WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СМЕКАЛОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ

ОСОБЕННОСТЕЙ НОВОЙ ТЕЛОМЕРАЗЫ ДРОЖЖЕЙ

02.00.10 – биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва – 2012

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН Донцова Ольга Анатольевна;

кандидат химических наук, Зверева Мария Эмильевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН Кочетков Сергей Николаевич;

кандидат биологических наук, Агафонов Михаил Олегович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.Новосибирск

Защита состоится 13 марта 2012 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001. по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.

Ломоносова.

Автореферат разослан 10 февраля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Теломеры – это специализированные ДНК-белковые структуры, локализованные на концах хромосом эукариотических организмов; их основная функция состоит в поддержании стабильности генома. Классический механизм репликации не в состоянии обеспечить синтез конца хромосомы, это приводит к укорочению теломер при каждом раунде деления клетки, дестабилизации генома и сенессенсу. Для предотвращения этих процессов клетка использует различные механизмы, важнейшим из которых является активация теломеразы. Данный фермент представляет сложный РНК-белковый комплекс.

Основные компоненты теломеразы – теломеразная каталитическая субъединица (теломеразная обратная транскриптаза, TERT) и теломеразная РНК (TR), в составе которой присутствует небольшой матричный участок, по которому и осуществляется синтез теломерного повтора.

Исследования в области биогенеза теломер позволяют предположить, что отсутствие или низкая активность теломеразы в соматических клетках – одна из причин старения организма. Мутации в теломеразной РНК вызывают дискератоз, а также ассоциированы с некоторыми случаями апластичной анемии, миелодисплазией и диффузным интерстициальным пневмофиброзом. Понимание механизма работы теломеразы и закономерностей регуляции фермента позволит найти новые подходы для лечения этих болезней. Было показано, что теломераза активна в 85% опухолей, а активация теломеразы является одним из первых шагов на пути трансформации клетки в злокачественную, поэтому теломеразный комплекс также является заманчивой мишенью для создания препаратов в области противоопухолевой терапии.

Отсутствие структурных данных для функционального теломеразного комплекса представляет главную проблему на пути изучения фермента и создания эффекторов, влияющих на его активность. Одна из причин – низкая стабильность каталитической субъединицы теломеразы, что не позволяет получить белок в форме, пригодной для структурных и функциональных исследований. Другая проблема – вариабельность теломеразной РНК. Различия в размере (от 150 нуклеотидов в реснитчатых до нуклеотидов в дрожжах) и нуклеотидном составе зачастую не позволяют выявить структурные элементы, необходимые для работы и регуляции комплекса и затрудняют идентификацию РНК субъединиц теломеразы из новых организмов. Использование термофильных организмов часто более перспективно для структурно-функционального изучения ферментов, так как биологические компоненты – и белки, и нуклеиновые кислоты, имеют более компактную пространственную организацию, что способствует их стабилизации в растворе. Данная работа посвящена идентификации и изучению особенностей теломеразы в термотолерантных дрожжах Hansenula polymorpha.

Цели работы:

1. Идентификация основных компонентов теломеразы дрожжей H. polymorpha 2. Разработка метода выделения каталитической субъединицы теломеразы, пригодной для структурно-функционального изучения комплекса 3. Изучение особенностей функционирования новой теломеразы дрожжей Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе были идентифицированы основные компоненты теломеразы дрожжей H. polymorpha – теломеразная каталитическая субъединица (hpTERT) и теломеразная РНК (hpTER). Высокая стабильность каталитической субъединицы теломеразы H. polymorpha позволила разработать метод выделения рекомбинантного белка, пригодного для структурных и функциональных исследований. Он включает экспрессию каталитической субъединицы теломеразы с 6His и S-тагами на N-конце белка в E.coli, очистку методами аффинной и ионообменной хроматографии. Впервые было показано, что в системе in vitro рекомбинантная каталитическая субъединица теломеразы обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.

Идентифицированная в работе теломеразная РНК H. polymorpha представляет собой одну из самых компактных теломеразных РНК дрожжей, ее длина составляет нуклеотида. Анализ матричного участка теломеразной РНК методами мутагенеза, детекция теломеразной активности H. polymorpha in vitro и анализ теломер выявили существенное различие в работе теломеразы in vitro и in vivo. Теломераза, выделенная in vitro, использует дополнительный нуклеотид с 5’ конца матричного участка (A170) в реакции обратной транскрипции. Синтезируемый таким образом тимин отсутствует в аннотированной последовательности теломер. Анализ последовательности концов хромосом показал, что нет ни одного случая присутствия тимина в этой позиции in vivo. На основе полученных данных предложена модель регуляции теломеразы на конце хромосомы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях:

36th FEBS Congress “Biochemistry for tomorrow’s medicine”, 25-30 июня, г. Турин, Италия, 2011; международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения», 12- апреля, г. Сыктывкар, 2010; CSHL Meetings “Telomeres&Telomerase”, 28 апреля-2 мая, НьюЙорк, США, 2009; Spetsai Summer School “Proteins and their Networks - from specific to global analysis”, 7-17 сентября, г. Спеце, Греция, 2009.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы.

Материал иллюстрирован 32 рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель включает 137 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В данной работе мы впервые обратились к термотолерантным дрожжам Hansenula polymorpha в качестве модели для исследования теломеразы. Этот организм способен выживать при температурах до 50 С, что позволяет надеяться на большую стабильность выделенной каталитической субъединицы теломеразы H. polymorpha по сравнению с аналогами из других организмов. На настоящий момент единственным примером полноразмерной теломеразной обратной транскриптазы, для которой удалось получить кристаллическую структуру, является TERT из организма Tribolium castaneum.

Отличительной особенностью этого белка является отсутствие N- концевого домена, характерного для всех других известных теломеразных обратных транскриптаз. Для Tetrahymena thermophila получены данные о структуре N-концевого домена теломеразной каталитической субъединицы и о структуре ее РНК-связывающего домена.

H. polymorpha принадлежит к метилотрофным дрожжам, таксономический анализ относит ее к семейству Saccharomycetaceae, род Pichia. Анализ митохондриального генома H. polymorpha позволяет сомневаться в принадлежности H. polymorpha к роду Pichia и предполагает создание отдельного рода для данного организма.

