WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ПАНКРАТОВ Тимофей Анатольевич

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СООБЩЕСТВА СФАГНОВЫХ БОЛОТ И ИХ

УЧАСТИЕ В ДЕСТРУКЦИИ ПРИРОДНЫХ ПОЛИМЕРОВ

Специальность 03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук С.Н. Дедыш

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловская кандидат биологических наук Т.Г. Добровольская

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Защита диссертации состоится в 14-00 « 23 » апреля_ 2007 г. на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан «_» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк Актуальность проблемы.

Сфагновые болота являются одной из важнейших наземных экосистем бореальной и тундровой зон Северного полушария. На территории России болота занимают около 140 млн. га, причем наибольшие их площади сосредоточены в Западной Сибири (Вомперский и др., 1999). Торфяные болота являются крупнейшим депозитарием устойчивого органического углерода. Мировой пул углерода торфов составляет около 455 млрд. т (Gorham, 1991; Smith et al., 2004); не менее трети этого пула приходится на Россию (Вомперский и др., 1999). Накопление органического вещества в болотах вызвано низкой скоростью его разложения, что, в свою очередь, обусловлено кислой реакцией среды, аноксией, недостатком биогенных элементов, низкими температурами и наличием фенолсодержащих органических соединений, продуцируемых сфагновыми мхами (Заварзин, 2004).




Знания о микробных сообществах сфагновых болот ограничены. Важный вклад в их расширение внесли работы кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова (Звягинцев и др., 1991; Добровольская и др., 1991;

Добровольская и др., 2000; Головченко и др., 2002). В них было показано, что пул микроорганизмов в сфагновых болотах сравним с таковым в черноземных почвах, а численность бактерий в грамме торфа достигает 109 клеток. Однако культивировать на традиционно используемых в микробиологической практике средах удается не более 0.01% общего количества клеток, обнаруживаемых в торфе методом люминесцентной микроскопии (Добровольская и др., 1991), а доминантами среди культивируемых форм являются грамотрицательные микроаэрофильные бактерии (Головченко и др., 2002). Следующий этап изучения микроорганизмов северных болот был инициирован интересом к проблеме глобального изменения климата и роли болот в эмиссии метана в атмосферу. Как результат, были детально исследованы оказавшиеся своеобразными метанотрофные бактерии (Дедыш, 2005) и метаногенные археи этих кислых экосистем (Horn et al., 2003; Sizova et al., 2003; Kotsyurbenko et al., 2004; Bruer et al., 2006; Kotsyurbenko et al., 2007). Однако общее филогенетическое и функциональное разнообразие представителей домена Bacteria в сфагновых болотах до недавнего времени оставалось вне внимания микробиологов. Одним же из наименее изученных в составе микробного сообщества этих экосистем является блок, отвечающий за деструкцию органического вещества.

В большинстве экосистем деструкция природных полимеров осуществляется комплексом эукариотных и прокариотных микроорганизмов (Заварзин, 2004), причем в наземных экосистемах ведущая роль в этом процессе отводится грибам (Lynd et al., 2002; Rice et al., 2006). Им же было посвящено основное внимание исследователей при изучении деструкции целлюлозы и гемицеллюлоз в сфагновых болотах (Низовцева и др., 1995; Семенов и др., 1995; Rice et al., 2006). Исследования показали, что мицелиальные грибы эффективно осуществляют деструкцию природных полимеров только при относительно низких величинах влажности и в условиях достаточного обеспечения кислородом и биогенными элементами, т.е. in situ их активность значительно подавлена. О природе бактерий, участвующих в процессах деструкции растительных остатков в сфагновых болотах, известно гораздо меньше.

Оценка численности целлюлозолитических бактерий с использованием традиционных культуральных методов позволяла выявить не более 104 – 105 клеток г-1 торфа (Waksman, 1929; Зименко, 1966; Загуральская, 1967; Наплекова, 1974;

Добровольская и др., 2000). Ни для одного из полученных в этих исследованиях изолятов не была показана способность деградировать целлюлозу в кислых условиях среды. Таким образом, до сих пор остается неясным, какие группы бактерий участвуют в деструкции растительных полисахаридов в сфагновых болотах и какова их численность in situ.

Итак, бактерии - деструкторы растительных полисахаридов являются первичным звеном в цепи превращений органического углерода в сфагновых болотных экосистемах. Их первостепенная роль в цепи деструкции органического вещества и глобальность процессов аккумуляции органического углерода в сфагновых болотах послужили причиной выполнения данной работы.





Цели и задачи исследования.

Цель работы - определить структуру сообщества прокариотных организмов кислых сфагновых болот и выявить бактерии, осуществляющие процессы деструкции полимерных соединений углерода в этих экосистемах.

Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Оценить общее филогенетическое разнообразие и численность отдельных групп домена Bacteria в сфагновых болотах.

2. Оценить метаболическую активность и исследовать состав бактериальных сообществ, осуществляющих деструкцию целлюлозы и водорастворимых полисахаридов при низких значениях pH.

3. Выделить чистые культуры бактерий, способных осуществлять разложение природных полисахаридов, исследовать особенности их физиологии, установить их филогенетическую принадлежность и таксономический статус.

Научная новизна и значимость работы.

Впервые с применением метода FISH (fluorescent in situ hybridization) произведена оценка численности метаболически активных представителей отдельных филогенетических групп микроорганизмов, населяющих сфагновые болота.

Определен состав прокариотного комплекса, осуществляющего процессы деструкции растительных и микробных биополимеров в кислой среде при низких температурах. Впервые с использованием методов молекулярной диагностики микроорганизмов in situ выявлена специфика сообществ, деградирующих целлюлозу в олиготрофных сфагновых болотах и их принципиальное отличие от таковых в эвтрофных местообитаниях.

Описан и узаконен новый род бактерий семейства Sphingobacteriaceae Mucilaginibacter gen. nov., включающий 2 новых вида - Mucilaginibacter paludis sp.

nov. и Mucilaginibacter gracilis sp. nov. Бактерии этого рода способны деградировать пектин, ксилан, микробные полисахариды, ламинарин. Типовые штаммы новых видов депонированы в международных коллекциях микроорганизмов ATCC, DSMZ и ВКМ.

Проведено уточнение таксономического описания вида Chitinophaga arvensicola, в которое включена способность к росту и деградации ряда полисахаридов в диапазоне рН 4.5 – 5.5.

Выявлены аэробные бактерии филогенетической группы Actinobacteria, способные деградировать целлюлозу в диапазоне рН 4-6 и температуре 10-25С.

Практическая значимость.

Оптимизирована методика FISH для исследования микробных сообществ торфяно-болотных почв.

Создана коллекция бактерий – представителей различных филогенетических групп, способных деградировать целлюлозу, пектин, ксилан, ламинарин, крахмал, бактериальные экзополисахариды, пуллулан, фукоидан, хондроитин при низких значениях рН (3-5.5) и низких положительных температурах (0-15°С).

