF-Tu c тмРНК составили порядка 1x106 M-1 как в присутствии GDP, так и в присутствии GTP, что в 10-20 раз меньше, чем соответствующие константы для комплексов AlaтРНК•EF-Tu•GTP и Phe-тРНК•EF-Tu•GTP (Таблица 1).

Таблица 1. Константы ассоциации комплексов тмРНК и тРНК с EF-Tu.

тмРНК•EF-Tu•GDP тмРНК•EF-Tu•GTP Ala-тРНК•EF-Tu•GTP Phe-тРНК•EF-Tu•GTP тмРНК может взаимодействовать с EFРисунок 2. Анализ белкового компонента Tu, будет проверка необходимости ССAфотоаффинного 3’ конца для формирования ковалентного продуктов реакции химического сшивания в SDS-ПААГ комплекса (Рис. 2).

после обработки РНКазой Т1. Дорожки 1 Молекулы тмРНК без двух (CA) и 6 – суммарный белок S100 экстракта, – очищенный белок EF-Tu, 3 – белок, или четырех (ACCA) нуклеотидных сшившийся с тмРНК без ACCA-3’ конца, остатков на 3’-конце, которые 4 – белок, сшившийся с тмРНК без CA-3’ использовали далее в экспериментах по конца, 5 – белок, сшившийся с фотоаффинному химическому сшиванию, полноразмерной тмРНК. были получены с помощью реакции T7транскрипции. После очистки ковалентных соединений и гидролиза РНК с помощью РНКазы Т1 белковые составляющие «сшивки» анализировали в SDSПААГ. Видно, что подвижность полученных белков в геле соответствует подвижности EF-Tu, следовательно, укороченные формы тмРНК взаимодействуют с EF-Tu•GDP столь же эффективно, как и полноразмерная молекула тмРНК.

Является ли способность взаимодействовать с EF-Tu•GDP свойством только деацилированной тмРНК? Для проверки молекулы [32P]тмРНК, содержащие по 5±2 остатка 4-тиоуридина на молекулу, аминоацилировали с помощью [14C]Ala и использовали в экспериментах по сшиванию с EF-Tu•GDP (Таблица 2). В контрольной полосе, соответствующей несшитому образцу, соотношение 32P/14C составляло 2,7. В полосе, соответствующей «сшивке», это соотношение равнялось 2,4, что доказывает присутствие значительного количества [14C]Ala-тмРНК в ковалентном соединении, хотя деацилированной тмРНК в нём несколько больше.

Следовательно, эффективность взаимодействия элонгационного фактора Tu с обеими формами тмРНК практически одинакова.

Таблица 2. Результаты эксперимента по фотоаффинному химическому сшиванию Необычный комплекс тмРНК•EF-Tu•GDP может представлять собой новый тип взаимодействия РНК с белком EF-Tu, поэтому мы подвергли его более детальному анализу методами удлинения праймера и химического футпринтинга.

Рисунок 3. Нуклеотиды U268 (A) и U308 (Б) очищена и использована как тмРНК участвуют в образовании ковалентного матрица в реакции обратной соединения с EF-Tu•GDP. A, G, C и U – дорожки сиквенса тмРНК. X и K – дорожки, содержащие продукты реакции обратной транскрипции по количестве контроля была сшившейся с белком и несшившейся тмРНК, использована не изменившая соответственно. Стрелкой обозначена полоса, подвижность после облучения соответствующая месту остановки обратной фракция тмРНК, выделенная из транскриптазы за 1 нуклеотид до места «сшивки». того же геля.

Обратная транскриптаза не может встроить нуклеотидный остаток напротив нуклеотида, участвующего в образовании ковалентного соединения, поэтому удлинение праймера прекращалось за 1 нуклеотид до места «сшивки».

Использование в качестве контроля облучённой, но не сшившейся тмРНК обеспечивало детекцию изменений, внесенных именно образованием ковалентного соединения с белком. Обратная транскриптаза останавливалась в положении С269-С270 (Рис. 3, А) и А309 (Рис. 3, Б). Таким образом, основаниями, участвующими в «сшивании», являются U268 и U308. Появление других полос в дорожках эксперимента и контроля (Рис. 3, дорожки x и к) может быть объяснено деградацией тмРНК и/или образованием внутримолекулярных «сшивок», так как модификация 4-тиоуридином позволяет получать «сшивки»

между основаниями внутри одной молекулы РНК.

Рисунок 4. Анализ доступности остатков метода обратной транскрипции.

тмРНК действию СМСТ в комплексе с EF- Наиболее сильное изменение Tu•GDP. A, G, C и U – сиквенс тмРНК.

Дорожки 1-4 содержат продукты реакции обратной транскрипции: 1 – тмРНК в тмРНК в присутствии EF-Tu•GDP было растворе без обработки CMCT; 2 – тмРНК в отмечено в районе спирали 2 тмРНК комплексе без обработки CMCT; 3 – (Рис. 4). Реакционная способность тмРНК, модифицированная СМСТ в оснований G315 и U311 существенно растворе; 4 – тмРНК, модифицированная снижена, о чем свидетельствует CMCT в комплексе. Стрелками обозначены положения полос, показывающих усиление реакционной способности тмРНК в присутствии EF-Tu•GDP (чёрная) нуклеотидных остатках А316 и А312 в или их защиту (белая). Отмеченные полосы комплексе по сравнению с соответствуют месту остановки обратной соответствующими сигналами в транскриптазы за 1 нуклеотид от места растворе (Рис. 4, дорожки 3 и 4).

модификации.

модифицирующего агента возрастает (сравнить сигнал, соответствующий А309 в растворе и комплексе, Рис. 4, дорожки 4 и 3, соответственно). Полученные данные свидетельствует о контакте EF-Tu•GDP с данным районом тмРНК и хорошо соотносятся результатами фотоаффинного химического сшивания с нуклеотидом U308.

Нуклеотидные остатки тмРНК, защищающиеся EF-Tu•GDP от химической модификации, частично перекрываются с последовательностью ACCGA (основания 312-316 тмРНК), гомологичной сиквенсу пяти РНК-аптамеров, отобранных методом SELEX как эффективно связывающиеся с обеими формами EF-Tu (GDP и GTP) из T. thermophilus. Домен II EF-Tu был предложен как сайт взаимодействия с этими аптамерами. Он не претерпевает сильных структурных изменений при переходе EF-Tu из GTP в GDP форму и служит связывающим звеном между доменами I и III, расстояние между которыми сильно изменяется при переходе из одной формы в другую.

Последовательность ACCGA гомологична также сегменту консервативной -сарциновой петли 23S рРНК (нуклеотиды 2677-2681 в T. thermophilus). сарциновый домен важен для связывания факторов элонгации с рибосомой. сарциновая шпилька защищается от действия химических реагентов при связывании элонгационных факторов. Элонгационные факторы связывают Т7транскрипты РНК, соответствующие району спирали 42-44 23S рРНК и сарциновой шпильке. Положение EF-Tu на рибосоме было определено с помощью криоэлектронной микроскопии. Фактор контактирует с 50S субчастицей в основании L7/L12-протуберанца, в котором локализована -сарциновая шпилька.

вовлечённая во взаимодействие с EF- основания в УФ-индуцированном сшивании Tu•GDP. Большими чёрными точками консервативные в 90% маленькими – в 75%. Х – нуклеотиды, данном районе.

продуктов фотоаффинного позволяет предположить, что спираль 2 и химического сшивания. Стрелками псевдоузел 4 в молекуле тмРНК обозначены положения нуклеотидов, показывающих усиление реакционной оснований тмРНК в комплекс тмРНК•EF-Tu•GDP, отличный от способности присутствии EF-Tu•GDP (чёрная) или канонического комплекса с TLD тмРНК.

их защиту (белая).

существование второго сайта взаимодействия между EF-Tu и тмРНК из T. thermophilus, отличного от канонического. Можно предположить, что такой необычный комплекс тмРНК•EF-Tu•GDP является следствием нового и, возможно, необходимого для функционирования тмРНК в клетке типа взаимодействия. Роль подобного взаимодействия между деацилированной тмРНК и EF-Tu•GDP, в котором не принимает участия универсальный ССА-3’ конец, неизвестна. EF-Tu, возможно, придает тмРНК конформацию, необходимую для вхождения тмРНК в А-участок рибосомы без кодон-антикодонового узнавания.

Другой возможной функцией подобного комплекса может быть защита тмРНК от деградации РНКазами, всегда присутствующими в клетках эубактерий.

Известно, что тмРНК синтезируется в клетке конститутивно, однако, данная молекула необходима только в определенных специфических условиях. Можно предположить, что большая часть тмРНК в клетке хранится в форме рибонуклеопротеида в комплексе с фактором элонгации Tu, подобно тому, как некоторые мРНК сохраняются в клетке в виде РНП.

Другая, не обязательно альтернативная, роль может заключаться в участии комплекса EF-Tu•GDP в освобождении тмРНК из E-участка рибосомы после завершения синтеза сигнального пептида и/или защите тмРНК во время трансляции ОРС тмРНК. После прочтения нескольких кодонов, присутствующих в ОРС, TLD тмРНК будет освобожден из рибосомы. При этом тмРНК, возможно, образует вторичный комплекс с EF-Tu•GDP для защиты от действия клеточных рибонуклеаз до тех пор, пока трансляция tag-пептида не будет полностью завершена. Следует заметить, что эукариотический EF-1-GDP может формировать стабильный комплекс с деацилированной тРНК, что, возможно, указывает на существование прямого пути транспорта деацилированной тРНК из Е-участка рибосомы к соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазе.