последовательности 5’-gggtggcg-3’. Они характеризуются высоким процентным содержанием G-C пар (87%), а также гомогенностью, необычной для большинства дрожжей. Тот факт, что H. polymorpha стоит на пересечении между разными видами дрожжей делает особенно интересной идентификацию теломеразной РНК из этого организма.

1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ

КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ ТЕЛОМЕРАЗЫ, ПРИГОДНОЙ ДЛЯ

СТРУКТУРНЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В сотрудничестве с лабораторией генетической инженерии центра «Биоинженерии»

РАН мы отсеквенировали геном H. polymorpha, штамм DL1. Собранные контиги находятся в свободном доступе в базе данных Pubmed, Genbank (AEOI01000001.1 - AEOI01000013.1).

Последовательность каталитической субъединицы теломеразы S. cerevisiae (Est2) сравнили с геномом H. polymorpha. Анализ программой BLAST выявил 44% гомологии по аминокислотам с участком HPODL контига 07 318035-315746. Искомый ген белка (далее hpTERT) содержит обратнотранскриптазный домен, который характерен для всех обратных транскриптаз, включая обратные транскриптазы ретровирусов, ретротранспозонов, интронов II-й группы. Также в аминокислотной последовательности hpTERT можно выделить N- и С- концевые домены, характерные для теломеразных обратных транскриптаз.

Ген кодирует белок размером 92 кДа – это одна из самых маленьких теломеразных обратных транскриптаз, за исключением TERT из T. castaneum.

Ген белка hpTERT был клонирован под T7 промотор в 3 различные экспрессионные системы для последующего выделения из E. coli: 1) pCDF с 6His тагом на N-конце белка 2) pET33b+ с 6His тагом на С-конце белка 3) pET30aTEV с 6His и S- тагами с N- конца белка.

Постановка тагов с различных сторон белка обусловлена вероятностью сворачивания концов аминокислотной цепи внутрь белковой глобулы, с чем может быть связано снижение эффективности аффинной хроматографии. S-таг представляет собой небольшую пептидную последовательность размером 4 кДа, которая может использоваться для стабилизации белков в растворе. Экспрессия белков индуцировалась изопропил--D-1тиогалактопиранозидом, очистка проводилась с помощью металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA (никель-нитрилтриуксусная кислота) агарозе в нативных условиях. hpTERT детектируется во всех образцах элюции с аффинного сорбента. Это говорит об успехе тактики выбора термотолерантных дрожжей в качестве источника каталитической субъединицы теломеразы. Однако при использовании векторов pCDF и pET33b+, как в случае расположения тага с N-, так и с C- конца вместе с целевым белком на смоле происходит совыделение значительного количества примесей. Нужно отметить, что соотношение целевой белок/примеси лучше в случае использования конструкции pET33b+ с 6His тагом на С-конце белка, что, скорее всего, отражает закрытую ориентацию N-конца белковой цепи hpTERT. Выделение белка с использованием S тага (конструкция pET30aTEV) дает принципиально лучший результат. Очевидно, что хорошо структурированный, небольшой S-таг с N- конца белка значительно повышает его стабильность в растворимой форме. Белок был выделен и дополнительно очищен с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии на SP-сефарозе, результат очистки представлен на рисунке 1А.

Рис.1. Проверка функциональной активности hpTERT, выделенной из клеток E. coli, трансформированных вектором pET30aTEV_hpTERT. А - Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантной hpTERT, полученной из клеток E. coli, трансформированных вектором pET30aTEV_hpTERT. Дорожки 1 и 2 -- белки суммарных клеточных лизатов E. coli до и после индукции ИПТГ. Образец в дорожке «hpTERT» соответствует белковому препарату, полученному с помощью дополнительной очистки посредством аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе и ионообменной хроматографии на SP-сефарозе. Б - Схема РНК-ДНК-дуплекса, используемого в качестве субстрата для hpTERT в реакции обратной транскрипции. В - продукты реакции с участием hpTERT (добавление белка в реакционную смесь обозначено «+», те же компоненты без добавления белка обозначены «–» над рисунком) и различных субстратов (тип субстрата указан над рисунком) проанализированы методом электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях. Для визуализации продуктов удлинения ДНК-олигонуклеотида в реакционной смеси присутствует [P]dGTP. Зона, соответствующая по подвижности исходному ДНК-олигонуклеотиду, отмечена стрелкой. Отсутствие явных продуктов удлинения ДНК-олигонуклеотида во всех дорожках, кроме первой, свидетельствует о получении активной hpTERT в растворимой форме.

На основании данных о составе теломер можно предположить последовательность матричного участка теломеразной РНК и смоделировать ДНК олигонуклеотид, имитирующий теломеру. Таким образом, система содержала очищенную рекомбинантную каталитическую субъединицу теломеразы; субстрат, представляющий собой гибридный РНК-ДНК дуплекс со свободным 3’ концом (Рис. 1Б); смесь нуклеотидов, где dGTP содержит 32й изотоп фосфора в альфа положении (для визуализации удлинения олигонуклеотида). В качестве контролей использовались аналогичный ДНК-ДНК дуплекс, либо одноцепочечная теломерная ДНК. Поскольку каталитическая субъединица теломеразы является обратной транскриптазой, такие субстраты не могут использоваться hpTERT для удлинения. Кроме того, каждая реакция проводилась в присутствии и в отсутствии hpTERT (Рис. 1В). В дорожке №1 рисунка 1В можно наблюдать специфичный сигнал, соответствующий присоединению dGTP к ДНК олигонуклеотиду в РНК-ДНК дуплексе. Эта зона отсутствует в системах с субстратами ДНК-ДНК, либо одноцепочечной ДНК и в отсутствии белка, что исключает участие клеточных полимераз E. coli в данной реакции.

ДНК/РНК дуплекс, используемый для реакции, спланирован таким образом, что теоретически в данной системе возможно присоединение трех нуклеотидов. Сигналы, соответствующие присоединению второго и третьего нуклеотидов, можно также детектировать в дорожке под номером 1, однако их интенсивность намного ниже. Скорее всего, это связано с отсутствием в системе полноразмерной теломеразной РНК, необходимой для реконструкции теломеразной активности in vitro. Тем не менее, присоединение даже одного нуклеотида говорит о наличии у белка специфичной обратнотранскриптазной активности и о сохранении им корректной структуры каталитического центра.