Получены культуры бактерий - продуцентов экзополисахаридов, перспективных для медицинской и инженерной биотехнологии.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на российских конференциях:

1. «Болота и биосфера», 3 научная школа. 13-16 сентября 2004 г., г. Томск.

2. «Экологическое состояние континентальных водоемов арктической зоны в связи с промышленным освоением северных территорий», 21-25 июня 2005 г., г.

Архангельск.

3. «Актуальные аспекты современной микробиологии», Всероссийская Молодежная школа-конференция, 1-3 ноября 2005 г., г. Москва.

Публикации.

экспериментальных статьях, 1 материалах конференции и 3 тезисах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на _страницах, включая _таблиц, _рисунков и списка литературы из _ наименований, из них _ – на русском, _ на немецком и _ на английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа выполнена в отделе микробных сообществ Института микробиологии им.

С.Н. Виноградского РАН с 2003 по 2006 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш, при финансировании в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», гранта РФФИ-НИИО 04-04-04000 и проекта ФЦНТП «Ведущие научные школы» № РИ-112/001/027.

Образцы торфа болот различного географического расположения были предоставлены автору к.б.н. Ю.Ю. Берестовской, к.б.н. И.С. Куличевской, к.б.н. А.В.

Поляковой (ИНМИ РАН), сотрудницей Самарского государственного университета Т.А. Трофимовой, также получены самим автором.

Исследования с использованием метода FISH выполнены автором. Исследования ультратонкого строения клеток описываемых в работе бактерий были проведены совместно с к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН, г. Пущино) и к.б.н. Н.А. Кострикиной (ИНМИ РАН). Молекулярный анализ и определение филогенетического положения изолятов проводились д.б.н. С.Н. Дедыш в Макс-Планк-Институте микробиологии суши (Марбург, Германия). Анализ хинонов изолятов бактерий был проведен к.х.н.

Б.П. Баскуновым (ИБФМ РАН, г. Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены к.б.н. А.М. Лысенко (ИНМИ РАН). Часть физиологических, биохимических описаний изолятов, а также исследований с использованием метода FISH проведены автором при участии к.б.н. С.Э. Беловой (ИНМИ РАН).

Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы, а также искреннюю признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и акад. Г.А.

Заварзину за практическую помощь, постоянное внимание и ценные советы на всех этапах ее выполнения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследований служили образцы сфагнового торфа болот бореальной и тундровой зон России (Табл. 1). В работе использовали сфагновый мох с сопутствующими растительными включениями: нижняя часть очеса (мертвый мох) и растительная масса с доминированием сфагновых мхов на разных стадиях разложения (в зоне стояния болотной воды на границе раздела водной и воздушной фаз и далее вниз по профилю деятельного слоя до максимальной глубины 70 см).

Экстракцию микробных клеток из сфагнового торфа проводили с использованием гомогенизатора “MiniMix” (модель 100, Interscience, Франция) и прилагающихся к нему стерильных пакетов BagFilter®. К 2 г торфа добавляли 20 мл Таблица 1. Характеристика образцов сфагнового торфа, использованных в настоящем исследовании.

55N, 38E Брянский лес, 4.5-4.7 50 олиготрофное Sphagnum sp., Eriophorum 39°E обл., 67N, 63E стерильной дистиллированной воды, обрабатывали с помощью гомогенизатора в течение 10 минут при максимальной частоте. Затем отбирали 0.5 мл полученной суспензии и фиксировали 4%-ым раствором формальдегида в фосфатном буфере (NaCl – 8.0 г, KCl – 0.2 г, Na2HPO4 – 1.44 г, NaH2PO4 – 0.2 г, H2O – 1 л, pH 7.0) в течение 1.5 часов. Образец осаждали и промывали фосфатным буфером, ресуспендировали в растворе этанола и фосфатного буфера (1:1, об:об) и до анализа хранили при -20С.

Нанесенные на стёкла фиксированные препараты клеток или торфяных экстрактов обрабатывали раствором лизоцима (1 мг в 1 мл 0.05 М EDTA и 0.1 M TRIS HCl, 1:1, pH 8.0) для увеличения проницаемости клеточных стенок бактерий.

Гибридизацию препаратов с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами проводили в соответствии с методикой Stahl & Amann (1991) при температуре 46С.

Для детекции представителей домена Bacteria использовали смесь универсальных зондов EUB338-mix (Daims et al., 1999), а для определения численности Archaea – эквимолярную смесь зондов ARCH915 и ARC344 (Amann et al., 1990; Stahl & Amann, 1991). Для специфической детекции представителей Alphaproteobacteria использовали зонд ALF1b, Betaproteobacteria - BET42a, Gammaproteobacteria - GAM42a (Manz et al., 1992), Deltaproteobacteria - SRB385Db (Rabus et al., 1999), Bacteroidetes - смесь зондов CF319a и CFB560 (Manz et al., 1996; O’Sullivan et al., 2001), Planctomycetes эквимолярную смесь зондов PLA46 и PLA886 (Neef et al., 1998), Actinobacteria HGC69 (Roller et al., 1994), Firmicutes эквимолярную смесь LGC354A, LGC354B, LGC354C (Meier et al., 1999), Acidobacteria - зонд HoAc1402 (Juretschko et al., 2002), Verrucomicrobia - эквимолярную смесь зондов Ver138 и Ver1463 (Dedysh et al., 2006).

Численность целевых клеток в образцах торфа и накопительных культур оценивали подсчётом количества гибридизованных с зондами клеток в 100 полях зрения, с последующим расчётом на 1 г влажного торфа или 1 мл накопительной культуры.

Общую численность бактерий определяли окрашиванием препаратов 1 мкМ раствором ДНК- специфичного красителя ДАФИ (4’,6’-диамидино-2-фенилиндол) в течение 5-7 мин.

Для получения торфяного экстракта торф обрабатывали с помощью гомогенизатора и отжимали из него торфяную суспензию. Полученную суспензию фильтровали через стерильную стекловату для удаления грубых торфяных частиц и разливали по 10 мл в стерильные флаконы объемом 50 мл. Ксиланолитические, пектинолитические и целлюлозолитические сообщества получали путем внесения в жидкий торфяной экстракт сухого березового ксилана, яблочного пектина (Fluka) или распущенной на волокна целлюлозы (2 г/л суспензии), соответственно. Для подавления развития мицелиальных грибов в одну серию флаконов вносили циклогексимид в концентрации 30 мг/л (Мамилов и др., 2000). Опытные флаконы инкубировали при 10 и 20С.

