WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Учреждение Российской академии наук

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

На правах рукописи

Новожилова Наталья Михайловна

Метаболизм D-арабинозы: характеристика бифункциональной

арабинокиназы/пирофосфорилазы Leishmania major.

03.01.04 – Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2010 1  

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и Медицинском Центре Университета Кентукки, США.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, Николай Владимирович Бовин

Научный консультант:

профессор биохимии Сальваторе Турко, Медицинский Центр, Департамент Биохимии, Университет Кентукки, США

Официальные оппоненты:

Румш Лев Давыдович, доктор химических наук, заведующий лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН Дружинина Татьяна Николаевна, кандидат биологических наук, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится 27 октября 2010 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу:

117997 ГСП-1, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан сентября 2010 г.

Ученый секретарь специализированного совета   доктор физико-математических наук В.А.Олейников  

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 

Актуальность проблемы. Лейшманиоз – это заболевание, вызываемое паразитическими простейшими рода Leishmania. По данным ВОЗ им заражены 12 млн. людей в мире, 60 000 из которых ежегодно умирают. Против этого заболевания нет вакцин, а методы лечения состоят в жесткой химиотерапии с тяжелыми побочными эффектами. Поэтому разработка новых эффективных лекарств и вакцин для лечения лейшманиоза остается актуальной на сегодняшний день задачей.




На протяжении жизненного цикла Leishmania проходит стадию метациклогенеза, когда проциклические промастиготы Leishmania, прикрепленные к эпителию желудка москита-переносчика, трансформируются в метациклические промастиготы, способные проникать в кровоток млекопитающих. На этой стадии L. major синтезирует липофосфогликан (LPG), боковые цепи которого терминированы D-арабинопиранозой (D-Ara). В результате, галектин на эпителии желудка москита перестает узнавать галактозу в составе боковых цепей LPG, что позволяет Leishmania отделиться от поверхности желудка и мигрировать в кровоток человека (D-Ara отсутствует в клетках млекопитающих). Биосинтетические пути с участием этого моносахарида остаются неизвестными, а их изучение может дать ключ к созданию лекарств против лейшманиоза.  Цели и задачи исследования. Данная работа направлена на изучение биосинтеза D-Ara на стадии активации моносахарида до GDP-D-Ara. Основной целью исследования являлась характеризация двух необычных ферментов из L. major, один из которых оказался арабинокиназой-пирофосфорилазой, т.е.

синтезировал GDP-D-Ara из D-Ara через промежуточный D-арабино-1-фосфат в присутствии АТР и GTP. Одной из задач работы являлась идентификация белка-переносчика, транспортирующего GDP-D-Ara из цитозоля в люмен аппарата Гольджи, где происходит синтез D-Ara-содержащих гликоконъюгатов клеточной поверхности Leishmania. В задачи исследования также входило изучение арабинозилирования фосфогликанов L. major на разных стадиях жизненного цикла этого простейшего организма.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что фермент, способный в L. major синтезировать GDP-D-Ara из D-Ara, является бифункциональным; синтез GDP-D-Ara протекает через промежуточный D-арабино-1-фосфат; измерены кинетические параметры этой реакции и изучено расположение активных доменов в белке. Установлено, что этот фермент отвечает за синтез цитоплазматического GDP-D-Ara, используемого для арабинозилирования LPG клеточной поверхности L. major.

Доказано, что у Leishmania, синтезируемый в цитоплазме GDP-D-Ara транспортируется в аппарат Гольджи белком-переносчиком LPG2. Проведен сравнительный анализ известных на сегодняшний день бифункциональных киназ/пирофосфорилаз из различных организмов. Предложен механизм контроля арабинозилирования фосфогликанов клеточной поверхности на протяжении жизненного цикла L. major. Показано, что паразитический простейший организм L. major способен синтезировать фукозо-содержащие фосфогликаны, предложен механизм биосинтеза GDP-L-Fuc.

Публикации и апробация работы. По тематике диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на международных конференциях:

“Annual Conference of the Society for Glycobiology” (Лос-Анжелес, США, 2006) “Annual Conference of the Society for Glycobiology” (Бостон, США, 2007) “Annual Conference of the Society for Glycobiology” (Даллас, США, 2008) “Annual Conference of the Society for Glycobiology” (Сан-Диего, США, 2009).





XXII Зимняя молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, Россия, 2010) Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 173 ссылки. Диссертация содержит 24 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Идентификация бифункциональной арабинокиназы-пирофосфорилазы в геноме L. major. Донором D-арабинопиранозы (D-Ara) в биосинтезе гликоконъюгатов Leishmania является GDP-D-Ara, но ферменты, осуществляющие его синтез не изучены. Известно, что бактерии (Bacteriodes) и растения (Arabidopsis) могут синтезировать GDP-L-Fuc из L-фукозы (L-Fuc) через промежуточный L-фукозо-1-фосфат с помощью бифункционального фермента L-фукокиназы/GDP-L-фукозопирофосфорилазы (Рисунок 1).

