WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ОДИНОКОВ Георгий Николаевич

Генетический анализ биохимических особенностей штаммов

Yersinia pestis основного и неосновных подвидов

03.02.03 – микробиология

03.02.07 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание учной степени

кандидата биологических наук

Саратов – 2010 2

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучии человека»

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ерошенко Галина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна доктор медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН»

Защита состоится «_»2010 г._часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»».

Автореферат разослан «_»2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума – зоонозная природно-очаговая особо опасная карантинная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1996]. Чума представляет реальную угрозу для населения из-за существования многочисленных природных очагов чумы, часть из которых расположена в Российской Федерации и ближнем зарубежье [Онищенко с соавт., 2004]. Высока вероятность заноса возбудителя чумы на территорию России из соседних, неблагополучных по этой болезни стран, а также в результате биотеррористических актов. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 2000 случаев заболевания чумой, многие из которых заканчиваются летальным исходом. Большая вспышка легочной чумы в 2009 г. произошла в Хайнань-Тибетском автономном округе Китая, в которой тоже был зарегистрирован ряд смертельных случаев [WHO / plague sheets, 2009]. Все эти факты настоятельно требуют разработки новых, основанных на современных технологиях высокоэффективных методов диагностики возбудителя чумы, средств профилактики и лечения вызываемой им особо опасной болезни.




Используемые до настоящего времени классификации Yersinia pestis учитывали лишь морфологические, культуральные, биохимические и другие фенотипические признаки [Безсонова, 1928; Борзенков, 1938; Туманский, 1957; Тимофеева, 1968; Кутырев, Проценко, 1998; Devignat, 1951] и были не лишены недостатков, связанных с изменчивостью этих свойств. Однако достигнутые в последнее время успехи в фундаментальной генетике и молекулярной микробиологии позволяют перевести решение задач по систематизации возбудителя чумы на качественно новый уровень, основанный на использовании его молекулярно-генетических особенностей.

В соответствии с принятой в настоящее время отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делят на основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский) подвида [Тимофеева, 1985; Кутырев, Проценко, 1998]. Согласно распространенной зарубежной классификации штаммы Y. pestis на основании различий по ряду биохимических свойств (способность к ферментации глицерина, редукции нитратов, окислению аммиака) и по историко-географическому принципу [Devignat, 1951] делят на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). По фенотипическим характеристикам штаммы основного подвида соответствуют трем биоварам (античному, средневековому и восточному), принятым в зарубежной классификации. Однако штаммы Y. pestis, циркулирующие в природных очагах чумы в РФ и ближнем зарубежье, остаются не систематизированными по их принадлежности к определенным биоварам.

По экспрессии дифференциально-значимых биохимических признаков наиболее активными являются штаммы античного биовара. Они ферментируют глицерин и обладают денитрифицирующей активностью. Штаммы средневекового биовара Y.

pestis не способны редуцировать нитраты, но ферментируют глицерин и арабинозу.

Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но активно редуцируют нитраты и утилизируют арабинозу.

Штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнего зарубежья, как правило, высоко вирулентны и имеют высокую эпидемическую значимость. Они не ферментируют рамнозу и мелибиозу, не чувствительны к пестицину I, имеют высокий уровень продукции изоцитралиазы. Штаммы неосновных подвидов ферментируют рамнозу и мелибиозу, чувствительны к пестицину I, не проявляют изоцитрат-лиазной активности, избирательно вирулентны для лаборторных животных, эпидемически малозначимы.

Генетические причины различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на биовары и подвиды, остаются к настоящему моменту изученными недостаточно. Достоверно установлено лишь то, что причиной отсутствия ферментации глицерина у штаммов восточного биовара является мутация в гене глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (glpD). Показано, что в этом гене у всех штаммов восточного биовара присутствует делеция размером 93 п.н. [Parhill et al., 2001; Motin et al., 2002]. В литературе имеются лишь единичные работы по определению различий в структуре генов Y. pestis основного и неосновных подвидов, кодирующих редукцию нитратов и ферментацию рамнозы [Куклева с соавт., 2008;





2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].

Остаются не установленными причины гетерогенности штаммов чумного микроба по питательным потребностям. Штаммы из различных природных очагов чумы отличаются по питательным потребностям, определяемым нарушениями генов промежуточного метаболизма, что может быть использовано в генетической схеме дифференциации штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы.

Выявление изменений в структуре генов, лежащих в основе различной экспрессии микробиологических и биохимических признаков, послужит надежной основой для создания генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы, а также для определения основных направлений внутривидовой эволюции Y. pestis.

Цель работы. Определение генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары.

Задачи исследования:

Охарактеризовать использованные в работе штаммы Y. pestis, выделенные в природных очагах чумы в РФ и ближнего зарубежья, по биохимическим свойствам (редукция нитратов, продукция изоцитрат-лиазы, ферментация арабинозы и мелибиозы), лежащим в основе деления на подвиды и биовары. Установить принадлежность штаммов, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, к определенным биоварам.

Изучить структурно-функциональную организацию генов, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении на биовары, – редукцию нитратов и ферментацию арабинозы.

Выявить изменения в генах Y. pestis, детерминирующих ферментацию мелибиозы и продукцию изоцитрат-лиазы, лежащих в основе дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

Определить питательные потребности штаммов Y. pestis кавказского подвида и установить генетические основы их ауксотрофности.