Таким образом, наряду с каноническим комплексом, образуемым аминоацилированным тРНК-подобным доменом тмРНК с EF-Tu•GTP, деацилированная тмРНК может формировать специфический и устойчивый комплекс с EF-Tu•GDP. В образовании этого комплекса участвуют спираль 2 и псевдоузел 4 тмРНК. Его роль, возможно, заключается в стабилизации структуры молекулы тмРНК, защите её от деградации, а также в транспортировке деацилированной тмРНК из Е-участка рибосомы к аминоацил-тРНК-синтетазе.

Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой Двухдоменная организация тмРНК Центральным вопросом в понимании механизма транс-трансляции остаётся вопрос о том, как молекула тмРНК взаимодействует и движется в рибосоме.

Присутствие четырёх псевдоузлов во вторичной структуре тмРНК E. coli хорошо доказано. Сложно представить, что псевдоузлы расплетаются в ходе движения тмРНК внутри рибосомы. Мы предполагаем, что тмРНК состоит из двух компактно свернутых доменов (включающих псевдоузлы), которые взаимодействуют со специфическими участками рибосомы и сохраняют эти контакты во время трансляции кодирующей части тмРНК (Рис. 6) 2.

Домен 1 сформирован тРНК-подобной областью, спиралью 2 и псевдоузлом 1. Он, возможно, необходим для вхождения тмРНК в рибосому и содержит, воМоделирование проведено совместно с Г. Аглямовой и В. Лимом (ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия).

Рисунок 6. Модель пространственной структуры тмРНК.

Показаны A-, P- и E-участки рибосомы. Номера спиралей и псевдоузлов соответствуют рис. 5. А. тмРНК в растворе; компактную структуру, тРНК-подобная часть тмРНК выделена чёрным цветом. пряча между собой Обозначены домены 1 и 2. Б. тмРНК с первым кодоном одноцепочечный мРНКмРНК-подобной части в А-участке и тРНК-подобной подобный модуль (Рис. 6, структурой домена 1 в Р-участке рибосомы. В. тмРНК А).

после нескольких раундов транслокации.

гипотезы о двухдоменной организации молекулы тмРНК мы применили метод фотоаффинного химического сшивания. тмРНК со случайно распределенными по молекуле остатками 4-тиоуридина была обработана УФ-светом. Облучённый образец про-анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 7) и обнаружили, по крайней мере, 5 продуктов определения нуклеотидных остатков, принимающих участие в формировании «сшивок», ранее неоднократно успешно использованные в нашей лаборатории для изучения ковалентных соединений мРНК и 5S рРНК с рибосомой.

РНКаза Н является рибонуклеазой, специфически разрезающей гибридный дуплекс ДНК-РНК. Имея набор олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных определённым участкам тмРНК, можно получить фрагменты РНК известной длины, и, следовательно, с известной подвижностью в геле. Изменение подвижности какого-либо фрагмента в геле свидетельствует о его участии в фотоаффинном химическом сшивании. Пример подобного анализа для аддуктов Х1 и Х5 (рис. 7) приведен на рисунке 8.

Разрезание контрольного образца в присутствии олигонуклеотида, комплементарного последовательности 200-217 тмРНК, приводит к образованию двух продуктов: 5-концевого фрагмента длиной 214 и 3-концевого фрагмента длиной 149 нуклеотидов (рис. 8, дорожка 4). Для продукта Х1 (рис. 8, дорожка 5) наблюдается фрагмент с подвижностью большей, чем для 214-звенной РНК, и, следовательно, в образовании продукта фотоаффинного химического сшивания участвует 5-концевой фрагмент тмРНК. При использовании дополнительных олигонуклеотидов, лежащих в 3-концевой области от нуклеотида 217, изменение длины фрагмента 149 происходит одинаково для контрольного (рис. 8, дорожки 7, 10, 13, 16) и экспериментального (рис. 8, А, дорожки 8, 11, 14, 17) образцов.

последовательностям 200-217 и 128-145 тмРНК. Дорожки 22-24 – в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 200-217 и 56-73 тмРНК. Дорожки 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 –гидролиз контрольного образца (рис. 7, дорожка1). Дорожки 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 – гидролиз образца Х1. Дорожки 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 – гидролиз образца Х5. Размеры продуктов разрезания РНКазой Н обозначены цифрами рядом с соответствующей полосой.

В присутствии второго олигонуклеотида, комплементарного области 56- (т.е. лежащего в 5-направлении от нуклеотида 217), в контрольном образце (рис.

8, дорожка 22) видны продукты длиной 149, 145 и 69 нуклеотидов. В образце Х (рис. 8, дорожка 23) не детектируется полоса с подвижностью, соответствующей фрагменту длиной 145 нуклеотидов. Проведённый анализ позволяет сделать вывод, что в образовании «сшивки» Х1 участвуют нуклеотиды, лежащие в области 69-214 тмРНК. К сожалению, использование олигонуклеотидов, комплементарных этому району, не позволило сократить интервал (рис. 8, дорожка 20), поскольку компактность структуры данного района препятствует гибридизации олигонуклеотидов.

При обработке РНКазой Н в присутствии олигонуклеотида, комплементарного району 200-217, продукта фотоаффинного химического Х (рис. 8, дорожка 6) не происходит образования ожидаемых фрагментов 214 и (сравнить с контрольным образцом (рис. 8, дорожка 4)). Следовательно, можно предположить, что в формировании этого продукта фотоаффинного химического сшивания участвуют 5- и 3-концы тмРНК. Выщепление фрагментов соответствующей длины при использовании второго олигонуклеотида (рис. 8, дорожки 9, 12, 15 и 18) позволяет локализовать 3-концевого участника продукта фотоаффинного химического сшивания в районе 324-358 тмРНК. Аналогичный анализ 5-концевой части приводит к заключению, что в образовании аддукта Х принимает участие какой-либо нуклеотид из первых 69. Результаты анализа суммированы на рисунке 9. Тот факт, что поведение продукта сшивания Х4 при обработке РНКазой Н в присутствие различных олигонуклеотидов совмещает черты, присущие Х1, Х2 и Х3, с одной стороны, и Х5, с другой, говорит о том, что Х4 может быть комбинацией Х5 и одного из продуктов Х1-Х3.

Рисунок 9. Схема, суммирующая результаты Таким образом, продукт экспериментов по анализу продуктов фотоаффинного фотоаффинного химического химического сшивания с помощью РНКазы Н и метода обратной транскрипции.

тмРНК; в его формировании участвуют районы 11-16 и 325-345 тмРНК.

Продукты Х1-Х3 содержат U182 из петли псевдоузла 2, связанный с тремя различными нуклеотидами из области второго и третьего псевдоузла. Продукт Х представляет собой комбинацию двух продуктов сшивания: продукта Х5 и одного из продуктов Х1-Х3 (рис. 9).

Рисунок 10. Анализ продуктов фотоаффинного химического сшивания методом обратной транскрипции. А. A, G, C, U – сиквенс тмРНК. Дорожки Х1, Х2, Х5, анализ соответствующих продуктов фотоаффинного химического сшивания (рис. 7). Область сигналов остановки обратной транскрипции в позициях, соответствующих «сшивкам» нуклеотидов, показана стрелками. Б. A, G, C, U – сиквенс тмРНК. Дорожки Х1-Х5, анализ соответствующих продуктов фотоаффинного химического сшивания (рис. 7). Сигнал остановки обратной транскрипции в положении С183, соответствующий «сшивке» нуклеотида U182, показан стрелкой.

К сожалению, нам не удалось определить места «сшивок» с точностью до нуклеотида, поскольку тмРНК, как упоминалось выше, обладает очень компактной структурой, и после её облучения УФ-светом отжиг праймеров затруднен. Тем не менее, данные по фотоаффинному химическому сшиванию, полученные в нашей работе, подтверждают существование двух компактно свернутых доменов в молекуле тмРНК.

Согласно нашей модели, домены 1 и 2 связаны между собой кодирующей частью и псевдоузлом 4 (рис. 6). Мы предполагаем, что в растворе домены 1 и располагаются близко друг к другу, формируя очень компактную структуру, которая, возможно, стабилизирована взаимодействием с белками (например, SmpB, рибосомным белком S1 или EF-Tu). В такой третичной структуре мРНКподобная часть тмРНК «спрятана» между двумя структурно-функциональными доменами 1 и 2 тмРНК (рис. 6, А).

Мы предполагаем, что такая компактно свернутая аминоацилированная форма тмРНК входит в рибосомный А-участок в комплексе с EF-Tu•GTP и SmpB.

Можно полагать, что данный комплекс похож на канонический комплекс, сформированный аа-тРНК и EF-Tu. Когда домен 1 тмРНК взаимодействует с Аучастком рибосомы, в рибосоме происходит конформационное изменение, которое вызывает гидролиз GTP до GDP. Это ведет к конформационным изменениям в EF-Tu и, возможно, также в тмРНК. Аминоацилированный ССАконец тмРНК перемещается в пептидил-трансферазный центр рибосомы, и EF-Tu покидает рибосому. На этой стадии домен 2 должен занять свой сайт связывания на рибосоме.

