WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ НИКИТА НИКОЛАЕВИЧ

Структура кровой части репликазы фага Q

03.01.03 – Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук Четверин Александр Борисович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич доктор биологических наук Северинов Константин Викторович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «_»_2011 года в часов на заседании совета Д.501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.

Белозерского, ауд.536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Q-репликаза является РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага Q, паразитирующего на клетках Escherichia coli. Q-репликаза является гетеротетрамерным белковым комплексом, состоящим из каталитической субъединицы, кодируемой геномом фага, и трех белков E. coli – рибосомного белка S1 и факторов элонгации трансляции EF-Tu и EF-Ts. Такой комплекс способен экспоненциально размножать геномную РНК бактериофага длиной 4200 нт и относительно короткие RQ РНК (от Replicable by Q-replicase), образующиеся путем случайных рекомбинаций РНК и присутствующие как в зараженных клетках, так и фаговых частицах. До настоящего времени Q-репликаза остается наиболее эффективной РНК-зависимой РНК-полимеразой, способной к экспоненциальному размножению РНК in vitro.




По отношению к РНК-матрицам Q-репликаза проявляет высокую специфичность, что позволяет ей избирательно размножать геномную РНК при заражении клеток E. coli Механизм узнавания РНК-матриц Q-репликазой до сих пор остается не известным, что ограничивает применение Q-репликазы для размножения заданных молекул РНК in vitro. Для узнавания матриц Q-репликаза не использует каких-либо праймеров или промоторных элементов, а последовательности реплицируемых молекул РНК не гомологичны, за исключением 5'-концевого олиго(G) и 3'-концевого олиго(C) кластеров. Однако из 1012 случайных последовательностей длиной 50-77 нт, содержащих 5'-GGG… и …CCC-3’ участки, с помощью процедуры SELEX удалось отобрать лишь единичные молекулы РНК, способные к размножению Q-репликазой. Отсюда следует, что высокая специфичность узнавания обусловлена вторичной и третичной структурой РНК.

Выявить важные для узнавания элементы структуры РНК можно было бы с помощью рентгеноструктурного анализа комплексов репликазы с РНК-матрицами, однако до сих пор не удавалось получить кристаллы ни таких комплексов, ни свободной Qрепликазы.

В настоящей работе впервые получены кристаллы и определена пространственная структура коровой части (комплекса -субъединицы с факторами EF-Tu и EF-Ts), способной к выполнению основных каталитических функций Q-репликазы. Это помогает выяснить, как взаимодействуют вирусная и клеточные субъединицы при образовании репликазного комплекса, ответить на вопросы о роли хозяйских белков в составе вирусной репликазы, и, что наиболее интересно, выяснить механизм узнавания РНК-матриц Q-репликазой.

Цели и задачи Целью данной работы явилось получение кристаллов Q-репликазы и определение ее трехмерной структуры. Для этого были решены следующие задачи. Чтобы повысить вероятность образования кристаллов репликазы, мы применили следующие способы увеличения жесткости ее молекулы. Во-первых, удалили белок S1, который не имеет компактной глобулярной структуры. Оставшаяся (коровая) часть репликазы способна выполнять все основные функции, включая специфическое узнавание реплицирующихся РНК и их экспоненциальное размножение. Во-вторых, попытались заменить факторы элонгации E. coli (Eco EF-Tu и Eco EF-Ts) на их более стабильные аналоги из термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tth EF-Tu и Tth EF-Ts) и найти способ получения химерной репликазы в количествах, достаточных для проведения экспериментов по кристаллизации. Втретьих, использовали для кристаллизации «слитую» Q-репликазу, в которой субъединицы объединены в единый полипептид. Полученные варианты репликазы были проверены на способность образовывать кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, и на способность выполнять функции, характерные для репликазы дикого типа. Наконец, полученные кристаллы использовали для определения пространственной структуры Q-репликазы.

Вклад автора Работа по кристаллизации и определению структуры Q-репликазы была выполнена большим международным коллективом авторов из трех научных учреждений:

Института белка РАН (Пущино, Россия), Института генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция) и Университета города Орхуса (Дания).





Автор диссертации разработал способ полного удаления белка S1 из молекулы Qрепликазы без ее денатурации и способ получения в нативных условиях и в препаративных количествах химерных молекул, содержащих фактор элонгации Tth EF-Ts; выполнил эксперименты по кристаллизации химерной репликазы и участвовал в экспериментах по выделению и кристаллизации слитой репликазы; исследовал функциональные свойства химерной и слитой репликаз; участвовал в анализе и интерпретации рентгеноструктурных данных.