Чистые культуры бактерий получали методом рассева на плотные питательные среды, содержащие в качестве источников углерода торфяной экстракт, глюкозу, целлюлозу, ксилан (0.02 – 0.2%) или комплексные питательные среды R2A и NutrientAgar (Difco), разведенные в 10-100 раз. В качестве гелеобразующих компонентов использовали агар-агар и полисахарид микробного происхождения Gellan-Gum (Fluka). Для определения филогенетической принадлежности и контроля чистоты изолятов использовали метод экспресс-гибридизации отобранных из колоний клеток с группо-специфичными олигонуклеотидными зондами.

Интенсивность дыхания в накопительных и чистых культурах определяли по выделению СО2, с использованием газоанализатора Infralit 4 (ГДР, Dessau).

Динамику роста культур прослеживали путем определения оптической плотности суспензий с использованием Eppendorf Biophotometer (длина волны 600 нм).

Содержание белка в суспензиях чистых и накопительных культур определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951). Проверку чувствительности бактерий к антибиотикам проводили на агаризованных средах путем наложения на газоны культур тест-дисков с различными антибиотиками (Oxoid G.). Определение других физиологических и биохимических свойств бактерий проводили в соответствии с общепринятыми методиками (Методы общей бактериологии, 1991).

1. Разнообразие и численность отдельных филогенетических групп прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах.

Использованный в данной работе метод FISH позволил учесть живые, метаболически активные клетки в образцах торфа исследуемых болот. Окраска препаратов красителем ДАФИ дала возможность оценить общую численность клеток микроорганизмов в образцах, включая покоящиеся формы. Применение олигонуклеотидных зондов, специфичных для представителей Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп домена Bacteria, позволило осуществить филогенетический анализ микробных сообществ сфагнового торфа.

1.1. Соотношение численности представителей доменов Bacteria и Archaea и их распределение по профилю болота.

Филогенетический анализ структуры микробного сообщества был осуществлен с использованием образцов пяти сфагновых болот – Бакчар, Куровского, Брянский лес, Обуховского и Тальник. Анализу были подвергнуты образцы, отобранные из слоя торфа, находящегося на границе раздела аэробной и анаэробной частей болотного профиля, т.е. на уровне стояния болотных вод (Табл. 2).

Таблица 2. Численность клеток бактерий, выявленных в образцах сфагнового торфа окраской ДАФИ, и численность представителей доменов Archaea и Bacteria.

Число клеток, Число клеток, выявленных гибридизацией с Образец (болото, слой 10-20 см слой 10-20 см слой 10-20 см 13-19 см слой 10-20 см * - доля от общего количества клеток, окрашенных ДАФИ Общая численность микроорганизмов, выявленных окраской ДАФИ, варьировала в пределах 1.3–11.2108 клеток г-1 сырого (содержание воды 85-95%) торфа. Эти величины близки к таковым, полученным ранее для верховых сфагновых болот (Добровольская и др., 1991; Dedysh et al., 2001).

Число клеток представителей домена Bacteria составило 6.2-32.3107 клеток г- сырого торфа или 21-50% общего числа клеток, обнаруженных окраской ДАФИ.

Численность представителей домена Archaea оказалась на порядок ниже и варьировала в диапазоне 0.8-3.4107 клеток г-1 торфа. В целом, суммарная доля идентифицируемых клеток, обнаруженных гибридизацией с универсальными зондами на представителей доменов Bacteria и Archaea, составила в отобранных на уровне стояния вод образцах торфа различных болот от 26 до 60% общего числа клеток, выявленных окрашиванием ДАФИ. Эти данные позволяют предположить, что значительная доля прокариотных организмов кислых и холодных сфагновых болот находится в форме покоящихся или метаболически неактивных клеток.

Рис. 1. Соотношение численности бактерий (серый цвет), архей (черный цвет) и неидентифицируемых зондами прокариотных микроорганизмов (белый цвет) в образцах сфагнового торфа, отобранных по профилю олиго-мезотрофного болота Куровское (a) и олиготрофного тундрового болота Тальник (б).

Профильное распределение общего числа клеток, выявленных окраской ДАФИ, и изменение численного соотношения бактерий и архей в составе комплекса прокариот было проанализировано на примере олиго-мезотрофного болота бореальной зоны (болото Куровское) и олиготрофного болота зоны тундры (Рис. 1).

Вниз по профилю деятельного слоя болот наблюдалось увеличение численности метаболически активных клеток представителей доменов Bacteria и Archaea. Доля бактерий в составе комплекса прокариот в нижних, анаэробных слоях болотного профиля заметно снижалась по сравнению с таковой в его верхних слоях, тогда как доля архей, наоборот, увеличивалась. Как для болота бореальной зоны, так и для болота зоны тундры отчетливо прослеживалась тенденция возрастания с глубиной доли метаболически неактивных, неидентифицируемых зондами микроорганизмов. В нижних слоях этих болот она составляла до 45-55% общего числа клеток.

1.2. Идентификация отдельных филогенетических групп домена Bacteria и оценка их численности.

Выбор зондов для настоящего исследования был сделан на основе данных анализа библиотеки клонов генов 16S рРНК представителей домена Bacteria в сфагновом торфе, проведенного в 2004-2005 г. (Dedysh et al., 2006), который выявил в торфе бактерий групп Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria, Deltaproteobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Bacteroidetes и Chlorobi. Кроме зондов, специфичных для этих филогенетических групп, в работе были использованы также зонды, специфичные для Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Firmicutes, так как ряд их представителей являются активными гидролитиками.

Суммарная доля клеток, выявленных в торфе группо-специфичными зондами, составила 39% общего числа бактерий в болоте Обуховское и 41% в болоте Бакчарское. Численность представителей отдельных филогенетических групп в различных болотах значительно варьировала, однако наиболее многочисленными были микроорганизмы, относящиеся к Proteobacteria. Примененные в настоящей работе зонды охватывали четыре из пяти известных классов этой группы: Alpha-, Beta-, Gamma- и Deltaproteobacteria. В сумме, представители этих классов составляли 12.8-13.5% общей численности клеток, обнаруженных в торфе с использованием зонда EUB338-mix. Наибольшее число клеток было выявлено при гибридизации с зондами, специфичными для Alpha- и Betaproteobacteria: 0.35 - 1.47107 и 0.24 – 1.15107 кл г-1, соответственно. Грамположительные бактерии с высоким содержанием Г+Ц в ДНК, относящиеся к филогенетической ветви Actinobacteria, присутствовали во всех исследованных нами образцах, и их численность достигала 1.2107 кл·г-1 торфа. Напротив, представители Firmicutes составляли минорный компонент комплекса прокариот в сфагновом торфе. Численность их вегетативных клеток, обнаруживаемых методом FISH, не превышала 104-106 кл·г-1 торфа.

Betaproteobacteria Firmicutes Planctomycetes Deltaproteobacteria Alphaprotebacteria Actinobacteria Verrucomicrobia Acidobacteria Bacteroidetes Gammaproteobacteria Рис. 2. Доля представителей отдельных филогенетических групп от общего числа идентифицированных бактерий по данным двух различных методов: А – метод посева, Б – метод FISH.