Оценить перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis и установления основных направлений внутривидовой эволюции этого возбудителя.

Научная новизна работы. На основании данных комплексного микробиологического, биохимического и генетического анализа установлено, что штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

Впервые показано, что причиной отсутствия нитратредуцирующей активности у части штаммов основного подвида, циркулирующих на территории РФ и ближнего зарубежья, является наличие замены единичного нуклеотида G T в позиции гена периплазматической нитратредуктазы – napA, что доказывает принадлежность этих штаммов к средневековому биовару. Отсутствие экспрессии этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов вызвано вставкой тиминового нуклеотида (+Т) в 302 позиции другого гена – ssuA, которая приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры кодируемого транспортного белка – SsuA, также участвующего в восстановлении нитратов.

Впервые установлено, что отсутствие ферментации арабинозы у штаммов Y.

pestis алтайского и гиссарского подвидов связано с наличием мутации в регуляторном гене арабинозного оперона – araС, который содержит инсерцию гуанинового нуклеотида (+G) в позиции 773 от начала гена, приводящую к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры регуляторного белка AraC, необходимого для инициации транскрипции генов арабинозного оперона.

Впервые установлена генетическая основа различной продукции изоцитратлиазы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, связанная с наличием вставки двух нуклеотидов (+СС) в регуляторном гене iclR в позиции 269которая приводит к инактивации кодируемого им белка-репрессора ацетатного оперона IclR и является причиной конститутивного синтеза фермента изоцитратлиазы у штаммов основного подвида. Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген iclR и не способны к конститутивному синтезу изоцитрат-лиазы.

Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов Y. pestis основного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности IS285 в ген melB, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подвидов вставка IS285 в гене melB отсутствует.

Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей IS100 в гены argA и aroF, вставкой 10 п.н. в ген aroG, инсерцией тиминового нуклеотида в ген thiH и делецией 13 п.н. в гене thiG.

Полученная молекулярная характеристика штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в основе деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы.

По результатам работы оформлены заявки на изобретение «Способ определения подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы методом секвенирования» (№2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено решение о выдаче патента) и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс – типирования (№2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и утверждены методические рекомендации «Определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов rhaS и araC, контролирующих ферментацию рамнозы и арабинозы» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 6 от 16 июня 2009) и «Определение подвидовой принадлежности штаммов Yersinia pestis методом мультилокусмного сиквенс – типирования (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 1 от 23 февраля 2010).

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штамма: Y. pestis КМ 910 алтайского, КМ 596 гиссарского и КМ 1861 улегейского подвидов в качестве референс-штаммов этих подвидов.

Полученные в ходе выполнения исследования данные по генетической организации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации и повышения квалификации при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохимических и генетических свойств этих штаммов.

2. В основе разного проявления биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в генах, кодирующих эти признаки. Отсутствие способности к редукции нитратов у штаммов основного подвида средневекового биовара связано с наличием нонсенсмутации (G T) в гене napA периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов – с инсерцией единичного нуклеотида в ген ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена araC.

3. Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией кодирующих их генов у основного подвида и их интактностью у неосновных подвидов.

Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено внедрением IS285 в ген melB галактозидпермеазы, а конститутивный синтез изоцитратлиазы у штаммов этого подвида – вставкой двух нуклеотидов (СС) в последовательность регуляторного гена iclR. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены melB и iclR.

4. Причиной множественных питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказского подвида является инактивация у них ряда генов биосинтеза аминокислот и витаминов. Зависимость штаммов этого подвида по аргинину вызвана инсерцией IS в ген argA, по фенилаланину – вставкой 10 п.н. в ген aroG, по тирозину – внедрением IS100 в ген aroF, по тиамину (B1) делецией 13 п.н. - в ген thiG и инсерцией единичного нуклеотида в thiH. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штаммов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определены характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетической схемы внутривидовой классификации Y. pestis.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на IХ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников содружества независимых государств», Волгоград, 2008; VI Международной конференции «Молекулярная диагностика и биобезопасность», М., 2009; научно-практической школыконференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 25 – 27 мая 2010 г.; на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов 2008 - 2010 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России…».

Структура и объм диссертации. Диссертация представлена на 157 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 отечественных и зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы В работе использовано 111 штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, из них штамм возбудителя чумы основного и 50 штаммов неосновных подвидов, выделенных на территории РФ, ближнего и дальнего зарубежья. Исследовано также 10 штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения. Изучение культуральноморфологических и биохимических свойств штаммов проводили с помощью традиционно используемых методов [Практическое руководство по лабораторной диагностики опасных инфекционных болезней, 2009 г.]. Выделение ДНК штаммов Y. pestis осуществляли стандартным методом в соответствии с методикой, приведенной в М.У.