Рисунок 1. Схема синтеза GDP-L-Fuc у Bacteroides fragilis с помощью бифункциональной фукокиназы/пирофосфорилазы FKP.  Т.к. D-Ara и L-Fuc являются структурно родственными моносахаридами, представляется логичным, что биосинтез GDP-D-Ara у Leishmania может протекать по механизмам, схожим с биосинтезом GDP-L-Fuc у других организмов. Чтобы проверить это предположение, геном L.major был изучен на наличие открытых рамок считывания, гомологичных участкам генов фукокиназы и GDP-L-фукозопирофосфорилазы. В результате, на шестнадцатой хромосоме были обнаружены два почти идентичных гена (lmjF16. и lmjF16.0480), обладающие высокой схожестью с генами fkp Bacteroides fragilis (клонированный ранее L. Comstock с коллегами) и at1g01220 Arabidopsis thaliana (клонированный ранее Y. Tsumuraya с коллегами), кодирующими бифункциональные L-фукокиназы/GDP-L-фукозопирофосфорилазы. Открытые Список используемых сокращений: а.к. – аминокислота; D-Ara – D-арабинопираноза;

Ara-1-P – арабинозо-1-фосфат; L-Fuc – L-фукоза; Fuc-1-P – фукозо-1-фосфат;

AKP – арабинокиназа/пирофосфорилаза; FKP – фукокиназа / пирофосфорилаза;

LPG – липофосфогликан; GIPL – гликозилинозитолфосфолипиды.

рамки считывания lmjF16.0440 и lmjF16.0480 соответствуют предполагаемым полипептидам, состоящим из 1187 аминокислот c расчетной молекулярной массой 126.5 кД (Рисунок 2). Единственным различием (три а.к. остатка) между двумя белками является участок 196 – 199, а именно PheGlnAsnHis для LmjF16.0480 и LeuGlnAspTyr для LmjF16.0440. На N-концах этих белков находятся два высококонсервативных участка, один из которых, Val100 – Lys117, обладает высоким сходством с консервативным мотивом пирофосфорилаз, Lys(X)2GlyXThrXMet(X)4Lys, а другой, Asp50 – Gly54, Рисунок 2. Полипептидная последовательность, кодируемая генами lmjF16. и lmjF16.0480. Участок ХХQХ соответствует последовательностям LQDY у lmjF16.0440 и FQNH у lmjF16.0480. GTP-связывающий, пирофосфорилазный и АTP-связывающий (консервативные) мотивы выделены, соответственно, простой, пунктирной и двойной рамками. А.к., выбранные для проведения сайт-направленного мутагенеза (см. ниже) отмечены звездочками.

является одним из трех консервативных GTP-связывающих мотивов AspXXGly. На С-концах также находится консервативный участок Gly950 – Ile958, гомологичный мотиву GlyXGly(X)2Gly(Ser)2Gly, формирующему ATP-связывающий карман у многих киназ. Присутствие этих последовательностей дало основание предполагать наличие киназной и пирофосфорилазной активностей на С- и N-концах белков, соответственно.

Тестирование ферментативной активности белков, кодируемых генами lmjF16.0440 и lmjF16.0480. Для тестирования активности предполагаемых ферментов, гены lmjF16.0440 и lmjF16.0480 были клонированы в плазмидный вектор pET 16b*. Клетки E.coli штамма BL21 (DE3)-RIPL трансформировали полученными плазмидами pET16b-lmjF16.0440(His)6 и pET16b-lmjF16.0480(His)6. После лизиса индуцированных клеток, белки солюбилизировали и иммобилизовали на аффинном сорбенте TALON за счет гистидинового тэга на N-концах.

Иммобилизованные LmjF16.0440 и LmjF16.0480 тестировали на наличие ферментативной активности; реакционная среда содержала АТP, GTP и [3H]D-Ara в качестве субстрата. Тритилированные продукты реакции разделяли и анализировали с помощью анионо-обменной хроматографии.

Так как помимо LmjF16.0440 и LmjF16.0480 с TALON могли неспецифически связаться другие белки, было необходимо контролировать возможную активность посторонних белков. Для этого проводили контрольные реакции, в которых в качестве источника белка добавляли TALON, инкубированный с лизатом клеток E.coli, трансформированных вектором pET 16b без генных вставок.

Результаты тестирования ферментативных активностей рекомбинантных LmjF16.0440 и LmjF16.0480 представлены на рисунке 3. Белок LmjF16. катализировал образование D-Ara-1-фосфата и GDP-D-Ara, в то время как LmjF16.0440 синтезировал только D-Ara-1-фосфат. Когда в реакции присутствовали только неспецифические белки, образования продуктов реакции не наблюдалось. Полученные данные позволяют заключить, что продукт гена lmjF16.0480 действительно действует как бифункциональная *Генно-инженерные работы по клонированию генов были выполнены H. Guo в лаборатории молекулярной микробиологии Вашингтонского Университета.

арабинокиназа-пирофосфорилаза, т.е. данный фермент обладает D-арабинокиназной и GDP-D-Ara-пирофосфорилазной активностями. В то же время, рекомбинантный белок LmjF16.0440 обладает только D-арабинокиназной активностью, а его пирофосфорилазная активность или отсутствует вовсе, или настолько мала, что чувствительность используемого метода не позволяла ее детектировать.