Впервые в сфагновых болотах нами были обнаружены представители филогенетических групп Acidobacteria и Planctomycetes, которые широко распространены в наземных и водных экосистемах, но слабо изучены и бедно представлены культивируемыми формами (Neef et al., 1998; Hugenholtz et al., 1998).

Особенно многочисленными были планктомицеты. Их численность достигала 1.2107 кл·г-1 сырого торфа. Численность представителей Bacteroidetes, которые ранее считались одной из доминирующих групп в сфагновых болотах (Зименко, 1966;

Загуральская, 1967), составляла 105-106 кл·г-1 торфа. Таким образом, в переходной зоне деятельного слоя торфяной залежи наиболее метаболически активными в ряду убывания были представители Proteobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes, Acidobacteria и Bacteroidetes.

Определение численности бактерий в сфагновом торфе методом посева на питательные среды позволило учесть лишь 104-106 кл·г-1. Напротив, метод FISH позволил идентифицировать 3-12107 кл·г-1, причем численность бактерий отдельных филогенетических групп составила от 10 до 107 кл·г-1 торфа. Общая картина соотношения отдельных групп идентифицированных бактерий болот по данным двух различных методов существенно отличалась (Рис. 2). Например, на чашках со средами доминировали представители Betaproteobacteria (55%), тогда как по данным анализа in situ они составляли лишь 2% идентифицированных клеток бактерий. Кроме этого, метод посева не позволил выявить ряд репрезентативных групп болотных бактерий, таких как Planctomycetes, Acidobacteria, Verrucomicrobia.

1.3. Распределение представителей различных филогенетических групп бактерий по профилю сфагнового болота.

Мы проанализировали распределение бактерий отдельных филогенетических групп по профилю болота Бакчарское (Рис. 3). Во всех исследованных слоях торфяной залежи доминировали представители Alphaproteobacteria. Второй по численности группой бактерий аэробной части болотного профиля были Planctomycetes. Впервые в анаэробной зоне болотного профиля был обнаружен второй максимум популяционной численности этих бактерий. Способность к росту в аэробных и анаэробных условиях при рН 4-6 и температуре 4-20С предполагает широкое разнообразие экологических функций и метаболических свойств представителей Planctomycetes.

Увеличение численности представителей Verrucomicrobia в слое 20-30 см и Acidobacteria в слое 40-50 см указывает на их возможное участие в процессе анаэробного разложения торфа. На данный момент среди описанных и узаконенных представителей Verrucomicrobia выявлены бактерии, способные к росту на целлюлозе, пектине, ксилане, крахмале, глюкуронате и галактуронате (Chin et al., 2001; Sangwan et al., 2004). Не исключено, что в анаэробной зоне торфяной залежи представители упомянутых групп могут быть представлены облигатными или факультативными анаэробами, осуществляющими деструкцию полисахаридов.

Рис. 3. Изменение численности отдельных групп бактерий по профилю сфагнового болота Бакчарское. Правая панель, группы бактерий, представители которых способны к деградации природных биополимеров.

Среди представителей филогенетических групп Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и порядка Myxococcales в пределах класса Deltaproteobacteria найдено наибольшее количество видов, обладающих гидролитическим потенциалом. При анализе распределения бактерий этих групп оказалось, что по всему профилю деятельного слоя торфяной залежи доминируют актинобактерии. Их численность была максимальна в верхних горизонтах и монотонно уменьшалась вниз по профилю (Рис. 2). Вторая по численности группа в верхнем аэробном слое – Deltaproteobacteria, которая с глубиной уступала место бактериям филогенетической группы Bacteroidetes. Численность клеток Firmicutes в изученном профиле сфагнового болота Бакчарское оказалась низкой и варьировала в диапазоне 2.3– 3.7105 кл·г-1 сырого торфа. Таким образом, среди возможных агентов микробной деградации природных полимеров в сфагновых болотах при рН от 4 до доминировали представители филогенетической группы Actinobacteria.

2. Активность и состав сообществ прокариот, вовлеченных в процессы деструкции природных полимеров.

Состав фитомассы сфагновых мхов определяет разнообразие прокариот, вовлеченных в процессы ее деструкции. Отсутствие лигнина в растениях рода Sphagnum было подтверждено гистохимическим методом (Kremer et al. 2004) и методом ЯМР (Каницкая и др., 1999). До 55% углеводов представлено в тканях сфагновых мхов целлюлозой. Согласно Ligorne et al. (2002) и Kremer et al. (2004), пектиноподобные полимеры (рамногалактуронаны) являются доминирующей группой гетерополисахаридов сфагновых мхов, и их доля составляет около 35% от общей массы полисахаридов. Ксилан в клеточных стенках мхов содержится в небольшом количестве (около 10%), но составляет большую часть гемицеллюлоз болотных сосудистых растений (до 30%). Таким образом, основными субстратами гидролитических бактерий болот должны быть, в первую очередь, целлюлоза, пектин и ксилан.

2.1. Деструкция пектина и ксилана.

Анализу были подвергнуты аэробные накопительные культуры, полученные при внесении пектина и ксилана в торфяные суспензии (сфагновое болото Обуховское) и инкубации при 10°С. Динамика интенсивности дыхания сообществ отражена на рисунке 4. В первые 5 суток адаптивные перестройки в сообществах приводили к снижению интенсивности дыхания, после чего начиналось потребление внесенных полисахаридов. Скорость продукции СО2 в пектинолитическом сообществе была на 50% выше, чем в ксиланолитическом. Интенсивность дыхания в обоих вариантах превышала контроль в 2-6 раз. Такие результаты указывали на высокую активность микробных сообществ, деградирующих пектин и ксилан. Образцы накопительных культур отбирали и фиксировали для последующего анализа на 20-й день инкубации, когда интенсивность дыхания сообществ была максимальной.

Gammaproteobacteria Рис. 4. Анализ пектинолитического и ксиланолитического бактериальных сообществ сфагнового болота Обуховское. Левая панель: интенсивность дыхания (ИД) в сообществах по сравнению с контролем. Правая панель:

филогенетическая структура сообществ. Минорные группы: Actinobacteria, Deltaproteobacteria, Planctomycetes, Acidobacteria, Verrucomicrobia и Firmicutes.

Анализ компонентного состава этих сообществ позволил идентифицировать около 70% клеток бактерий (Рис. 4, правая панель). Около 30% клеток, не идентифицированных примененными зондами, могут быть представлены неизвестными бактериями или являться членами филогенетически обособленных кластеров известных групп бактерий. Основными компонентами пектинолитического сообщества оказались Bacteroidetes и Betaproteobacteria (24 и 20%, соответственно), что указывает на их специализацию в сфагновых болотах – гидролиз гетерополисахаридов при рН от 4 до 5.5 и дефиците биогенных элементов.