1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности». Анализ полученных в ПЦР продуктов проводили в 0,8 – 2 % агарозном геле в соответствии с руководством Т. Маниатиса с соавт. [1984]. Определение нуклеотидных последовательностей генов осуществляли на генетическом анализаторе модели “CEQ 8000” (Beckman Coulter) по методу F. Sanger [1977]. Сравнительный анализ геномов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и метаболических путей биосинтеза факторов роста проводили с помощью алгоритма BLAST базы данных NCBI GenBank и KEGG Metabolic Pathways. Филогенетический анализ штаммов выполняли на основе программ Mega 4.0, PHYLIP и SplitsTree4 и дистанционно-матричных методов: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ микробиологических и биохимических свойств штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы Все использованные в работе штаммы Y. pestis были исследованы по их биохимической активности: способности к редукции нитратов, ферментации глицерина, арабинозы, мелибиозы, рамнозы, продукции изацитрат-лиазы – признакам, используемым при делении на подвиды и биовары. Как было установлено, все изученные штаммы основного подвида - Y. pestis ssp. pestis не ферментировали рамнозу и мелибиозу, но продуцировали изоцитрат-лиазу. В отличие от них все штаммы Y. pestis неосновных подвидов ферментировали рамнозу и мелибиозу, но не продуцировали изоцитрат-лиазу. Полученные сведения коррелировали с литературными данными о биохимических особенностях штаммов Y. pestis, используемых для дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

При изучении биохимических признаков, применяемых при делении штаммов Y. pestis на биовары, - редукции нитратов, ферментации арабинозы и глицерина была установлена гетерогенность по этим свойствам у штаммов основного и неосновных подвидов. Часть штаммов основного подвида, выделенных на территории РФ и ближнего зарубежья, не редуцировала нитраты, что свидетельствовало об их принадлежности к средневековому биовару. Штаммы неосновных подвидов – алтайского, гиссарского и улегейского также не редуцировали нитраты, в то время как кавказские штаммы были положительны по этому признаку.

По второму дифференциальному признаку – ферментации арабинозы, все исследованные в работе штаммы Y. pestis основного, кавказского и улегейского подвидов были однородными и утилизировали этот моносахарид. Штаммы алтайского и гиссарского подвидов не ферментировали арабинозу, и генетические основы различной экспрессии этого признака оставались не известными.

Отсутствие способности ферментировать глицерин (еще один дифференциальный биохимический признак) является характерным признаком штаммов биовара orientalis. Однако в РФ и странах ближнего зарубежья не выявлено очагов с постоянной циркуляцией таких штаммов. В литературе имеются лишь отдельные сообщения о выделении на этих территориях единичных глицериннегативных штаммов Y. pestis [Сагымбек с соавт., 2003; Онищенко с соавт., 2004].

Характерной генетической меткой штаммов биовара orientalis является делеция размером 93 п.н. в гене glpD – глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [Parhill et al., 2001].

Нами установлено, что все штаммы Y. pestis из природных очагов чумы РФ и ближнего зарубежья не содержали в гене glpD характерной для восточного биовара делеции размером 93 п.н., что подтверждает отсутствие среди них штаммов биовара orientalis (рисунок 1). Такие штаммы выявлялись лишь среди изолятов, полученных в странах дальнего зарубежья.

Рисунок 1. ПЦР анализ штаммов Y. pestis с праймерами на ген glpD : 1 – 16 – штаммы основного подвида из природных очагов чумы РФ и ближнего зарубежья; 17 – 19 – штаммы восточного биовара из дальнего зарубежья; 20 – отрицательный контроль.

Стрелками указаны размеры образуемых амплификатов.

Таким образом, изученные нами штаммы Y. pestis, выделенные на территории РФ и ближнего зарубежья, по комплексу биохимических признаков (ферментация глицерина, редукция нитратов) принадлежат к античному и средневековому биоварам, что коррелирует с общепринятым мнением о приуроченности штаммов этих биоваров к континентальным очагам чумы, а штаммов восточного биовара – к очагам крысиного типа, расположенным вдоль океанических побережий.

Большое внимание в ходе выполнения этой работы было уделено исследованию штаммов возбудителя чумы кавказского подвида, поскольку, по мнению ряда исследователей [Бобров, Филиппов, 1997], они являются самыми древними из сохранившихся штаммов возбудителя чумы и наиболее близки к предшественнику – Y.

pseudotuberculosis. По биохимическим свойствам штаммы этого подвида оказались наиболее активными среди всех подвидов Y. pestis. Они обладали нитратредуцирующей активностью, ферментировали глицерин, арабинозу, рамнозу, мелибиозу. Поскольку в литературе имелись противоречивые данные по питательным потребностям штаммов этого подвида [Мартиневский, 1969; Апарин, Голубинский, 1989], нами проведены исследования по уточнению питательных потребностей штаммов кавказского подвида.

Установлено, что все изученные штаммы кавказского подвида вели себя достаточно единообразно. У них выявлена потребность в аминокислотах – фенилаланине, тирозине, аргинине и витамине B1 (тиамине). У штаммов из Восточно-Кавказского высокогорного очага чумы кроме потребностей в этих факторах роста также обнаружена зависимость по лейцину, в то время как штаммы кавказского подвида из Ленинаканского, Присеванского, Зангезуро-Карабахского, Приараксинского природных очагов такой зависимости не имели.

Поскольку причины ауксотрофности штаммов кавказского подвида по аминокислотам и витамину B1 (тиамину) не известны, нами в дальнейшем было проведено исследование генетических основ ауксотрофности штаммов этого подвида.

