WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«О-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Бакунина Ирина Юрьевна

О-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ

02.00.10 — биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Владивосток — 2011

2

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Звягинцева Т.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Шибнев В.А.

доктор химических наук, профессор Лукьянов П.А.

доктор биологических наук, с.н.с. Пивненко Т.Н.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится _2011 г., в _ часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН.

Факс: (4232) 314-050, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан " " 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение О-гликозидгидролаз (ЕС 3.2.1.-), ферментов, катализирующих гидролитическое расщепление О-гликозидной связи в углеводах и углеводсодержащих биополимерах, является актуальной задачей.

Эти ферменты наиболее востребованы современной биотехнологией и широко используются для нужд пищевой, фармакологической, легкой промышленности и других областей. Они являются ключевыми ферментами углеводного обмена как в высших организмах, так и в микроорганизмах, поэтому знания об их свойствах, структуре и механизме действия необходимы для понимания многих процессов, происходящих в клетке. Кроме того, индивидуальные гликозидгидролазы с установленной субстратной специфичностью являются точными инструментами структурного анализа соответствующих природных полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров.



Большой научный и практический интерес О-гликозидгидролазы представляют при исследовании и модификации антигенной структуры различных биологических объектов. Частным случаем энзиматической модификации антигенов является направленное изменение групповой специфичности эритроцитов крови человека групп А и В в эритроциты группы O, которое нашло применение в биотехнологии создания "универсальной крови" из крови доноров разной групповой принадлежности. Для конверсии эритроцитов необходимы специфические экзогликозидазы, способные при нейтральных значениях рН и физиологических температурах эффективно катализировать удаление терминальных -1,3-связанных иммунодоминантных остатков N-ацетилгалактозамина и галактозы, которые определяют групповую специфичность А- и В-эритроцитов соответственно. На сегодняшний день имеются сведения о двух таких ферментах из клинических бактериальных патогенов. Сообщения о подобных ферментах из морских бактерий в литературе отсутствуют.

Фукоиданы — семейство как гомо- и гетерополисахаридов, основная цепь которых построена из остатков сульфатированной L-фукозы, связаных преимущественно -1,3- и/или -1,4-О-гликозидными связями, так и полисахаридов с высоким содержанием глюкуроновой кислоты и низким содержанием фукозы и сульфатов. Остатки галактозы, маннозы, ксилозы, рамнозы также найдены в различных фукоиданах. Фукоиданы обнаружены только в морских организмах.

Высоким содержанием этих полисахаридов отличаются бурые водоросли.

Подобные полисахариды также выделены из экстрацеллюлярного матрикса тела кукумарии и обнаружены на поверхности оболочки яйцеклеток у различных видов морских ежей.

Фукоиданы проявляют широкий спектр биологического действия на различные системы организма млекопитающих. Известны их антикоагулянтная, антиангиогенная, антивирусная, антиопухолевая, антиоксидантная и другие виды активностей, т.о. они имеют значительный потенциал как терапевтические агенты.

В настоящее время возрастает интерес к фукоиданам, как к основе для создания эффективных медицинских препаратов нового поколения. В связи с этим, важной проблемой является определение тонкой химической структуры этих биополимеров для корреляции с их биологической активностью.

Большие надежды в процессе изучения структуры фукоиданов возлагают на метод селективной деградации этих полисахаридов с помощью ферментов — фукоиданаз. Ферментативное расщепление этих полисахаридов также необходимо для трансформации их с целью получения новых соединений, проявляющих биологические свойства.

Фукоиданазы — гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз О-гликозидных связей основной цепи фукоиданов, остаются наименее изученным семейством О-гликозидгидролаз. С невысоким уровнем активности они обнаружены только у обитателей морской среды. Несмотря на многолетние усилия ряда исследовательских коллективов, в настоящее время нет коммерческого препарата данного фермента с охарактеризованными свойствами и субстратной специфичностью.

В качестве источников -галактозидазы, -N-ацетилгалактозаминидазы и фукоиданазы наибольший интерес представляют морские бактерии. Бактерии играют ключевую роль в метаболических процессах морских экосистем. Быстрый ответ микроорганизмов на экологические изменения, их важные функции в экосистемах обеспечиваются разнообразными ферментными системами.

Гетеротрофные аэробные облигатно морские бактерии привлекают все большее внимание как источники ферментов с оригинальными свойствами и специфичностью, так как они легко культивируются, обладают высокой скоростью размножения и позволяют осуществлять биосинтез веществ в контролируемых условиях. Кроме того, генетический материал уникальных бактерий можно использовать для создания суперпродуцентов рекомбинантных ферментов на основе легко культивируемых известных технологичных штаммов.

Современное развитие генетической инженерии и морской аквакультуры позволяет рассчитывать на создание новых биотехнологических процессов, альтернативных экологически деструктивной крупномасштабной добыче морской биомассы для получения ферментов.

Целью исследования являлось изучение О-гликозидгидролаз из истинно морских гетеротрофных бактерий, имеющих биотехнологический потенциал:

-N-ацетилгалактозаминидаз и -галактозидаз, пригодных для получения "универсальной крови", а также фукоиданаз, участвующих в биодеградации биологически активных полисахаридов бурых водорослей — фукоиданов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

исследовать особенности распространения -N-ацетилгалактозаминидаз и -галактозидаз среди морских бактерий, собранных в различных акваториях Мирового океана;

провести поиск -N-ацетилгалактозаминидаз и -галактозидаз, удаляющих иммуннодоминантные моносахариды от углеводных составляющих антигенов эритроцитов крови человека при нейтральных значениях рН, из перспективных источников выделить -N-ацетилгалактозаминидазу и -галактозидазу в гомогенном состоянии, охарактеризовать их основные биохимические свойства и субстратную специфичность;

изучить действие -N-ацетилгалактозаминидазы и -галактозидазы на эритроциты крови человека группы А и В, а также действие -галактозидазы на клетки буккального эпителия и патогенной бактерии Corynebacterium diphtheriae;

установить первичную структуру, пространственную организацию, механизм действия -галактозидазы и её принадлежность к определённому семейству гликозидгидролаз;

провести поиск ингибиторов -галактозидазы среди морских природных соединений, а также их синтетических производных;

выполнить иммобилизацию -галактозидазы в полисахаридсодержащих нанокомпозитных материалах;

получить высокоочищенный образец фукоидана, охарактеризовать элементы его структуры и обусловленные ими биологические свойства;

провести поиск фукоиданаз среди бактерий-эпифитов и ассоциантов морских животных Охотского и Японского морей, исследовать особенности их распространения среди -протеобактерий и бактероидов, используя высокоочищенный субстрат;

изучить особенности деградации фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides под действием ферментов из морских бактерий, принадлежащих к различным таксонам и культивируемых на различных по составу питательных средах;

определить области практического применения ферментов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Облигатно морские бактерии, обитающие в Охотском и Японском морях, являются перспективными источниками -N-ацетилгалактозаминидаз, -галактозидаз и фукоиданаз.

2. -N-ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericius N-ацетилгалактозамина от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы крови А.

3. -Галактозидаза из морской -протеобактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 удаляет иммунодоминантные -1,3-связанные остатки галактозы от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы В. Фермент имеет свободную SH-группу, важную для проявления активности; по биохимическим свойствам, субстратной специфичности, первичной и пространственной структуре он относится к 36-ому семейству О-гликозидгидролаз.

4. Иммобилизация -галактозидазы в гибридные полисахарид-силикатные нанокомпозитные материалы увеличивает уровень ее активности и стабильность.

5. Влияние полигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность тиоловой -галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. KMM 701 зависит от природы заместителей, их числа и положения в структуре соединений: эхинохром А не влияет на активность фермента, ди- и тригалогензамещенные нафтазарины являются необратимыми ингибиторами -галактозидазы.

6. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens, освобожденный от полифенольных соединений, сохраняет структурные характеристики и биологические свойства исходного полисахарида. Образец полисахарида пригоден для использования в качестве субстрата при поиске фукоиданаз, изучении их свойств и субстратной специфичности.

7. Фукоиданазы с невысоким уровнем активности широко распространены как среди бактерий-эпифитов бурых водорослей, так и среди изолятов морских иглокожих. Лучшими продуцентами являются бактерии родов Alteromonas и Pseudoalteromonas филума Proteobacteria, а также бактерии семейства Flavobacteriaceae типа Bacteroidetes.

8. -Протеобактерия Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T, а также бактероиды семейства Flavobacteriaceae, такие как Mesonia algae КММ 3909Т, Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 содержат ферменты, участвующие в деградации как нейтральных, так и полианионных полисахаридов бурых водорослей, в том числе — фукоиданазы. Уровень активности фукоиданаз в клетках этих бактерий невысок и варьирует в зависимости от состава питательной среды.

9. Фукоиданазы из штаммов бактерии Pseudoalteromonas citrea, которые являются эпифитами бурых водорослей F. evanescens и Chorda filum, а также ассоциантами голотурии Apostichopus japonicus, катализируют гидролиз доступных -1,3-О-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens по эндо-типу, образуя в качестве продуктов сульфатированные -L-фукоолигосахариды.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выполнено крупномасштабное исследование распространенности О-гликозидгидролаз среди бактериальных изолятов различных экотопов Охотского, Японского, ЮжноКитайского, Кораллового морей, литорали Сейшельских о-в, о-в Кука и других акваторий Мирового океана.

Впервые в морских бактериях найдены гликозидгидролазы, модифицирующие эритроциты и гликопротеины крови человека группы А и В:

-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701, -N-ацетилгалактозаминидаза из Arenibacter latericius КММ 426Т, проведено их выделение и очистка; впервые показано, что -галактозидаза из морской бактерии нарушает углеводные структуры, экспрессированные на поверхности эпителиоцитов человека и бактерий С.

diphteriae.

Установлена полная аминокислотная последовательность -галактозидазы и принадлежность ее к 36 семейству О-гликозидгидролаз. Впервые методом сравнительного моделирования получены теоретические модели пространственной структуры -галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701, её каталитического домена и комплекса с конкурентным ингибитором галактозой. На основании результатов этих исследований установлены функционально значимые участки в молекуле фермента и их роль в катализе.

Выполнена иммобилизация -галактозидазы в гибридных нанокомпозитных материалах, содержащих полисахариды, в результате чего увеличилось время функционирования фермента и его термостабильность.

Среди природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов обнаружены ингибиторы -галактозидазы; наиболее значительным необратимым ингибирующим действием отличались хлорпроизводные этих соединений.

Из бактерии Pseudoalteromonas citrea выделен фермент, который катализирует гидролиз доступных -1,3-О-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens и является 1,3--L-фуканазой (ЕС 3.2.1.-).

Результаты исследований защищены патентами и позволят достичь конечной практической цели — применения ферментов морских бактерий и их рекомбинантных форм в медицине, структурной химии углеводов и генной инженерии.