Ксиланолитическое сообщество отличалось от пектинолитического увеличением доли Alphaproteobacteria (25% против 14%) за счёт уменьшения численности представителей Betaproteobacteria (7%) и Bacteroidetes (19%). Очевидно, что в сфагновых болотах ксилан разлагается, главным образом, при участии альфапротеобактерий, многие из которых способны к азотфиксации и не зависят от источников связанного азота.

2.2. Деструкция целлюлозы.

Мониторинг интенсивности дыхания целлюлозолитических сообществ (ЦЛС) был проведён в течение 90 суток (Рис. 5). Сравнение ИД ЦЛС с активным Рис. 5. Динамика интенсивности дыхания целлюлозолитических сообществ сфагнового болота Обуховское. Обозначения: C+ - вариант с добавлением циклогексимида (30 мг/л), C- без циклогексимида.

Таблица 4. Изменение численности бактерий в целлюлозолитическом сообществе при рН 4.2-4.6. Жирным шрифтом выделены значения численности бактерийдоминантов.

Филогенетическая Bacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Deltaproteobacteria Actinobacteria Acidobacteria Planctomycetes Firmicutes Bacteroidetes * в скобках указана концентрация белка (мкг в 1 мл накопительной культуры) но – численность ниже предела детекции метода ( 105 кл/мл) Рис. 6. Анализ компонентного состава целлюлозолитического бактериального сообщества, развивающегося при подавлении мицелиальных грибов циклогексимидом и температуре инкубации 10 и 20С, с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов. Минорные группы:

Bacteroidetes, Acidobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia.

Рис. 7. In situ гибридизация целлюлозолитического микробного сообщества с 23S рРНК-специфичным зондом, детектирующим представителей филогенетической группы Actinobacteria. А – флуоресцентная микрофотография гибридизации с Cy3-меченым зондом HGC69A. Б – фазовый контраст. Маркер – 5 мкм.

грибным компонентом и ИД сообщества, в котором грибы были подавлены внесением циклогексимида, не выявило значимых различий при 10°С и 20°С.

При 20С ИД в ЦЛС увеличивалась в 2-3 раза по сравнению с ИД в сообществах, которые инкубировали при 10°С. Филогенетический анализ структуры ЦЛС, развивающегося при 20С показал, что доминантами в нем были представители филогенетической группы Actinobacteria (табл. 4, рис. 6). Их численность увеличилась в ходе инкубации на 2.5 порядка и составила около трети числа всех идентифицированных бактерий в сообществе (рис. 6 и 7). Увеличение доли представителей этой группы в целлюлозолитическом сообществе сфагнового болота указывает на присутствие актинобактерий, разлагающих целлюлозу при низких значениях рН. Ранее (Bayer et al., 2006; Lynd et al., 2002) способность к разложению целлюлозы была показана только для нейтрофильных бактерий родов Cellulomonas и Streptomyces, являющихся членами филогенетической группы Actinobacteria.

Постоянным и неотъемлемым компонентом всех изученных ЦЛС являются альфапротеобактерии, доля которых в структуре сообществ составляла не менее 20% идентифицированных бактерий (Рис. 6). Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria были представлены в анализируемых сообществах небольшим количеством клеток, от 2 до 5% общего числа бактерий. Таким образом, протеобактерии являлись фоном, на котором происходило развитие целлюлозолитических актинобактерий.

Функциональная роль представителей филогенетической группы Planctomycetes, доля которых в ЦЛС составляла от 3 до 9%, пока неясна.

3. Выделение и идентификация бактерий – деструкторов природных биополимеров в сфагновых болотах.

В результате работы по выделению чистых культур бактерий, способных деградировать гомо- и гетерополисахариды, был получен ряд изолятов, способных разлагать пектин, ксилан, микробные полисахариды, ламинарин, хондроитин и целлюлозу. Наиболее активные из них были идентифицированы путем секвенирования гена 16S рРНК, а их физиологические свойства изучены.

3.1. Бактерии рода Burkholderia.

К числу бетапротеобактерий, способных деградировать полисахариды, относится род Burkholderia. Рост при рН от 3.5 до 6.0 и утилизация широкого спектра субстратов объясняет распространение этих бактерий в составе ацидофильных микробных сообществ сфагновых болот (Белова и др., 2006). Изоляция и последующая идентификация бактерий, присутствующих в пектинолитических и целлюлозолитических сообществах, показали, что их типичным компонентом являются представители рода Burkholderia. Штаммы F4 и F4w, выделенные из целлюлозолитического сообщества, были представлены грамотрицательными неподвижными палочками длиной 0.8-1.5 мкм и толщиной 0.4-0.6 мкм. Наибольшее Рис. 8. Динамика интенсивности дыхания Burkholderia sp. штамм F4 при росте на пектине и полисахариде микробного происхождения Gellan Gum (левая панель).

Морфология штамма F4 (правая панель), маркер – 5 мкм.

сходство гена 16S рРНК было обнаружено с B. fungorum (98%) и B. phenazinium (98%). Представители Burkholderia использовали в качестве источников углерода широкий спектр субстратов от сахаров и органических кислот до ароматических соединений, а также гидролизовали пектин и микробные полисахариды (Рис. 8). Целлюлозолитической активностью эти культуры не обладали, однако, в отличие от типичных диссипотрофов, способных использовать только мономерные субстраты, они должны быть отнесены к гидролитикам.

3.2. Выделение и характеристика бактерий рода Chitinophaga.

В процессе выделения бактерий из целлюлозолитических сообществ нами было получено 5 штаммов, по морфологическим признакам близких к бактериям семейства Flexibacteriaceae (филогенетическая группа Bacteroidetes) (Рис. 9).

Последовательность нуклеотидов гена 16S рРНК этих культур оказалась на 99сходной с таковой у Chitinophaga arvensicola (Kmpfer et al., 2006). Проверка Рис. 9. А. Фазово-контрастная микрофотография клеток Chitinophaga arvensicola штамм FX1, суточная культура, Б – 5-суточная, маркер – 5 мкм. В – электронная микрофотография срезов клеток 5-суточной культуры штамма FX1, маркер мкм.

функциональных свойств показала, что изоляты способны гидролизовать ламинарин, микробные полисахариды, казеин, эскулин и желатин. Некоторые штаммы могли деградировать агар, ксилан и крахмал. Ни один из изолятов не мог деградировать целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, хитин и пектин. В отличие от ранее описанных представителей Chitinophaga arvensicola, болотные изоляты могли расти при рН от 4.0 до 5.0 и не были способны восстанавливать нитрат. Температурный диапазон роста (2-37С), способность к утилизации ксилана и крахмала, рост в микроаэробных условиях указывают на возможность участия этих бактерий в составе ассоциаций, осуществляющих первичную деструкцию полисахаридов болотных растений.