Далее EF-G взаимодействует с рибосомой и способствует прохождению транслокации, после которой тРНК-подобная часть домена 1 тмРНК и структурно-функциональный аналог кодон-антикодонового дуплекса перемещаются в Р-участок рибосомы, а первый кодон мРНК-подобной части, кодирующий аланин, входит в А-участок рибосомы благодаря раскрытию данной области (рис. 6, Б). В то же время домен 2 остается связанным со своим сайтом на рибосоме. На следующих стадиях домен 1 движется из Р-участка рибосомы в Е и затем выходит из рибосомы. Домен 2 остаётся связанным со своим сайтом до терминации трансляции мРНК-подобной части тмРНК. Транслокация кодирующей части тмРНК осуществляется обычным путем. В тот момент, когда стоп-кодон матричной части тмРНК появляется в А-участке рибосомы, происходит каноническая терминация трансляции, и тмРНК покидает рибосому после диссоциации последней на субчастицы. Таким образом, в ходе транстрансляции домены 1 и 2 не подвергаются значительным структурным перестройкам, происходит лишь разворачивание мРНК-подобной части и поворот псевдоузла 1 транспортно-матричной РНК.

Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А-участком рибосомы Известно, что декодирующий центр 30S субчастицы узнает геометрию комплементарного кодон-антикодонового комплекса. Расшифровка кристаллической структуры комплекса 30S субчастицы с гексауридиновым фрагментом мРНК и тРНКPhe выявила особенности, характерные для этого узнавания. Было показано, что универсальный А1493 образует контакты с первой парой оснований кодон-антикодонового дуплекса, а нуклеотиды G530 и A взаимодействуют с малым желобком, образованным второй парой оснований.

Третья пара оснований узнается элементами рибосомы менее специфично, что хорошо согласуется правилом генетического кода, позволяющим образование неканонического взаимодействия в третьем положении кодон-антикодонового дуплекса.

Ацилированная тмРНК узнает рибосомы, «арестованные» на мРНК, утративших стоп-кодон. В этом случае в А-участке рибосомы невозможно образование классического кодон-антикодонового дуплекса. Как уже упоминалось выше, мы полагаем, что домен 1 тмРНК содержит некий элемент, который структурно мимикрирует кодон-антикодоновый дуплекс между тРНК и мРНК, узнающийся А-участком рибосомы. Для поиска нуклеотидных остатков, формирующих такой структурный элемент, мы применили метод сайтнаправленного мутагенеза.

Первым кандидатом на роль «кодона» были нуклеотиды 87GUC89, предшествующие кодону, кодирующему первую аминокислоту tag-пептида.

В роли потенциального «антикодона» для этих нуклеотидов мы рассматривали частично комплементарный к последовательности 87GUC триплет 318GAU320 (принимая во внимание, что образование G-U пары достаточно распространено в мире РНК). Данный триплет располагается в тРНКподобной части тмРНК рядом с областью, соответствующей антикодоновой петле канонической тРНК. Согласно некоторым данным, эта область тРНК-подобной части тмРНК, возможно, взаимодействует с декодирующим центром рибосомы.

Для проведения сайт-направленного мутагенеза на базе вектора pGEM-T мы создали конструкцию pGEMtmRNA, в которую клонировали ген ssrA, кодирующий тмРНК, под контролем своего конститутивного промотора и заканчивающийся своим терминатором транскрипции. Эта конструкция позволяет экспрессировать тмРНК in vivo. Все мутантные варианты тмРНК были созданы в дальнейшем на базе данной плазмиды.

Рисунок 11. Эффективность роста гибридного фага immP22 на штамме ssrA с плазмидами серии pGEM, гибридного фага immP22 до уровня дикого кодирующими мутантные варианты типа, который существенно отличается от тмРНК. EOP – Efficiency оf Plating - титра фага на штамме с делецией гена ssrA.

титр фага. WT – дикий тип, в данном Разница между титрами составляет величину случае штамм E. coli K37. близкую к опубликованной (рис. 11, колонки WT и ssrA::сat). Данный метод не лишён ряда недостатков. Во-первых, он является трудоёмким, во-вторых, этот подход не отвечает на вопрос, связано ли нарушение функциональной активности тмРНК с её способностью выполнять транс-трансляцию или со способностью напрямую взаимодействовать с какимлибо репрессорным белком. В частности, существуют данные о прямом взаимодействии тмРНК с LacI and cI фага.

Другой метод оценки функциональной активности тмРНК («генетический») Рисунок 12. Система для оценки стоп-кодоны в рамке считывания функциональной активности in vivo.

вариант фагового репрессора Arc и заканчивается терминатором транскрипции.

Рисунок 13. Определение активности мутантных молекул тмРНК, закодированных на плазмидах серии pGEM. Рост клеток E. coli штамма X91 (ssrA), трансформированных Рибосомы, транслирующие плазмидой-репортёром pR и одной из плазмид серии такую мРНК, будут pGEM в отсутствие (А) и в присутствии (Б) индуктора «арестованы» на её 3ИПТГ. 1 – без pGEM; 2 – pGEMtmRNA(WT); 3 – конце. Образующийся комpGEMtmRNA(UA300,301CC); 4 – pGEMtmRNA(2a-2b); 5 – плекс является естественной pGEMtmRNA(UA85,86CC); 6 – pGEMtmRNA(A86C).

клетках с активной тмРНК Arc репрессор будет маркирован и деградирует под действием клеточных протеиназ. Такие клетки будут устойчивы к канамицину.

Если в клетках тмРНК отсутствует или функционально неактивна, деградация Arc репрессора не произойдёт, и он будет репрессировать экспрессию гена, дающего устойчивость к канамицину, связавшись с промотором Pant. Такие клетки чувствительны к присутствию канамицина в среде.

Оригинальная система 3 была модифицирована с целью её улучшения. Мы переклонировали функциональный модуль из p6A в вектор pACYC 184, совместимый с pGEM-tmRNA, получив плазмиду pR. Клетки штамма X (ssrA), трансформированные данной плазмидой, не росли на среде, содержащей Таблица 3. Влияние мутаций в области 87-89 и канамицин, в присутствии 318-320 на функциональную активность тмРНК. индуктора IPTG (рис. 13, Б, Последовательность Рост „+++“ – скорость роста сопоставима со скоростью В табл. 3 суммированы клеток дикого типа; 2 „+++“ – эффективность данные о мутациях, ввеаминоацилирования сопоставима с эффективностью Штамм клеток E. coli X91 и плазмида р6А были предоставлены К. Вильямсом (Университет штата Индиана, Блумингтон, США).

тельность потенциальных «кодона» (87-89) и «антикодона» (318-320) для частичного или полного нарушения их гипотетического взаимодействия.

Оказалось, что ни одна из мутаций в данных районах не сказывается ни на аминоацилировании, ни на функциональной активности тмРНК, что было подтверждено как в фаговой системе проверки активности (рис. 11), так и в «генетической» системе. Следовательно, представляется маловероятным непосредственное участие нуклеотидов 87-89 и 318-320 в формировании структурного элемента, который узнает А-участок рибосомы.

Вероятно, в этом узнавании задействованы более сложные механизмы. Так, согласно литературным данным, петля тмРНК, соответствующая антикодоновой петле классической тРНК, может взаимодействовать с декодирующим центром рибосомы. Для проверки важности данного структурного элемента в процессе транс-трансляции нуклеотиды, образующие данную петлю, были изменены таким образом, чтобы стало возможным формирование спирального участка (pGEMtmRNA(2a-2b)). Однако эта мутация не затрагивала активности тмРНК (рис. 13, Б, сектор 4), что свидетельствует против того, что данная петля выполняет функцию, аналогичную функции канонической антикодоновой петле тРНК. Возможно, что другие части тмРНК образуют структурный элемент, узнающийся декодирующим центром рибосомы, или данное взаимодействие определяется какими-либо транс-факторами.

Известно, что белок SmpB необходим для транс-трансляции, в частности, показана его необходимость для начального связывания тмРНК с А-участком рибосомы, а также влияние на аминоацилирование тмРНК как in vitro, так и in vivo. Возможно, именно белок SmpB и какой-то структурный элемент РНК играют главную роль в узнавании тмРНК декодирующим центром рибосомы.

Рисунок 14. Карта консервативных нуклеотидов тмРНК, созданная на основе филогенетического анализа химического сшивания с EF-Tu. Хотя эти генов, кодирующих тмРНК.

о доминирующей роли данного нуклеотида в образовании комплекса, они указывают на важность региона тмРНК, окружающего данный нуклеотид, для взаимодействия с EF-Tu•GDP (рис. 5). Интересно отметить, что предшествующий U308 нуклеотид G307 был инвариантен во всех известных на тот момент генах тмРНК (более 150 эубактерий с известной последовательностью генома).

Следующими кандидатами для анализа были высококонсервативные нуклеотиды 85-86, отстоящие на триплет от первого кодона мРНК-подобной части тмРНК. Нуклеотиды 300UA301 также являются высококонсервативными (консервативность более 95%) и комплементарны паре нуклеотидов 85UA86.

Возможно, что эти нуклеотиды являются частью структурного элемента, узнаваемого А-участком рибосомы.