2. Определение структурно-функциональной организации генов, кодирующих биохимические признаки, используемые для дифференциации биоваров возбудителя чумы Отсутствие способности редуцировать нитраты является характерным признаком штаммов Y. pestis средневекового биовара, который отличает их от штаммов античного и восточного биоваров. Штаммы неосновных подвидов чумного микроба, циркулирующие в природных очагах на территории РФ и стран ближнего зарубежья, также различаются по их денитрифицирующей активности. Однако генетические причины различного проявления у них этого признака остаются не установленными.

Нами на основе сравнительного компьютерного анализа геномов штаммов Y.

pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, установлено, что гены, участвующие в редукции нитратов объединены в nap оперон, который имеет у них идентичную структуру и состоит из шести генов: napA-F и napP (рисунок 2).

Были исследованы и другие гены, также принимающие участие в восстановлении нитратов, – narP и ssuA, кодирующие соответственно регуляторный белок NarP и транспортный белок SsuA Рисунок 2. Структура nap оперона у штаммов Y. pestis В результате проведенного компьютерного анализа генов nap оперона было выявлено наличие единичных нуклеотидных замен во всех генах этого оперона, но наиболее значимой оказалась замена нуклеотида G Т в позиции 613 от начала гена napA – периплазматической нитратредуктазы, которая была выявлена ранее у Y. pestis KIM и других штаммов биовара medievalis [Deng et al., 2002]. По данным компьютерного анализа с использованием программы MEGA 4.0 установлено, что эта мутация приводит к смене триплета GAA ТАА, который является стоп-кодоном и служит причиной преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи (после 204го аминокислотного остатка) молекулы этого фермента.

Другая значимая для проявления денитрифицирующей активности мутация выявлена нами в хромосомном гене ssuA (размер гена – 1123 п.н.), который содержал вставку тиминового нуклеотида в 302 позиции у штамма 91001 биовара microtus (NCBI GenBank). По данным компьютерного анализа с использованием программы Mega 4.0 эта мутация приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры белка SsuA.

На вариабельные участки генов napA и ssuA были сконструированы праймеры, с помощью которых проводили амплификацию фрагментов этих генов в ПЦР и, в дальнейшем, определяли их нуклеотидную последовательность. Для выявления причин различной денитрифицирующей активности у штаммов Y. pestis нами был изучено 90 штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы, а также 10 штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения. В результате проведенного анализа установлено, что выделенные в РФ и ближнем зарубежье штаммы основного подвида, неспособные редуцировать нитраты, имели единичную нуклеотидную замену G Т в позиции 613, характерную для штаммов биовара medievalis, которая приводит к смене кодона (GAA ТАА) и преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи молекулы периплазматической нитратредуктазы. Наличие характерной нуклеотидной замены в позиции 613, являющейся генетической меткой биовара medievalis, у части изученных штаммов основного подвида, наряду с отсутствием у них денитрифицирующей активности служит основанием для отнесения их к средневековому биовару.

В тоже время нами не было выявлено наличие этой мутации в гене napA у штаммов алтайского и гиссарского подвидов, также не способных редуцировать нитраты. Было установлено, что причиной отсутствия денитрифицирующей активности у этих штаммов является другая мутация, вызванная вставкой тиминового нуклеотида в 302 позиции гена ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Эта мутация обнаружена не только у штаммов алтайского и гиссарского подвидов, но и у штамма 91001 биовара microtus, который также не способен редуцировать нитраты.

Другим важным биохимическим признаком, используемым для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы, является ферментация арабинозы. Все штаммы основного, кавказского и улегейского подвидов способны утилизировать этот углевод, в то время как штаммы алтайского и гиссарского подвидов, а также биовара microtus не способны его использовать. Однако генетические причины отсутствия проявления этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов возбудителя чумы остаются не установленными.

Нами на основе сравнительного компьютерного анализа геномов Y. pestis и Y.

pseudotuberculosis (NCBI GenBank) установлено, что у всех штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов арабинозный оперон имеет идентичную структуру и состоит из шести генов. В него входят пять структурных - araA, araB, araH, araF, araG, и один регуляторный ген araC (рисунок 3).

Рисунок 3. Структура арабинозного оперона Y. pestis В результате сравнительного компьютерного анализа генов арабинозного оперона, а также гена araD у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank), было установлено наличие значимой мутации в регуляторном гене araC, который содержал делецию в 112 п.н. (26 - 137) и инсерцию гуанина в позиции 773 у штамма 91001 биовара microtus, как это ранее было установлено D. Zhou et al. [2004].

На вариабельные области гена araC были сконструированы две перекрывающиеся пары праймеров, фланкирующие полную нуклеотидную последовательность этого гена, и в ПЦР получены его амплификаты.

Секвенирование полной последовательности гена araC, проведенное нами у природных штаммов Y. pestis и 10 штаммов Y. pseudotuberculosis, установило, что штаммы только алтайского и гиссарского подвидов имели мутацию в гене araC, которая была связана со вставкой гуанинового нуклеотида в 773 позиции, в то время как штаммы других подвидов и штаммы псевдотуберкулезного микроба имели интактную структуру этого гена. Наличия делеции размером 112 п.н., характерной для штаммов биовара microtus [Zhou et al., 2002], у изученных штаммов Y. pestis, выделенных на территории РФ и ближнего зарубежья, выявлено не было.

Таким образом, нами впервые установлено, что отсутствие способности утилизировать арабинозу у штаммов алтайского и гиссарского подвидов связано с инсерцией единичного нуклеотида в гене araC.