В предыдущих исследованиях* M. Ferguson с коллегами нашли, что в цитоплазме L. major помимо GDP-D-Ara также присутствует GDP-L-Fuc.

Учитывая, что D-арабинопираноза и L-фукоза структурно похожи, LmjF16. и LmjF16.0480 были также протестированы на способность синтезировать GDP-L-Fuc из L-Fuс. Для этого, рекомбинантные белки инкубировали с АТP, GTP и [3H]L-Fuс в качестве субстрата, и продукты реакций анализировали с помощью анионо-обменной хроматографии (Рисунок 4). Как видно из представленных на рисунке 4 хроматограмм, оба фермента обладают бифункциональной активностью по отношению к данному субстрату, т.е. способны синтезировать GDP-[3H]L-Fuc из [3H]L-Fuc.

Таким образом, как LmjF16.0440 так и LmjF16.0480, обладают способностью синтезировать GDP-L-Fuc из ATP, GTP и L-Fuc, но только LmjF16.0480 способен синтезировать GDP-D-Ara из D-Ara. На основании этих данных, ферментам L. major были присвоены следующие имена:

Lmj16.0440 = FucoKinasePyrophosphorylase=FKP40, Lmj16.0480 = ArabinoFucoKinasePyrophosphorylase=AFKP80.

*Turnock D.C. and Ferguson M.A. // Eukaryot Cell. 6:1450-63 (2007).

Рисунок 3. Анализ продуктов ферментативной реакции. Pекомбинантные белки LmjF16.0440 и LmjF16.0480 тестировали на наличие ферментативной активности в реакционной среде, содержащей [3H]D-Ara в качестве субстрата. Продукты реакции анализировали с помощью анионо-обменной хроматографии на ДЕ-52 в градиенте NH4HCO3. В контрольной смеси, содержащей только неспецифические белки, продуктов реакции не наблюдается. При добавлении в реакционную смесь белка LmjF16.0440 образовывался только D-Ara-фосфат, в то время как фермент LmjF16.0480 синтезировал D-Ara-фосфат и GDP-D-Ara.

Рисунок 4. Анализ продуктов ферментативных реакций с участием рекомбинантных белков LmjF16.0440 и LmjF16.0480 L. major. В реакционную среду, содержащую рекомбинантные LmjF16.0440 и LmjF16.0480 добавляли [3H]L-Fuc в качестве субстрата. Образовавшиеся продукты разделяли на анионообменнике ДЕ- в градиенте NH4HCO3. В отличие от контрольной смеси (содержащей только неспецифические белки), где продуктов реакции не наблюдается, оба исследуемых фермента способны синтезировать GDP-L-Fuc.

АТP и GTP необходимы для активности FKP40 и AFKP80. Чтобы подтвердить необходимость АТP для киназной и GTP для пирофосфорилазной активностей FKP40 и AFKP80, ферментативные реакции проводили в присутствии только одного из трифосфатов, результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Зависимость ферментативных реакций, катализируемых рекомбинантными FKP40 и AFKP80 L. major, от наличия ATP и GTP.

В отсутствие как АТP, так и GTP, образования продуктов реакции не наблюдалось (данные не представлены). В присутствии только АТP, реакция шла не полностью, и приводила только к арабинозо-фосфату. Когда в реакционной смеси находился только GTP, образовывались небольшие количества GDP-D-Ara, по-видимому, благодаря тому, что фермент был способен частично утилизировать GTP вместо ATP. Однако, в присутствии только GTP реакция шла медленно и выход продуктов реакций был низким, по сравнению с реакцией в присутствии ATP + GTP.

Таким образом, для протекания полноценной реакции необходимо присутствие в реакционной среде обоих трифосфатов: АTP для киназной и GTP для пирофосфорилазной активности исследуемых бифункциональных ферментов.

Изучение киназных и пирофосфорилазных доменов FKP40 и AFKP методом сайт-направленного мутагенеза. Расположение доменов и активных центров в бифункциональных ферментах L. major было подробно изучено методом сайт-направленного мутагенеза*.

*Сайт-направленный мутагенез был выполнен Т. Notton в лаборатории молекулярной микробиологии Вашингтонского Университета.

В а.к. последовательности FKP40 были выбраны восемь эволюционноконсервативных а.к. остатков и заменены на аланин, фенилаланин или серин.

Полученные мутанты были протестированы на наличие ферментативной активности, результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2. Исследование FKP40 L. major методом сайт-направленного мутагенеза.

Образование GDP-L-Fuc происходило в незначительных количествах (менее 5% от количества GDP-L-Fuc, синтезируемого ферментом дикого типа).

“–” тестирование активности с данным субстратом не проводили.

Четыре мутации на N-конце привели к потере ферментом пирофосфорилазной, а три мутации на C-конце – киназной активностей, что подтверждает предсказанное (см. стр. 4) расположение пирофосфорилазного и киназного доменов на N- и С-концах соответственно. Одна из этих мутаций (замена Ser956 на Аla956) находится в С-концевом участке, гомологичном ATP-связывающему консенсусному мотиву GlyXGly(X)2Gly(Ser)2Gly, поэтому, вероятно, потеря киназной активности происходит из-за неспособности белка связывать ATP. Аналогично, когда Asp50 на N-конце, принимающий участие в формировании GTP-связывающего мотива AspXXGly, был заменен на Ala, белок терял способность синтезировать GDP-Fuc, возможно из-за неспособности связывать GTP.