Данные о мутациях, введенных по описанным выше сайтам, и их влиянии на функционирование тмРНК, суммированы в таблице 4.

Таблица 4. Влияние мутаций некоторых высококонсервативных нуклеотидов на функциональную активность тмРНК.

Последовательность Рост „++“ – скорость роста незначительно замедлена по аминоацилирования составсравнению со скоростью клеток дикого типа, „+“ – лял 40%, следовательно, эти замедленна, „±“ – сильно замедленна, „-“ – клетки не мутации затрагивают именно растут совсем. „+++“ – эффективность способность тмРНК осущестаминоацилирования сопоставима с эффективностью аминоацилирования тмРНК дикого типа. Nd – не было влять транс-трансляцию.

определено.

оставалось неясным, какую именно стадию затрагивают мутации UA85,86CC в молекуле тмРНК. Известно, что мутантные тмРНК связываются с рибосомой, но транс-трансляция не завершается. Мы предположили два возможных сценария:

1. если тмРНК входит в А-участок, но пептид остается связанным с тРНК, соответствующей последнему кодону повреждённой мРНК, значит, нарушена аккомодация тмРНК в А-участке или перенос пептида с тРНК на тмРНК;

2. если же перенос пептида на тмРНК проходит, тогда нарушена транслокация тмРНК или адаптация матричной части в декодирующем центре рибосомы.

Для определения положения пептида в комплексе мы создали специальную конструкцию, позволяющую экспрессировать в клетках репортёрный пептид, имеющий в своем составе аффинный эпитоп His6 и 10 С-концевых а.к. белка YbeL. Известно, что в клетках E. coli дикого типа белок YbeL на 30-40% маркируется деградационным пептидом. Белок YbeL содержит ингибирующий терминацию контекст Glu-Pro-stop(UAA). Показано, что замена природного терминационного контекста на Pro-Pro-stop(UGA) усиливает эффект, поэтому мы использовали именно его. Располагая такой конструкцией, мы можем выделить пептид и связанную с ним молекулу РНК и детектировать комплекс, остановленный как до переноса пептида (пептид связан с тРНКPro, находящейся в P-участке), так и после (пептид связан с тмРНК).

В клетках, не содержащих тмРНК, репортёрный пептид был связан исключительно с тРНКPro, что соответствует литературным данным об остановке терминации на контексте CCG-CCG-UGA-A. В присутствии тмРНК дикого типа происходил перенос пептида на тмРНК, однако, тот факт, что пептид присутствовал и на тРНКPro, а кроме того маркирование проходило успешно, свидетельствует о том, что эта картина отражает транзитные стадии, возможно, замедленные в силу каких-то причин. В присутствии мутантной формы тмРНК репортёрный пептид был связан исключительно с тмРНК. Это означает, что мутация UA85,86CC в молекуле тмРНК не затрагивает перенос пептида на тмРНК, но нарушает какую-либо из последующих стадий транс-трансляции:

транслокацию, адаптацию мРНК-подобной части или связывание следующей тРНК в А-сайт.

Известно, что многие мутации и делеции нуклеотидов в области 84- тмРНК приводят к сдвигу рамки считывания tag-пептида. В экспериментах по случайному мутагенезу области, прилегающей к кодирующей части тмРНК, показана важность нуклеотидов 85-86 для функционирования тмРНК. Интересно, что A86C не влияет на связывание тмРНК с рибосомой, но ингибирует транстрансляцию как in vitro, так и in vivo (наши данные, рисунок 13, сравнить А и Б, сектор 6). Таким образом, мы предполагаем, что область 84-89 служит для позиционирования первого кодона GCA, кодирующего аланин, причём решающую роль играют нуклеотиды 85UA86.

Поиск интрамолекулярных супрессоров для летальных мутаций UA85,86СС и UA300,301СС Для проверки существования в тмРНК взаимодействия нуклеотидов, мутации которых приводят к летальному фенотипу, между собой или с другими нуклеотидами тмРНК мы провели поиск супрессоров летального эффекта этих мутаций.

Известно, что ген mutD (dnaQ) кодирует одну из субъединиц полимеразы III и контролирует 3’5’-экзонуклеазную (proofreading) активность полимеразы.

Мутации, затрагивающие данный ген, приводят к повышенному (примерно в раз) уровню спонтанных ошибок в ходе репликации.

В нашей работе мы использовали клетки E. coli штамма SL185, содержащие мутации в гене mutD, для получения случайных замен нуклеотидов в плазмидах, кодирующих тмРНК с летальными мутациями UA85,86СС или UA300,301СС.

Полученный набор плазмид со случайными мутациями протестировали в системе in vivo для отбора тмРНК, обладающих активностью. Нуклеотидная последовательность отобранных тмРНК была определена.

Все мутации, восстанавливающие активность тмРНК с летальной мутацией UA300,301СС, являются реверсиями этих нуклеотидов к дикому типу UA ( вариантов из 9 отсеквенированных). В случае тмРНК с летальными мутациями в положении UA85,86СС во всех вариантах в положении 86 появлялся нуклеотид А (14 из 14), что соответствует дикому типу. Вариантов тмРНК, восстановивших свою активность, не изменив нуклеотиды в позициях 86 или 300,301, обнаружено не было.

Таким образом, результаты данного эксперимента указывают на важность нуклеотидов 85UA86 и 300UA301 для активности тмРНК, хотя взаимодействий между этими нуклеотидами обнаружено не было. Не выявлены и потенциальные партнеры этих функционально важных нуклеотидов, мутации в которых могли бы компенсировать летальный фенотип.

Ответ на вопрос о роли этих нуклеотидов в транс-трансляции, а также на многие другие вопросы о функционировании тмРНК может дать изучение структуры комплексов тмРНК с рибосомой методами рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии.

Мутации нуклеотидов тРНК-подобной части, затрагивающие активность тмРНК Для поиска других функционально важных нуклеотидов в молекуле тмРНК мы провели случайный мутагенез гена ssrA с последующим отбором мутантных молекул тмРНК, проявляющих пониженную активность в системе селекции in vivo. Для проведения мутагенеза мы использовали клетки E. coli штамма SL185 с мутациями в гене mutD.

случайных мутаций в тмРНК, приводящих к потере или существенному снижению функциональной активности in vivo.

GG13,14UC - определена его пространственная организация (в Характеристика роста клеток, содержащих плазмиду мутацией в гене, кодирующем Результаты, полученные нами в условиях in vivo, в соответствует целом, коррелируют с данными, полученными in тмРНК, описанной в табл. 4.

Единичная замена G14C существенно снижает функциональную активность тмРНК, а мутация GG13,14UC приводят к полной её потере в нашей системе in vivo. Нуклеотиды G13G14 являются филогенетически консервативными и располагаются в сильно редуцированной D-петле тмРНК. В канонической тРНК D-петля взаимодействует с ТC-петлей с помощью нуклеотидов G18-55 и G19С56. Как было показано методом ЯМР, в молекуле тмРНК в подобном взаимодействии участвуют нуклеотиды G13-342 и G14-С343.

Энзиматический пробинг структуры молекулы тмРНК с мутацией GG13,14CC показал, что в ней действительно дестабилизировано взаимодействие ТC- и D-петель, а кроме того, нарушена структура аминоакцепторного стебля.

Это приводит к ухудшению аминоацилирования в условиях in vitro более чем в раз и, как следствие, к полной потере способности тмРНК связываться с рибосомой и осуществлять транс-трансляцию.

Единичная замена G14A тоже снижает, хотя и в меньшей степени, ацилирование (в 3 раза) и активность (в 5 раз) мутантной тмРНК in vitro. В нашем эксперименте клетки, несущие тмРНК с мутацией G14С сохраняли некоторую способность к росту в присутствии канамицина.

Нарушением аминоацилирования из-за дестабилизации аминоакцепторного стебля можно объяснить влияние мутации G7C на функциональную активность тмРНК in vivo. Нуклеотид G7 лежит в основании аминоакцепторного стебля тмРНК и взаимодействует с нуклеотидом С353. Данное взаимодействие инвариантно для всех известных тмРНК.

Согласно модели структуры комплекса белка SmpB с тРНК-подобной частью тмРНК A. aeolicus наблюдаемое нами влияние нуклеотидных замен UC17,18GA; G333U и С335G на активность тмРНК можно объяснить нарушением взаимодействия с белком SmpB. Нуклеотидные остатки U16 (U17 E. coli), C (C18 E. coli) и G317 (G333 E. coli) взаимодействуют с аминокислотными остатками Leu86, Lys 117, Glu26, Val30 и His88, составляющими высоко консервативную область белка SmpB, а C319 (C335 E. coli) – с инвариантным остатком Arg 40.

В условиях in vitro существенное снижение функциональной активности выявлено только для мутанта С335G. Данное противоречие с нашими результатами можно объяснить меньшей чувствительностью системы проверки активности in vitro, или влиянием того, что соотношение компонентов транстрансляции в ней существенно отличается от природного.