3. Выявление изменений в генах, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении возбудителя чумы на основной и неосновные подвиды Штаммы возбудителя чумы неосновных подвидов, также как и штаммы Y.

pseudotuberculosis обладают ферментативной активностью в отношении дисахарида мелибиозы. Способность утилизировать мелибиозу обнаружена и у штаммов Y. pestis биовара microtus [Zhou et al., 2004]. В отличие от них все высоковирулентные штаммы Y. pestis основного подвида не ферментируют мелибиозу. Генетические причины отсутствия у них этой биохимической активности остаются неизвестными.

На основе сравнительного компьютерного анализа геномов штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, нами установлено, что мелибиозный оперон возбудителей чумы и псевдотуберкулеза имеет идентичную структуру и представлен тремя генами – melA (YP_1469), melB (YP_1470) и melR (YP_1471) (рисунок 4).

В результате анализа структуры этих генов было установлено, присутствие важной для проявления изучаемого свойства мутации в структурном Рисунок 4. Структура мелибиозного оперона Y. pestis Pestoides F гене melB, кодирующем транспортный белок MelB – галактозидпермеазу. В нуклеотидной последовательности этого гена у штаммов основного подвида – CO92, KIM, Antiqua и Nepal516 (NCBI GenBank), обнаружена вставка инсерционной последовательности – IS285 после 73 нуклеотида. В отличие от них у штамма Y. pestis Pestoides F (кавказскиий подвид) и у всех штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружена интактная структура гена melB.

На вариабельные области гена melB была сконструирована пара праймеров, фланкирующая область внедрения IS285, и в ПЦР проведена амплификация фрагмента этого гена. У всех использованных в работе штаммов Y. pestis основного подвида (51 штамм) амплификаты, полученные с помощью этой пары праймеров, имели размер 1648 п.н., что свидетельствовало о внедрении IS285 (1324 п.н.) в последовательность гена melB у этих штаммов и коррелировало с отсутствием у них ферментативной активности в отношении мелибиозы. В отличие от основного подвида у штаммов неосновных в ПЦР выявляли амплификаты меньшего размера (325 п.н.), что свидетельствовало об интактной структуре гена melB и соответствовало их способности ферментировать этот дисахарид (рисунок 5).

Таким образом, нами установлено, что причиной отсутствия способности штаммов Y. pestis основного подвида к ферментации мелибиозы является нарушение структуры гена melB, обусловленное вставкой IS285. Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген melB.

Для дифференциации штаммов основного подвида возбудителя чумы от штаммов неосновных подвидов и псевдотуберкулезного микроба используется также способность первых к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы.

Рисунок 5. ПЦР-анализ гена melB у штаммов возбудителя: 1 – 3 – кавказский подвид;

4 – 5 гиссарский подвид; 6 – 7 – алтайский подвид; 8 – улегейский подвид; 9 – 17 – основной подвид; 18 – отрицательный контроль. Слева представлены маркеры молекулярных масс X174/HincII.

Показано, что штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. pestis неосновных подвидов, в отличие от штаммов основного подвида, не способны к конститутивному синтезу этого фермента. Однако генетические причины различий в экспрессии этого признака у штаммов основного и неосновных подвидов к настоящему моменту не известны.

По данным проведенного нами анализа геномов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, установлено, что структура ацетатного оперона у всех штаммов возбудителя чумы идентична и включает три структурных гена – aceA, aceB, aceK, которые находятся под негативной регуляцией гена iclR (рисунок 6).

Рисунок 6. Структура ацетатного оперона у штаммов Y. pestis Сравнительный компьютерный анализ генов ацетатного оперона показал наличие значимой для фенотипического проявления изучаемого свойства мутации в регуляторном гене iclR (843 п.н.). Установлено, что у штаммов Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (основного подвида) ген iclR инактивирован вставкой двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269-270 от начала гена, и его размер составлял у этих штаммов 845 п.н. Выявленная нами инсерция (+СС) в 269-270 позиции гена iclR приводит к преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи белка-репрессора IclR, что влечет за собой конститутивную экспрессию генов ацетатного оперона и, как следствие, высокий уровень синтеза изоцитрат-лиазы.

На вариабельную область гена iclR была сконструирована пара праймеров, с помощью которой была изучена структура этого гена у 95 природных штаммов Y.

pestis основного и неосновных подвидов и у 10 штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Было установлено, что нуклеотидные последовательности фрагментов гена iclR у всех штаммов Y. pestis кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов идентичны, составляют 370 п.н. и полностью соответствуют аналогичной последовательности штаммов псевдотуберкулезного микроба, а также штамма Pestoides F (NCBI GenBank), что свидетельствует об интактности секвенированного участка гена iclR и коррелирует с низкой активностью у них фермента изоцитрат-лиазы. Иная картина обнаружена у штаммов основного подвида возбудителя чумы. В гене iclR у них выявлена инсерция – вставка двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 – 270, которая приводит к сдвигу рамки считывания регуляторного гена iclR и, как следствие, к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы у штаммов Y. pestis основного подвида.

4. Установление генетических основ ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказского подвида Как было показано нами выше, все штаммы кавказского подвида нуждаются для своего роста в аминокислотах: аргинине, тирозине, фенилалание и витамине B1 – тиамине. Однако генетические причины ауксотрофности штаммов Y. pestis ssp.caucasica до сих пор не изучались.