Апробация результатов. Результаты диссертационной работы были представлены в виде постерных сообщений и устных докладов на следующих Региональных, Всероссийских и Международных конференциях и симпозиумах:

45th Arctic Science Conference "Bridges of the science between North America and the Russian Far East" (Vladivostok, Russia, 1994), PICIES Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas (Vladivostok, Russia, 1995), 2-ом Cъезде биохимического общества (Москва, Россия, 1997), Proceedings Сonference Oceanology International 97 Pacific Rim (World Trade Center, Singapore, 1997), Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 1998), IX Pacific Science Inter-Congress (Taipei, Taiwan, 1998), 2-ом Международном симпозиуме "Химия и химическое образование" (Владивосток, Россия, 2000), Научной конференции "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока" (Владивосток, Россия, 2001), 9th International Symposium on Microbial Ecology (Amsterdam, Holland, 2001), Science Cnference on Marine Biotechnology (Shizuoka, Japan, 2001), 18th European Conference on Biomaterials (Stuttgart, Germany, 2003), Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 2004), XVIII International Seaweed Symposium (Bergen, Norway, 2004), "2004 International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies" (Seoul, Korea, 2004), V Всероссийском научном семинаре и молодежной школе "Химия и медицина" (Уфа, Россия, 2005), PICES XIV (Vladivostok, Russia, 2005), 31st FEBS congress (Turkey, 2006), II Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 2006), 1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences (Vladivostok, Russia, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 26 статей в отечественных и международных журналах и 37 тезисов докладов в сборниках трудов Региональных, Всероссийских и Международных конференций и симпозиумов. Штаммы-продуценты, способы получения ферментов защищены тремя патентами РФ.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источников. Работа изложена на 276 страницах, содержит 50 таблиц и 79 рисунков.

Автор искренне благодарен научному руководителю и учителю, д.х.н., проф.

Еляковой Л.А. и научному консультанту, зав. лабораторией химии ферментов, д.х.н., проф. Звягинцевой Т.Н. за ценные советы, глубокий и критический анализ и помощь в работе. Автор глубочайше признателен всем сотрудникам лаборатории химии ферментов и других лабораторий и подразделений ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в работе: к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Шевченко Н.М., н.с.

Киселёвой М.И., к.б.н. Кусайкину М.И., к.б.н. Бурцевой Ю.В., к.х.н. Ермаковой С.П., д.б.н., член.-кор. РАН Михайлову В.В., д.б.н. Недашковской О.И., д.б.н. Ивановой Е.П., к.б.н. Шевченко Л.С., д.б.н. Пивкину М.В., к.б.н. Рассказову В.А., к.б.н.

Балабановой Л.А., к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., к.ф-м.н. Исакову В.В., к.ф-м.н. Глазунову В.П., н.с. Ким Н.Ю., вед. инженеру-электронику Кулешу Ю.Г., д.х.н. Ануфриеву В.Ф., д.х.н. Новикову В.Л., к.х.н. Похило Н.Д., к.х.н. Шестак О.П., к.х.н. Кольцовой Е.А., к.х.н. Чикаловец И.В. Автор также благодарен за плодотворное сотрудничество в работе сотруднику Института химии ДВО РАН д.х.н., член.-кор. РАН Щипунову Ю.А., сотрудникам Института микробиологии и эпидемиологии РАМН, акад. РАМН Беседновой Н.Н., д.б.н. Запорожец Т.С., д.б.н. Кузнецовой Т.А., к.б.н. Макаренковой И.Д., сотрудникам Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, д.х.н., проф. Усову А.И., к.х.н. Лихошерстову Л.М. и к.х.н. Мартыновой М.Д., сотрудникам Гематологического научного центра РАМН к.б.н. Кульману Р.А. (посмертно), д.б.н., проф. Макарову В.А., к.б.н. Дрозд Н.Н., сотруднику Института биохимии им. А.Н.

Баха РАН, д.х.н., проф. Рабиновичу М.Л.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из двух основных глав, даны общие представления о ферментах, относящихся к группе О-гликозидгидролаз (GH) 1.

Используемые сокращения: GH гликозидгидролаза, GalА -галактозидаза, NАGalА N-ацетилгалактозаминидаза, NAGlcВ -N-ацетилглюкозаминидаза, F2 фукоидан из бурой водоросли Fucus evanescens, освобожденный от недиализуемых полифенолов, FL фукоидан из бурой водоросли Laminaria cichorioides, FucА -фукозидаза, GlcВ -глюкозидаза, PsGalА – -галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 701, TmGalА -галактозидаза из термофильной бактерии Thermotoga maritima, OsGalА – -галактозидаза из культуры клеток Oryza sativa, pNPHGal п-нитрофенил--D-галактопиранозид, pNPHNAcGal п-нитрофенил-N-ацетилD-галактозаминид, U стандартная единица активности фермента (мкмоль/мин/мл), а.о. – аминокислотный остаток, АЧТВ активированное частичное тромбопластиновое время, ГВК-А, ГВКВ и ГВК-Н групповые вещества крови А, В и Н соответственно, БСА бычий сывороточный альбумин, н.п. нуклеотидная последовательность, п.н. – пара нуклеотидов, ОРС открытая рамка считывания для белка, КД круговой дихроизм, ТГЭОС тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликат, Cat-HEC катионное производное гидроксиэтилцеллюлозы, ЛБГ галактоманнан бобов белой Описано распространение, свойства, классификация, структура и механизм действия -галактозидаз и -N-ацетилгалактозаминидаз — представителей различных семейств GH. Основное внимание уделено ферментам, которые используются в биотехнологии получения универсальной крови из донорских эритроцитов разных групп. Обобщены немногочисленные сведения о фукоиданазах — ферментах, принимающих участие в деградации фукоиданов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Гликозидазы морских бактерий, инактивирующие групповую специфичность эритроцитов крови человека -Галактозидаза (GalA) (ЕС 3.2.1.22) и -N-ацетилгалактозаминидаза (NАGalА) (ЕС 3.2.1.49) — О-гликозидгидролазы, катализирующие отщепление соответственно остатков галактозы (D-Gal) и N-ацетамидо-2-дезокси--Dгалактопиранозы (NAcGal), связанных -гликозидной связью, от невосстанавливающих концов различных олигосахаридов, разветвленных полисахаридов, а также гликозидов и углеводных составляющих различных природных гликоконъюгатов. Ферменты, удаляющие иммунодоминантные -1,3-связанные остатки D-Gal и NAcGal эритроцитов крови групп В (ЭЧ-B), А (ЭЧА) и АВ, трансформируя их в эритроциты "универсальной крови" О (ЭЧ-O) при нейтральный значениях рН, физиологической температуре и ионной силе, в условиях, когда красные клетки сохраняют жизнеспособность, представляют большой практический интерес для решения проблем трансфузионной медицины.

В литературе приводились сведения об успешном переливании добровольцам "универсальной крови", полученной путем ферментативной обработки при рН 5, ЭЧ-В -галактозидазой из зерен кофе. Так как фермент имеет кислый рН-оптимум действия (3,5-4,0), процедура обработки опытной партии эритроцитов требовала больших количеств дорогостоящего ферментного препарата. Имеются сообщения об GalA и NАGalА из клинических штаммов анаэробных симбиотрофных и патогенных бактерий Bacteroides fragilis и Elisabethkingia meningoseptica соответственно, эффективно действующих при ~ рН 7,0, которые полностью конвертировали ЭЧ-В и -А в ЭЧ-О. Сведения о подобных ферментах из морских бактерий отсутствуют.

Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН обладает обширной коллекцией морских бактерий, собранных в различных районах Мирового океана во время экспедиций научно-исследовательского судна "Академик Опарин".

Первая часть работы посвящена исследованию GalA и NАGalА из морских бактерий.

1.1 Распространение -галактозидаз и -N-ацетилгалактозаминидаз среди Проведен поиск GalA и NАGalА среди 2008 и 860 морских бактерий соответственно. В качестве субстратов для тестирования активности ферментов использованы коммерческие хромогенные гликозиды: рNPHGal и рNPHNAcGal для GalA и NАGalА соответственно (0,1 М Na+-фосфатный буфер, рН 7,0).

Выполнен анализ распространения этих ферментов среди морских бактерий, изолированных из различных местообитаний Мирового океана.

В целом, из общего числа изученных штаммов 28% содержали GalA и 19% — NАGalА. Среди свободноживущих микроорганизмов штаммы-продуценты GalA и NАGalА встречались реже, чем среди изолятов животных (рис. 1). Продуценты акации, Мм молекулярная масса, Да, Мr молекулярная масса, а.е.м., CФ спектры флуоресценции, Ме2+ ионы двухвалентных металлов, НСТ-тест тест с нитросиним тетразолием, ИС индекс сравнения, ЭЧ-А, ЭЧ-В, ЭЧ-О эритроциты человека группы А, В и О.

GalA и NАGalА, выделенные из животных, составляли 15 и 12% соответственно, из водорослей — 2 и 1%.

Рис. 1. Гистограмма, показывающая соотношение между общим числом исследованных штаммов бактерий, выделенных из различных экотопов Мирового океана, и количеством продуцентов -галактозидаз и -N-ацетилгалактозаминидаз.

Наибольшее количество продуцентов GalA было обнаружено у изолятов Охотского и Японского морей (~ 40%), тогда как продуценты NАGalА встречались среди них довольно редко (~ 14%) (рис. 2).

Рис. 2. Распределение продуцентов -галактозидаз и -N-ацетилгалактозаминидаз, по различным районам Мирового океана: Охотскому (I) и Японскому (II) морям, Тихому океану в районе островов Кука (III), Индийскому (IV) и Атлантическому океанам (V):

количество изученных штаммов (1), из них активных (2).

В Тихом океане у островов Кука почти половина изолятов являлись продуцентами и GalA, и NAGalA, тогда как в Атлантике у Канарских островов до 38% изолятов синтезировали GalA, а продуцентов NAGalA там не обнаружено. Не обнаружены продуценты ни GalA, ни NАGalА среди 326 изолятов Кораллового моря.

Анализ микробных популяций, выделенных из 50 морских животных и водорослей, показал, что GalA синтезировали бактерии (91%), ассоциированные с красной водорослью Polysiphonia sp., а также бактерии (~ 60%), ассоциированные с губками из Охотского моря. Заслуживают внимания микробные популяции голотурии Stichopus horrenes, собранной в районе островов Кука, почти 44% бактерий-ассоциантов которой синтезировали NАGalА, тогда как продуценты GalA среди них отсутствовали.

Следует отметить, что бактерии распространенного в морской среде филума Proteobacteria, рода Pseudoalteromonas проявили себя лучшими продуцентами GalA, тогда как NАGalА чаще встречались среди немногочисленных изолятов родов Aeromonas, Enterobacter, Pseudomonas.