Интересно, что замена Gly1140, локализованного на С-конце, на серин привела к потере белком пирофосфорилазной активности, не затрагивая при этом киназную. В связи с этим необходимо отметить, что FKP40 и AFKP не обладают классическим мотивом Gly(X)4GlyLys мононуклеотидсвязывающих белков. Вместо этого, на С-концах обоих белков находится глицин-содержащий участок, сильно напоминающий последовательность XhXhGlyXGlyXXGly (Xh – гидрофобная аминокислота), характерную для динуклеотид-связывающих белков. Gly1140 находится именно в этом участке, а его замена на аланин приводит к потере пирофосфорилазной активности.

Полученные данные позволяют предположить, что пирофосфорилазный домен разобщен на уровне полипептидной цепи, и часть С-конца играет роль в образовании GTP-связывающего участка. В таком случае, ферментативноактивная форма белка образуется на уровне третичной структуры, причем пирофосфорилазный домен формируется при участии последовательностей, расположенных на N- и С-концах (Рисунок 5).

Рисунок 5. Предполагаемое расположение киназного и пирофосфорилазного доменов на полипептидной последовательности FKP40. Буквы (см. табл. 2) показывают расположение а.к. остатков, выбранных для сайт-направленного мутагенеза.  Определение кинетических параметров для FKP40 и AFKP80. Для рекомбинантных форм FKP40 и AFKP80 L. major были измерены кинетические параметры, а именно константы Михаэлиса-Ментен (Km) и максимальная скорость реакции (Vmax), см. таблицу 3.

Таблица 3. Кинетические параметры сродства к субстрату рекомбинантных ферментов FKP40 и AFKP80 L. major.

Как киназы, оба фермента ведут себя схожим образом. Обращает на себя внимание необычно большое значение Km = 67 мМ для пирофосфорилазной реакции, катализируемой АFКР80. Такое низкое сродство к арабинозо-фосфату может свидетельствовать о том, что в ферменте каталитические центры расположены близко один к другому, и D-Ara-1-Р из киназного центра сразу попадает в пирофосфорилазный. Поэтому, для того чтобы «внешний»

арабинозо-фосфат достиг пирофосфорилазного активного центра, потребовалось добавление его значительных количеств, что и отразилось на значении Km.

Значения Km для реакции с L-Fuc оказались на два порядка ниже, чем для реакции с D-Ara, что свидетельствует о значительно большем предпочтении обоими ферментами фукозы. Интересно, что на сегодняшний день на клеточной поверхности лейшманий не обнаружено Fuc-содержащих гликоконъюгатов. Однако, из кинетических данных становится очевидно, что L. major обладает эффективным биосинтетическим аппаратом для активации L-Fuc. Можно предположить, что L. major экспрессирует Fuc-содержащие гликолипиды на определенных стадиях жизненного цикла, например, находясь в организме человека. В клетках млекопитающих находится много Fuc-содержащих гликоконъюгатов, поэтому теоретически, Leishmania может получать L-Fuc из окружающей среды и, обладая ферментами для ее активации, включать в гликолипиды клеточной поверхности, что позволило бы паразиту имитировать глико-паттерн хозяйских клеток.

AFKP80 – основной фермент, синтезирующий GDP-[3H]D-Ara в цитозоле Leishmania. Для исследования биологической роли FKP и AFKP80 использовали нокаутные мутанты по гену каждого из ферментов:

L. major fkp40(-) и L. major afkp80(-). (Генно-инженерные работы по нокаутированию генов были выполнены H. Guo в лаборатории молекулярной микробиологии Вашингтонского Университета) Каждый ген был замещен генно-инженерной конструкцией, кодирующей антибиотики, которые использовали в качестве селективных маркеров. Так как Leishmania имеет диплоидный геном, было произведено по два раунда замены каждого гена, чтобы удалить обе аллели генов lmjF16.0440 и lmjF16.0480. В результате были получены гомозиготные нокаутные линии L. major, способные синтезировать только один из двух исследуемых ферментов: FKP40 в случае с afkp80(-), и АFKP80 в случае с fkp40(-).

Чтобы оценить уровень синтеза GDP-D-Ara каждым из ферментов в отдельности, из клеток L. major дикого типа, fkp40(-) и afkp80(-) с помощью ультрацентрифугирования получали цитозольные фракции, добавляли к ним [3H]D-Ara и сравнивали количество GDP-[3H]D-Ara, синтезированного ферментами цитозоля (Рисунок 6).

Рисунок 6. Изучение способности нокаутных мутантов L. major fkp40(-) и afkp80(-) синтезировать GDP-D-Ara. Фракции цитозоля из клеток L. major дикого типа, fkp40(-) и afkp80(-) инкубировали с 3H]D-Ara и оценивали количество GDP-[3H]D-Ara, синтезированного FKP40 или AFKP80.