Таким образом, конструкция pET30aTEV с hpTERT, где 6His- и S-аффинные таги расположены с N-конца белка, может быть использована для получения рекомбинантной функциональной каталитической субъединицы теломеразы H. polymorpha. Это открывает новые возможности для определения структуры теломеразной обратной транскриптазы и изучения механизма ее работы.

2. ДИМЕРИЗАЦИЯ N-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА hpTERT И БЕЛКА EST3 S.

CEREVISIAE

Кроме обратно-транскриптазного домена, ответственного за катализ, теломеразная обратная транскриптаза содержит С- и N-концевые домены, необходимые для ее функционирования. Было показано, что N-концевой домен участвует в ассоциации теломеразной РНК и TERT, взаимодействует с теломерой, способствует функциональной мультимеризации теломеразного комплекса. Учитывая исключительную роль N-концевого домена в фунционировании теломеразы, а также тот факт, что это единственный фрагмент теломеразной обратной транскриптазы (за исключением T. castaneum TERT), для которого удалось получить кристаллическую структуру, мы экспрессировали N-концевой домен TERT H. polymorpha в системе, отработанной на полноразмерном белке.

Как и в случае полноразмерного белка hpTERT, N-концевой домен, слитый с 6-His и Sтагом, был растворим при выделении из клеток E. coli, трансформированных плазмидой pET30aTEV_Ndom. После очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе образец белка был подвергнут гель фильтрации на Superdex S200 колонке, предварительно откалиброванной стандартными белковыми маркерами. При анализе хроматограммы мы детектировали основной пик, соответствующий N-концевому домену, в области 46 кДа, что соответствует димерной форме белка. Интересно, что при очистке полноразмерного белка методом гель фильтрации мы не обнаружили димеризации, пик hpTERT соответствует массе белка, которая составляет 96 кДа. Предыдущие эксперименты с использованием аффинных тагов с N- и C- конца hpTERT позволили предположить, что N-домен имеет закрытую ориентацию по отношению к белковой глобуле. Это гипотеза также объясняет отсутствие способности N-домена к димеризации в составе полноразмерного белка hpTERT.

Ранее мы исследовали димеризацию дрожжевого белка Est3, являющегося компонентом теломеразного комплекса S. cerevisiae. В позвоночных организмах не обнаружено гомологов Est3 белка, однако, его способность связывать РНК и теломерподобные ДНК олигонуклеотиды, а также взаимодействие с теломерой in vivo позволили предположить, что он выполняет сходные функции с N-концевым доменом каталитической субъединицы теломеразы. В эксперименте по исследованию димеризации Est3 белка мы использовали его производные с различными аффинными тагами - Gst-Est3 (Est3 слит с аффинным эпитопом глутатион S трансферазы) и 6His-Est3 (гексагистидиновое производное).

Мы смешивали два белковых препарата Est3-6His и GST-Est3p и затем выделяли из полученной смеси белок с гистидиновым аффинным эпитопом с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. При анализе полученной таким образом белковой фракции с помощью ПААГ-ДСН мы детектировали оба производных Est3p, что указывало на взаимодействие между этими двумя белками. В качестве контроля на специфичность взаимодействия мы использовали чистый белок GST, который не совыделялся с гексагистидиновым производным. При переходе от молярного соотношения Est3p-6His:GST-Est3p 1:1 к молярному соотношению 1:10 количество совыделявшегося GST-Est3p не увеличивалось и не превышало количество Est3p-6His. Это наблюдение позволяет предположить, что происходит насыщение белка GST-Est3p по отношению к Est3p-6His, следовательно, олигомерная форма, скорее всего, является димером.

Способность Est3 к образованию димера коррелирует с димеризацией N-концевого домена полноразмерной каталитичекой теломеразы H. polymorpha. Этот факт не доказывает, но поддерживает гипотезу о схожей функции этих белков в работе теломеразного комплекса.

3. ВЫДЕЛЕНИЕ ТЕЛОМЕРАЗЫ И АНАЛИЗ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В

ДРОЖЖАХ H. POLYMORPHA

Теломераза была выделена из клеток H. polymorpha дикого типа. Дрожжевой S экстракт был очищен на DEAE сефарозе с помощью ионообменной хроматографии. Для визуализации теломеразной активности использовался классический «прямой метод детекции». В экстракт, предположительно обогащенный теломеразой, добавляли субстрат (олигонуклеотид, содержащий теломерную последовательность), радиоактивно меченный (-32P)-dGTP (dGTP*), другие нуклеотиды. Продукты реакции анализировали в полиакриламидном геле, визуализация осуществлялась с помощью системы PhosphorImager.

В DEAE фракциях, содержащих 400-500 мМ NaOAc, была детектирована РНКзависимая полимеризующая активность в области, соответствующей более тяжелому, чем исходный праймер, продукту (рис. 2А). Дальнейшие эксперименты показали, что продукты удлинения не детектируются в отсутствие праймера или с неспецифическим праймером, т.е.

в данном случае специфически детектируется именно теломеразная активность. Для того чтобы проверить последовательность нуклеотидов, добавляемую ферментом, мы провели серию реакций, в которых один из нуклеотидов (dA, dT, dC) был заменен своим дидезоксианалогом. Для этого эксперимента использовался праймер HD5 5’-tggcggggtggcgВ обычных условиях в результате работы фермента он удлинялся на 9 нуклеотидов.

Удлинение HD5 праймера в присутствии ddT приводило к преждевременному стопу на четвертом нуклеотиде (Рис. 2Б, дорожка 4), тогда как в присутствии ddC HD5 удлинялся на 7 нуклеотидов (Рис. 2Б, дорожка 5). Как и ожидалось, включение ddA в реакционную смесь не изменило паттерн продуктов реакции (Рис. 2Б, дорожка 3). Эти результаты позволили нам предположить, что последовательность, синтезируемая ферментом в данных условиях, соответствует теломерной.

Дрожжевая теломераза, выделенная in vitro, не обладает высокой процессивностью.