Бактерии рода Pseudoalteromonas относятся к истинно морским представителям прокариот. Они способны утилизировать разнообразные природные субстраты, включая полисахариды водорослей. У некоторых штаммов, исследованных в представленной работе, была обнаружена способность гидролизовать агар-агар из красных водорослей Ahnfeltia sp., Gelidium amansii и др.

Скрининг 404 штаммов-агаролитиков рода Pseudoalteromonas из Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (КММ) выявил продуценты высокоактивных GalA среди свободноживущих псевдоальтеромонад (10%) и среди ассоциантов гидробионтов (27%), собранных в Охотском и Японском морях.

По результатам широкого скрининга были отобраны продуценты GalA и NАGalА. Клеточные экстракты этих штаммов, а также очищенные препараты ферментов были проверены по действию на ЭЧ и ГВК крови групп А и В в Гематологическом научном центре РАМН и Институте органической химии им. Д.Н.

Зелинского РАН. Для дальнейшего изучения выбраны два штамма бактерий под номерами КММ 426 и КММ 701, экстракты которых содержали NАGalА и GalA, инактивирующие серологическую активность эритроцитов А и В при рН 7, соответственно.

1.2 -N-ацетилгалактозаминидаза из бактерии Arenibacter latericius КММ 426T, устраняющая групповую специфичность А-эритроцитов В результате таксономического изучения фено-, фило- и генотипических характеристик новый изолят под номером КММ 426, выделенный из грунта ЮжноКитайского моря, был валидизирован как новый род и вид морских бактерий Arenibacter latericius КММ 426Т из семейства Flavobacteriacea филума Bacteroidetes.

В клеточном экстракте бактерии обнаружены следующие гликозидазы (mU/мг белка) 2:

-N-ацетилглюкозаминидаза (NAGlcB) (32,0), NАGalА (0,44), GalA (0,14), -фукозидаза (FucА) (0,81), -маннозидаза (ManA) (0,14) и -ксилозидаза (XylB) (+).

Ферменты, деградирующие полисахариды, выявлены не были.

Процедура очистки NAGalA включала экстракцию дезинтегрированной биомассы, анионообменную хроматографию и гель-фильтрацию (табл. 1).

Очистка -N-ацетилгалактозаминидазы из биомассы Arenibacter latericius КММ 426Т DEAE-Sepharose CL-6В После хроматографии на DEAE-Sepharose CL-6В были получены две белковых фракции (I и II), содержащие -N-ацетилгалактозаминидазную активность. Фракция I не сорбировалась на анионообменной смоле в условиях разделения. Фракция II, в свою очередь, была разделена гель-фильтрацией на два пика активности (IIа и IIб, минорный высокомолекулярный и основной ~ 80 кДа соответственно).

NAGalAIIб проявляет максимальную активность в районе значений рН 7,0-8,0.

Этот интервал значений рН является наиболее комфортным для проведения реакции конверсии ЭЧ-А в ЭЧ-О. NАGalAIIб сохраняет 100% активности в течение Стандартную активность гликаназ определяли по появлению восстанавливающих сахаров, образующихся в результате ферментативного гидролиза соответствующих полисахаридов. За единицу активности (U) принимали количество фермента, при действии которого образуется мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 мин. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяли по методу Нельсона, используя в качестве стандарта соответствующий моносахарид.

Стандартную активность гликозидаз определяли по п-нитрофенолу, выделившемуся в ходе гидролиза соответствующих коммерческих хромогенных гликозидов. Количество п-нитрофенола определяли спектрофотометрически при 400 нм (=18300 моль-1 см-1) и рассчитывали по формуле:

U = D400/(18,3V), мкмоль/минмл, где: V – объём аликвоты фермента (мл), время реакции (мин). За единицу активности фермента (U) принимали такое его количество, которое катализировало образование 1 мкмоля п-нитрофенола в минуту.

30-минутного прогревания при 50°С и рН 7,2, длительное время активна при 4°С и в течение недели — при 20 °С в присутствии 0,1% азида натрия, выдерживает замораживание в виде суспензии при высоких концентрациях (NH4)2SO3. Как многие ферменты морских микроорганизмов, NАGalАIIб галотолерантна, а при концентрации NaCl, равной 0,5 М, ее активность возрастает почти вдвое (рис. 3).

Константа Михаэлиса-Ментен (Кm) NАGalАIIб по pNPHNAcGal при рН 7, равна 0,60±0,07 mМ. Значение молекулярной массы NАGalАIIб по данным SDS-электрофореза в денатурирующих условиях составляет 48 кДа, а по результатам гель-фильтрации в физиологических условиях — 94 кДа. Этот факт свидетельствует о наличии четвертичной структуры у фермента, т.е. NAcGalАIIб в растворе образует гомодимер.

Методом ингибиторного анализа исследована роль отдельных аминокислотных остатков в каталитической активности NАGalАIIб (табл. 2).

Влияние химических реагентов на активность -N-ацетилгалактозаминидазы Ингибирование NАGalАIIб п-хлормеркурибензоатом и N-этилмалеимидом предполагает важное значение свободных SH-групп для проявления ферментативной активности этого фермента. Полная потеря активности фермента под действием карбодиимида может свидетельствовать о существенном значении карбоксильных групп остатков Asp и/или Glu, которые входят в активные центры всех известных гликозидаз, где выполняют различные функции. Окисление NAGalAIIб N-бромсукцинимидом при рН 7,2 также приводило к полной потере ее активности. Известно, что в указанных условиях, наряду с остатками Trp, могут быть задеты и имидазольные группы His, и свободные SH-группы остатков Cys.

Установлено, например, что у представителя семейства GH27, рекомбинантной NAGalA из печени цыпленка, остаток Trp16 участвует в образовании комплекса с субстратом. В активном центре NAGalA семейства GH109 остатков Trp не отмечено. Важным для проявления активности у этого фермента является His228.

Однако при действии диэтилпирокарбоната, растворенного в этаноле, на фермент из морской бактерии, сохранялось около 60% его активности. Растворитель, 2%ный этанол, не ингибировал NAGalAIIб.

EDTA незначительно снижала активность NAGalAIIб, ионы Са2+ полностью ее инактивировали, а в присутствии Mg2+ активность фермента возрастала на 30% (табл. 2). Экзогенные Mn2+ и NAD+ не влияли на активность NАGalАIIб. Зависимость гидролитической активности от присутствия ионов Ме2+ — отличительная черта только гликозидгидролаз семейства GH4, среди представителей которого -N-ацетилгалактозаминидаз пока не обнаружено. -N-ацетилгалактозаминидазы семейства GH109, эффективно конвертирующие ЭЧ-А в ЭЧ-О, являются NAD+ зависимыми ферментами, но не нуждаются в ионах Ме2+ для проявления активности.

Автоматическим методом Эдмана определена N-концевая аминокислотная последовательность нативной NАGalАIIб, состоящая из 15 а.о.

последовательностью ферментов семейства GH109.

Изучено действие NАGalАIIб на ЭЧ-А и групповую специфичность ГВК-А. В таблице 3 показаны результаты иммунологического изучения нативных и обработанных ферментом ЭЧ-А.

Титр агглютинации донорских эритроцитов группы А до и после обработки как нет агглютинации с анти-А сывороткой. NАGalАIIб не вызывала неспецифической агглютинации эритроцитов и их гемолиза. Полная инактивация серологической активности ЭЧ-А может свидетельствовать о том, что NAGalAIIб модифицирует ЭЧ как группы А2, так и А1. Это отличает NAGalAIIб от NAGalA из печени цыпленка, бактерий R. torques IX-70265 и C. perfringens, которые конвертируют только ЭЧ-А2. На сегодняшний день полная конверсия ЭЧ-А в ЭЧ-О была достигнута только под действием рекомбинантного фермента из бактерии E.

meningoseptica.

Препарат NАGalАIIб проявлял высокую активность в реакции ингибирования гемагглютинации с групповым веществом крови А (ГВК А+Н), имеющим детерминанты, аналогичные таковым ЭЧ-А. Для установления типа действия NАGalАIIб, ГВК А+Н обрабатывали препаратом фермента, продукты ферментолиза разделяли гельфильтрацией. В низкомолекулярной фракции, предварительно подвергнутой кислотному гидролизу, был идентифицирован галактозамин (NАcGal), при практически полном отсутствии других моносахаридов. Это свидетельствовало о том, что NАGalАIIб является экзо-гликозидазой.

Таким образом, из морской бактерии A. latericius КММ 426Т выделена -N-ацетилгалактозаминидаза, представляющая большой практический и теоретический интерес. Благодаря способности действовать на ЭЧ-А и ГВК-А в нейтральной области рН она может быть весьма перспективной и как биохимический инструмент, и как фермент для получения универсальных эритроцитов из эритроцитов человека группы А.

1.3 -Галактозидаза бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 701, устраняющая Штамм облигатно морской бактерии, синтезирующий GalA c требуемыми свойствами, был выделен из воды Охотского моря. Исследование фенотипических признаков показало, что бактерия является гетеротрофной, аэробной, галофильной, психротолерантной, грамотрицательной, движущейся посредством единственного полярного жгутика.

последовательностей гена 16S рРНК штамма KMM 701 (инвентарный номер GenBank EU661863) новый изолят относится к членам филума Proteobacteria, класса -Proteobacteria и образует кластер с непигментированными бактериями рода Pseudoalteromonas. Ближайшим филогенетическим родственником исследуемого штамма оказался штамм Pseudoalteromonas nigrifaciens NCIMB 8614T с гомологией последовательности гена 16S-рРНК 99,1%. Уровень гомологии последовательностей гена 16S-рРНК между KMM 701 и типовыми штаммами родственных видов достигал 98,9% для P. elyakovii KMM 162T и P. espejiana NCIMB 2127T, 98,8% для P. haloplanktis ATCC 14393T, P. distincta КММ 638T и P. paragorgia KMM 3548T, 98,7% для P. carrageenovora IAM 12662T, 98,6% для P. agarivorans KMM 255T, 98,4% для P. gracilis B9T и P. issachenkonii KMM 3549T, 98,1% для P. aliena KMM 3562T и 97,5% для P. antarctica CECT 4664T. Уровень гомологии последовательностей с другими видами бактерий рода Pseudoalteromonas был ниже 97,5%. На основании данных филогенетического анализа можно предположить, что штамм KMM 701 принадлежит новому виду в пределах рода Pseudoalteromonas.

В экстракте сырой биомассы бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM обнаружены только 4 гликозидгидролазы (mU/мг белка): GalA (102,0±22,0) и GalВ (5,8±0,5), а также ламинараназа (12,4±1,7) и амилаза (8,04). По уровню активности GalA из Pseudoalteromonas КММ 701 (PsGalА) превосходила в 10-20 раз 3 других гликозидгидролазы.

Активность PsGalА появлялась в клетках бактерии после 5 ч культивирования и достигала максимального значения через 24 ч (рис. 4).