Количество GDP-[3H]D-Ara, синтезированного в L. major дикого типа и fkp40(-), было практически одинаковым, в то время как в цитозоле аfkp80(-) почти не происходило процесса активации D-Ara. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что AFKP80 является главным ферментом L. major, ответственным за синтез GDP-Ara.

Роль FKP40 и AFKP80 в арабинозилировании боковых цепей липофосфогликана (LPG) L. major. Чтобы проанализировать углеводный состав боковых цепей LPG, образцы LPG L. major fkp40(-) и afkp80(-), меченных [3H]D-Ara, были подвергнуты мягкому кислотному гидролизу и проанализированы с помощью электрофореза (Рисунок 7).

Рисунок 7. Анализ углеводного состава боковых цепей липофосфогликана (LPG) L. major.

(A) Схема получения олигосахаридных фрагментов. Стрелки на схеме указывают на места разрыва связей в результате кислотного гидролиза.

(В) Электрофоретический анализ олигосахаридных фрагментов LPG промастигот L. major дикого типа, afkp80(-) и fkp40(-) на проциклической (про) и метациклической (мета) стадиях. Структуры фрагментов LPG, соответствующие каждой полоске, показаны справа. Фрагменты, имеющие D-Ara, идентифицировали по тритиевой метке (соответствующие им полоски на геле отмечены звездочками). В качестве стандартов мол.веса использовали олигомеры глюкозы длиной от двух до семи остатков.

Как и ожидалось, LPG проциклических промастигот у всех проанализированных линий L. major не имеет D-Ara в боковых цепях. Когда клетки L. major дикого типа переходили в метациклическую стадию, на LPG появлялись боковые цепи, терминированные D-Ara. Точно так же вели себя клетки L. major fkp40(-), лишенные фермента FKP40. В отличие от них, метациклические промастиготы L. major аfkp80(-) не отличались от проциклических промастигот L. major и не синтезировали арабинозосодержащего LPG.

Количество арабинозилированых боковых цепей LPG у метациклических промастигот L. major в отсутствие AFKP80 снижается (см. таблицу 4) почти в пять раз по сравнению с диким типом, а именно с 29% D-Ara-содержащих боковых цепей LPG у дикого типа до 6% у L. major afkp80(-). В отличие от afkp80(-), клетки L. major, лишенные FKP40, синтезировали почти такое же количество Ara-содержащего LPG, как и L. major дикого типа (соответственно 27% и 29% боковых цепей LPG L. major fkp40(-) и дикого типа были терминированы D-Ara).

Таблица 4. Сравнение олигосахаридного состава LPG метациклических промастигот L. major дикого типа, afkp80(-) и fkp40(-). Приведено содержание фрагментов LPG по отношению к суммарному количеству олигосахаридов, полученных в результате кислотного гидролиза LPG.

Ara-Gal-Gal-Gal-Man Из представленных данных следует, что арабинозилирование боковых цепей LPG L. major fkp40(-) на разных стадиях жизненного цикла не отличается от аналогичного процесса у L. major дикого типа. Напротив, промастиготы с генотипом аfkp80(-) и, следовательно, не имеющие фермента AFKP80, практически лишены Ara-содержащих фрагментов боковых цепей LPG даже на метациклической стадии жизненного цикла. Таким образом, AFKP является главным ферментом у L. major, ответственным за активацию D-Ara до GDP-Ara, необходимой для арабинозилирования боковых цепей LPG Leishmania.

Tранспорт GDP-D-Ara в аппарат Гольджи Leishmania. В большинстве случаев, активированные формы углеводов синтезируются в цитоплазме и затем переносятся в люмен аппарата Гольджи, где они утилизируются соответствующими гликозилтрансферазами в реакциях гликозилирования.

Ранее было показано существование в аппарате Гольджи Leishmania мультиспецифичного белка-транспортера LPG2, способного, помимо GDP-Man, переносить также GDP-D-Ara и GDP-L-Fuc.

Чтобы доказать, что LPG2 является единственным транспортером, ответственным за перенос GDP-D-Ara в аппарат Гольджи, клетки L.mаjor дикого типа и нокаутные по гену lpg2 (L.mаjor lpg2(-)) растили в присутствии [3H]D-Ara, после чего измеряли количество [3H]D-Ara, включенной в гликоконъюгаты клеточной поверхности (Рисунок 8).