3.3. Выделение и описание бактерий нового рода Mucilaginibacter gen. nov.

Из торфа болота Бакчарское нами были получены изоляты бактерий, которые были способны использовать в качестве источника углерода пектин, ксилан, крахмал, ламинарин, пуллулан и хондроитин (Рис. 10). Бактерии обильно продуцировали экзополисахариды и образовывали крупные слизистые колонии. Предварительный анализ новых культур с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов позволил отнести их к филогенетической группе Bacteroidetes. Штаммы TPT18 и TPT56 принадлежали к семейству Sphingobacteriaceae, но имели лишь 91сходства генов 16S рРНК с представителями родов Pedobacter и Sphingobacterium (Рис. 11). Анализ свойств выделенных штаммов показал, что это факультативно аэробные хемоорганотрофы, использующие в качестве источников углерода полисахариды, сахара, но не органические кислоты и полиспирты. По совокупности данных физиологических, хемотаксономических и генотипических анализов изоляты были отнесены к новому роду Mucilaginibacter gen. nov.

Характеристика Mucilaginibacter gen. nov.

Mucilaginibacter (Mu.ci.la.gi.ni.bac’.ter. N.L. mucilago слизь; N.L. masc. n. bacter палочка; N.L. masc. n. Mucilaginibacter слизеобразующие палочки).

Грамотрицательные палочки длиной 1.5 - 40 мкм и толщиной до 1.2 мкм, концы клеток закругленные или слегка заостренные. Клетки неподвижные, на плотных средах могут быть собраны в цепочки, образуют внеклеточные везикулы. Цвет колоний от желтовато-кремового до розового или красноватого. Флексирубин не образуют. Диаметр колоний от 3 до 10 мм. Колонии выпуклые, обильно слизистые, круглые. Может расти аэробно и анаэробно за счёт брожения. Сбраживает глюкозу, но не мелибиозу и мелецитозу. Не может использовать в качестве источника углерода мелибиозу, мелецитозу, целлюлозу, хитин, гепарин и эскулин. Индол из триптофана и сероводород на средах, содержащих тиосульфат, сульфат железа и пептон, не образует. Растет при температуре от 2 до 33°C, при оптимуме 18-25°C. Рост в Рис. 10. Морфология клеток штаммов ТРТ18 (А) и ТРТ56 (Б), маркер – 5 мкм. В микрофотография ультратонкого среза клеток штамма ТРТ56; МПС – мезосомоподобные структуры, В – везикулы, ПФ – гранулы полифосфатов, маркер – 0.5 мкм. Г- динамика роста штамма ТРТ56 при деградации пектина и ксилана.

Рис. 11. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК штаммов ТРТ18 и ТРТ56 и других представителей семейства Sphingobacteriaceae.

диапазоне pH 4.5–8.5, при оптимуме 6.0-6.5. В составе клеток доминируют isoC15:0, anteiso-C15:0, iso-C17:0 3OH, iso-C15:0 2OH and C16:17c жирные кислоты. Хиноны представлены менахинонами MK-7 (90-92%) и MK-6 (8-10%). Содержание пар Г+Ц в ДНК 42.4% - 46.1%. Типовой вид - Mucilaginibacter paludis.

Mucilaginibacter paludis gen. nov., sp. nov.

Основные характеристики указаны при описании рода. Колонии розовые или красноватые. Толщина клеток 0.6–1.0 мкм; длина 1.5–30 мкм. Использует в качестве источников углерода D-целлобиозу, D-фруктозу, D-галактозу, натрия D-галактуронат, натрия D-глюконат, D-глюкозу, D-лактозу, D-лейкрозу, D-мальтозу, D-рамнозу, Dсахарозу, D-трегалозу, D-ксилозу, D-маннозу, мезоинозит, N-ацетилглюкозамин.

Образует кислоты при росте на целлобиозе, фруктозе, галактозе, глюкозе, лактозе, мальтозе, рамнозе, сахарозе, ксилозе, маннозе, ламинарине и ксилане. Гидролизует хондроитин 6-сульфат, ксантановую камедь, ламинарин, пектин, пуллулан, крахмал и ксилан, но не альгинат, карбоксиметилцеллюлозу, целлюлозу, хитин, эскулин, фукоидан, гепарин, лихенан. Температура роста 2-35C с оптимумом при 20-25C.

Растет в диапазоне рН от 4.4 до 8.2 с оптимумом при 6.0-6.5. Содержание пар Г+Ц в ДНК - 46.1 моль %. Изолирован из сфагнового торфа. Типовой штамм ТРТ56T =ATCC BAA-1394T.

Mucilaginibacter gracilis sp. nov.

Основные характеристики указаны при описании рода.

Колонии круглые, выпуклые, слизистые, непрозрачные или полупрозрачные, кремовые или желтоватые. Клетки грамотрицательные, палочковидные толщиной 0.4–0.8 мкм; длиной 1.5–40 мкм. Использует в качестве источников углерода Dгалактозу, D-глюкозу, D-ксилозу, D-лактозу, D-мальтозу, D-рамнозу, D-раффинозу, салицин, D-сахарозу, D-трегалозу, D-фруктозу, D-целлобиозу, пируват. Образует кислоты при росте на D-галактозе, D-глюкозе, D-ксилозе, D-мальтозе, D-сахарозе, Dтрегалозе, D-фруктозе, D-целлобиозе, ламинарине и ксилане, но не на маннозе.

Спектр утилизируемых полимерных субстратов такой же, как у M. paludis.

Оптимальный рост при температуре 2-33С и рН 5.8-6.2. Содержание пар Г+Ц в ДНК - 42.4 моль %. Изолирован из сфагнового торфа. Типовой штамм TPT18T =ATCC BAA-1391T.

4. Бактерии, способные к гидролизу целлюлозы.

Из целлюлозолитических сообществ был получен ряд изолятов, представляющих филогенетические группы Bacteroidetes, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, Acidobacteria и Actinobacteria. Тестирование этих изолятов показало, что только некоторые представители Actinobacteria были способны к деструкции целлюлозы. Три штамма – ACTR, ACTY, ACT104 – грамположительных мицелиальных бактерий были способны разлагать целлюлозу при рН 4.0-6.0 (Рис. 12А, В). Их колонии образовывали хорошо выраженные зоны просветления на агаре, содержащем кристаллическую целлюлозу (Рис. 12Б), а в жидких средах при рН 5.2 и уровне минерализации 40 µS см-1 в отсутствие минеральных источников азота и фосфора они разлагали целлюлозу с образованием СО2 (Рис. 12Г). Штамм ACTR обнаруживал 98.5% сходства гена 16S рРНК с Streptomyces galbus (Frommer, 1959), ACTY – 98% сходства c Streptomyces ferralitis (Saintpierre-Bonaccio et al., 2004) и ACT104 – 99% сходства c Micromonospora matsumotoense (Lee et al., 1999). В данной работе впервые для этих видов показана способность к гидролизу целлюлозы.