Рис. 4. Изменение биомассы бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 (1), общего белка (2), -галактозидазной активности (3) в процессе роста бактерии. Т — 26С, скорость вращения качалки — 120 об/мин, состав среды (г/л): бактопептон — 5,0, глюкоза — 1,0, K2HPO4 — 0,2, дистиллированная вода — 500 мл, стерильная морская вода — 500 мл, рН 7,8.

Показано, что для биосинтеза PsGalА бактерия не требует определенного индуктора и может расти на стандартной среде, содержащей глюкозу.

1.3.2 Выделение и основные свойства -галактозидазы В результате последовательности процедур, указанных в таблице 4, получен высокоочищенный препарат PsGalA.

Очистка -галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ Стадии очистки PsGalА проявляет максимальную активность в области значений рН 6,7-7, (рис. 5), термолабильна, при 37°С полностью теряет активность в течение 10 мин (рис. 6). Однако при 20°С фермент сохраняет активность более суток. Присутствие бычьего сывороточного альбумина (БСА) защищает PsGalА от термической денатурации (рис. 7).

Рис. 5. Зависимость начальной скорости Рис. 6. Термостабильность PsGalА.

гидролиза PsGalА от рН, 0,1 М Na+- Прогревание в течение 10 (1) и 30 (2) мин, ацетатно-фосфатно-боратный буфер.

Термолабильность свойственна ферментам морских психротолерантных бактерий, обитающих в водах северных морей, которые летом прогреваются только до 4°С.

Рис. 7. Зависимость активности PsGalА Рис. 8. Зависимость активности от времени выдерживания ее при 20° PsGalА от концентраций NaCl (1), (1), 25° (2) и 30С (3) в присутствии (а) мочевины (2) и гуанидинхлорида (3), и в отсутствии (б) 0,2% БСА, 0,02 М Na+-фосфатный буфер, рН 7,0.

Галотолерантность является также характерной чертой морских бактерий и, вероятно, их ферментов. Мочевина и гуанидинхлорид при низких концентрациях инактивируют фермент (рис. 8, кривые 2 и 3), что позволяет предполагать наличие у PsGalА четвертичной структуры.

Значение молекулярной массы PsGalА по результатам гель-фильтрации составляет 170±3 кДа, согласно данным SDS-электрофореза — 80,5±2,5 кДа. Это означает, что в физиологических условиях фермент имеет олигомерную структуру и состоит, по меньшей мере, из двух одинаковых субъединиц с величиной молекулярной массы, равной приблизительно 80 кДа. Такой результат согласуется с литературными данными, что почти все -галактозидазы бактерий имеют четвертичную структуру.

1.3.3 Субстратная специфичность -галактозидазы PsGalА отщепляет галактозу от мелибиозы (Gal1,6Glс), дисахарида Gal1,3Gal и трисахарида Gal1,3(Fuc1,2)Gal. Последний олигосахарид является концевым фрагментом структуры В-антигена на ЭЧ-В (табл. 5). Фермент из морской бактерии не действует на раффинозу, что отличает его от мелибиаз из наземных источников. Для оценки эффективности действия микробной -галактозидазы на ГВК-В было использовано одинаковое количество стандартных единиц изучаемого фермента и коммерческой -галактозидазы из зеленых бобов кофе.

Субстратная специфичность -галактозидазы PsGalА оказалась существенно более активной на модели эритроцитарного антигена, чем кофейная GalA, использовавшаяся ранее в опытах по трансформации донорских эритроцитов для внутривенного введения. Установлено, что для достижения одинаковой инактивации ГВК-В требуется PsGalА примерно в раза меньше, чем GalA из зеленых бобов кофе.

1.3.4 Каталитические свойства -галактозидазы В таблице 6 представлены кинетические параметры гидролиза рNPHGal, катализируемого PsGalА.

Кинетические параметры гидролиза рNPHGal, катализируемого -галактозидазой 0,1 М Nа+-фосфатный буфер, рН Величина константы Михаэлиса-Ментен (Km) PsGalА типична для бактериальных ферментов, тогда как величина kсat, равная 36,82 мин-1, является низкой по сравнению с таковыми для известных GalA из семейств GH27 и GH36.

PsGalА по эффективности действия на хромогенный гликозид (kсat/Km) в три раза превосходит GalA из Bacteroides fragilis (семейство GH110), которая проявляет более низкое сродство (Km = 0,70 mM) к рNPHGal, но эффективно конвертирует ЭЧ-В в ЭЧ-О.

Показано, что галактоза является конкурентным игибитором PsGalА (Ki = 1, mМ) (рис. 9 и 10).

Рис. 9. График Лайнуивера-Берка. Рис. 10. График Диксона. Зависимость Зависимость начальной скорости обратной скорости гидролиза 0,10, 0,21, гидролиза от концентрации рNPHGal в 0,42, 0,83 mМ рNPHGal от концентрации обратных координатах в присутствии 0, 1, Gal (зависимости 1, 2, 3, 2, 3 mМ галактозы (зависимости 1, 2, 3, 4 соответственно). Кi = 1,32 mМ; условия соответственно); 0,1 М Nа+-фосфатный эксперимента аналогичны указанным на Тип ингибирования установлен c помощью графика Лайнуивера-Берка, из которого видно, что в присутствии возрастающих концентраций D-Gal увеличивается значение Km фермента при постоянной величине Vmax (рис. 9).

Величина константы ингибирования определена по графику Диксона (рис. 10).

Согласно литературным данным D-Gal ингибирует активность многих растительных -галактозидаз семейства GH27 по механизму конкурентного или смешанного ингибирования. Следует отметить, что D-Gal является слабым конкурентным ингибитором для GalA из термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus (Кi = 16,25 mM), и не ингибирует GalA из термофильной археи Sulfolobus solfatariсus.

Вопрос о стереохимическом результате ферментативного гидролиза гликозидов является принципиальным при классификации О-гликозидгидролаз.

Конфигурацию аномерного центра D-Gal, образующейся при гидролизе pNPHGal под действием PsGalА, определяли с помощью 1Н ЯМР-спектроскопии. Появление в начале реакции в 1Н ЯМР-спектрах pNPHGal резонансного сигнала в виде дублета с равным 5,287-5,294, который соответствует протонам -аномерного центра D-Gal, свидетельствует о том, что PsGalА катализирует гидролиз -О-гликозидной связи с сохранением конфигурации аномерного центра субстрата, как все известные -галактозидазы клана GH-D. Представители семейства GH являются "обращающими" гликозидгидролазами.

1.3.5 Действие -галактозидазы на антигены клеток человека и бактерий 1.3.5.1 Действие -галактозидазы на эритроциты человека Результаты иммунологического изучения нативных эритроцитов и обработанных PsGalА (рН 7,3, 26С, 24 ч) показаны таблице 7. Из таблицы видно, что В-антигены трансформированы в Н-антигены, так как отсутствует агглютинация с анти-В сывороткой. Титр агглютинации с анти-Н сывороткой закономерно увеличен за счёт появления новых Н-антигенов вместо В-антигенов. Полученные данные свидетельствуют также об отсутствии в препарате -фукозидазы. Титр агглютинации с анти-М или анти-N сыворотками не изменяется, что может указывать на отсутствие сиалидаз в изученном образце фермента. PsGalА не вызывала неспецифической агрегации эритроцитов и их гемолиза. При изучении субстратной специфичности фермента на ГВК выяснилось, что на фоне ярко выраженной активности к В-антигенам этот фермент не проявляет активности к Аи Н-антигенам.

Титры агглютинации нативных и трансформированных под действием определили, что 0,24 U/мл фермента конвертируют 1 мл ЭЧ-В в 15-20% гематокрите в течение трех ч при 26С в 0,01 M K+-Na+-фосфатном буфере, рН 7,3.

1.3.5.2 Действие -галактозидазы на эпителиоциты человека Было исследовано влияние PsGalА на адгезию токсикогенного штамма Сorynebacterium diphtheriae к клеткам буккального эпителия. В работе использовали эпителиоциты донора с группой крови B. Установлено, что PsGalА эффективно снижала адгезию патогена (табл. 8).

Среднее количество бактерий токсикогенного штамма Сorynebacterium diphtheriae, прикрепившихся к одной эпителиальной клетке

I II III

Вариант опыта I — фермент инкубировали с микроорганизмами; II — фермент инкубировали с клетками буккального эпителия; III — фермент инкубировали с клетками буккального эпителия и адгезированными микроорганизмами; n=4.

Максимальный эффект достигался в том случае, когда ферментом обрабатывали клетки с уже прикрепившимися микроорганизмами. Это может быть обусловлено действием фермента на углеводные структуры как клеток бактерий, так и эпителиоцитов. Подобный эффект описан для протеолитических ферментов, действие которых приводит к нарушению уже сформированных колоний микроорганизмов, образующих биопленку. Полученные результаты демонстрируют возможность нарушения углеводных структур, экспрессированных на поверхности эпителиоцитов и бактерий, при действии PsGalА.

Известно, что буккальный эпителий, являясь частью мукозальной системы, сохраняет структурные элементы, которые обеспечивают взаимодействие с различными факторами внешней и внутренней среды. На клетках буккального эпителия идентифицированы различные варианты АВН изотипов углеводных цепей, соответствующие АВН антигенам эритроцитов индивидуума. Принимая во внимание способность АВН антигенов участвовать в различных cell-cell и cell-matrix взаимодействиях, результаты, демонстрирующие высокую антиадгезивную активность PsGalА, могут быть обусловлены, в числе прочих возможных факторов, специфичностью фермента, обеспечивающей нарушение углеводных структур, входящих в состав В-антигенов.

Таким образом, выделенная из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 701 -галактозидаза представляет большой практический и теоретический интерес.

По действию на ГВК-В, ЭЧ-В и другие клетки организма человека и бактерий в нейтральной области значений рН, фермент может быть весьма перспективным не только как биохимический исследовательский инструмент, но и как один из реагентов для получения конвертированных универсальных эритроцитов из эритроцитов группы В.

1.3.6 Характеристика структуры -галактозидазы 1.3.6.1 Функционально значимые аминокислотные остатки Роль отдельных аминокислотных остатков в ферментативной активности PsGalА была исследована методом ингибиторного анализа (табл. 9). пХлормеркурибензоат натрия ингибировал активность фермента полностью, Nэтилмалеимид — на 95%, что говорит о важной роли SH-групп для активности PsGalA. Известно, что соединения с близко расположенными SH-группами (дитиолы) имеют высокое сродство к арсениту натрия и образуют циклические дитиоарсениты. Было показано, что арсенит не влияет на активность фермента.

Этот факт позволяет предположить, что в ближайшем окружении SH-группы, важной для активности PsGalA, нет других свободных сульфгидрильных групп.