В большинстве случаев она непроцессивна. Это справедливо как для делящихся дрожжей S.

pombe, так и для почкующихся дрожжей, например, K. lactis, C. albicans, S. cerevisiae (хотя известно, что при определенных условиях теломераза S. cerevisiae может синтезировать больше одного повтора). Теломераза S. castelii производит более 8 теломерных повторов без диссоциации от субстрата, но это, скорее, исключение из правил. В наших экспериментах теломераза H. polymorpha была непроцессивной в подавляющем большинстве случаев. При концентрировании DEAE фракции, обогащенной теломеразой, мы детектировали РНКзависимую ДНК полимеризующую активность в зоне, соответствующей по подвижности второму и третьему повторам. Это согласуется с гипотезой о том, что процессивность является количественной, а не качественной характеристикой теломеразы.

нуклеотидной последовательности, синтезируемой ферментом. Дидезоксианалог нуклеотида, используемый в реакции, указан над рисунком. В - Анализ активности теломеразы в широком температурном диапазоне. Буквой «К» обозначен контроль нанесения – радиоактивно меченный олигонуклеотид, добавляемый к продуктам теломеразной реакции перед переосаждением.

Поскольку одной из особенностей дрожжей H. polymorpha является способность выживать при температурах до 50С, мы провели анализ теломеразной активности в широком температурном диапазоне от +4 до +70 С (Рис. 2В). Реакционная смесь и экстракт, обогащенный теломеразой, предварительно инкубировались при инкубировались еще 15 минут. Оптимальная температура жизнедеятельности H. polymorpha составляет 37 С, именно это значение использовалось в предыдущих экспериментах.

Несмотря на то, что клетки H. polymorpha способны выживать при температуре 50 С, теломеразная активность не детектируется при температурах выше, чем оптимальное значение. Наоборот, даже при 4 С можно детектировать синтез ДНК, при этом наиболее эффективно добавляются первые четыре нуклеотида. Логично было бы предположить, что изменение температурных условий реакции равномерно повлияет на «процессивность первого типа», то есть, способность теломеразы добавлять каждый следующий нуклеотид в рамках одного повтора. Тот факт, что при 4 С синтез первых пяти нуклеотидов происходит с той же эффективностью, что и при 37 С, в то время, как эффективность обратной транскрипции следующих четырех нуклеотидов значительно снижается, говорит о возможном существовании дополнительного термодинамического барьера в реакции. В процессе синтеза теломерной последовательности теломеразная РНК должна репозиционировать матричный участок и синтезируемую ДНК в каталитическом сайте, действуя, как пружина. Можно предположить, что репозиционирование гетеродуплекса после синтеза пятого нуклеотида сопряжено со структурными изменениями в архитектуре теломеразной РНК и этот переход облегчается в условиях более высоких температур.

4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ РНК H. POLYMORPHA

Стратегия поиска Для того чтобы идентифицировать теломеразную РНК H. polymorpha мы применили сочетание подходов биоинформатического анализа генома и метода биохимического поиска. Последовательность теломеразной РНК должна была содержать матричный участок, комплементарный теломерному повтору, кроме того, ген теломеразной РНК должен отстоять на значительном расстоянии от генов консервативных белков. Мы провели выборку последовательностей H. polymorpha, содержащих последовательность 5’-gggtggcgи исключили кандидаты, где предполагаемый матричный участок входил в состав открытой рамки считывания. Стратегия идентификации теломеразной РНК и использованием биохимического подхода заключается в амплификации необходимой молекулы, причём селективность достигается за счёт знания последовательности предполагаемого матричного участка. Теломеразная РНК присутствует в клетке в очень небольших количествах, поэтому для увеличения эффективности метода необходимо было сконцентрировать и очистить теломеразу. Первым этапом на этом пути стало получение поликлональных антител против каталитической субъединицы теломеразы из H. polymorpha (hpTERT). На втором этапе теломеразный экстракт, полученный после очистки на DEAE сефарозе, был подвергнут иммунопреципитации за очищенные поликлональные антитела против каталитической субъединицы теломеразы. Мы детектировали теломеразную активность в иммунопреципитате, что доказывает надежность используемого подхода (Рис.

3А). Из полученной фракции были извлечены рибонуклеиновые кислоты, после чего образец был подвергнут обратной транскрипции и амплификации. Последняя стадия последовательностей (Рис. 3Б).

В результате проведенного анализа было получено 20 последовательностей. Несмотря на несколько стадий очистки значительная часть (9 сиквенсов) представляла гены консервативных белков дрожжей – таким образом, маловероятно, чтобы они кодировали теломеразную РНК. Еще 4 соответствовали генам E. coli, - чувствительность метода выявила даже следовые количества примесей. 4 последовательности совпадали друг с биоинформатического подхода на предыдущем этапе.

Транскрипция гена – кандидата на роль теломеразной РНК в клетке Последовательность кандидата на роль гена теломеразной РНК располагается между аннотированными белками PDD4 (в 187 нуклеотидах в 5’ области от предполагаемого матричного участка) и геном Ароматической аминотрансферазы I (в 647 нуклеотидах в 3’ области от предполагаемого матричного участка). Для того чтобы подтвердить транскрипцию исследуемого участка генома в клетке, был проведен Нозерн блот анализ с использованием зонда в 556 нуклеотидов на область, содержащую матричный участок и лежащую между генами консервативных белков (Рис. 3В). Были проанализированы образцы суммарной РНК; РНК, выделенной из S100 экстракта; а также РНК, полученной после переосаждения DEAE фракции, обогащенной теломеразой. Анализ выявил присутствие нескольких форм транскрипта исследуемого гена. Основной сигнал соответствовал длине маркера приблизительно в 800 нуклеотидов и присутствовал во всех изученных образцах. Эта длина идеально соответствует размеру участка между аннотированными белковыми генами. Впоследствии мы будем обращаться к этой области генома как к гену hpTER. Клонирование дополнительных молекул hpTER позволило определить 5’- и 3’- концы транскрипта более точно. 5’- конец достаточно гомогенен и отстоит от матричного участка на 168 нуклеотидов. Анализ 3’- конца разделил последовательности РНК, соответствующие гену hpTER, на 3 класса: 1) четыре наиболее длинных клона содержали дополнительно полиадениловую последовательность (6-11A) с 3’ полиаденилировании теломеразной РНК; 2) последовательности, заканчивающиеся в позиции 672-680 нуклеотидов от начала транскрипта hpTER; 3) последовательности, заканчивающиеся в позиции 584-590 нуклеотидов от начала транскрипта hpTER. Три формы аналогичной длины детектируются Нозерн блот анализом. Этот результат отражает или направленный процессинг, или деградацию, что не может быть точно выявлено с помощью данного метода анализа. Логично предположить, что наиболее удаленные концы соответствуют исходному транскрипту, - таким образом, его длина составляет нуклеотида. Нужно отметить, что это одна из наиболее коротких известных дрожжевых теломеразных РНК. Единственное исключение – это теломеразная РНК C. guilliermondii, длина которой составляет 779 нуклеотидов.