Научная новизна и практическая значимость Несмотря на значительное число известных структур вирусных РНК-зависимых РНКполимераз, структурных исследований Q-репликазы или репликаз родственных вирусов до настоящего времени не проводилось. В данной работе не только впервые установлена пространственная структура нового типа РНК-зависимых РНКполимераз, но и впервые определена структура вирусной репликазы в комплексе с клеточными белками. Полученные результаты могут быть использованы для изучения структурной организации РНК-репликаз вирусов эукариот, многие из которых, подобно Q-репликазе, существуют в клетках в виде комплексов с хозяйскими белками, участвующими в трансляции.

Получение кристаллов и определение структуры Q-репликазы открывает путь к детальному изучению отдельных стадий репликационного цикла, а также создает базис для исследований механизма специфического узнавания Q-репликазой ее матриц. Это, в свою очередь, сделает возможным конструирование молекул РНК, обладающих заданной нуклеотидной последовательностью и способных к эффективному размножению Q-репликазой, что может найти применение в разнообразных прикладных задачах, связанных с использованием РНК.

Апробация работы и научные публикации Работа прошла апробацию на открытом семинаре лаборатории биохимии вирусных опубликованных в рецензируемых научных журналах, и представлены на 1 научной конференции.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного описанию свойств и строения Q-репликазы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 135 листах машинописного текста и содержит 37 рисунков.

Библиография включает 218 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и свойства химерной Q-репликазы, содержащей фактор элонгации Отсутствие данных о структуре Q-репликазы связано с трудностью получения ее кристаллов. Наиболее вероятной причиной неудач может быть наличие в составе репликазного комплекса рибосомного белка S1, для которого было показано отсутствие компактной глобулярной структуры и подвижность отдельных его частей относительно друг друга. Это характерно для белка S1 как в свободном состоянии, так и в составе Q-репликазы и 30S субчастиц рибосом (Chu and Cantor, 1979. Nucleic Acids Res. 6, 2363-2379; Moore and Laughrea, 1979. Nucleic Acids Res. 6, 2355-2361;

Labischinski and Subramanian, 1979. Eur. J. Biochem. 95, 359-366; Chu et al., 1982.

FEBS Lett. 145, 203-207). Поэтому первой задачей была разработка эффективного представленной факторами элонгации EF-Tu, EF-Ts и -субъединицей. Известно, что коровая часть репликазы сохраняет ферментативную активность, а потому определение ее структуры могло бы дать ответы на многие вопросы, связанные с функционированием репликазы. Подробно способ удаления белка S1 в нативных условиях будет изложен ниже. Однако оказалось, что коровая часть репликазы дикого типа также не способна образовывать кристаллы. Поэтому мы попытались заменить мезофильные факторы элонгации Escherichia coli на их более стабильные аналоги из термофильной бактерии Thermus thermophilus, надеясь, что это повысит стабильность и жесткость структуры репликазного комплекса, и повысит вероятность его кристаллизации.

Можно ли заменить факторы элонгации в составе Q-репликазы на их термофильные аналоги?

Из литературных данных известно, что с помощью ренатурации денатурированной в мочевине Q-репликазы можно получить химерные молекулы, если на стадии ренатурации добавить факторы элонгации из других бактерий. Сообщалось, что таким способом удалось получить химерные репликазы, содержащие EF-Tu и EF-Ts из Caulobacter crescentus, а также EF-Ts из Bacillus stearothermophilus (Stringfellow et Рис. 1. Обмен фактора элонгации Eco EF-Ts в составе Q-репликазы на Tth EF-Ts.

Коровую часть Q-репликазы (дорожка 1) смешивали с 10-кратным молярным избытком Tth His6-EF-Ts (дорожка 4), после чего проводили 30-минутную инкубацию при указанной температуре и затем хроматографию на заряженной Ni2+ сефарозе (GE Healthcare). С помощью денатурирующего электрофореза в 10% ПААГ сравнивали белковый состав образцов до хроматографии (О), проскока (белка, не адсорбированного колонкой, П) и элюата (Э), полученного при промывке колонки буфером с 200 мМ имидазолом. Гель окрашен серебром.

al. 1980. J. Bacteriol. 143, 389-395; Stringfellow and Blumenthal, 1983. J. Bacteriol. 153, 1083-1087). Мы попытались получить репликазный комплекс, содержащий факторы элонгации из T. thermophilus. Tth EF-Tu и Tth EF-Ts не только обладают высокой термостабильностью, но и образуют между собой прочный комплекс, разрушающийся лишь в присутствии солей гуанидина (Arai et al. 1978. Eur. J. Biochem. 92, 509-519).