В присутствии перекиси водорода наблюдалось значительное ингибирование активности PsGalА. Падение активности могло быть связано как с окислением свободных SH-групп Cys, так и остатков Met и Trp. Окисление N-бромсукцинимидом при различных значениях рН, которое сопровождалось полной потерей активности фермента, также может затрагивать SH-группы, но вероятнее всего в данном случае модифицируются остаток(и) Trp, играющие существенную роль в активном центре классических гликозидгидролаз.

Влияние химических реагентов на активность -галактозидазы N-Бромсукцинимид EDTA Этанол На активность фермента не действовали ни EDTA, способная ингибировать активность металлозависимых ферментов, ни азид натрия. Катионы двухвалентных металлов также не требуются ферменту для проявления активности (табл. 9).

1.3.6.2 Определение первичной структуры -галактозидазы Последовательность из 15 а.о. (A D T N S F Y R L D R V N S T ) с N-конца полипептидой цепи нативной PsGalА определили с помощью автоматического метода Эдмана. Полную аминокислотную последовательность PsGalА установили с помощью методов молекулярной биологии и генной инженерии. На основании анализа высоко консервативных участков первичной структуры -галактозидаз семейств GH27 и GH36, размещенных в GenBank (NCBI), были сконструированы вырожденные праймеры для амплификации первого специфического фрагмента гена, кодирующего PsGalА: прямой праймер (5'-RTNGAYGAYGGNTGGTT-3') на участок активного центра I/VDDGWF и обратный праймер (5'AT(A/C/T)CCCATRTGNCCRAA-3') на участок FGHMGI, где Y, N и R обозначают нуклеотиды C/T, A/C/G/T и A/G. В течение 44 циклов амплификации геномной ДНК при 55°C был получен единственный фрагмент гена длиной 705 п.н., который клонировали и секвенировали с помощью стандартных процедур. Для получения 5’- и 3’-концевых последовательностей, соответствующих открытой рамке считывания для предшественника белка (OРС), были синтезированы генспецифические праймеры, ориентированные в противоположные направления.

С помощью четырех из десяти эндонуклеаз рестрикции, которыми обрабатывали ДНК бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 701 для инверсированной ПЦР, были получены фрагменты ДНК, содержащие ген PsGalА. Фрагмент ПЦР длиной в 1000 п.н. был получен при амплификации лигированных в кольцо рестриктов EcoRI, AspS9I, Bpu14I, а фрагмент ПЦР длиной в 3000 п.н. был амплифицирован на PstI-фрагментах ДНК. Все рестрикционные фрагменты ДНК содержали N-концевой участок PsGalА, включая первый метионин. Фланкирующий участок гена длиной в 1200 п.н. со стороны 3’-конца, 453 п.н. которого соответствовали C-концевой части первичной структуры белка, был получен с 3’-CGTGCTGCGGTATCAATGTTC-5’.

В результате выполненных процедур выделен ген PsGalA, соответствующий ОРС для белка, состоящий из 2130 п.н. и кодирующий полипептидную цепь из а.о. Отсутствие потенциального сигнального пептида в выведенной аминокислотной последовательности подтверждает цитоплазматическую локализацию белка. Зрелая форма белка имеет расчетную молекулярную массу 80,050 кДа и изоэлектрическую точку — pI 5,6, что соответствует экспериментальным данным. Последовательность 15 а.о. с N-конца полипептидной цепи, выведенной из нуклеотидной последовательности гена, совпадает с результатами секвенирования, полученными методом Эдмана. Полная аминокислотная последовательность PsGalА характеризуется высоким содержанием отрицательно заряженных, незаряженных полярных и неполярных аминокислотных остатков, таких как Leu (10,28%), Ser (7,89%), Val (7,04%), Ala (7,04%), Glu (6,90%). Таким образом, установлена полная аминокислотная последовательность -галактозидазы из морской бактерии, модифицирующей антигены клеток.

1.3.6.3 Характеристика вторичной структуры -галактозидазы Содержание элементов вторичной структуры нативной PsGalА (0,01 М Na+фосфатный буфер, рН 7,3, 0,15 М NaCl, 20С) определяли экспериментально методом спектроскопии кругового дихроизма (КД). В области спектра КД фермента от 204 до 230 нм наблюдалась широкая отрицательная полоса с минимумом эллиптичности при 219 нм и двумя плечами вблизи 222 и 208 нм, а также положительная полоса с максимумом эллиптичности при 195 нм, что указывало на наличие как -спиралей, так и -структуры в полипептидной цепи фермента.

На основании результатов анализа спектра КД с помощью пакета компьютерных программ CDPro было установлено, что PsGalА, наиболее вероятно, является + белком, который содержит 19,1% -спирали, 29,6% -структуры и 60,3% неупорядоченной структуры, включая 21,7% -изгибов (табл. 10). Содержание элементов вторичной структуры PsGalА, рассчитанное с помощью серверов PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) и SCRATCH (http://www.igb.uci.edu/tools/scratch/) на основании выведенной аминокислотной последовательности (No GenBank DQ530422.1) (табл. 10), хорошо согласуется с экспериментальными данными, полученными для нативной PsGalА из спектров КД.

Содержание элементов вторичной структуры (%) в молекуле PsGalА Метод расчета Примечания: *) — не определяется.

1.3.6.4 Филогенетический анализ -галактозидаз Сравнительный анализ множества аминокислотных последовательностей гомологичных белков из GenBank показал, что PsGalА принадлежит к семейству GH36 и является ближайшим гомологом с -галактозидазами из морских бактерий семейства Alteromonadales TW-7 (A0XX24) идентичность — 92%) и Pseudoalteromonas atlantica (Q15PJ9) (идентичность — 51%), энзиматические свойства которых не охарактеризованы.

Для определения эволюционных взаимоотношений между белками из морских бактерий и другими представителями семейств GH27 и GH36 был проведен филогенетический анализ аминокислотных последовательностей ряда -галактозидаз. Некорневое филогенетическое древо, построенное с помощью сервера Phylogeny.fr на основании множественного выравнивания этих последовательностей представлено на рис. 11.

Исследуемые -галактозидазы разделились на два больших кластера, в которые вошли представители семейства GH27 и GH36 соответственно. GalA археи Sulfolobus solfataricus (Q97U94), обитающей в грунте геотермальных источников, находится на отдельной ветви в кластере семейства GH36, тогда как -галактозидазы термофильных бактерий Thermus sp. IB-21 (Q8GEA8), Thermus sp.

T2 (Q9WXC1) и Thermotoga maritima (O33835), изолированных из тех же источников, образовали на филограмме отдельное подсемейство в пределах семейства GH36.

Исследуемая PsGalА (Q19AX0) находится в кластере бактериальных ферментов семейства GH36, на одной ветви с -галактозидазами из морских бактерий: Pseudoalteromonas atlantica (Q15PJ9) и инвалидной бактерии семейства Alteromonadales TW-7 (A0XX24). Положение -галактозидаз морских -протеобактерий рода Pseudoalteromonas на филограмме указывает на ближайшее родство с -галактозидазами наземных мезофилов семейства Enterobacteriactae (Q2NBZ6). Из топологии полученного дерева следует, что ближайшими родственниками морских ферментов являются -галактозидазы наземных -протеобактерий Vibrio vulnificus (Q7MG03), Ervinia carotovora (Q6D965) и Escherichia coli (P16551), некоторое время сохраняющих жизнеспособность в морской водной среде.

Рис. 11. Филогенетическое древо -галактозидаз 27 и 36 семейств GH. Филограмма получена с помощью сервера Phylogeny.fr (http://www.phylogeny.fr/) с использованием программы Phylogeny PhyML 3.0 и статистического теста aLRT для аминокислотных последовательностей -галактозидаз, выровненных с помощью программы MUSCLE v3.7.

Древо построено с помощью программы TreeDyn.

1.3.6.5 Компьютерное моделирование пространственной структуры -галактозидазы и ее комплекса с -галактозой Анализ аминокислотной последовательности PsGalА с помощью сервера SWISS-MODEL показал, что в качестве прототипов для построения теоретической модели ее пространственной структуры могут быть использованы гликозидгидролазы клана-D c известной кристаллической структурой: GalA Oryza sativa семейства GH27, код PDB 1uas (OsGalA) и GalA Thermotoga maritima семейства GH36, код PDB 1zy9 (TmGalA) (рис. 12).

Q19AX0 1 MADTKSFYRL DRVNSTVIFD CQSKTPALLY FGKRLSERTT ETMLTQLATR QEVKCAVVEE APISLSPLLG

O

Q19AX0 71 EGFTGAPGLE LVNDSIAWSV GPELQEVRQP SSAAVEFVSV DKLR-GIEVV HSITLDNNSD VLSAHTVLTN

O33835 1 MEIFGKT FREGRFVLKE KNFTVEF-AV EKIHLGWKI- -SGRVKGSPG RLEV--LRTK

Q19AX0 140 LGDSPLSVNF CAAPTFQLPD SVS-KIVSFE GRWSNEFQRQ SVDLVLGSFV RENRKGKTSH DVFPGLLVHN

O33835 53 APEKVLVNNW QSWGPCRVVD AFSFKPPEID PNW-----RY TASVV-PDVL ERNLQS---- DYF----VAE

Q19AX0 209 ENAGEQHGEC YGFHLGWSGN NKLRAELLAE GRRYVQMGEL LLPGELTLAK GQTYQSPSIY GSFSSEGFSA

O33835 109 E------GKV YGFL-----S SKIAHPFFA- ----VEDGEL VAYLEYFDVE FDDFVPLEPL VVLEDPNTPL

Q19AX0 279 LSRNFHRFVK ANLLSQAQRE KARPMHYNTW EGIYFDHD-V DTLKQLADKV AP-LGIERFV LEDGWFKEPS

O33835 163 LLEKYAELVG ME--NNARVP KHTPTGWCSW YHYFLDLTWE ETLKNL--KL AKNFPFEVFQ IDDAYEKD-Q19AX0 347 WRQCRLRYWT VDYKIYPDGL SPVIDHVNSL GMEFGIWFEP EMVNPDSFLY RAHPDWVLGS ENNEQLSFRN

O33835 227 -----IGDWL VTRGDFPS-V EEMAKVIAEN GFIPGIWTAP FSVSETSDVF NEHPDWVVKE NGEPKMAYRN

Q19AX0 417 Q----LVLDL TRSEVVEYLY KAIDDILVEY PTIKYIKWDM NRDINHAGNF DGKPAVHQQT LALYRLIDRI

O33835 291 WNKKIYALDL SKDEVLNWLF DLFSSL--RK MGYRYFKIDF LFAGAVPGER –KKNITPIQA FRKGIETIRQ19AX0 483 KAAHPGLEIE SCSSGGARVD YGVLAHTDRV WTSDSNDALD RLEIQRGCSF FFPSSVMGAH VGPRDCHITG

O33835 357 KAVGEDSFIL GCGSPLLPA- VGCVDGM-RI ----GPDTAP ---------F W------GEH I--EDNGAPA Q19AX0 553 RNVSIEMRAA VSMFGHMGIE MDPRELNDHE YNALKAAIA- -LHKEHREFI HSA---DLYR LDSDDLSI-O33835 404 ARWALR-NAI TRYFMH---- -DRFWLNDPD CLILREEKTD LTQKEKELYS YTCGVLDNMI IESDDLSLVR

Q19AX0 616 NFGLIDAQKT KALFAYNSVR ETPRTAPNKL RF-VGLDADA QYTLNLVWPV KFEEYRPSSI AAVNGQTFTG

O33835 468 DHGKKVLKET LELLGGRP-- RVQNIMSEDL RYEIVSSGTL SGNVKIVVDL NSREYHLEKE ----GKSSLK Q19AX0 685 EALMQFGLQM PISFPQTSLI FELNKA O33835 532 KRVVKREDGR NFYFYE---- -EGERE Рис. 12. Выравнивание аминокислотных последовательностей PsGalА (UniProt Q19AX0) и TmGalA (UniProt O33835). На рисунке отмечены идентичные остатки (*), гомологичные замены (.), каталитические остатки (), остатки Trp190 (), Asp220 () и Cys357 (), расположенные вблизи активного центра TmGalA, и соответствующие им остатки PsGalА.