Рисунок 8. Идентификация белка, ответственного за перенос GDP-D-Ara в аппарат Гольджи. Культуры паразита L.mаjor дикого типа и нокаутного по гену lpg2 (L. mаjor lpg2(-)) были метаболитически мечены [3H]-D-Ara. LPG и GIPL клеточной поверхности меченых клеток были экстрагированы, и измерено количество включенной в каждую фракцию [3H]-D-Ara. Нокаутирование гена lpg2, кодирующего мультиспецифичный белок-транспортер LPG2, предотвращало включение D-Ara в состав фосфогликанов клеточной поверхости L. major.  Из приведенных данных видно, что у клеток L. major, нокаутных по гену lpg2, не происходит включения [3H]D-Ara. Отсутствие D-Ara в LPG L. major lpg2(-) вполне объяснимо, так как потеря LPG2 приводит к прекращению транспорта GDP-Man в аппарат Гольджи, и, соответственно, прекращению синтеза углеводной части молекулы. Таким образом, даже при наличии GDP-Ara, транспортируемой в люмен Гольджи другим белком, у арабинозилтрансфераз нет акцепторных сайтов для переноса D-Ara на LPG. Этого нельзя сказать о гликозилинозитолфосфолипидах (GIPL), гликозилирование которых происходит по другому биосинтетическому пути, а именно с использованием долихол-фосфат-маннозы в качестве донора. Отсутствие D-Ara в составе GIPL L. major lpg2(-) можно объяснить только прекращением транспорта GDP-Ara в аппарат Гольджи в клетках, лишенных гена lpg2. Таким образом, синтезируемый в цитоплазме GDP-D-Ara транспортируется в люмен аппарата Гольджи мультифункциональным белком-переносчиком LPG2.

Контроль арабинозилирования липофосфогликана проциклических и метациклических промастигот. У метациклических промастигот L. major количество арабинозилированого LPG в несколько десятков раз больше, чем у проциклических. Очевидно, что паразиту необходимо контролировать процесс арабинозилирования на протяжении своего жизненного цикла.

В нашей работе мы попытались ответить на вопрос: как Leishmania осуществляет этот контроль и что является “пусковым механизмом” для резкого увеличения арабинозилирования LPG на метациклической стадии.

Известно, что GDP-D-Ara синтезируется в цитозоле бифункциональным ферментом AFKP80, после чего переносится белком-транспортером LPG в аппарат Гольджи. В люмене аппарата Гольджи две D-Ara-трансферазы SCA и SCА2 переносят D-Ara от GDP-D-Ara на боковые цепи LPG.

Предположительно, любая из этих стадий может служить регулятором процесса арабинозилирования, однако, существующие данные* показывают, что это не так. Уровень активности ферментов SCA1, SCA2, а также AFKP80, измеренный у клеток Leishmania в проциклической стадии был таким же или даже более высоким, чем у клеток в метациклической стадии. Также, проциклические промастиготы L. donovani имели больше мРНК LPG2, чем метациклические. В клеточных линиях L. major, несущих дополнительные плазмиды с генами LPG2, AFKP80 и SCA1/2 и позволяющих им активно экспрессировать эти белки, не обнаруживалось повышенного количества D-Ara-содержащего LPG**. Все вместе эти данные позволяют заключить, что стадии синтеза GDP-D-Ara, транспорта GDP-D-Ara в аппарат Гольджи и переноса D-Ara на боковые цепи LPG не являются регуляторами процесса арабинозилирования. Единственной неизученной стадией остается синтез самой D-Ara. Хорошо известно, что Leishmania способна синтезировать D-Ara из D-Glc, отщепляя от Glc C1-фрагмент, однако ферменты, участвующие в этом процессе, не изучены. Также паразит способен поглощать D-Ara из окружающей среды. Учитывая этот факт, мы попытались понять, как количество D-Ara в цитозоле клеток Leishmania влияет на арабинозилирование LPG.

*Dobson D.E. et al. // J Biol Chem. 278:15523-31 (2003); Ma D. et al // J Biol Chem. 272:3799Descoteaux A. // Science. 269:1869-1872 (1995).

** Guo H., неопубликованные данные.

Для этого, культуры проциклических промастигот L. major растили в присутствии D-Ara, концентрация которой варьировалась от 0.005 мМ до 0.5 мМ. Из клеток выделяли LPG и анализировали его моносахаридный состав (Рисунок 9). В норме (когда концентрация D-Ara равна нулю) проциклические промастиготы L. major не арабинозилируют LPG. Однако, когда в среде и, соответственно в клетке, появлялась свободная D-Ara, даже в небольшой концентрации 0.005 мМ, в составе LPG появлялась арабиноза, т.е. проциклические промастиготы вели себя как метациклические.

Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что наличие D-Ara в цитоплазме запускает каскад реакций, ведущих к арабинозилированию LPG.

Окончательный ответ на вопрос, как осуществляется контроль арабинозилирования LPG, может быть получен после изучения ферментов, синтезирующих D-Ara, однако представленные данные говорят о том, что стадия синтеза D-Ara контролирует стадию синтеза Ara-содержащего LPG.

Рисунок 9. Зависимость арабинозилирования боковых цепей липофосфогликана L. major от количества D-Ara в окружающей среде. LPG выделяли из проциклических промастигот L. major, выращенных в питательной среде с разным содержанием D-Ara (от 0 до 0.5 мМ), гидролизовали 2 N ТФУ и полученные моносахариды разделяли с помощью ВЭЖХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные в рамках диссертационной работы исследования позволили охарактеризовать биосинтез D-Ara у паразитического простейшего Leishmania major на этапе синтеза GDP-D-Ara – донора для реакций гликозилирования.