На первом этапе нами был проведен компьютерный анализ пути биосинтеза аргинина, тирозина, фенилалана и витамина B1 (тиамина) у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных KEGG Metabolic Pathways, и определены ключевые ферменты биосинтеза этих факторов роста и кодирующие их гены. С помощью алгоритма BLAST, проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов биосинтеза аргинина, тирозина, фенилалана и витамина B1 (тиамина) у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank). По результатам компьютерного анализа значимой для проявления зависимости по аргинину оказалась мутация, обнаруженная нами у штамма Pestoides F в структурном гене Nацетилглутаматсинтазы – argA, которая представляла собой вставку инсерционной последовательности IS100 после 196 нуклеотида от начала гена.

В ПЦР-анализе с использованием пары праймеров, фланкирующих внедрение IS100, было установлено, что размер образуемого фрагмента гена argA у всех использованных в работе штаммов возбудителя чумы основного, алтайского и улегейского подвидов, а также псевдотуберкулеза составлял 215 п.н., что соответствовало интактной структуре гена. Фрагменты гена argA у штаммов Y. pestis кавказского подвида имели большую молекулярную массу (2143 п.н.), обусловленную наличием вставки IS100, приводящей к инактивации гена.

Анализ генов, участвующих в биосинтезе ароматических аминокислот, показал, что ген aroG (1053 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС-[Phe] (3-дезокси-Dарабиногептулозонат-7-фосфат-синтаза), у штамма Pestoides F инактивирован вставкой 10 нуклеотидов (в позиции 820 – 829), приводящей к сдвигу рамки считывания и нарушению синтеза фенилаланина.

При секвенировании фрагмента aroG у 95 природных штаммов основного и неосновных подвидов было установлено, что у штаммов чумного микроба основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов этот ген имеет интактную структуру и кодирует функционально активный белок ДАГФС-[Phe]. В отличие от них у штаммов кавказского подвида Y. pestis в гене aroG обнаружена инсерция 10 п.н. в позиции 820 – 829, приводящая к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры фермента.

Наличие этой мутации у всех штаммов кавказского подвида коррелировало с отсутствием у них способности синтезировать фенилаланин.

Другой структурный ген - aroF (1071 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФСTyr], у штамма Pestoides F инактивирован внедрением инсерционной последовательности IS100 после 888 нуклеотида от начала гена, что вызывает потерю способности синтезировать тирозин. В ПЦР-анализе у штаммов основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов образовывались амплификаты гена aroF размером 563 п.н., что соответсвовало интактной структуре гена. У штаммов кавказского подвида специфический амплификат гена aroF в ПЦР не образовывался, что свидетельствовало об утрате его фрагмента после внедрения инсерционной последовательности IS100 и коррелировало с ауксотрофностью по тирозину Структурный анализ генов метаболического пути биосинтеза витамина В (тиамина) показал наличие значимых мутации в генах, кодирующих фермент тиазолсинтазу – thiG и thiH, которые инактивированы у штамма Pestoides F делецией 13 п.н.

в позиции 384 – 396 и инсерцией тиминового нуклеотида (+Т) в позиции 552.

Проведенное нами секвенирование фрагментов thiG и thiH у природных штаммов Y. pestis выявило интактную структуру этих генов у штаммов основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов, что коррелировало с их способностью синтезировать витамин В1. В отличие от других подвидов у штаммов кавказского подвида обнаружена инсерция тиминового нуклеотида в 552 позиции гена thiH и делеция 13 п.н. в позиции 384 – 396 гена thiG, что совпадало с отсутствием у них способности синтезировать тиамин.

Таким образом, нами впервые определены генетические основы ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IS100 в ген argA, по фенилаланину – вставкой нуклеотидов в aroG, по тирозину – инсерцией IS100 в aroF, по витамину B1 – делецией в 13 п.н в thiG и инсерцией тиминового нуклеотида в thiH. Такие мутации не встречаются у штаммов Y. pestis других подвидов (основного, алтайского, гиссарского и улегейского) и поэтому могут быть использованы как характерные генетические метки кавказских штаммов.

5. Оценка перспективности использования полученных данных для создания генетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы В результате выполненных исследований нами были установлены генетические основы различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары. Выявленная в ходе выполнения этой работы вариабельность генов napA, ssuА, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH и thiG, наряду с ранее установленной вариабельностью гена glpD [Parhill et al., 2001;

Motin et al., 2002], а также вариабельностью регуляторного гена rhaS рамнозного оперона [Куклева с соавт., 2008] может быть положена в основу генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы на биовары и подвиды. На основе сравнительного анализа последовательностей этих генов нами определены характерные генетические особенности основного (античный, средневековый, восточный биовары) и неосновных подвидов Y. pestis (таблица). Вариабельность нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих дифференциальные биохимические признаки, а также биосинтез различных факторов роста была использована нами для определения эволюционных связей штаммов Y. pestis и построения филогенетических деревьев с помощью компьютерных программ Mega 4.0, PHYLIP, SplitsТree 4 с помощью дистанционно-матричных методов: UPGMA, взвешенных средних квадратов ФитчаМаргулиса, Kitch, Neighbor-Joining.

Таблица. Генетические особенности штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из природных очагов РФ и ближнего зарубежья.