Так как обмен субъединиц посредством денатурации репликазы дает низкий выход химерного комплекса и может приводить к химической модификации белков продуктами распада мочевины, мы проверили возможность обмена факторов элонгации на термофильные в нативных условиях.

С этой целью мы смешивали коровую часть Q-репликазы дикого типа с 10-кратным молярным избытком термофильных факторов, модифицированных на N-конце гексагистидтином (His6-EF-Tu или His6-EF-Ts). После 30-минутной инкубации при разных температурах, His6-модифицированные белки выделяли с помощью металлхелатной хроматографии и сравнивали белковый состав элюатов (рис. 1). Видно, что вместе с Tth His6-EF-Ts выделяется -субъединица и Eco EF-Tu, а вытесненный из репликазы Eco EF-Ts E. coli оказывается в проскоке. Отсюда следует, что фактор элонгации EF-Ts E. coli в составе Q-репликазы действительно может быть заменен на его аналог из T. thermophilus. При этом выход химерного комплекса увеличивается с повышением температуры инкубации перед хроматографией от 0 до 30С. В Рис. 2. Образование химерной репликазы in vivo.

Проводили индукцию синтеза в E. coli только -субъединицы или одновременно субъединицы и фактора элонгации Tth EF-Ts, после чего сравнивали суммарный белковый состав клеток (С), а также белков в растворимой фракции клеточного лизата (Р) с помощью денатурирующего электрофореза в 10% ПААГ. Единица активности репликазы соответствует включению 1 нмоль [3H]GMP в течение 10 минут при 30С в кислотонерастворимую фракцию при использовании поли(C) в качестве матрицы.

отличие от EF-Ts, обмена фактора EF-Tu на его термофильный аналог не происходило. Поэтому в дальнейшем работали с химерной репликазой, содержащей Tth EF-Ts.

Несмотря на простоту способа получения химерного комплекса с помощью обмена субъединиц, он не подходит для использования в препаративном масштабе из-за малого выхода продукта обмена и требует предварительного получения значительных количеств как репликазы, так и фактора элонгации Tth EF-Ts. Более продуктивным оказалось получение химерной репликазы in vivo.

Оказалось, что химерную репликазу можно получить в клетках E. coli при использовании двухплазмидной системы экспрессии, которая позволяет одновременно индуцировать синтез как каталитической () субъединицы репликазы, так и фактора элонгации Tth EF-Ts. Выяснилось, что одновременная индукция Tth EFTs повышает растворимость -субъединицы (бльшая ее часть остается в растворе после осветления) и удельную активность Q-репликазы в лизатах клеток (рис. 2).

Эти данные подтверждают факт образования химерного комплекса in vivo.

Заменить фактор элонгации EF-Tu на термофильный аналог с помощью коэкспрессии в клетках не удалось, что согласуется с результатами экспериментов in vitro.

Выделение химерной Q-репликазы На этом этапе задачей стояло не только получение гомогенного препарата химерной репликазы, пригодного для кристаллизационных экспериментов, но и поиск эффективного способа отделения белка S1 от коровой части репликазы.

Для получения химерной репликазы в очищенном виде мы разработали процедуру на основе метода, описанного Муди и коллегами (Moody et al., 1994. Biochemistry 33, 13836-13847). После разрушения клеток с помощью ультразвука нуклеиновые кислоты удаляли с помощью осаждения полиэтиленимином. Затем проводили анионообменную хроматографию на Q Sepharose (GE Healthcare). Полученный препарат репликазы представлял собой смесь молекул, содержащих белок S (холофермент) и не содержащих его (кор).

Чтобы разделить холофермент и кор, мы ввели гидрофобную хроматографию.

Наилучшие результаты были получены при использовании Butyl Sepharose (GE Healthcare): на такой колонке можно выделить коровую часть репликазы, полностью лишенную белка S1. Ранее коровую часть репликазы получали лишь в виде плечевых фракций при анионообменной хроматографии и гель-фильтрации, при этом ее выход составлял не более 20% от всего препарата репликазы (Kamen et al., 1972. Eur. J.

Biochem. 31, 44-51). Другой метод удаления S1 включал обработку репликазы мочевиной (Hill and Blumenthal, 1983. Nature 301, 350-352), что создавало риск ее частичной денатурации и химической модификации.

На заключительной стадии проводили анионообменную хроматографию на колонке высокого разрешения (Resource Q, GE Healthcare). Разработанная процедура позволяет получать химерную Q-репликазу в почти гомогенном состоянии с выходом 8-10 мг очищенного белка из культуры клеток E. coli объемом 1 л, что в 4- раз больше в сравнении с известными ранее методами.