Теоретическая модель пространственной структуры PsGalА получена методом сравнительного моделирования. Для построения фрагмента структуры PsGalА в качестве прототипа использовали единственную известную кристаллическую структуру TmGalA семейства GH36. Согласно литературным данным, полипептидная цепь TmGalA состоит из 552 а.о. Выравнивание полных аминокислотных последовательностей TmGalA и PsGalА (рис. 12) выявило фрагмент полипептидной цепи (83-710 а.о.), который является общим для двух ферментов.

Степень идентичности а.о. данного фрагмента PsGalА и TmGalA составляет 19,1%, а степень гомологии фрагмента с учетом консервативных замен — 40,2%.

Как видно из рис. 12, каталитические остатки Asp327 и Asp387 TmGalA идентичны остаткам Asp451 и Asp519 PsGalА. Остатки Trp190 и Cys357 со свободной SH-группой, расположенные в полости активного центра TmGalA, идентичны остаткам Trp308 и Cys494 у PsGalА. Остаток Asp220 TmGalA консервативно заменен остатком Glu338 у PsGalА. Полученные данные указывают на сходство в строении активного центра ферментов.

Модель 3D-структуры фрагмента с 83 по 710 а.о. PsGalА построена с помощью программы МОЕ (рис. 13, А).

Рис. 13. А — Модель фрагмента пространственной структуры PsGalА с 83 по а.о., построенная на основе кристаллической структуры TmGalA. Структура PsGalА изображена в виде ленточной диаграммы, цветом показаны элементы вторичной структуры (-спирали — красным, -структура — желтым, -изгибы — синим, неупорядоченная структура — голубым цветом). Б — Суперпозиция структур PsGalА (красного цвета) и TmGalA (зеленого цвета). Структуры показаны в виде ленточных диаграмм.

Величина потенциальной энергии модели в вакууме составила -30769, кДж/моль. Суперпозиция С атомов модели этого фрагмента и прототипа показала, что величина среднеквадратичного отклонения составляет 1,24. Различия наблюдаются в протяженности -спиралей и -тяжей, а также в области петель на поверхности молекул (рис.13, Б). Полипептидная цепь исследуемого фрагмента PsGalА уложена в три домена, как у прототипа. В N-концевом домене (83-295 а.о.) видны антипараллельные -тяжи, упакованные в форме -сэндвича, и несколько коротких -спиралей. Укладка центрального домена (296-576 а.о.) PsGalА в виде -цилиндра, окруженного -спиралями и неупорядоченными петлями, соответствует пространственной структуре (/)8-цилиндра ферментов семейств GH27 и GH36, который, как известно, выполняет функцию каталитического домена у всех ферментов клана GH-D. Полипептидная цепь С-концевого домена (577- а.о.) образует -складку из антипараллельных -тяжей, меньшего размера, чем -сэндвич, т.н. "греческий ключ", ферментов семейства GH27.

Модель пространственной структуры PsGalА с учетом N-концевого участка (1а.о.), отсутствующего в модели фрагмента, построенного с использованием программы МОЕ, получена с помощью программного обеспечения сервера I-TASSER (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) (рис. 14). Согласно данным сервера I-TASSER структура участка полипептидной цепи с 1 по 82 а.о. содержит протяженный -спиральный фрагмент. В настоящее время отсутствуют литературные данные о пространственной упаковке N-концевого домена других гликозидгидролаз семейства GH36, кроме TmGalA. Следует отметить, что TmGalA имеет самую короткую полипептидную цепь среди ферментов семейства GH36 и не образует олигомерной структуры.

Содержание элементов вторичной структуры, рассчитанное на основании теоретических моделей и спектра КД нативной PsGalА, приведено в таблице 11.

Экспериментальные данные о вторичной структуре фермента коррелируют с данными, полученными нами с помощью теоретических моделей.

Содержание элементов вторичной структуры (%) PsGalА Модель фрагмента 83- (программа МОЕ) Модель полной структуры (сервер I-TASSER) Нативная PsGalА (КД спектр, CONTIN/LL) Пространственную структуру каталитического домена PsGalА, который включает участок полипептидной цепи с 296 по 576 а.о., а также структуру активного центра PsGalА исследовали с использованием в качестве прототипа OsGalA семейства GH27.

Выравнивание аминокислотных последовательностей каталитических доменов -галактозидаз представлено на рис. 15.

Q19AX0 296 -------------------------------------------------------QREKA 1uas 1 ---------------------------------------------------FENG-LGRT Q19AX0 301 RPMHYNTWEGIYFDHDVDTLKQLADK-----VAPLGIERFVLEDGWFKEPSWRQCRLRYW

1uas 9 PQMGWNSWNHFYCGINEQIIRETADALVNTGLAKLGYQYVNIDDCW-AEYS-RDSQGNFQ19AX0 356 TVDYKIYPDGLSPVIDHVNSLGMEFGIWFEPEMVNPDSFLYRAHPDWVLGSENNEQLSFR

1uas 58 VPNRQTFPSGIKALADYVHAKGLKLGIYSD------------------AGSQT---CSNK

Q19AX0 416 NQLVLDLTRSEVVEYLYKAIDDILVEYPTIKYIKWDMNRDINHAGNFDGKPAVHQQTLAL

1uas 97 MPGSLDHEEQDVKTFASWGVD----------YLKYD---NCNDA----GRSVMERYT--Q19AX0 476 YRLIDRIKAAHPGLEIESCSSGGARVDYGVLAHTDRVWTSDSNDALDRLEIQRGCSFFFP 1uas 145 -RMSNAMKTYGKNIFFSLCEWGKENPATWA-GRMGNSWRT-TGDIADNWGSM--TSRADE Q19AX0 536 SSVMGAHVGPRDCHITGRNVSIEMR 1uas 200 NDQWAAYAGP-----GGWN-DPDML Рис. 15. Выравнивание фрагментов аминокислотных последовательностей (296а.о.) PsGalА и (1-275 а.о.) OsGalA (UniProt Q9FXT4), соответствующих каталитическим доменам. На рисунке отмечены каталитические остатки (), остатки Trp16 () и Cys162 (), расположенные в активном центре OsGalA, и соответствующие им остатки PsGalА.

Для OsGalA семейства GH27 и PsGalА семейства GH36 в активном центре идентичными остаются остатки Asp130 и Asp451, Asp519 и Asp185, Trp16 и Trp308, Cys162 и Cys494 соответственно (рис. 15). Остаток Asp51 OsGalA заменен на Glu338 у PsGalА. Это пока единственный случай замены остатка Asp на Glu у -галактозидаз из семейств GH27 и GH36.

Исследованием кристаллической структуры комплекса OsGalA с D-галактозой установлено, что остаток Asp185 выступает в качестве сопряженной кислоты/основания, а Asp130 действует как нуклеофил. Из суперпозиции пространственных структур каталитического домена OsGalA (фрагмент 1-275 а.о.) и модели каталитического домена PsGalА (фрагмент 296-576 а.о.), построенной на основе кристаллической структуры каталитического домена OsGalA с помощью программы МОЕ (рис. 16) видно, что указанные выше остатки Asp в пространстве совместились. Это может свидетельствовать об идентичности их функции в активном центре обоих ферментов.

Рис. 16. Суперпозиция каталитического домена OsGalA (код PDB 1uas) и модели каталитического домена PsGalА, построенной на основе кристаллической структуры OsGalA. Структура доменов изображена в виде основной цепи, цветом показаны элементы вторичной структуры (-спирали — красный, -структура — желтый, изгибы — синий, неупорядоченная структура — серый). Каталитические остатки показаны в шаростержневой форме: зеленым цветом — остатки Asp130 и Asp OsGalA, красным цветом — Asp451 и Asp519 PsGalА. На рисунке указаны расстояния между каталитическими остатками OsGalA (6,46 ) и PsGalА (5,76 ).

На рис. 16 указаны расстояния между каталитическими остатками OsGalA (6,46 ) и PsGalА (5,76 ), что соответствует расстоянию между каталитическими карбоксилами для классических гликозидгидролаз, катализирующих гидролиз Огликозидной связи с сохранением оптической конфигурации аномерного центра субстрата.

Пространственное взаиморасположение каталитических остатков (Asp451 и Asp519) и других остатков их ближайшего окружения (Trp308, Glu338 и Cys494) представлено на рис. 17. Консервативный Trp308, расположенный на расстоянии 30 а.о. от маркерного участка DD(G/C)W для гликозидгидролаз семейства GH (рис. 12), соответствует Trp16 у OsGalA (рис. 15). Согласно литературным данным, Trp16 вносит существенный вклад в создание гидрофобного микроклимата в этом районе молекулы, необходимого для протонирования каталитических остатков Asp.

Функциональная важность остатка Trp для PsGalА, вытекающая из модели пространственной структуры, согласуется с экспериментальными данными, полученными нами методом ингибиторного анализа (табл. 9).

Рис. 17. Структура фрагмента активного Рис. 18. Сайт связывания -галактозы с центра -галактозидазы Pseudoalteromonas -галактозидазой Pseudoalteromonas sp.

sp. КММ 701. Аминокислотные остатки КММ 701. Пунктиром показаны показаны в стержневой форме. На рисунке водородные связи, образованные приведены каталитические остатки (Asp451 -галактозой: Glu338.OE1-Gal.O4, и Asp519) и функционально важные остатки Asp451.OD1-Gal.O6, Asp519.OD1-Gal.O1, их ближайшего окружения (Trp308, Glu338 и Asp519.OD1-Gal.O2.

Cys494).