Выделение комплексов транспортно-матричной РНК c рибосомой Как для экспериментального подтверждения нашей модели прохождения тмРНК через рибосому в процессе транс-трансляции, так и для дальнейшего изучения особенностей функционирования тмРНК необходимо иметь индивидуальные комплексы между тмРНК и рибосомой, соответствующие определённым этапам транс-трансляции. Принципиально возможны два подхода к формированию комплексов – реконструкция in vitro либо остановка процесса на заданном этапе в живых клетках с последующим выделением комплекса. Первый подход требует получения препаративных количеств высокоочищенных компонентов, причём выход целевого продукта оказывается невысоким, что приводит к необходимости проведения дополнительной стадии очистки комплекса. Поэтому мы воспользовались способностью живых клеток к эффективному проведению транс-трансляции и создали систему, позволяющую останавливать процесс на заданном этапе.

исследования с использованием различных биохимических и структурных подходов проводили с помощью аффинной хроматографии.

В качестве аффинного эпитопа мы выбрали РНК-аптамер, специфичный к стрептавидину, эффективность применения которого для выделения высокомолекулярных рибонуклеопротеидных комплексов, таких как РНКаза Р, сплайсосома и рибосома, была убедительно продемонстрирована ранее. Данный аптамер имеет высокую аффинность к стрептавидину (Kd около 7х10-8 M).

Стрептавидин-сефароза широко распространена и коммерчески доступна. И, наконец, элюция молекул, связанных со стрептавидин-сефарозой, осуществляется биотином и проходит в мягких условиях, не требующих использования высокой концентрации соли, изменений pH или применения денатурирующих агентов.

Константа связывания биотина со стрептавидином составляет 1х1014 М-1, что позволяет количественно элюировать связанные со смолой молекулы.

РНК-аптамер к стрептавидину был введён вместо псевдоузла 3 в молекулу тмРНК. Известно, что в тмРНК E. coli псевдоузлы 2, 3 и 4 взаимозаменяемы.

Более того, их замещение одноцепочечными участками не сказывается на аминоацилировании тмРНК и её функциональной активности в бесклеточной системе транс-трансляции. Кроме того, согласно нашей модели пространственной организации тмРНК в рибосоме (рис. 6) псевдоузел находится на поверхности макромолекулы и должен быть доступным для взаимодействия на всех этапах транс-трансляции. Мутантная тмРНК, несущая аптамер к стрептавидину, сохраняла функциональную активность в тесте in vivo, описанном ранее (Рис. 15, сектор pGEMstra).

Рисунок 15. Мутантные молекулы тмРНК в тесте in vivo. хлорамфеникол-ацетилтранТолько клетки, содержащие активную тмРНК, могут расти на среде, содержащей канамицин, в присутствии сферазу, обеспечивающую IPTG. -тмРНК – клетки штамма E.coli X91 с устойчивость к хлорамфениделетированным геном тмРНК, pGEMstra, pGEMstra 4 и колу (Рис 16.). Кроме того, pGEMstra 11 – клетки штамма E.coli X91, данный штамм содержал ген трансформированные соответствующими плазмидами. термочувствительного RF2.

Рисунок 16. Вторичная структура молекулы тмРНК. Изменения, внесённые в тмРНК, показаны на врезке в правом верхнем углу (последовательность РНК-аптамера к стрептавидину) и в нижней части рисунка (замены, произведённые в MLD тмРНК).

В молекуле тмРНК терминация синтеза tag-пептида происходит на стопкодоне UAA, находящемся в положении 11 кодирующей области, который могут узнавать оба фактора терминации. Для использования термочувствительного RF для остановки транс-трансляции стоп-кодон UAA был заменён на UGA.

Так как эффективность терминации трансляции зависит не только от природы стоп-кодона и активности фактора терминации, но также и от нуклеотидов, окружающих стоп-кодон, то была изменена последовательность перед стоп-кодоном. Для терминации трансляции на стоп-кодоне UGA наименее благоприятным является контекст GAC CCA UGA А (Рис. 16). Перемещение стоп-кодона и окружающего его контекста GAC CCA UGA А по матричной области тмРНК позволяет остановить процесс транс-трансляции на более ранних этапах, а именно, на 2, 4 и 5 кодонах мРНК-подобной части тмРНК.

В итоге были созданы 4 плазмиды, кодирующие тмРНК со стрептавидиновым аптамером и изменённым стоп-кодоном, которые получили название pGEMstra 2, pGEMstra 4, pGEMstra 5 и pGEMstra 11, соответственно (Рис. 16).

Рисунок 17. Анализ маркированных ssrA и термочувствительным RF2 были белков, полученных при использования трансформированы плазмидой pGEMtmtmRNA-stra-(His6) в штаммах X91 с RF2 stra-6His. Анализ суммарного клеточного термочувствительным RF2. маркирование белков происходит одинаково в обоих штаммах, подтверждая, что тмРНК нормально функционирует в штамме SKZ1. В отсутствие тмРНК оба штамма продуцируют одинаковые пептиды, неспецифично связывающиеся с антителами против His6.

Для выделения комплексов клетки штамма SKZ1 трансформировали плазмидами, несущими мутантные тмРНК, и выращивали до оптической плотности 0,3 при температуре 37С в присутствии необходимых антибиотиков.

Затем повышали температуру до 42С. В этих условиях эффективность терминации резко снижалась из-за термочувствительности RF2 и неблагоприятного контекста вокруг стоп-кодона в тмРНК, что позволяло блокировать комплекс. Клетки собирали центрифугированием, получали S экстракт и с помощью ультрацентрифугирования через сахарозную подушку осаждали фракцию рибосом. Фракцию рибосом, содержащих тмРНК, выделяли с помощью аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе. Элюцию комплекса проводили с помощью биотина, его состав анализировали электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях.

Для подтверждения специфичности выделения комплекса аналогичную процедуру очистки проводили с использованием клеток штамма SKZ1, трансформированных плазмидой pGEMstra, кодирующей тмРНК дикого типа.

Анализ белкового состава фракций комплекса, выделенного с использованием тмРНК дикого типа, собранных на разных этапах выделения, показал, что неспецифического взаимодействия рибосом со стрептавидин-сефарозой не происходит.

Для подтверждения остановки трансляции в выделенных комплексах на стоп-кодоне UGA мы использовали свойство токсина Rel E разрезать цепь мРНК по кодону, расположенному в А-участке рибосомы в комплексах со свободным Аучастком, несущих тРНК в Р-участке. Только одна полоса, соответствующая разрезанию цепи РНК в ожидаемом месте в А-участке, появляется при обработке выделенных комплексов токсином Rel E (Рис. 18, дорожки 1 и 5).

Анализ РНК, входящих в состав выделенных комплексов Анализ РНК, входящих в состав выделенных тмРНК-рибосомных комплексов, проводили с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 19). тмРНК, выделенная из S30 экстракта (дорожка 1), была использована как маркер подвижности мутантной формы тмРНК в геле.

Первичную рибосомную фракцию (дорожка 3) и рибосомную фракцию, не связавшуюся с колонкой (дорожка 4), использовали в качестве контрольных.

Выделенный комплекс (дорожка 2), наряду с полосами, соответствующими выделенного с использованием тмРНК положении в 6% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Дорожки: 1 – тмРНК, выделенных тмРНК-рибосомных выделенная из S30 экстракта, 2 – комплексов проводили количественный фракция, полученная при элюции анализ РНК, входящих в их состав, с биотином, 3 – фракция, которая была нанесена на смолу, 4 – фракция, не связавшаяся со смолой, 5 – фракция, денатурирующих условиях. ПААГ полученная при промывке смолы. окрашивали бромистым этидием и Положение рибосомных 23S, 16S и 5S фотографировали, используя специальную РНК, тмРНК и тРНК показано программу “Gel” (Рис. 20).

стрелками.

Рисунок 20. Анализ РНК комплексов, выделенных с использованием тмРНК со стоп-кодоном во 2, 4, 5 и 11 положениях сигнал на геле с количеством РНК.

(дорожки подписаны соответственно), в 8% Подсчитанное соотношение тмРНК к 5S ПААГ, содержащем 7М мочевину.

Положение 5S рРНК и тмРНК показано стрелками.

соответственно), можно утверждать, что содержание тмРНК в выделенных комплексах составляло около 100%.

Исходя из конструкции плазмид, используемых в эксперименте, при остановке транс-трансляции в Р-участке рибосомы должна находиться тРНКPro, что было подтверждено с помощью Нозерн-блот анализа с использованием DIGмеченных олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных последовательности тРНКPro.

Таким образом, разработанная система выделения тмРНК-рибосомных комплексов позволяет останавливать транс-трансляцию на определенных этапах прочтения ОРС тмРНК и получать комплексы, содержащие рибосомы и тмРНК в соотношении 1:1. Принципиальная возможность такого выделения является доказательством того, что pK3 тмРНК находится на поверхности рибосомы и остается структурированным на всех этапах транс-трансляции.

Анализ белкового состава выделенных комплексов Анализ белкового состава выделенных комплексов проводили с помощью гель-электорфореза (рис. 21).

Рибосомные белки, выделенные из 30S (TP30) и 50S (TP50) рибосомных субчастиц, были использованы в качестве маркеров. Белки из первичных рибосомных фракций (дорожки 1) и фракций, не связавшихся с колонкой (дорожки 2), были использованы как контроль. Комплексы, выделенные за счёт связывания тмРНК-4 и тмРНК-11, несущих стрептавидиновый аптамер, содержат рибосомные белки (Рис. 21, А и Б, дорожки 3).