Это расширяет знания о биосинтезе редко встречающихся в природе гликоконъюгатов – производных D-арабинопиранозы, а также, о структуре и особенностях работы бифункциональных киназ-пирофосфорилаз, что может быть использовано при дальнейшем изучении этого семейства ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Ген lmjF16.0480 паразитического простейшего L. major кодирует бифункциональную арабинокиназу/пирофосфорилазу, способную активировать D-Ara до GDP-D-Ara через промежуточный Ara-1-P в присутствии одновременно ATP и GTP. Продукт другого гена, lmjF16.0440, лишен пирофосфорилазной активности, но способен синтезировать Ara-1-P.

2. Ферменты, кодируемые генами lmjF16.0480 и lmjF16.0440, названные AFKP80 и FKP40, кроме D-Ara могут использовать в качестве субстрата L-Fuc, а именно, синтезировать GDP-L-Fuc в присутствии одновременно ATP и GTP.

3. Киназный домен обоих ферментов L. major расположен на С-конце, а пирофосфорилазный домен формируется при участии последовательностей, расположенных как на N-, так и на С-конце.

4. Белок AFKP80 является главным ферментом L. major, синтезирующим GDP-D-Ara.

5. GDP-D-Ara транспортируется из цитоплазмы в люмен аппарата Гольджи белком-переносчиком LPG2.

6. Синтез свободной D-Ara в цитоплазме запускает и регулирует каскад биосинтетических реакций, ведущих к арабинозилированию боковых цепей липофосфогликана Leishmania.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи Новожилова Н. М., Бовин Н. В. Метаболизм D-арабинозы: характеристика бифункциональной арабинокиназы/пирофосфорилазы Leishmania major.

Acta Naturae (2009) 2: 6-8.

Новожилова Н. М., Бовин Н. В. Структура, функции и биосинтез гликоконъюгатов клеточной поверхности Leishmania spp. Биохимия (2010) 75 (6): 770- Тезисы докладов на конференциях 1. Novozhilova N.M, Bovin N.V, Beverley S.M, Turco SJ. Characterization of D-Arabinopyranose-containing Glycosylinositolphospholipids from Leishmania major. “Annual Conference of the Society for Glycobiology”,

Abstract

221, Лос-Анжелес, США, 2. Novozhilova N.M, Capul A.A, Beverley S.M, Turco SJ. Incorporation of D-Arabinopyranose into Leishmania major Glycoconjugates Requires Golgi Nucleotide-sugar Transport Activity.“Annual Conference of the Society for Glycobiology”, Abstract 123, Бостон, США, 3. Novozhilova N.M, Guo H, Beverley S.M, Turco SJ. Characterization of a Bi-functional Enzymes from Leishmania major involved in Activation of GDP- D-Arabinopyranose. “Annual Conference of the Society for Glycobiology”, Abstract 264, Даллас, США, 4. Guo H, Novozhilova N.M, Bandini G, Notton T, Turco S.J, Ferguson M.A, Beverley S.M. A requirement for GDP-Fucose in Leishmania inferred by rescue of D-arabinopyranose/L-fucose salvage mutants (afkp80-/fkp80-) by expression of GDP-L-Fuc de novo pathway enzymes from T. brucei. “Annual Conference of the Society for Glycobiology” Сан-Диего, США, 2009.

5. Новожилова Н.М., Гуо Х., Турко С., Бовин Н.В. Бифункциональная арабинокиназа/пирофосфорилаза Leishmania major: строение, субстратная специфичность и функции. “XXII Зимняя молодежная научная школа” Москва, Россия, Автор выражает свою признательность д-ру Х. Гуо (Dr. Hongjie Guo, University of Washington, USA) за помощь в идентификации и клонировании генов Leishmania и получении гомозиготных нокаутных линий L. major fkp40(-) и L. major fkp80(-); Т. Ноттон (Timothy Notton, University of Washington, USA) за помощь в проведении сайт-направленного мутагенеза гена lmjF16.0440 и проф. С. Турко (Pr. S. Turco, University of Kentucky, USA) за предоставленную возможность выполнения части экспериментальной работы в его лаборатории.



 
Похожие работы:

«Николаев Юрий Александрович АУТОРЕГУЛЯЦИЯ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ Специальность 03.02.03 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан Официальные оппоненты : Доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский Доктор...»

«Безина Ольга Вячеславовна Экологические особенности распределения наземных моллюсков в разнотипных биоценозах лесостепи Правобережного Поволжья 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов - 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского на кафедре зоологии и экологии Научный...»

«АБДЕЕВА Анна Рамильевна ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ АКВАПОРИНОВ В РАСТЕНИЯХ Mesembryanthemum crystallinum L. В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА И ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕДИ И ЦИНКА 03.00.12 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН Научный руководитель : кандидат...»

«АХМЕТОВ ИЛЬДУС ИЛЬЯСОВИЧ АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ-РЕГУЛЯТОРОВ С ФИЗИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ, АДАПТАЦИЕЙ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ К ФИЗИЧЕСКИМ НАГРУЗКАМ И ТИПОМ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН ЧЕЛОВЕКА 14.00.51 - Восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия 03.00.15 - Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2006 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении...»