Методом молекулярного докинга построена теоретическая модель структуры комплекса PsGalА с молекулой D-Gal (рис. 18). Установлено, что конкурентный ингибитор D-Gal взаимодействует с активным центром фермента, образуя водородные связи: Glu338.OE1-Gal.O4, Asp451.OD1-Gal.O6, Asp519.OD1-Gal.O1, Asp519.OD1-Gal.O2, три из которых — с каталитическими остатками Asp451 и Asp519. Величина свободной энергии связывания галактозы с каталитическим доменом фермента составила -11,916 ккал/моль. Теоретическая константа ингибирования фермента галактозой (pKi), рассчитанная с помощью модуля LigX программы МОЕ составила 9,01 мкМ.

Таким образом, в результате выполненного нами анализа моделей пространственных структур показана идентичность каталитических а.о. у ферментов семейств GH27 и GH36. В активном центре PsGalА роль сопряженной кислоты/основания выполняет Asp451, а нуклеофила — Asp519. При низкой идентичности аминокислотных последовательностей гликозидгидролазы семейств GH27 и GH36 имеют высокую степень гомологии как пространственных структур в целом, так их каталитических доменов и активных центров, что позволяет ферментам реализовывать одинаковый механизм катализа. Данное исследование еще раз подтвердило, что -галактозидазы семейств GH27 и GH36 имеют общее происхождение и механизм действия. Полученную модель пространственной структуры PsGalА можно использовать в дальнейших исследованиях взаимосвязи структуры и функции фермента.

1.3.8 Иммобилизация -галактозидазы в гибридных нанокомпозитах, Иммобилизация ферментов давно и успешно используется на практике.

Включение в матрицу или закрепление на носителе позволяет многократно использовать ферменты и облегчает отделение продуктов ферментативной реакции, что имеет существенное значение при создании биотехнологических процессов. Иммобилизация значительно увеличивает время функционирования и устойчивость ферментов.

При иммобилизации по методу золь-гель технологии макромолекулы белка включаются в неорганическую матрицу, формирующуюся in situ в результате реакций поликонденсации. При этом они претерпевают минимальные изменения пространственной структруры, что обеспечивает сохранение активности ферментов.

Иммобилизация PsGalА выполнена в гибридных полисахарид-силикатных нанокомпозитных материалах, синтезированных в Институте химии ДВО РАН с использованием нового прекурсора — тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликата (ТГЭОС). К числу достоинств прекурсора относятся растворимость в воде и совместимость с биополимерами. Полисахариды являются катализаторами зольгель процессов. В их присутствии гелеобразование протекает при любых значениях рН, а также при низких температурах, что важно для термолабильных ферментов.

Чтобы минимизировать денатурацию термолабильной PsGalА в процессе включения в силикатную матрицу, иммобилизацию проводили при температуре, близкой к 0°С и рН 7,2.

Активность PsGalА, иммобилизованной в различных по составу гибридных полисахарид-силикатных нанокомпозитных материалах, тестировали на протяжении 16 мес. (табл. 12).

Активность -галактозидазы в зависимости от условий её иммобилизации и * — mU/мл, **н.о. — не определяли Наибольшая активность фермента наблюдалась у образца №5.

Ферментативная активность образцов №2 и №3, содержащих полисахарид, являющийся высокоразветвленным галактоманнаном (ЛБГ), сразу после иммобилизации была сопоставима по уровню с активностью фермента в растворе.

При увеличении количества силиката и ЛБГ (образцы №3 и №4) активность значительно снижалась. В ряду исследованных полисахаридов только присутствие ламинарана в геле не оказывало стабилизирующего действия на иммобилизованную PsGalА.

Большое значение для практического применения иммобилизованных ферментов имеет удерживание их в/на носителе. После двух суток выдерживания гелей в буферном растворе при 4°С их подвергали центрифугированию и определяли активность фермента в супернатантах и в гелях. Ферментативная активность практически полностью отсутствовала в растворах, в которых выдерживались биокатализаторы (табл. 13). Это указывает на достаточно хорошее закрепление макромолекул фермента в матрице геля. Однако активность фермента в самих гелях №2 и №3 оказалась значительно ниже исходной.

Возможно, центрифугирование привело к уплотнению гелей, что стало причиной либо ограничения доступа субстрата к ферменту, либо инактивации иммобилизованного фермента. Любопытно отметить, что с увеличением концентрации ЛБГ в геле (образец №4) механическое воздействие отразилось на активности фермента в значительно меньшей степени (табл. 13).

Удерживание -галактозидазы в силикатном нанокомпозите с различным Включение PsGalА в силикатную матрицу привело к некоторому уширению интервала рН, но практически не изменило величины рН-оптимума фермента.

Возросла термостабильность PsGalА, каталитические характеристики фермента существенно не изменились.

Таким образом, матрицы, содержащие нейтральный полисахарид ЛБГ, являются оптимальными для иммобилизации PsGalА.

1.3.9 Влияние природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на Исследовано влияние морских природных полигидрокси-1,4-нафтохинонов (ПГНХ) и их синтетических производных (рис. 19) на гидролитическую активность PsGalА.

Рис. 19. Соединения, использованные в качестве эффекторов PsGalА. R1, R2, R3, R4, R5 – Результаты выполненного исследования (табл. 14) позволили разделить эти соединения на три группы: I — -метоксипроизводные 5,8-дигидрокси-1,4нафтохинонов (1 — 6), не влияющие на активность PsGalА в концентрациях 3,2 — 4,610-4 M в условиях эксперимента; II — соединения (7 — 16), подавляющие активность фермента на 50% при концентрациях C50 10-4-10-5 M; III — полигалогензамещенные нафтазарины (17 — 21), наиболее эффективно ингибирующие фермент (C50 10-6 M).

Все соединения со свободными -ОН группами либо не ингибируют фермент, как эхинохром А (2), либо проявляют ингибирующее действие при достаточно высоких концентрациях, как соединение 16 (C50 = 2,3·10-5 M). В водных растворах при физиологических значениях рН О-Н связь -гидроксильных групп этих соединений подвергается гетеролитической диссоциации с образованием моноили дианионов. Эхинохром А (2) при рН 7,3 существует в виде дианиона. По отсутствию ингибирующего действия эхинохрома А (2) можно предположить, что область активного центра PsGalА при рН 7,3 электростатически отрицательна и ее заряд может препятствовать связыванию этого соединения.

Влияние природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на Примечания: *) — номер соединения; **) — в таблице приведенгы концентрации соединений, при которой активность фермента снижалась на 50% при выдерживании фермента в присутствии этого соединения в течение 30 мин.

Исследуемые соединения различаются действием на фермент, которое зависит от природы заместителя и его расположения в кольцах. Локализация гидроксильной и этильной групп в положениях 2 и 3 хиноидного кольца влияет на ингибирующее действие соединения (см. данные для изомеров 9 и 16). Вероятно, одна из ОН-групп в положениях 6 и 7 соединения 16 более кислая и поэтому легче, чем в случае соединения 9, вступает в образование межмолекулярной водородной связи с нуклеофильными группами активного центра фермента. Причиной этого различия может быть также стерический фактор и/или возникновение дополнительной водородной связи за счет ОН-группы в 5-м положении бензоидного кольца. Так, при одинаковом характере связывания всей молекулы ингибитора эта гидроксильная группа для соединений 9 и 16 должна будет попадать в разные участки активного центра.

Показано, что ингибирование ПГНХ обратимо. Галогензамещенный нафтазарин 19 необратимо ингибирует, т.е. инактивирует фермент: после гельфильтрации фермента, инактивированного соединением 19, его активность не восстанавливалась. Эффективными необратимыми ингибиторами оказались соединения 17 — 21 (табл. 14, рис. 19). PsGalА имеет функционально значимую(ые) SH-группу(ы) (табл. 9, рис. 17, 18). Механизм влияния нафтохинонов на активность некоторых ферментов, содержащих свободные SH-группы остатков Cys, обсуждался в литературе. В результате сопряженного присоединения (реакции Михаэля) S-нуклеофила образуется ковалентно связанный коньюгат нафтазарина с ферментом. Возможность протекания реакций такого типа в мягких условиях показана ранее на примере реакции 2,3-дихлорзамещенного нафтазарина 17 и восстановленной формы трипептида глутатиона.

Электронодонорные заместители в хиноидном кольце нафтазарина понижают способность его к сопряженному присоединению нуклеофилов, что видно из сопоставления эффектов соединений 15 и 1, 18 и 12. Соединения 17 — 21, имеющие электроноакцепторные заместители в хиноидном ядре, проявляют себя как эффективные необратимые ингибиторы фермента за счет активации положений 2 и 3 хиноидного кольца к атаке нуклеофилов. Присутствие электронодонорных заместителей Еt или Me в бензоидном кольце этих соединений также вызывает понижение, а присутствие электроноакцепторных заместителей Br или Cl — повышение их инактивирующей способности.

Низкую ингибирующую способность соединения 8, также содержащего два атома хлора в одном кольце нафтазаринового кора, можно объяснить существованием его в экспериментальных условиях в виде моноаниона, являющегося энергетически наиболее выгодной таутомерной формой этой молекулы. Атомы хлора в моноанионе 8 локализованы в бензоидном ядре, где они не могут вступать в реакции нуклеофильного замещения RS-функции по механизму сопряженного присоединения тиола и последующего отщепления молекулы НСl.

То же самое относится и к соединению 13. Отсутствие инактивирующего действия у хлорзамещенных нафтазаринов 4 и 5 можно объяснить соседством с атомом хлора сильной электроноакцепторной МеО-группы, нивелирующей активирующее влияние атома хлора для атаки нуклеофила в положения 2 и 3 хиноидного кольца.

Сайт связывания ингибитора 15 в активном центре PsGalА показан на рис. (А). Как видно из рисунка, соединение 15 локализовано в непосредственной близости от каталитических остатков Asp451, Asp519, в окружении остатков Trp308, Cys494 и Ser496.

Рис. 20. А — сайт связывания нафтазарина 15 в активном центре PsGalА. Красным цветом показана область активного центра фермента, несущая отрицательный электростатический заряд, синим цветом — положительный, серым цветом — нейтральный. Б — локализация соединения 21 в активном центре вблизи свободной сульфгидрильной группы Cys494. Аминокислотные остатки соединения 15 и показаны в стержневой форме. Свободная сульфгидрильная группа окрашена в желтый цвет, атомы хлора — в зеленый цвет.

Внутренняя поверхность активного центра электростатически отрицательна.

-Гидроксильная группа соединения 15 образует водородную связь с карбонилом Asp519, а противоположный карбонил в положении С5 хиноидного кольца — с ОНгруппой остатка Ser496. Локализация наиболее эффективного необратимого ингибитора 21 в активном центре PsGalА показана на рис. 20 (Б). Свободная SH-группа остатка Cys494 приближена к С3 хиноидного кольца трихлорнафтазарина на расстояние 3,15, что создает предпосылку к реакции нуклеофильного замещения атома Cl. Образование ковалентной связи между Cys494 и соединением 21, вероятно, является причиной необратимого ингибирования фермента под действием данного соединения. Интересно отметить, что наиболее цитотоксичные соединения 19, 20 и 21 для развивающихся эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius, оказались и самыми эффективными необратимыми ингибиторами фермента.