Рисунок 21. Анализ белкового состава комплексов, выделенных с использованием тмРНК со стоп-кодоном в четвертом (А) или одиннадцатом (Б) положениях, с помощью электрофоретического разделения белков в 17,5% Tricine-SDS-ПААГ. Дорожки: 1 – исходная рибосомная фракция, которая была нанесена на смолу, 2 – фракция белков, не связавшихся со смолой, 3 – фракция, полученная при элюции биотином, TP30 и TP50 – белки, выделенные из 30S и 50S субчастиц рибосом, соответственно, молекулярная масса некоторых из них показана справа. Звёздочкой отмечена неспецифическая полоса, которая появляется при взаимодействии стрептавидин-сефарозы с рибосомной фракцией. Толстыми стрелками показано местонахождение прокариотических факторов элонгации. MALDI масс-спектры под гелями получены в результате HDMMS эксперимента, определяющего присутствие гипотетического пептида ANISDSYVLLR с m/z равным 1250.67 в триптическом лизате, полученном для соответствующих фрагментов геля из контрольных (TP30, TP50) и экспериментальных (3) дорожек.

Полосы, соответствующие по подвижности элонгационным факторам G, Tu и Ts, отмеченные стрелками на Рис. 21, слева от дорожек 1, пропадают в дорожках 3, соответствующих комплексам. Дополнительная полоса с молекулярной массой порядка 18-19 kDa, что соответствует белку SmpB, появляется в дорожках 3. Фрагменты геля, содержащие данную полосу, были вырезаны и после триптического гидролиза проанализированы с помощью MALDI масс-спектрометрии 4.

Анализ белкового состава комплексов, содержащих тмРНК со стопкодонами во 2 или 5 положениях ОРС, показал, что и в них наряду с рибосомными белками появляется дополнительная полоса, соответствующая белку SmpB.

Первоначально количество SmpB в комплексах было оценено денситометрически по соотношению интенсивности полосы, соответствующей белку SmpB, к интенсивности полосы, соответствующей рибосомному белку L2, в ПААГ, окрашенном красителем кумасси голубым R250. Проведенный анализ Анализ проводили в сотрудничестве с М. Калкумом (Бекмановский исследовательский институт, Дуарт, США).

показал, что не более одной молекулы SmpB связывается с одной рибосомой в выделенных комплексах.

Для уточнения полученных результатов был проведен Вестерн-блот анализ для комплексов, содержащих тмРНК со стоп-кодонами во 2, 4, 5 или положениях (Рис. 22, дорожки подписаны соответственно).

Визуализацию белков проводили с помощью антител против белка SmpB и рибосомного белка S3. Белок SmpB (дорожки 1-5) и суммарный рибосомный белок S30 субчастицы (дорожки 6-10), нанесенные на гель в количествах от 0, до 0,4 пмоль, были использованы для построения калибровочного графика зависимости интенсивности сигнала на рентгеновской пленке от количества белка в пробе (Рис. 22, Б). Использование этого графика позволило нам оценить количество SmpB и белка S3 в комплексах, содержащих тмРНК со стоп-кодонами Таблица 7. Соотношение белка SmpB к установить, что одна рибосома рибосомному белку S3 в разных комплексах. связывает одну молекулу SmpB (Суммированы результаты трёх во всех изученных комплексах независимых экспериментов.) (Таблица 7).

обсуждении вопроса о числе молекул белка SmpB в комплексе с рибосомой и тмРНК. Мы показали, что SmpB остаётся связанным с тмРНК-рибосомным комплексом до конца процесса транс-трансляции. Стехиометрия комплекса SmpB-тмРНК-рибосома равна 1:1:1 на всех стадиях транс-трансляции от этапа, когда TLD тмРНК находится в Е-участке рибосомы, до терминации транстрансляции на природном стоп-кодоне.

Исследование комплексов тмРНК с рибосомой методом химического пробинга Как уже отмечалось ранее, сведения о взаимодействии компонентов тмРНКрибосомных комплексов между собой крайне ограничены. Одним из методов изучения рибонуклеопротеидных комплексов, позволяющим исследовать контакты компонентов комплекса между собой, а также изменения в структуре РНК, вызванные комплексообразованием, является метод химического пробинга.

Для проведения такого исследования необходимо выделение комплекса в препаративных количествах, именно трудность такого выделения и объясняет отсутствие подобных работ. В литературе описано единственное исследование, в котором метод химического пробинга использовали для изучения тмРНКрибосомных комплексов. В этой работе были исследованы начальные этапы процесса транс-трансляции. В условиях in vitro путем последовательного добавления компонентов были сформированы комплексы тмРНК с рибосомой от преинициаторного до элонгационного, в котором TLD тмРНК располагался в Есайте рибосомы.

Выделенные нами из клеток тмРНК-рибосомные комплексы, в которых транс-трансляция была заблокирована на разных этапах прочтения ОРС, позволяют изучить взаимодействие тмРНК с рибосомой на более поздних этапах – от стадии, когда тРНК-подобная часть тмРНК всё ещё связана с Е-участком рибосомы до терминации на стоп-кодоне, закодированном в ОРС тмРНК.

В качестве модифицирующих агентов для изучения изменений структуры тмРНК и её контактов с компонентами системы транс-трансляции были использованы DMS, CMCT и кетоксаль. DМS метилирует А по положению N1 и в меньшей степени C в положении N3, CMCT модифицирует U в положении N3 и в меньшей степени G в положении N1, и кетоксаль модифицирует G в положениях N1 и N2. Каждый из четырех выделенных комплексов рибосомы, соответствующих различным этапам трансляции ОРС тмРНК, был обработан DMS, CMCT или кетоксалем. Нуклеотиды, подвергнувшиеся модификации, определяли с помощью реакции обратной транскрипции. Интенсивность полосы, соответствующей остановке обратной транскриптазы, позволяет определять доступность каждого отдельного нуклеотида для модифицирующего реагента и, таким образом сделать вывод о его контактах с другими участниками в составе комплекса или изменениях в структуре РНК. Как контроль мы использовали соответствующие свободные тмРНК, выделенные из клеток с помощью аффинной хроматографии. Нам удалось исследовать большую часть последовательности тмРНК (фрагменты от G172 до С239, и от U341 до A363 не были изучены) в составе четырёх комплексов, соответствующих различным стадиям трансляции ОРС тмРНК (данные суммированы на рисунке 23).

Рисунок 23. Спектр модификаций нуклеотидов тмРНК в различных рибосомных комплексах по сравнению со свободной тмРНК в растворе. Внизу рисунка выделена область мРНКподобной части тмРНК с прилегающими районами (от 86 до 137 нуклеотида последовательности тмРНК), слева – нуклеотидов 324GG325. Зелёный цвет обозначает уменьшение доступности действию модифицирующего агента нуклеотидов тмРНК в комплексе с рибосомой по сравнению с тмРНК в растворе, красный – увеличение, синий – без изменения, серый или чёрный – неспецифическое разрезание цепи РНК.

мРНК-подобная часть тмРНК, предшествующий регион и спираль 5.

Наибольшее число эффектов было найдено в районе MLD тмРНК и прилегающих к нему участков – области перед кодоном возобновления синтеза и спирали (Рис. 23, 24 и 25). Именно здесь наблюдались сильные изменения доступности нуклеотидов тмРНК для модифицирующих реагентов в различных рибосомных комплексах по сравнению со свободной тмРНК в растворе. Сравнение между собой спектров модификации для разных комплексов выявило также существенные изменения реакционной способности нуклеотидов тмРНК при переходе от комплекса, остановленного на 2-ом кодоне ОРС, к комплексу, заблокированному на природном стоп-кодоне (Рис. 23).

Рисунок 24. Модификации нуклеотидов в области С86-С137 для комплексов рибосомы с тмРНК-2 (А), -4 (Б), -5 (В) и -11 (Г). tm – дорожки, соответствующие свободной тмРНК в растворе, C – дорожки, соответствующие комплексу. Панель DMS, Ket, СMCT относятся к образцам, обработанным соответствующими реагентами. NM – немодифицированный образец. В рамках выделена последовательность сигнала терминации. Стрелками обозначены эффекты, описанные в тексте.

Цепь РНК в комплексе с тмРНК-2, остановленном на втором кодоне ОРС тмРНК, наиболее защищена от модификации по сравнению с другими комплексами (Рис. 23 и 24, A). Из 51 нуклеотида в области, начинающейся с - кодона ОРС до конца спирали 5 тмРНК, 27 нуклеотидов стали менее доступны действию модифицирующих агентов при формировании комплекса с тмРНК-2.

Нуклеотиды U88, U93, U105, U110-112, U119-120, U123, U131-132 и A92, A95-97, A102-103, A106, A113, A116, A121-122, A124-125, C126, A133, A135 тмРНК-2, доступные для модификации CMCT и DMS, соответственно, в растворе (Рис. 24, A, линии tm в панелях CMCT и DMS), защищаются от модификации в большей (например, U93) или меньшей (например, A124) степени, когда молекула тмРНК становится компонентом комплекса с рибосомой (Рис. 24, A, линии C в панелях CMCT и DMS).

В тоже время доступность двух нуклеотидов, а именно, G94 и G99, для модифицирующего агента кетоксаля увеличивается, когда тмРНК-2 находится в составе тмРНК-рибосомного комплекса (сравнить линии C и tm в панели Ket, Рис.

24, A).