«Иванов Алексей Викторович СРАВНИТЕЛЬНОЕ ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА, УЧАСТВУЮЩИХ В ОБЕСПЕЧЕНИИ ДВИГАТЕЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ. специальность 03.01.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Федерального государственного бюджетного учреждение науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук. Научный руководитель : доктор биологических наук...»

«Ломин Сергей Николаевич ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЦИТОКИНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ 03.00.12-физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2008 Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. академика М.Х. Чайлахяна Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор Романов Георгий Александрович...»

«ЛЕТУТА Ульяна Григорьевна Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Саратов 2012 1 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет в Научно-образовательном центре биохимической физики наносистем. Научный руководитель : Бердинский Виталий Львович...»

«Васильева Галина Валериевна СЕМЕННАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ И РОСТ ПОТОМСТВА ЕСТЕСТВЕННЫХ ГИБРИДОВ МЕЖДУ КЕДРОМ СИБИРСКИМ (PINUS SIBIRICA DU TOUR) И КЕДРОВЫМ СТЛАНИКОМ (P. PUMILA (PALL.) REGEL) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте мониторинга климатических и экологических систем Сибирского отделения РАН, г. Томск Научный руководитель : кандидат...»

«МАРТИРОСОВА Елена Игоревна ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В СТАБИЛИЗАЦИИ И МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ БЕЛКОВ 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 2 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева совместно с Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН доктор биологических наук, профессор Научный руководитель :...»

«Семенова Ольга Владимировна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА НАСЕЛЕНИЯ ЖУЖЕЛИЦ ПАРКОВОЙ ЗОНЫ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА НА ПРИМЕРЕ НИЖНЕГО ТАГИЛА 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург - 2008 2 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской Академии Наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Ольшванг Владимир Николаевич Официальные оппоненты : доктор...»

«Байгужина Ольга Вадимовна Особенности адаптивных реакций вегетативной нервной системы и нейродинамических процессов организма студенток 19-20 лет в зависимости от типа ментальной нагрузки 03.00.13 – Физиология 19.00.02 – Психофизиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск, 2008 Диссертация выполнена на кафедре биологии человека и медикобиологической подготовки ГОУ ВПО Челябинский государственный педагогический...»

«Высоцкая Ольга Владимировна ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ мРНК СУРВИВИНА, МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-7 И ЦИКЛООКСИГЕНАЗЫ-2 ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в ГУЗ Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Глухов Александр Иванович...»

«ДОРОФЕЕВА Мария Михайловна Эмбриологические особенности строения и развития семязачатков и зародышевых мешков некоторых видов рода Iris L. подрода Limniris (Tausch) Spach 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2013 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики растений ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент...»

«ШАХ МАХМУД РАИХАН ВЛИЯНИЕ 2-(ПАРА-АМИНОБЕНЗОЛСУЛЬФАМИДО)-ТИАЗОЛА НА РОСТ КУЛЬТУРЫ SERRATIA MARCESCENS W1050 И БИОСИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ И В ОТСУТСТВИE ПУРИНОВ 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2010 Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета Научный руководитель : доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Филимонова Мария...»

«ДОЛМАТОВ Владимир Юрьевич ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ЧЕЛОВЕКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 03.00.23 – биотехнология 14.00.29 – гематология и переливание крови Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Киров - 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по...»

«Сибиркина Альфира Равильевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В СОСНОВЫХ БОРАХ СЕМИПАЛАТИНСКОГО ПРИИРТЫШЬЯ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант : доктор биологических наук, профессор М.С. Панин Омск, 2014 2 Работа выполнена на кафедре общей экологии Челябинского государственного университета Барановская Наталья Владимировна, Официальные доктор биологических наук, профессор...»

«МУЛЛАГУЛОВА ЭЛЬВИРА РАФИКОВНА ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА И ПРИНЦИПЫ ОХРАНЫ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА КАЗАЦКОГО (JUNIPERUS SABINA L.) НА ЮЖНОМ УРАЛЕ Специальность 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2009 2 Работа выполнена в Сибайском филиале Академии наук Республики Башкортостан доктор биологических наук Научный руководитель : Редькина Нина Николаевна доктор биологических наук Официальные оппоненты : Путенихин Валерий...»

«НЕВОСТРУЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПРИДАТКОВ МАТКИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ И КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГРЯЗЕВОГО ЭКСТРАКТА (экспериментально-клиническое исследование) 14.00.01 – акушерство и гинекология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Томск 2004 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального...»

«Арефьев Станислав Павлович СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ БИОТЫ ДЕРЕВОРАЗРУШАЮЩИХ ГРИБОВ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Тюмень – 2006 Работа выполнена в Институте проблем освоение Севера СО РАН Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Седельникова Нелли Васильевна доктор сельскохозяйственных наук, профессор Залесов Сергей Вениаминович доктор географических наук, профессор Калинин Владимир Матвеевич...»

«ЧЕРНИКОВА Анна Александровна НАКОПЛЕНИЕ МЕДИ И МАРГАНЦА В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИИ SPIRULINA PLATENSIS 03.00.12 – Физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва -2009 Работа выполнена в Лаборатории управляемого фотобиосинтеза Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор Пронина Наталия...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.