Рис. 3. Поиск кандидатов на роль теломеразной РНК с использованием биохимического подхода. А - Анализ присутствия теломеразы до (DEAE) и после (IP) коиммунопреципитации экстракта против антител к hpTERT. Б - Схема получения пула последовательностей-кандидатов на роль теломеразной РНК в дрожжах H. polymorpha. В - Нозерн блот анализ с использованием зонда в 556 нуклеотидов к гену hpTER. Анализировались образцы суммарной РНК; РНК, выделенной из S100 экстракта и из DEAE фракции, обогащенной теломеразой.

Нокаут гена hpTER приводит к фенотипу укорачивающихся теломер Нокаут генов, необходимых для функционирования теломеразы, вызывает фенотип укорачивающихся теломер (Est фенотип). Он характеризуется потерей жизнеспобности клеток через определенное количество поколений ввиду укорочения теломер до критической длины.

Мы нокаутировали ген hpTERT (как положительный контроль) и ген hpTER. Штамм DL1-l, используемый в данных исследованиях, дефективен в производстве лейцина; в нормальных условиях он гаплоиден. Мы заменили часть гена hpTER в нуклеотидов, содержащую предполагаемый матричный участок теломеразной РНК, на лейциновый маркер H. polymorpha. В случае hpTERT ген был прерван вставкой лейцинового маркера по сайту Stu1. Полученные конструкции были трансформированы в штамм DL1-l, делеции искомых генов были подтверждены ПЦР анализом, который дал продукты предсказанной длины. Мы наблюдали два независимых hpTER трансформанта, hpTERT трансформант и штамм дикого типа в течение нескольких поколений. Анализ жизнеспособности клеток проводился высеванием жидкой клеточной культуры на чашку (Рис. 4А). С первым же пересевом (около 20 поколений с момента трансформации) можно наблюдать потерю жизнеспособности нокаутных штаммов (Рис.4А, 1й пересев). Теломеры H. polymorpha изначально короче теломер других дрожжей (140-190 нуклеотидов по сравнению с 300-500 нуклеотидами у S. cerevisiae, принадлежащей тому же роду).

Вероятно, укорочение теломер после 20 поколений достаточно сильно для того, чтобы серьезно повлиять на способность клетки поддерживать архитектуру генома; поэтому данный результат не противоречит литературным данным о том, что обычно первые признаки фенотипа наблюдаются позже. Начиная со второго пересева, клетки из жидкой культуры были неспособны к формированию колоний. После нескольких пересевов для всех типов мутантов можно наблюдать возникновение жизнеспособных колоний, скорее всего, результат гомологической рекомбинации – альтернативного механизма удлинения теломер.

Статус теломер в исследуемых штаммах был проверен с помощью метода Соузерн блот анализа терминальных фрагментов рестрикции (Рис. 4Б). В области, соответствующей по подвижности 0.6 kb можно наблюдать зону, укорачивающуюся по мере жизни нокаутных штаммов. Она соответствует концу хромосомы и отражает судьбу теломер. В совокупности с данными по жизнеспособности клеток это подтверждает фенотип укорачивающихся теломер для hpTERT и hpTER штаммов.

Наблюдаемый эффект может обуславливаться не делецией hpTER, а побочным эффектом трансформации (мутации, либо встраивание фрагмента ДНК в нецелевую область генома). Для того чтобы исключить подобное событие, мы сконструировали шаттл вектор, в который ген hpTER встроен вместе со 150 нуклеотидами из 5’ области, которые служили бы нативным промотором. Вектор был трансформирован в hpTER клетки. Полученный штамм мы характеризовали следующим образом: во первых, жизнеспособность клеток восстанавливалась; во вторых, из них можно было выделить активную теломеразу, тогда как в штамме hpTER теломеразная активность не детектировалась.

Рис. 4. Клетки, нокаутные по гену hpTER демонстрируют фенотип укороченных теломер. А жизнеспособность штаммов hpTER, hpTERT и штамма дикого типа оценивалась методом высевания жидкой культуры на чашку. Б - анализ изменения длины теломер в hpTER и hpTERT штаммах в течение поколений. Каждый пересев соответствует примерно 20 поколениям.

Мутационный анализ матричного участка теломеразной РНК H. polymorpha Известно, что одиночные мутации в матричном участке теломеразной РНК, используемом для синтеза, чаще всего не являются летальными. Такая мутантная теломеразная РНК используется клеткой для синтеза теломер с измененной последовательностью. Этот подход станет исчерпывающим доказательством функционирования hpTER гена в качестве теломеразной РНК в организме H. polymorpha.

Выравнивание гена hpTER с теломерной последовательностью выявило область со 171-го по 187-й нуклеотид, которая может служить матрицей для синтеза теломер (Рис. 5).

Логично предположить, что первая часть используется для связывания хромосомы, тогда как вторая вовлечена в синтез ДНК. Анализ паттерна нуклеотидов, добавляемого теломеразой к праймеру G4 5’-(gggtggcg)4-3’, поставил интригующий вопрос. К субстрату добавляется 9 нуклеотидов; в соответствии с теломерной последовательностью H.

polymorpha это должна быть последовательность 5’-gggtggcgg-3’. Частично этот сиквенс был подтвержден опытом с дидезоксинуклеотидами (было показано, что 4-й и 7-й нуклеотиды являются тимином и цитозином соответственно). Если первый повтор матричного участка (до нуклеотида С179) используется для связывания субстрата, тогда вторая часть (С178 – С171) служит для синтеза теломерного повтора. Здесь представлено только 8 нуклеотидов, комплементарных теломерному повтору, А170, расположенный с 5’ конца за матричным участком, не соответствует последовательности теломерного повтора.