последовательностью, неблагоприятной для терминации, в положение 4-ого кодона ОРС тмРНК уменьшает количество нуклеотидов, защищённых в результате образования соответствующего тмРНК-рибосомного комплекса, до (Рис. 23 и 24, Б). Защищённые нуклеотиды в 3'-области описываемого района (U105, U110-112, U120, U123, U131-132 и 92, A113, A116, A121-122, A124-125, C126, A133) остаются, в основном, теми же, что и в комплексе с тмРНК-2.

Однако, в 5'-области, последовательность которой была изменена, разница в спектре модификаций очевидна. Нуклеотид G87 становится менее, а нуклеотиды G90, G93 и G100 – более доступными для модификации кетоксалем (Рис. 24, Б, панель Ket). Нуклеотид в положении 94, доступный для модификации в комплексе с тмРНК-2, становится защищённым в комплексе с тмРНК-4 (A94 на Рис. 24, Б, панель DMS).

Второй доступный для модификации в тмРНК-2 нуклеотид G99 в тмРНК- был изменён на U99, и его доступность для модифицирующего агента в комплексе и в растворе стала одинаковой (Рис. 24, Б, панель CMCT). Нуклеотид A98 защищается от модификации DMS в комплексе с тмРНК-4 (Рис. 24, Б, панель DMS).

Смещение терминирующей последовательности по мРНК-подобной части тмРНК (тмРНК-5) уменьшает количество нуклеотидов, защищаемых от модификации при образовании комплекса с рибосомой, до 15 (Рис. 23 и 24, В).

Защиты нуклеотидов в положениях U105, A121-122, A124-125, и C126 исчезают.

В то же время защита G87 и усиление доступности для модификации нуклеотида G90 остаются теми же, что и в комплексе с тмРНК-4, G93 снова приобретает защиту, как в комплексе с тмРНК-2 (Рис. 24, В, панель Ket). Нуклеотиды в положениях 96 и 103 (оба G для тмРНК-5) становятся доступными для модификации кетоксалем в комплексе тмРНК с рибосомой (Рис. 24, В, панель Ket). Нуклеотиды в положениях 94, 97 и 102 (в тмРНК-5 A, A и U, соответственно) более защищены в тмРНК-рибосомном комплексе, чем в тмРНКв растворе (Рис. 24, В, панели DMS и CMCT, соответственно).

Только 5 нуклеотидов защищены от модификации химическими реагентами в комплексе рибосомы с тмРНК-11 (Рис. 23 и 24, Г), среди них нуклеотиды A97, U120 и U131-132, упомянутые выше для предыдущих комплексов. Изменения касаются G114, G121 и C126, которые становятся более доступными для модификации химическими реагентами, а также U128, который защищается в комплексе рибосомы с тмРНК-11 (Рис. 24, Г).

Следует упомянуть, что некоторые из нуклеотидов в различных тмРНК были исключены из обсуждения из-за неспецифического разрезания цепи РНК.

Мы не можем оценить влияние образования комплексов с рибосомой на доступность модификации нуклеотидов C91, C98, A100-101 в тмРНК-2; C95-97, A101-102, C104 в тмРНК-4; C91, A92, C99-100 в тмРНК-5; и C91, U105, C109, U112, C119, G129 в тмРНК-11.

располагающейся между pK1 и кодоном возобновления синтеза, доступны для модификации DMS во всех изучаемых нами вариантах тмРНК в растворе (Рис.

25). Однако доступность данных нуклеотидов во всех тмРНК-рибосомных комплексах уменьшается (Рис. 23 и 25, линии, обозначенные С), указывая на защиту данной области от модификации.

Рисунок 25. Модификации нуклеотидов уже упоминалось ранее, тмРНКU68-С90 DMS для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С – дорожки, соответствующие комплексу, tm – тмРНК в в условиях in vitro и отражали лишь растворе. T, G, C, A – дорожки, начальные этапы транс-трансляции.

соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками обозначены эффекты, обнаружена защита нуклеотида U85 от тмРНК с белком SmpB, изменения доступности нуклеотидов A79-A84 и A действию DMS в этой работе не наблюдали. Мы не можем судить достоверно о степени доступности модификации нуклеотида U85 в наших комплексах, поскольку мы наблюдали неспецифическое разрезание цепи РНК в этом положении во всех образцах, за исключением обработанного DMS. Защиты нуклеотидов A79-A84 и A86 в наших комплексах можно объяснить взаимодействием тмРНК с рибосомой, причём при прохождении MLD тмРНК через рибосому в ходе транс-трансляции эти контакты не изменяются. Таким образом, можно предположить, что, связавшись со своим сайтом на рибосоме на начальном этапе транс-трансляции, данный район тмРНК продолжает с ним взаимодействовать до стадии терминиции.

Согласно полученным результатам, спираль 5 тмРНК неустойчива в растворе, и её конформация, по-видимому, стабилизируется в комплексах тмРНК с рибосомой, хотя подобный эффект может возникать и в результате прямой защиты тмРНК рибосомой. Стоит отметить, что существование данной спирали тмРНК подтверждено не для всех организмов.

Как видно из рисунка 23, цепь РНК в районе MLD тмРНК подвержена неспецифическим разрывам, причём в молекуле тмРНК-11 в наименьшей степени, вероятно потому, что природное расположение стоп-кодона обеспечивает оптимальное взаимодействие данной тмРНК с рибосомой, влияя таким образом на её стабильность.

Характерные изменения в доступности действию модифицирующих реагентов нуклеотидов стоп-кодона (в UGA нуклеотид G экспонируется во всех комплексах, тогда как нуклеотид U защищается в комплексах рибосомы с тмРНКможно объяснить взаимодействием его с компонентами рибосомы.

В триплете GAC (-2 по отношению к стоп-кодону) последовательности тмРНК экспонируется нуклеотид G в комплексах рибосомы с тмРНК-4, -5, -11 и защищается нуклеотид А в комплексах рибосомы с тмРНК-2, -4, -5. Известно, что аминокислота, кодируемая этим кодоном, наряду с соседней с С-конца, Рисунок 26. Модификации нуклеотидов в области комплементарные нуклеотидам тРНК-подобной части тмРНК для комплексов 56-73 и 346-363 тмРНК.

рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, -11. С – дорожки, Доступность нуклеотидов в соответствующие комплексу, tm – тмРНК в положениях U16, U17 (Рис. 23 и растворе. Панели DMS и CMCT относятся к образцам, обработанным соответствующими реагентами. T, G, C, A – дорожки, соответствующие уменьшается во всех четырёх последовательности тмРНК. Стрелками обозначены комплексах тмРНК с рибосомой эффекты, обсуждаемые в тексте.

тмРНК в растворе. Нуклеотид C335 становится более доступным для модификации DMS (Рис. 26, Б), когда тмРНК участвует в образовании комплекса с рибосомой.

Изменения реакционной способности этих нуклеотидов при обработке модифицирующими агентами в составе комплексов могут быть объяснены взаимодействием тмРНК с белком SmpB.

Из литературных источников известно, что нуклеотиды U15, U16, A318 и C319 тмРНК A. aeolicus (U16, U17, A334 и C335 E. coli) более чем на 90% консервативны. В кристаллической структуре комплекса тРНК-подобной части тмРНК с белком SmpB A. aeolicus нуклеотиды U15, U16, A318 и С319 тмРНК вовлечены во взаимодействие с поверхностью белка в районе OB домена.

Нуклеотиды U15, U16, A318 и C319, доступные для разрезания в присутствии ацетата двухвалентного свинца в свободном тРНК-подобном домене тмРНК в растворе, становятся защищёнными в комплексе с SmpB. SmpB также защищает A318 от разрезания РНКазой S1, тогда как C319 становится более доступным для РНКазой S1 в комплексе тмРНК-SmpB.

В кристаллической структуре комплекса тРНК-подобной части тмРНК с белком SmpB T. thermophilus атомы нуклеотидов C15 (C2, C4, C5, N3, O2), U (O2), A320 (C4, C8, N6, N1) и C321 (C2, N4) тмРНК T. Thermophilus (U16, U17, A334 и C335 E. coli) тесно взаимодействуют с SmpB.

Степень расщепления цепи РНК в присутствии ацетата двухвалентного свинца в положениях G333-C335 и U16-U17 тмРНК E. coli уменьшается при увеличении количества белка SmpB (в молярных соотношениях тмРНК:SmpB от 1:1 до 1:10) в реакционной смеси. Аналогичный эффект был обнаружен и во всех исследованных рибосомных комплексах (от преинициаторного до содержащего TLD тмРНК в Е-сайте рибосомы). Также была обнаружена защита от модификации DMS нуклеотида A334 в комплексе тмРНК с белком SmpB и рибосомных комплексах.

G333 защищается белком SmpB от разрезания РНКазой T1 в комплексе SmpB с тРНК-подобной частью тмРНК.

Таким образом, белок SmpB остается связанным с тмРНК-рибосомным комплексом на всех стадиях транс-трансляции и занимает при этом свой канонический сайт связывания на TLD тмРНК.