Рис. 12. Рост штаммов ACT105 (А), ACTY (Б) и ACTR (В) на кристаллической целлюлозе, маркер 5 мкм. Динамика накопления СО при культивировании штаммов в жидкой среде с кристаллической целлюлозой (2 г/л) (Г). Контроль – рост на той же среде без целлюлозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методами молекулярной диагностики in situ показано, что прокариотные сообщества сфагновых болот включают представителей доменов Archaea и Bacteria. В аэробных слоях болотного профиля численность бактерий на порядок превосходит численность архей, однако с глубиной доля архей возрастает. Применение метода FISH позволило оценить численность и установить филогенетическую принадлежность физиологически активных прокариотных организмов, населяющих сфагновые болота. В составе бактериальных сообществ сфагновых болот были идентифицированы представители филогенетических групп Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Acidobacteria, и Verrucomicrobia, из которых последние три группы обнаружены нами в болотах впервые. Наиболее многочисленными из идентифицированных примененными зондами бактерий были представители класса Alphaproteobacteria и филогенетических групп Actinobacteria и Planctomycetes. Использование метода FISH позволило идентифицировать до клеток в 1 г влажного торфа, тогда как метод посева на питательные среды выявлял только 104-106 кл·г-1. Помимо этого, молекулярный in situ анализ микробного населения торфа позволил обнаружить ряд филогенетических групп домена Bacteria, которые не выявляются высевом на традиционные питательные среды, но при этом являются важным компонентом бактериального сообщества сфагновых болот.

Полученные в работе данные позволяют предположить, что деструкция растительной массы в кислых сфагновых болотах происходит поэтапно. После отмирания растений, бактерии филогенетических групп Bacteroidetes, Alphaproteobacteria и Betaproteobacteria разлагают легкодоступные водорастворимые полисахариды – пектин, ксилан, крахмал. Дальнейшее разложение стойких полимеров растительной массы осуществляется сообществом актинобактерий и представителей группы Alphaproteobacteria, численность которых в торфе достигает 107 кл·г-1. Уменьшение количества активных форм клеток этих бактерий с глубиной соответствует увеличению степени разложения торфа вниз по профилю. Численность физиологически активных бактерий филогенетической группы Firmicutes в кислом торфе и полученных из него накопительных культурах незначительна и не превышает 105 кл·г-1. При низких температурах и высокой влажности, характерных для сфагновых болот, прокариотные целлюлозолитические сообщества способны составить конкуренцию мицелиальным грибам, ведущая роль которых в деструкции целлюлозы в наземных экосистемах остается неоспоримой.

Из торфа сфагновых болот выделены бактерии, способные расти при рН 4.0-6. и утилизировать широкий спектр растворимых и нерастворимых полисахаридов в отсутствие источников связанного азота и при низкой концентрации ключевых биогенных элементов. Эти организмы относятся к филогенетическим группам Proteobacteria, Bacteroidetes и Actinobacteria.

ВЫВОДЫ

1. Впервые произведена оценка численности и состава физиологически активных прокариотных организмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH. Численность метаболически активных представителей доменов Archaea и Bacteria составила 107 и 108 клеток в грамме торфа, соответственно.

2. Показано, что численно значимыми компонентами бактериальных сообществ сфагновых болот являются представители филогенетических групп Proteobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes, Acidobacteria и Bacteroidetes. Впервые в сфагновых болотах выявлены бактерии групп Verrucomicrobia, Acidobacteria и Planctomycetes.

3. Разложение пектина в кислых олиготрофных болотах осуществляется бактериями филогенетических групп Bacteroidetes и Betaproteobacteria, а ксилана - представителями Bacteroidetes и Alphaproteobacteria.

4. При рН 4 - 5 и 10°С процесс деструкции целлюлозы в сфагновых болотах заторможен. Повышение температуры до 20°С приводит к активизации разложения этого биополимера бактериями филогенетической группы Actinobacteria в сообществе с представителями Alphaproteobacteria.

5. Из сфагнового торфа выделены и описаны ацидо- и психротолерантные бактерии нового рода Mucilaginibacter gen. nov. и двух новых видов Mucilaginibacter paludis sp. nov. и Mucilaginibacter gracilis sp. nov. - способные гидролизовать пектин, ксилан, ламинарин, микробные полисахариды и хондроитин в диапазоне рН 4.5 – 6.0 и температуре от 2 до 30С.

6. Из целлюлозолитических сообществ сфагновых болот выделены культуры актинобактерий, способных к деструкции целлюлозы в диапазоне рН 4.0-5.5. Они идентифицированы как представители видов Streptomyces ferralitis, Streptomyces galbus и Micromonospora matsumotoense. Способность гидролизовать целлюлозу показана для этих видов впервые.

1. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH // Микробиология, 2005, Т. 74, № 6, с. 722-728.

2. Марченко С.А., Панкратов Т.А., Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ в почве // Вестник МГУ. Сер. Почвоведение, 2005, № 2, с. 44-46.

3. Белова С.Э., Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Бактерии рода Burkholderia как типичный компонент микробного сообщества сфагновых болот // Микробиология, 2006, Т. 75, № 1, с.

90-96.

4. Dedysh S. N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S. and Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Appl. Envir Microbiol., 2006, V. 72 (3), p. 2110-2117.

5. Куличевская И.С., Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Выявление представителей Planctomycetes в сфагновых болотах с использованием молекулярных и культуральных подходов // Микробиология, 2006, Т. 76, № 3. С. 329-335.

6. Панкратов Т.А., Дедыш С.Н., Заварзин Г.А. Ведущая роль представителей Actinobacteria в процессах аэробной деструкции целлюлозы в сфагновых болотах // ДАН, 2006 Т. 410, № 4, с. 438-442.

7. Pankratov T.A., Kulichevskaya I.S., Liesack W. and Dedysh S.N. Isolation of aerobic, gliding, xylanolytic and laminarinolytic bacteria from acidic Sphagnum peatlands and emended description of Chitinophaga arvensicola Kmpfer et al. 2006 // Int J. Syst. Evol Microbiol, 2006, V. 56 (12), p.

2761-2764.

8. Pankratov T.A., Liesack W., Dedysh S.N. Mucilaginibacter paludis gen. nov., sp. nov. and Mucilaginibacter gracilis sp. nov., two novel pectin, xylan and laminarin degrading members of the family Sphingobacteriaceae from acidic Sphagnum peat bog// Int J. Syst. Evol Microbiol, (submitted).

Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Анализ микробных сообществ сфагновых болот путем in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами // «Болота и биосфера». Материалы 3-ей научной школы. 13сентября 2004. Томск. С. 231-238.