С другой стороны, олигонуклеотид G4 может начать удлиняться с нуклеотида C186 (в этом случае только два из трех нуклеотидов будут связаны уотсон-криковским взаимодействием для инициации полимеризации). Тогда последующая доступная часть матрицы идеально соответствует теломерному паттерну, однако вторая часть повтора останется незадействованной.

Для того чтобы разрешить это противоречие, мы мутировали нуклеотид С176 на аденин в шаттл векторе и трансформировали его в штамм, нокаутный по hpTER гену;

теломераза из полученного штамма была выделена и проанализирована на предмет добавляемой последовательности в присутствии дидезоксинуклеотидов (Рис. 6А). В случае, когда в реакционной смеси присутствует ddT, можно наблюдать преждевременную по отношению к дикому типу остановку синтеза на третьем нуклеотиде, в позиции мутации С176А. Этот результат однозначно подтверждает идентификацию теломеразной РНК H.

polymorpha. Он также позволяет обозначить область, используемую для синтеза теломерного повтора как 178-171 нуклеотид. Тем не менее, остаётся неясным появление девятого нуклеотида в теломеразной реакции при использовании G4 олигонуклеотида.

Теломераза H. polymorpha использует дополнительный (нетеломерный) нуклеотид А170 с 5’ конца матричного участка в реакции обратной транскрипции in vitro преждевременной транслокации, так, как это происходит для теломеразы S. cerevisiae или S.

pombe. Чтобы проверить, насколько эффективно используется конец матричного участка, мы сконструировали теломеразные РНК с мутациями C171T и G172T. Обе мутантных теломеразы были проанализированы, в каждом случае видно эффективное включение тимина в теломеразный паттерн (Рис. 6Б). Этот результат исключает возможность преждевременной транслокации. Кроме того, наличие девятого нуклеотида в случае мутанта С171Т показывает, что синтез дополнительного нуклеотида не может быть результатом транслокации в позиции С174 или С179, так как альтернативный аденозин с 3’ конца вновь синтезированной ДНК не сможет обеспечить комплементарность вначале матричного участка.

Рис. 6. Анализ матричного участка гена hpTER. А - Теломераза, выделенная из штамма с геном hpTER с мутацией С176А, добавляет к субстрату G4 альтернативную последовательность. Б Мутации C171T и G172T в гене hpTER показывают, что теломераза эффективно использует конец матричного участка и опровергают возможность преждевременной транслокации.

Мы предположили, что, несмотря на регулярный повтор 5’-(gggtggcg)n-3’ на концах хромосом, теломераза, выделенная in vitro может потенциально использовать нуклеотид A170. Мы провели реакцию с теломеразой дикого типа и праймером HD1, который позиционируется в середину матричного участка. В реакциях использовался различный набор нуклеотидов, что позволяло проследить последовательность, добавляемую теломеразой (Рис. 7А). Праймер заканчивается последовательностью 5’-tggcggggtg-3’, что на 5 нуклеотидов длиннее, чем G4 олигонуклотид, использовавшийся ранее. Таким образом, в соответствии с теломерной последовательностью H. polymorpha теломераза должна синтезировать сиквенс 5’-gcgg-3’. Как и ожидалось, в присутствии радиоактивно меченного dGTP* без других нуклеотидов теломераза добавляла к субстрату HD1 только один нуклеотид (Рис. 7А, дорожка 1). Присутствие dGTP* вместе с dCTP обеспечивало синтез трех нуклеотидов (не четырех, как можно было бы ожидать в соответствии с данными по теломерной последовательности). Включение четвертого нуклеотида можно наблюдать, только в присутствии dTTP в реакции (Рис. 7А, дорожка 3). Скорее всего, этот результат отражает обратную транскрипцию аденина 170, который располагается непосредственно с 5’ конца матричного участка. В дорожках 2-3 можно наблюдать сигнал меньшей интенсивности, он соответствует отжигу олигонуклеотида HD1 с последующим синтезом ДНК одним повтором ранее; эффективность такого процесса на порядок ниже (Рис. 7Б, «позиционирование 2»).

Рис.7. Обратная транскрипция нуклеотида А170. А - Работа теломеразы дикого типа анализировалась в присутствии олигонуклеотида HD1 и различного набора нуклеотидов. Б - варианта позиционирования олигонуклеотида HD1 в матричный участок теломеразной РНК.

Последовательность, добавляемая теломеразой, выделена черным цветом. «Позиционирование 2»

соответствует сигналу низкой эффективности в левой части рисунка.

В соответствии с данным предположением в присутствии dGTP* мы наблюдаем единственную зону (Рис. 7А, дорожка 1). Для эксперимента с участием dGTP* и dCTP реакция обратной транскрипции идет вплоть до позиции С176 – добавляется 6 нуклеотидов (Рис. 7А, дорожка 2). В присутствии dGTP*, dCTP и dTTP теломераза преодолевает барьер A175 (Рис. 7А, дорожка 3).

Удивительно, но проведённый эксперимент показал, что последний нуклеотид, добавляемый теломеразой к субстрату в реакции in vitro, не соответствует аннотированной последовательности теломер H. polymorpha. Для того чтобы выяснить, встречается ли подобная ситуация in vivo, мы проанализировали 87 чтений, полученных в результате секвенирования генома H. polymorpha, которые содержали от 13 до 20 теломерных повторов. Среди 1400 проанализированных повторов не было ни одного случая присутствия тимина после паттерна 5’-TGGCG-3’. Мы наблюдали гетерогенность после сиквенса 5’TGGC-3’, которая заключалась в различном количестве гуанинов – 6.7% и 4.5% теломерных повторов содержали 5 и 3 гуанина соответственно, в противоположность четырем, которые кодируются матричным участком теломеразной РНК H. polymorpha. В соответствии с литературными данными этот тип гетерогенности объясняется проскальзыванием фермента по матрице и наблюдается в случае, когда матрица содержит несколько одинаковых нуклеотидов подряд.