Таким образом, показано, что ингибирующие свойства ПГНХ по отношению к PsGalА зависят от природы заместителей, их числа и положения в структуре соединений. Благодаря высокой чувствительности к характеру и расположению заместителей, фермент можно рассматривать как тест-систему для получения аналитической информации, касающейся обнаружения и оценки высокотоксичных хлорпроизводных нафтазарина, являющихся микропримесями в препаратах синтетического эхинохрома А.

Другой группой морских ферментов, исследованных в представленной работе, являются фукоиданазы (ЕС 3.2.1.-), О-гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз -гликозидной связи между остатками L-фукозы в основной цепи фукоиданов. В настоящее время сведения о фукоиданазах в литературе крайне ограничены. Недавно появились сообщения об аминокислотных последовательностях трех бактериальных фукоиданаз, на основании которых эти ферменты объединены в особое семейство GH107. Это — внутри- и внеклеточные фукоиданазы из Alteromonas sp. SN-1009 (No GenBank AAO00508.1 и AAO00509. соответственно) и внеклеточная фукоиданаза из Mariniflexile fucanivorans SW5 (No GenBank CAI47003.1). Механизм гидролитического действия и пространственные структуры этих ферментов не охарактеризованы, номенклатурный номер ферментам не присвоен.

2.1 Выделение фукоидана из природного комплекса с полифенолами Для поиска, изучения свойств и субстратной специфичности фукоиданаз необходимы высокоочищенные образцы полисахаридов с установленной структурой. Сотрудниками лаборатории химии ферментов ТИБОХ разработан метод получения фукоидана из различных бурых водорослей. Выход фукоидана при переработке водоросли F. evanescens достигает 15% от сухой массы. Однако образцы этого полисахарида (F0) сохраняют бурую окраску и обладают высокой восстанавливающей способностью.

УФ-спектр поглощения образца фукоидана F0 свидетельствует о присутствии в нем соединений с высокосопряженной ароматической структурой (рис. 21, 1).

Согласно литературным данным бурые водоросли могут накапливать до 14% полифенольных соединений от массы сухой водоросли, главным образом, флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензола) и его полимеров — флоротаннинов.

Рис. 21. УФ-спектр поглощения (1), возбуждения (2) и флуоресценции (возб — 366 нм) (3) фукоидана F0 из бурой водоросли F. evanescens (1 мг/мл, 0,1 М Na+-фосфатный буфер, рН 8,4).

Присутствие этих соединений в образцах полисахарида затрудняет тестирование активности фукоиданаз по увеличению восстанавливающей способности сахаров. Влияние свободных и связанных с полисахаридами полифенолов на активность фукоиданаз также не исследовалось. Поэтому крайне важно для изучения этих ферментов использовать субстрат, не содержащий полифенольных соединений.

Флоротаннины являются флуоресцирующими соединениями. Спектры флуоресценции (СФ) полифенолов, связанных с фукоиданами, прежде не исследовались. Широкий максимум СФ образца F0 (рис. 21 (2, 3)) расположен при 450-460 нм. Значение индекса флуоресценции (I = f450/f500), характеризующего форму СФ, составляет 1,15. На флуоресценцию связанных флоротаннинов могут влиять различные факторы микроокружения, в том числе природа и состояние ионогенных групп полисахарида. Так, согласно литературным данным, СФ полифенолов, связанных с альгиновой кислотой из бурой водоросли Laminaria pallida и коммерческим альгинатом Manugel GHB, характеризуются максимумом при 440-445 нм и величиной I = 1,96.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«МАРТЬЯНОВ Евгений Михайлович ДИТИОФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ЭНАНТИОЧИСТЫХ И РАЦЕМИЧЕСКИХ ОДНО- И МНОГОАТОМНЫХ СПИРТОВ, ФЕНОЛОВ И АМИНОВ 02.00.08 - химия элементоорганических соединений Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Казань - 2013 Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений и в лаборатории фосфорорганических соединений отдела химии элементоорганических соединений Химического института им....»

«Подгорбунский Анатолий Борисович ИОННАЯ ПРОВОДИМОСТЬ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ И АМОРФНЫХ ФТОРИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТАЛЛОВ IV И V ГРУПП 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Владивосток – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии Дальневосточного отделения Российской академии наук (ИХ ДВО РАН) Научный руководитель : доктор химических наук, доцент, старший научный...»

«Романова Ирина Петровна ЭЛЕКТРОНОАКЦЕПТОРНЫЕ МОНО- И БИС-ЦИКЛОАДДУКТЫ ФУЛЛЕРЕНА С60. СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Казань – 2008 Работа выполнена в Институте органической и физической химии имени А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук...»

«Писарева Анна Владимировна Синтез и исследование физико-химических свойств кристаллических и полимерных протонных электролитов на основе бензолполикарбоновых и бензолполисульфоновых кислот 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Черноголовка - 2004 Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии Наук. Научный руководитель : кандидат химических наук Добровольский Юрий Анатольевич...»

«ОСИПОВА ВАЛЕНТИНА ВЛАДИМИРОВНА СТРУКТУРНАЯ САМООРГАНИЗАЦИЯ И ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОНОДОДЕЦИЛОВОГО ЭФИРА ДЕКАЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И НИТРАТОВ ЛАНТАНОИДОВ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ - 2008 Работа выполнена в ГОУ ВПО государственный Казанский технологический университет. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Галяметдинов Юрий Генадьевич Официальные оппоненты :...»

«Абакаров Гасан Магомедович БЕНЗОТЕЛЛУРАЗОЛЫ И БЕНЗОТЕЛЛУРАЗИНЫ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физической и органической химии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону и Дагестанском государственном техническом университете, г. Махачкала. доктор химических наук Научный...»

«ФАДЕЕВ ~рей Геннадьевич МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПОДВИЖНОСfЬ И ПЕРВАПОРАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ГРЕБНЕОБРАЗНЫХ ПОЛИМЕРОВ С ФТОРАЛКИЛЬНЫМИ БОКОВЫМИ ГРУППАМИ. 02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва, 1995 г. www.sp-department.ru Рабоrа выполнена в лаборатории поJJИМерных мембран ИнСТИiуrа...»

«Петров Александр Михайлович ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСНОГО СОСТАВА ЧИСТЫХ ЦВЕТНЫХ И РЕДКИХ МЕТАЛЛОВ МЕТОДОМ ДУГОВОГО АТОМНО-ЭМИССИОННОГО АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ МАЭС 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2012 1    Работа выполнена в Государственном научном центре Государственный научно-исследовательский и проектный институт редкометаллической промышленности Гиредмет Научный руководитель : член-корреспондент...»

«ГАЛЕЕВА ЭЛЬВИРА ИЛЬКАМОВНА ПОЛИУРЕТАНЫ НА ОСНОВЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ ПРОСТЫХ ОЛИГОЭФИРОВ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань 2009 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский государственный технологический университет (ГОУ ВПО КГТУ) Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Бакирова Индира Наилевна Официальные...»

«СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ L АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ 02.00.02 – Аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов 2011 2 Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, засл. деятель науки РФ, профессор Чернова Римма Кузьминична Официальные доктор химических наук,...»

«Левит Галина Львовна АМИНОКИСЛОТЫ В РЕГИО- И СТЕРЕОНАПРАВЛЕННОМ СИНТЕЗЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ 02.00.03 - Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Екатеринбург – 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органического синтеза Уральского отделения РАН им. И.Я. Постовского (г. Екатеринбург). Научный консультант доктор химических наук, профессор Краснов Виктор Павлович Официальные...»

«Кульбакин Игорь Валерьевич КИСЛОРОДОПРОНИЦАЕМЫЕ МЕМБРАННЫЕ МАТЕРИАЛЫ С ЖИДКОКАНАЛЬНОЙ ЗЕРНОГРАНИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ Специальность 02.00.01 – Неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории функциональной керамики №31 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН Научный руководитель : Белоусов Валерий Васильевич...»

«Козерожец Ирина Владимировна РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ СУБМИКРОННЫХ И НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ ОКСИДОВ АЛЮМИНИЯ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ПРИМЕСЕЙ 02.00.04 - физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Панасюк Георгий Павлович...»

«Цюпко Татьяна Григорьевна Аналитические решения при определении некоторых показателей безопасности и качества пищевых продуктов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук 02.00.02 - аналитическая химия Краснодар – 2012 Работа выполнена на кафедре аналитической химии ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет Научный консультант : доктор химических наук, профессор Темердашев Зауаль Ахлоович Официальные оппоненты : чл.-корр. АНБ, доктор...»

«Ермолин Михаил Сергеевич ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ НАНО- И МИКРОЧАСТИЦ ВО ВРАЩАЮЩИХСЯ СПИРАЛЬНЫХ КОЛОНКАХ ПРИ АНАЛИЗЕ ПОЛИДИСПЕРСНЫХ ОБРАЗЦОВ 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории концентрирования Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского Российской академии наук Научный руководитель : доктор химических наук Федотов П.С. Официальные оппоненты : доктор...»

«Нгуен Динь До СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТАЛЛОВ С ПОЛИОКСОСОЕДИНЕНИЯМИ НА ОСНОВЕ БЕНЗОЛА И ПИРИДИНА 02.00.01– неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва–2013 Работа выполнена на кафедре общей химии факультета физико–математических и естественных наук Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский университет дружбы...»

«ОЛУДИНА ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА Синтез и свойства новых гибридных структур на основе азот- и фосфорсодержащих пространственно затрудненных фенолов 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань-2014 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский национальный исследовательский технологический университет Научный руководитель : доктор...»

«Курочкин Николай Николаевич N-(Тозилметил)замещенные карбаматы и мочевины в синтезе азот- и кислородсодержащих гетероциклических соединений 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва, 2011 Работа выполнена на кафедре органической химии им. И.Н. Назарова Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : Доктор химических наук, профессор Шуталев...»

«Чернышев Виктор Михайлович С-АМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛЫ И КОНДЕНСИРОВАННЫЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ИХ ОСНОВЕ: СИНТЕЗ, ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ Специальность 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Ростов-на-Дону – 2012 г Работа выполнена в Южно-Российском государственном техническом университете (Новочеркасском политехническом институте) на кафедре Технология неорганических и органических...»

«Меньшова Марина Анатольевна СИНТЕЗ И ПРЕВРАЩЕНИЯ АЛКИЛ-, АРИЛ-, (ГАЛОГЕН)ЗАМЕЩЕННЫХ-2-ПЕНТЕН-1,5-ДИОНОВ С N,N(O,S)-БИНУКЛЕОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов - 2011 Работа выполнена на кафедре химии и методики обучения ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Пчелинцева Нина Васильевна...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.