1. Panikov N.S., Pankratov T. Relaxation Biodynamics: Experimental Studies and Modeling of Biogeochemical Processes in Northern Terrestrial Ecosystems // Eos Trans. AGU, 82(47), Fall Meet. Suppl., 2001.

2. Панкратов Т.А., Куличевская И.С., Белова С.Э., Дедыш С.Н., Заварзин Г.А.

Молекулярная диагностика филогенетического состава бактерий в ультрапресных водах верхового сфагнового болота Молого-Шекснинского водосбора // «Экологическое состояние континентальных водоемов арктической зоны в связи с промышленным освоением северных территорий». Материалы Межд. конференции. 21-25 июня 2005. Архангельск, 2005. С. 81-82.

3. Панкратов Т.А. Филогенетический анализ целлюлозолитического сообщества сфагнового торфа. В сб.: «Актуальные аспекты современной микробиологии: Всероссийская Молодежная школа-конференция, Москва, 1-3 ноября 2005 г.» (Тезисы конф.)- М.: МАКС Пресс, 2005. С. 51-52.



 
Похожие работы:

«Стародубайте Мария Станиславовна ФЕНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КРОТОВ РОДА TALPA В ОТДЕЛЬНЫХ РЕГИОНАХ ПАЛЕАРКТИКИ 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2007 Работа выполнена в лаборатории экологических основ охраны генофонда животных Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель :...»

«БЕККЕР ОЛЬГА БОРИСОВНА СОЗДАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ СКРИНИНГА ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ФОСФОТРАНСФЕРАЗ 03.02.07 - генетика. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1 Москва 2011. Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Даниленко Валерий Николаевич УРАН Институт общей генетики им. Н.И....»

«САВИЩЕНКО Елена Анатольевна ГИДРОКОРТИЗОНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРОВ ДОСТАВКИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ В ЖИВОТНЫЕ КЛЕТКИ 03.01.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 г. 2 Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, СанктПетербург и ГОУ ВПО...»

«Благодатский Сергей Александрович МИКРОБНАЯ БИОМАССА И МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦИКЛА АЗОТА В ПОЧВЕ Специальность 03.02.03 – микробиология 03.02.13 – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино – 2011 Работа выполнена в лаборатории почвенных циклов азота и углерода Учреждения Российской академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино, Московская обл. Научный консультант : д.б.н.,...»

«Якименко Алена Олеговна АГРЕГАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА СУБПОПУЛЯЦИЙ АКТИВИРОВАННЫХ ТРОМБОЦИТОВ 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Пантелеев Михаил Александрович Официальные оппоненты...»

«Лыкшитова Людмила Станиславовна ЭКОЛОГО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ MALUS BACCATA ( L. ), ULMUS PUMILA ( L. ), SYRINGA VULGARIS( L. ) К ВОЗДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.01 – ботаника (биологические наук и) 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ -2014 1 Работа выполнена на кафедре ботаники федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»

«Литягина Снежана Владимировна ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕКАЛЬЦИТРАНТНОСТИ СЕМЯН НА ПРИМЕРЕ КОНСКОГО КАШТАНА 03.01.05. – Физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. акад. М.Х. Чайлахяна Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва Научный руководитель : доктор...»

«Ямпольский Илья Викторович Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка специальность – 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А....»

«Кузнецова Светлана Борисовна БИОМОРФОЛОГИЯ КНЯЖИКА СИБИРСКОГО – ATRAGENE SIBIRICA L. (сем. RANUNCULACEAE) 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар - 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Вятский государственный гуманитарный университет (г. Киров) Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент Савиных Наталья Павловна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный...»

«Герасимова Анна Викторовна Анализ регуляции транскрипции генов дыхания в гамма-протеобактериях методами сравнительной геномики 03.00.03 Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2006 Работа выполнена в лаборатории биоинформатики Государственного научноисследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Научный руководитель : кандидат физико-математических наук, доктор...»

«ДОРОФЕЮК Надежда Ивановна Реконструкция природных условий Внутренней Азии в позднеледниковье и голоцене (по материалам диатомового и палинологического анализов озерных осадков Монголии) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2008 3 Работа выполнена в лаборатории экологии аридных территорий Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Официальные оппоненты : доктор биологических наук Савинецкий...»

«Фахруллин Равиль Фаридович ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ И НАНОЧАСТИЦ 03.02.03 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань - 2011 2 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, Республика Татарстан. Научный консультант : Член – корр. АН РТ, доктор биологических наук, профессор Ильинская Ольга Николаевна Официальные оппоненты :...»

«АБДОРРАХМАН МОТАМЕДИ ШАЛАМЗАРИ ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИОЗОВ ТОМАТА И МЕРЫ ЗАЩИТЫ специальности 06.01.07 – защита растений 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена на кафедре защиты растений Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Джалилов Февзи...»

«Шалыгин Сергей Сергеевич ГРУППИРОВКИ ЭПИЛИТНЫХ И ЭПИФИТНЫХ ЦИАНОПРОКАРИОТ ЛАПЛАНДСКОГО ЗАПОВЕДНИКА 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа - 2012 Работа выполнена в лаборатории флоры и растительных ресурсов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Полярно-альпийский ботанический садинститут им. Н. А. Аврорина Кольского научного центра РАН (ПАБСИ КНЦ РАН). Научный руководитель : доктор...»

«Горбатова Ольга Николаевна ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА АТРАЗИНА БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ И ИХ ФЕРМЕНТАМИ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена в группе Ферментативные основы биодеградации Института биохимии имени А.Н.Баха РАН Научные руководители: доктор биологических наук О.В. Королева кандидат биологических наук А.В.Жердев Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2014 Работа выполнена в лаборатории эволюционной зоологии и генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биологопочвенного института ДВО РАН Научный руководитель :...»

«КОЗЛОВА Александра Дмитриевна РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРВОВИРУСА И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2014 Работа выполнена в отделе генодиагностики инфекционных болезней животных отделения биологических лекарственных средств и биотехнологии федерального государственного...»

«Андреев Ярослав Алексеевич ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ МОДУЛЯТОРОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ TRPV1 РЕЦЕПТОРОВ специальность – 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2009 Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Учреждения Pоссийской академии наук Институт...»

«ЛЕВАКИН Иван Андреевич РЕАЛИЗАЦИЯ МОНОКСЕННОГО ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА BUNOCOTYLE PROGENETICA (TREMATODA: HEMIUROIDEA, BUNOCOTYLINAE) В УСЛОВИЯХ ЛИТОРАЛИ БЕЛОГО МОРЯ 03.00.19 – Паразитология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 Работа выполнена в Зоологическом институте РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Галактионов Кирилл Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Смирнова Людмила Олеговна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОВСА ПО ФОТОПЕРИОДИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СКОРОСПЕЛОСТИ Специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений, 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Диссертационная работа выполнена в отделе генетических ресурсов овса, ржи, ячменя и отделе физиологии растений Всероссийского...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.