Таким образом, последовательность нуклеотидов, получаемая в результате работы теломеразы in vitro, выглядит как 5’-gggtggcgt-3’, в то время как in vivo за паттерном 5’gggtggcg-3’ всегда следует «g».

В теломеразе процесс обратной транскрипции ограничен с 5’ конца РНК-шпилькой (TBE, template boundary element - ограничивающий элемент). Мутации, нарушающие структуру этого элемента, могут привести к обратной транскрипции нетеломерной последовательности за матричным участком теломеразной РНК, нарушениям в использовании РНК матрицы и изменениям в процессивности теломеразы. Известно, что Сдомен теломеразной обратной транскриптазы стабилизирует матричный граничный элемент, непосредственно взаимодействуя с РНК-шпилькой. Делеции в С-концевом домене hTERT приводили к синтезу последовательности за пределами матричного участка. Эти данные позволяют предположить, что включение нетеломерного нуклеотида теломеразой H. polymorpha in vitro может быть связано с положением, структурой граничного элемента, либо с его способностью связывать hpTERT. Возможно, что в процессе выделения теломеразы эта структура нарушается, то есть, включение дополнительного нуклеотида является артефактом выделения теломеразы. Однако высокая эффективность и 100% воспроизводимость наблюдаемого процесса позволяют предположить, что подобное событие может иметь место in vivo. Мы не зафиксировали ни одного случая присутствия тимина после паттерна 5’-gggtggcg-3’ в теломерах H. polymorpha. Возможно, что это является следствием нуклеазной активности, которая ассоциирована с теломеразой. В таком случае, нуклеазная активность может обеспечивать корректирующую функцию и удалять нетеломерный нуклеотид, ее эффективность может быть нарушена в процессе выделения теломеразы.

Другое возможное объяснение заключается в том, что включение тимина – это особенность именно непроцессивной формы теломеразы H._polymorpha. Находясь в процессивном состоянии, теломераза реплицирует теломерную ДНК без включения нетеломерного нуклеотида. Но для того чтобы диссоциировать с теломеры, теломераза переключается в непроцессивное состояние, возможно, что этот процесс сопряжен со структурными изменениями комплекса. В таком случае обратная транскрипция аденина будет происходить только на самом конце теломеры, а детекция этого события может быть затруднена вследствие клеточных процессов или в результате выделения геномной ДНК. В рамках этой гипотезы можно предположить, что добавление нетеломерного нуклеотида служит маркером теломеры, которая только что подверглась удлинению ферментом. В таком случае, теломераза не сможет использовать в качестве субстрата олигонуклеотид, заканчивающийся нетеломерной последовательностью 5’-gggtggcgt-3’.

Для того, чтобы проверить это предположение мы провели эксперимент, в котором использовали теломерный олигонуклеотид G4 и олигонуклеотид G4t, соответствующий последовательности, продуцируемой теломеразой in vitro (Рис. 8А).

Рис. 8. Эффективность теломеразной реакции в случае использования разных субстратов. А Схематичное изображение используемых в реакции олигонуклеотидов Б - Реакция удлинения праймера теломеразой. Фермент не способен использовать G4t олигонуклеотид (имититирующий только что синтезированную теломеразой последовательность) в качестве субстрата для реакции полимеризации. Буквой «К» обозначен контроль нанесения – радиоактивно меченный олигонуклеотид, добавляемый к продуктам теломеразной реакции перед переосаждением Отсутствие сигнала в дорожке «G4t» (Рис. 8Б) обозначает неспособность теломеразы использовать только что синтезированную последовательность нуклеотидов в реакции обратной транскрипции. Возможно, именно это обстоятельство обуславливает отсутствие процессивности теломеразы H. polymorpha in vitro.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы гены каталитической субъединицы теломеразы и теломеразной РНК в дрожжах H. polymorpha.

2. Разработан метод получения каталитической субъединицы теломеразы H. polymorpha (hpTERT), пригодной для структурных и функциональных исследований. Показано, что в отсутствие полноразмерной теломеразной РНК белок обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.

3. N-концевой домен каталитической субъединицы теломеразы H. polymorpha и белок Est S. cerevisiae димеризуются in vitro.

4. Охарактеризована теломеразная активность H. polymorpha. Теломераза H. polymorpha использует дополнительный нуклеотид (А170) с 5’ конца матричного участка в реакции обратной транскрипции in vitro, тогда как in vivo результат обратной транскрипции А не детектируется.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смекалова Е.М., Петрова О.А., Зверева М.Э., Донцова О.А. Рекомбинантная форма TERT H. polymorpha обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью (2012). Acta Naturae, 4 № 1 (12), с. 47-50.

2. Шаранов, Ю.С., Смекалова, Е.М., Зверева, М.Э., Донцова, О.А. (2007) Выделение активного теломеразного белка Est3p и изучение его димеризации in vitro. Биохимия, 7:

866-871.

3. Smekalova E.M., Zvereva M.I., Dontsova O.A. Detection of the telomerase activity and identification of the telomerase components in thermotolerant yeast Hansenula polymorpha.

(2011) 36th FEBS Congress “Biochemistry for tomorrow’s medicine”, 25-30 June, Turin, Italy,

Abstract

book, p. 90.

4. Смекалова Е.М., Зверева М.Э., Петрова О.А., Донцова О.А. Теломераза дрожжей продолжительности жизни и старения», 12-15 апреля, Сыктывкар, Россия, сборник тезисов, с. 17-18.

5. Smekalova E.M., Zvereva M.I., Petrova O.A., Dontsova O.A. Telomerase in thermo-tolerant yeast Hansenula polymorpha – detection of the telomerase activity, cloning and characterization of its catalytic subunit. (2009) CSHL Meetings “Telomeres&Telomerase”, 28 April - 2 May, New York, USA, abstract book, p. 161.

6. Smekalova E.M., Zvereva M.I., Petrova O.A., Dontsova O.A Telomerase in thermo-tolerant yeast Hansenula polymorpha (2009) Spetsai Summer School, 7-17 September, Spetsai, Greece, book «Proteins and their Networks – from specific to global analysis», p.57.