Основной п/в Как следует из рисунка 7, применение выбранных ДНК-мишеней позволяет в полной мере проводить дифференциацию штаммов возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, а также внутривидовое деление штаммов Y. pestis не только на биовары и на основной и неосновные подвиды, но и на отдельные подвиды этого возбудителя.

Анализ филогенетических данных подтверждает высказанное ранее предположение о том, что наиболее древней ветвью эволюции чумного микроба являются штаммы кавказского подвида, обладающего наибольшим генетическим сходством с предшественником – псевдотуберкулезным микробом (рисунок 8).

Другие неосновные подвиды – алтайский, гиссарский и улегейский филогенетически близки друг другу и составляют еще одну древнюю ветвь эволюции Y. pestis.

Полученные нами данные указывают на то, что штаммы microtus, которые недавно китайские исследователи [Zhou et al., 2004] предложили выделить в отдельный биовар, принадлежат к группе штаммов алтайского и гиссарского подвидов и являются их разновидностью.

После отделения от общего ствола кавказского подвида, а затем группы улегейско-алтайско-гиссарского подвидов дальнейшая эволюция вида Y. pestis сопровождалась накоплением мутаций в генах жизнеобеспечения (связанным с усилением паразитизма, патогенности и вирулентности возбудителя) и привела к формированию трех биоваров основного подвида: античного, средневекового и восточного.

Рисунок 7. Дендрограммы (программа Mega 4,0, методы: A - UPGMA и Б -Neighbor Joining) штаммов Y. pestis основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных (кавказского, алтайского, гиссарского, улегейского) подвидов, а также штаммов Y. pseudotuberculosis.

Рисунок 8. Схема внутривидовой эволюции Y. pestis Проведенные в этой работы исследования составляют основу для разработки молекулярной систематики возбудителя чумы, целью которого является создание полной внутривидовой таксономии Y. pestis на основе вариабельности генов дифференциально-значимых микробиологических и биохимических признаков чумного микроба.

ВЫВОДЫ

1. На основании проведенного комплексного анализа биохимических и генетических свойств природных штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы установлено, что штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

2. Причиной отсутствия экспрессии дифференциального биохимического признака – редукции нитратов у штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в природных очагах чумы в России и ближнего зарубежья, является наличие мутации – замены единичного нуклеотида в гене napA периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов – инсерции единичного нуклеотида в гене ssuА периплазматического транспортного белка.

3. Впервые установлены генетические основы различной экспрессии признаков ферментации мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы у штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба. Показано, что отсутствие способности штаммов основного подвида ферментировать дисахарид мелибиозу обусловлено инсерцией IS285 в последовательность структурного гена melB, кодирующего галактозидпермеазу. Установлено, что конститутивный синтез изоцитрат-лиазы, характерный для основного подвида чумного микроба, обусловлен вставкой двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 – 270 гена -репрессора iclR.

4. Причиной арабинозонегативности штаммов Y. pestis алтайского и гиссарского подвидов является мутация в регуляторном гене арабинозного оперона – araC, которая вызвана вставкой единичного гуанинового нуклеотида в 773 позиции этого гена.

5. Впервые определены генетические основы ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IS100 в ген argA, по фенилаланину – вставкой 10 р.н. в aroG, по тирозину – инсерцией IS100 в aro F, по витамину B1 – делецией 13 п.н в thiG и инсерцией тимина в thiH.

6. Определены характерные генотипы основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных подвидов возбудителя чумы, использование которых позволяет проводить внутривидовую дифференциацию Y. pestis. Показана перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Одиноков Г.Н., Кутырев В.В. Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов // Проблемы особо опасных инф. – 2008. – Вып. 3 (97). – С. 38 – 42.

2. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Структурно-функциональный анализ генов nap оперона у Yersinia pestis разных подвидов // Проблемы особо опасных инф. – 2008. – Вып. 4 (98). – С. 12 – 16.

3. Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Генетические особенности неосновных подвидов возбудителя чумы // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников содружества независимых государств. Материалы IХ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. – Волгоград, 2008. – С. 71 – 73.

4. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Краснов Я.М., Гусева Н.М., Кутырев В.В. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов Yersinia pestis различного происхождения // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. – 2009. – №3. – С. 36 – 40.

5. Куклева Л.М., Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов на основе вариабельности генов rhaS и araC // Сборник материалов VI Международной конференции «Молекулярная диагностика и биобезопасность». М., 2009. – С. 124.

6. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Вариабельные локусы генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestis // Проблемы особо опасных инф. – 2010. – Вып. 2 (104). – С. 57 – 59.

7. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А. Генетические особенности биохимической дифференциации штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов // Мат.

науч.- практ. шк.- конф. молодых ученых и специалистов Фед. службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 25 – 27 мая 2010 г., С. 289 – 291.

Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»

410005, г. Саратов, ул. Университетская,

 
Похожие работы:

«УДК 572 БАХОЛДИНА Варвара Юрьевна ИНФОРМАЦИОННАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И СТРУКТУРА ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИЗНАКОВ КРАНИОФАЦИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА 03.00.14 – Антропология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2008 2 Работа выполнена на кафедре антропологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В....»