Спираль 2 и псевдоузел 1. Связывание тмРНК с рибосомой привело к изменениям доступности некоторых нуклеотидов в спирали 2 и псевдоузле тмРНК для модифицирующих агентов (Рис. 23 и 27). Нуклеотиды G29 (Рис. 27, A), U60 (Рис. 27, В), A309, A316 и A323 (Рис. 27, Е) стали более доступными для модификации нуклеотид специфическими реагентами во всех изученных комплексах. В тоже время нуклеотиды U46 (Рис. 27, Б), U65, U68 (Рис. 27, В), 301, A302, A305 (Рис. 27, Г), U311 (Рис. 27, Д) и A319 (Рис. 27, Е) защищаются от модификаций при образовании комплексов тмРНК с рибосомой. Интерес вызывают некоторые эффекты в спирали 2, которые зависят от природы тмРНК.

Нуклеотиды G324 и G325 были доступны для модификации кетоксалем в тмРНКи тмРНК-5 в растворе (Рис. 27, Е), но становятся защищёнными от модификации при формировании тмРНК-рибосомных комплексов. Тот факт, что Рисунок 27. Модификации нуклеотидов в области спирали 2, спирали 2 защипсевдоузлов 1 и 4 тмРНК для комплексов рибосомы с тмРНК-2, -4, -5, щаются от разреС – дорожки, соответствующие комплексу, tm – тмРНК в зания в присутрастворе. Панели DMS, Kethoxal и СMCT относятся к образцам, ствии ацетата обработанным соответствующими реагентами.T, G, C, A – дорожки, двухвалентного соответствующие последовательности тмРНК. Стрелками комплексах с рибосомой. В нашей работе нуклеотиды A32, A34 в спирали тмРНК одинаково модифицируются в растворе и во всех тмРНК-рибосомных комплексах.

Кроме того, Иванова и соавторы обнаружили увеличение доступности нуклеотидов U59 и G58 в pK1 тмРНК для разрезания в присутствии ацетата двухвалентного свинца в комплексе с белком SmpB и в двух рибосомных комплексах (с TLD тмРНК в А- или E- сайте). В наших экспериментах соседний нуклеотид, U60, становился более доступным для модификации CMCT при образовании комплексов (Рис. 27, В). Причина таких различий кроется, вероятно, модифицирующих агентов.

Псевдоузел 4. Нуклеотиды A290, A291 и A292 защищены от модификации DMS во всех изученных комплексах (Рис. 23 и 27, Г).



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«Подколзин Иван Владимирович МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С ИНДУКТИВНО СВЯЗАННОЙ ПЛАЗМОЙ И ДИСПЕРСИОННАЯ ЖИДКОСТНО-ЖИДКОСТНАЯ МИКРОЭКСТРАКЦИЯ НЕКОТОРЫХ РЕДКИХ ЭЛЕМЕНТОВ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2013 2 Работа выполнена на кафедре химии Владимирского государственного университета имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых Научный руководитель...»

«КОНДРАТЬЕВА ОКСАНА ВИКТОРОВНА РЕАКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗАМЕЩЕННЫХ ЦИКЛОПРОПАНОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ КИСЛОТ ФОСФОРА И БОРА 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2009 2 Работа выполнена на кафедре химии ГОУ ВПО Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева. доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Митрасов Юрий Никитич Официальные оппоненты : доктор химических...»

«ЩЕКИНА МАРИЯ ПАВЛОВНА СИНТЕЗ ПОЛИГЕТЕРОАТОМНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ГИДРОАЗИНОВЫХ И –АЗОЛОВЫХ РЯДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ (АМИНО)КЕТОНОВ И (ТИО)КАРБАМИДОВ 02.00.03 – органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов – 2013 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : Клочкова Ираида Николаевна доктор химических наук, профессор Официальные оппоненты : Голиков...»

«КОЗЛОВСКИЙ Анатолий Анатольевич СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХЛОРИРОВАНИЯ И ПОЛИМЕРИЗАЦИИ МОНОМЕРОВ. ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ ТВЕРДОФАЗНОГО ХЛОРИРОВАНИЯ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте проблем химической физики РАН доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Михайлов Альфа Иванович доктор...»

«Евстигнеева Мария Александровна СТРУКТУРА И СВОЙСТВА СМЕШАННЫХ ТЕЛЛУРАТОВ (АНТИМОНАТОВ) ЩЕЛОЧНЫХ И ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ Специальность 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону 2014 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Южный федеральный университет. Научный руководитель :...»

«Быков Евгений Евгеньевич КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСФОРМАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛМАЛЕИНИМИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПРОТОННЫХ КИСЛОТ Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2009 Работа выполнена в лаборатории химической трансформации антибиотиков Института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе РАМН Научный руководитель : Доктор химических...»

«ДЕВЯТОВА НАДЕЖДА ФЕДОРОВНА СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ПРОДУКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МУКОХЛОРНОЙ КИСЛОТЫ С СЕРОСОДЕРЖАЩИМИ НУКЛЕОФИЛАМИ 02.00.03 - органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2008 Работа выполнена на кафедре органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И.Ленина...»

«УЛИХИН Артем Сергеевич ТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА ПЕРХЛОРАТОВ ЩЕЛОЧНЫХ МЕТАЛЛОВ И КОМПОЗИЦИОННЫХ ТВЕРДЫХ ЭЛЕКТРОЛИТОВ НА ИХ ОСНОВЕ 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения РАН Научный руководитель : доктор химических наук Уваров Николай Фавстович Учреждение Российской академии...»

«СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ L АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2011 2 Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, засл. деятель науки РФ, профессор Чернова Римма Кузьминична Официальные доктор химических наук,...»

«ТАЛИПОВ МАРАТ РИФКАТОВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ НИТРОЗООКСИДОВ 02.00.17 – Математическая и квантовая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук УФА 2006 2 Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра Российской Академии Наук Научный руководитель : доктор химических наук Сафиуллин Рустам Лутфуллович Официальные оппоненты : доктор химических наук Кузнецов Валерий Владимирович доктор...»

«Бредихин Роман Андреевич РЕАКЦИИ ПОЛИФТОРАРЕНТИОЛОВ С БРОМОМ И ГАЛОИДАЛКАНАМИ. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИФТОРАРЕНСУЛЬФОНИЛБРОМИДОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ НЕКОТОРЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ (02.00.03 – Органическая химия) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Новосибирск – 2013 1 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Полифторароматические серосодержащие соединения находят применение в оптике, электронике, технике, биохимии, медицине и сельском хозяйстве. Одним из...»

«ПАХОМОВА Виктория Александровна РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2006 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН. доктор химических наук Научный руководитель : профессор Михайлов Альфа Иванович доктор физико-математических наук Официальные оппоненты : Харитонов Александр Павлович доктор...»

«ПИСАРЕВ Ростислав Владимирович Строение и физико-химические свойства протонпроводящих твердых электролитов на основе ароматических сульфокислот 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Черноголовка – 2009 Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии Наук. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Добровольский Юрий Анатольевич Институт проблем химической физики РАН...»

«Козерожец Ирина Владимировна РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ СУБМИКРОННЫХ И НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ ОКСИДОВ АЛЮМИНИЯ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ПРИМЕСЕЙ 02.00.04 - физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Панасюк Георгий Павлович...»

«Хомишин Дмитрий Владимирович Получение изопреноидов и реакции их аллильной системы в синтезе монотерпенов с модифицированным углеводородным скелетом 02.00.03 Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 год Работа выполнена в Лаборатории тонкого органического синтеза Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук (ИНЭОС РАН) и на кафедре Химии и технологии биомедицинских...»

«ГОЛЬДФАРБ ОЛЬГА ЭДУАРДОВНА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ДНК-СЕНСОР С ФЕРМЕНТАТИВНЫМ УСИЛЕНИЕМ СИГНАЛА 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2005 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина Министерства образования и науки Российской Федерации Научный руководитель...»

«Галяутдинова Алсу Фердинандовна ПОЛИМЕРЫ НА ОСНОВЕ ПРОСТОГО ПОЛИЭФИРА, АРОМАТИЧЕСКИХ ИЗОЦИАНАТОВ И ОКТАМЕТИЛЦИКЛОТЕТРАСИЛОКСАНА Специальность 02.00.06 –Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА-2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский государственный технологический университет (ГОУ ВПО КГТУ) Научный руководитель : кандидат...»

«ВАСИЛЬЕВА Марина Юрьевна ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ЭТИЛЕНА НА БИС(ФЕНОКСИИМИННЫХ) КОМПЛЕКСАХ ТИТАНА РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2009 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Санкт-Петербургском филиале Института катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения РАН Научный руководитель :...»

«ГАДОМСКИЙ Святослав Ярославович ИЗУЧЕНИЕ ДИСПРОПОРЦИОНИРОВАНИЯ СЕМИХИНОННЫХ РАДИКАЛОВ ПО НЕСТАЦИОНАРНОЙ КИНЕТИКЕ ЦЕПНЫХ РЕАКЦИЙ ХИНОНИМИНОВ С ГИДРОХИНОНАМИ 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2010 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук Варламов Владимир Трофимович Официальные оппоненты : доктор химических наук Касаикина Ольга...»

«Цветков Дмитрий Сергеевич Термодинамика разупорядочения, электро- и массоперенос в перовскитоподобных оксидах GdBaCo2-xFexO6- (x=0, 0.2) 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург – 2010 1 Работа выполнена на кафедре физической химии ГОУ ВПО “Уральский государственный университет им. А.М. Горького” Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент Зуев А.Ю. Официальные оппоненты : доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.