 


Похожие работы:

«Охлупин Юрий Сергеевич ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА И ДИФФУЗИИ КИСЛОРОДА В КОМПОЗИЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ La0.8Sr0.2Fe0.7Ni0.3O3– – Ce0.9Gd0.1O1.95 МЕТОДОМ РЕЛАКСАЦИИ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск — 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения Российской академии наук Научный...»

«Соловьев Павел Андреевич Синтез 5-ацилзамещенных пиримидин-2-иминов и пиримидин-2-онов 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2009 Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н.Назарова Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор Шуталев Анатолий Дмитриевич Официальные оппоненты : Доктор...»

«Дрожжин Олег Андреевич Новые сложные перовскитоподобные оксиды кобальта Специальность 02.00.04 - физическая химия 02.00.01 - неорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка - 2009 Работа выполнена в Институте Проблем Химической Физики РАН, на химическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научные руководители: доктор химических наук Добровольский Юрий Анатольевич, доктор...»

«СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ L АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2011 2 Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, засл. деятель науки РФ, профессор Чернова Римма Кузьминична Официальные доктор химических наук,...»

«Казакова Анна Владимировна НОВЫЕ НИЗКОРАЗМЕРНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПРОВОДНИКИ И СВЕРХПРОВОДНИКИ НА ОСНОВЕ КАТИОН-РАДИКАЛЬНЫХ СОЛЕЙ 02.00.04-физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Ягубский Эдуард Борисович Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Абашев Георгий Георгиевич...»

«КАРЛИНСКИЙ ДАВИД МИХАЙЛОВИЧ ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ 02.00.10. – Биоорганическая химия 03.00.04. – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2009 1 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и лаборатории химии...»

«Новикова Светлана Александровна СИНТЕЗ И ТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАННЫХ МАТЕРИАЛОВ С МЕТАЛЛСОДЕРЖАЩИМИ ЧАСТИЦАМИ (Co, Ni, Cu, Ag) 02.00.04-физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН Научный руководитель : член -корреспондент РАН, профессор Ярославцев Андрей Борисович Официальные оппоненты :...»

«КУРОЧКИН СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СИНТЕЗА СВЕРХРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ МЕТОДОМ ТРЕХМЕРНОЙ РАДИКАЛЬНОЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : кандидат химических наук Грачев Вячеслав Петрович Официальные оппоненты : доктор химических наук, доцент Лачинов Михаил...»

«РАГУЛИН Валерий Владимирович Двойная реакция Арбузова и развитие методологии синтеза фосфоизостеров аминокислот и пептидов 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Черноголовка, 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН) Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор, Гололобов Юрий...»

«Степанова Вероника Борисовна ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ПЕРЕНОСА 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2013 Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский...»

«Солодова Светлана Леонидовна РАДИКАЛЬНАЯ ХИМИЯ АРТЕМИЗИНИНА: ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка-2009 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Денисов Евгений Тимофеевич Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Раевский Олег Алексеевич Институт физиологически активных веществ РАН,...»

«КОНДРАТЬЕВА ОКСАНА ВИКТОРОВНА РЕАКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗАМЕЩЕННЫХ ЦИКЛОПРОПАНОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ КИСЛОТ ФОСФОРА И БОРА 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2009 2 Работа выполнена на кафедре химии ГОУ ВПО Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева. доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Митрасов Юрий Никитич Официальные оппоненты : доктор химических...»

«Астахов Александр Владимирович СИНТЕЗ 1,2,4-ТРИАЗОЛОПИРИМИДИНОВ НА ОСНОВЕ РЕАКЦИЙ 1-ЗАМЕЩЕННЫХ 3,5-ДИАМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛОВ С 1,3-БИЭЛЕКТРОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ Специальность 02.00.03 – “Органическая химия” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Южно-Российском государственном техническом университете (Новочеркасском политехническом институте) на кафедре Технология неорганических и органических...»

«Дергунова Елена Сергеевна НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, ОСНОВАННЫЕ НА ИММУНОХИМИЧЕCКИХ РЕАКЦИЯХ НА ПОВЕРХНОСТИ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ СЕНСОРОВ 02.00.02 – аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Воронеж – 2007 2 Работа выполнена на кафедре химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Липецкий государственный технический университет Научный руководитель :...»

«ПАХОМОВА Виктория Александровна РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2006 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН. доктор химических наук Научный руководитель : профессор Михайлов Альфа Иванович доктор физико-математических наук Официальные оппоненты : Харитонов Александр Павлович доктор...»

«КОШЕЛЕВА Екатерина Валентиновна ТВЕРДЫЕ ЭЛЕКТРОЛИТЫ В СИСТЕМАХ CaY2S4-Yb2S3 и CaYb2S4-Y2S3 Специальность: 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург - 2014 2 Работа выполнена на кафедре неорганической и физической химии ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет, г. Киров Калинина Людмила Алексеевна, Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет,...»

«ФАДЕЕВ ~рей Геннадьевич МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПОДВИЖНОСfЬ И ПЕРВАПОРАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ГРЕБНЕОБРАЗНЫХ ПОЛИМЕРОВ С ФТОРАЛКИЛЬНЫМИ БОКОВЫМИ ГРУППАМИ. 02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва, 1995 г. www.sp-department.ru Рабоrа выполнена в лаборатории поJJИМерных мембран ИнСТИiуrа...»

«Левит Галина Львовна АМИНОКИСЛОТЫ В РЕГИО- И СТЕРЕОНАПРАВЛЕННОМ СИНТЕЗЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ 02.00.03 - Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Екатеринбург – 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органического синтеза Уральского отделения РАН им. И.Я. Постовского (г. Екатеринбург). Научный консультант доктор химических наук, профессор Краснов Виктор Павлович Официальные...»

«Старков Илья Андреевич КИСЛОРОДНАЯ НЕСТЕХИОМЕТРИЯ И ТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА ПЕРОВСКИТОПОДОБНОГО ОКСИДА SrCo0,8Fe0,2O3химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор химических наук старший научный...»

«ВОРОНИН Олег Геннадьевич ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗ ГИДРОГЕНАЗАМИ ДЛЯ КОНВЕРСИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ В ЭЛЕКТРИЧЕСТВО Специальности: 02.00.15 – кинетика и катализ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2010 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель :...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.