«ЛЕТУТА Ульяна Григорьевна Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Саратов 2012 1 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет в Научно-образовательном центре биохимической физики наносистем. Научный руководитель : Бердинский Виталий Львович...»

«КУЛИКОВСКИЙ МАКСИМ СЕРГЕЕВИЧ ДИАТОМОВЫЕ ВОДОРОСЛИ НЕКОТОРЫХ СФАГНОВЫХ БОЛОТ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН Научный руководитель доктор биологических наук Генкал Сергей Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор, Трифонова Ирина Сергеевна доктор биологических...»

«СИЛАЧЁВ ДЕНИС НИКОЛАЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ НА МОДЕЛИ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА 03.00.13 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в лаборатории структуры и функции митохондрии НИИ физикохимической биологии им А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова (заведующий – д.б.н., профессор Д.Б.Зоров), на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова (декан –...»

«Волкович Марк Габриэлевич ЖУКИ-ЗЛАТКИ ПОДСЕМЕЙСТВА POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): МОРФОЛОГИЯ, ФИЛОГЕНИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ 03.02.05 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологический институт Российской академии наук Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Медведев Сергей Глебович доктор...»

«ХАЛИЕВА Анна Сергеевна ВЛИЯНИЕ ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ И УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПРОЦЕССЫ РОСТА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ФИТОРЕМЕДИАЦИЮ ИМИ ПОЧВ ОТ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 Работа выполнена в Энгельсском технологическом институте (филиале) ФГБОУ ВПО Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А. на...»

«Калмыкова Ольга Геннадьевна ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ БУРТИНСКОЙ СТЕПИ (ГОСЗАПОВЕДНИК ОРЕНБУРГСКИЙ) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2008 Работа выполнена в лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна Официальные...»

«Астафьева Оксана Витальевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD. И HELICHRYSUM ARENARIUM L. ДЛЯ РАЗРАБОТКИ БИОПРЕПАРАТОВ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ставрополь – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Астраханский...»

«ХОАНГ ТХИ МИНЬ НГУЕТ Исследование процесса получения продуктов белковой и углеводной природы из белого лепестка сои Специальность 03.00.23 – биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2009 г Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева. Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент Красноштанова Алла Альбертовна Официальные оппоненты : доктор...»

«НОВОСЁЛОВ Сергей Владимирович Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительновосстановительного баланса клетки 03.00.04 – биохимия 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино, 2008 1 Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН, Пущино и в Университете Небраски в Линкольне (UNL), Департамент биохимии, Линкольн, Небраска, США Официальные...»

«Виноградова Галина Юрьевна ПОЛИЭМБРИОНИЯ У ALLIUM RAMOSUM L. И ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (СЕМ. ALLIACEAE) 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2009 2 Работа выполнена в Лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии Учреждения Российской академии наук Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Батыгина Т.Б. Официальные...»

«Волкович Марк Габриэлевич ЖУКИ-ЗЛАТКИ ПОДСЕМЕЙСТВА POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): МОРФОЛОГИЯ, ФИЛОГЕНИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ 03.02.05 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург – 2012 2 Работа выполнена в лаборатории систематики насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Зоологический институт Российской академии наук Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор,...»

«Торгашина Ирина Геннадьевна ИССЛЕДОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕСТОВ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск - 2007 Работа выполнена на кафедре биофизики Института естественных и гуманитарных наук ФГОУ ВПО Сибирский федеральный университет Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Кратасюк Валентина Александровна...»

«Силин Юрий Сергеевич ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ, СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ БАЛАНТИДИОЗА СВИНЕЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ 03.02.11– паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Ставрополь – 2011 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, профессор Луцук Светлана Николаевна Официальные оппоненты : доктор ветеринарных...»

«МАЙЕР НИКОЛАЙ КОНСТАНТИНОВИЧ ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПРОРАСТАНИЮ ЗЕРНА НА КОРНЮ У ТРИТИКАЛЕ Специальность: 03.02.07 – генетика, 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии и в научнообразовательном центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного...»

«Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Колупаев Борис Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, ПУЗАТКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА профессор Соколина Флюра Мухаметгалеевна; доктор биологических наук, профессор Дыганова Роза Яхиевна Ведущая организация : Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского ВЛИЯНИЕ...»

«Смирнова Людмила Олеговна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОВСА ПО ФОТОПЕРИОДИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СКОРОСПЕЛОСТИ Специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений, 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Диссертационная работа выполнена в отделе генетических ресурсов овса, ржи, ячменя и отделе физиологии растений Всероссийского...»

«Безжонова Оксана Владимировна Комплексы видов кровососущих комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae) России и ближнего зарубежья Специальности 03.02.05 – энтомология и 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории сравнительной генетики животных Учреждения...»

«РАХИМОВ Ильгизар Ильясович АВИФАУНА СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ ПРИРОДНЫХ ЛАНДШАФТОВ Специальность 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2002 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета Научный консультант : доктор биологических наук, профессор КонстантиновВ.М....»

«САЛАХОВА ГУЛЬНАРА МИРЗАЛИФОВНА ИЗМЕНЕНИЯ ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ РАСТЕНИЙ И РИЗОСФЕРНОЙ МИКРОБИОТЫ В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ И РЕКУЛЬТИВАЦИИ ПОЧВЫ Специальность 03.00.16 - Экология 03.00.12 - Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа - 2007 Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Башкирский...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.