Субъединичный состав химерной Q-репликазы Как и ожидалось, препараты химерной репликазы содержали четыре субъединицы в случае холофермента и три в случае кор-фермента (рис. 3А). Однако по сравнению с Рис. 3. Препараты химерной репликазы. Результаты денатурирующего электрофореза в 10% ПААГ (А), денситограммы того же геля (Б) и гель-фильтрации (В) препаратов репликазы дикого типа (1 и 2) и химерной репликазы (3 и 4). М – маркеры молекулярной массы (кДа); гель окрашен кумасси R-250. Денситограммы получали с помощью программы ImageJ 1.44. Гель-фильтрацию проводили на колонке 130 см Superdex 200.

Нумерация образцов на электрофореграмме и денситограмме совпадает с нумерацией образцов на хроматограмме.

репликазой дикого типа, в препарате химерной репликазы интенсивность окрашивания полос факторов элонгации выше (денситограмма на рис. 3Б), что говорит об их избыточном количестве. Избыточные факторы элонгации являются не примесью, а входят в состав комплекса химерной репликазы, что приводит к увеличению ее размера по сравнению с репликазой дикого типа (рис. 3В), несмотря на меньшую массу Tth EF-Ts по сравнению с Eco EF-Ts (22,4 и 30,4 кДа, соответственно).

Избыток факторов Eco EF-Tu и Tth EF-Ts можно объяснить способностью фактора Tth EF-Ts образовывать димер (Blank et al. 1996. Eur. J. Biochem. 236, 222-227), который может связывать две молекулы EF-Tu из E. coli (Arai et al. 1978. Eur. J. Biochem. 92, 521-531). Представленные данные говорят о том, что димерный комплекс факторов Eco EF-Tu и Tth EF-Ts сохраняется в составе репликазы.

Рис. 4. Активность химерной Q-репликазы в сравнении с репликазой дикого типа.

(А) Синтез поли(G) на поли(С) в присутствии 3,5 пмоль репликазы. (Б) Размножение 16,6 фмоль (1010 молекул) RQ135 РНК в присутствии 3,5 пмоль репликазы и [-32P] UTP.

Количество полноразмерного продукта определяли с помощью электрофореза в ПААГ и последующей радиоавтографии. (В) Падение активности в поли(С)-зависимой реакции после 10-минутной предынкубации при указанной температуре в отсутствие лигандов. (Г) Количество продукта репликации RQ135 РНК в присутствии холофермента в течение 10 минут при указанных температурах.

Ферментативная активность химерной Q-репликазы В реакции синтеза поли(G) на поли(C)-матрице химерная Q-репликаза, как и репликаза дикого типа, проявляла активность независимо от наличия рибосомного белка S1 в составе комплекса (рис. 4А). Хотя химерная репликаза обладала при 30°С несколько меньшей удельной активностью в поли(С)-зависимой реакции по сравнению с репликазой дикого типа (рис. 4А), она столь же эффективно размножала специфическую матрицу (RQ135 РНК) (рис. 4Б). В отсутствие белка S1 репликаза размножает RQ135 РНК автокаталитически, что сопровождается примерно 200кратным увеличением количества РНК за время реакции, однако среднее время репликационного цикла примерно в 10 раз больше, чем при использовании холофермента (рис. 4Б). Этот результат оказался неожиданным, так как ранее считалось, что белок S1 нужен лишь для инициации синтеза (–)-цепи на геномной РНК бактериофага, и не нужен для репликации RQ РНК (Carmichael et al. 1976. J. Biol.

Chem. 251, 2744-2748).

Замена Eco EF-Ts на Tth EF-Ts приводит к существенному повышению термостабильности репликазы. Температура полуинактивации химерной репликазы в отсутствие лигандов примерно на 10°С выше, чем репликазы дикого типа (приблизительно 40 и 30С, соответственно: рис. 4В). Термостабильность обоих вариантов повышается в условиях реакции репликации, но и в этом случае химерная репликаза стабильнее: ее температурный оптимум на 10°С выше, чем репликазы дикого типа: 40 и 30°С, соответственно (рис. 4Г). Бльшая термостабильность химерной репликазы позволяет более чем вдвое увеличить выход продукта реакции относительно репликазы дикого типа (рис. 4Г), что может найти применение в приложениях, связанных с синтезом РНК in vitro.

Таким образом, замена только одной субъединицы (EF-Ts) на аналог из термофильной бактерии приводит к стабилизации всего репликазного комплекса.

Наличие дополнительных копий EF-Ts и EF-Tu в составе химерной репликазы не мешает ей реплицировать РНК; следовательно, их расположение не перекрывается ни с участками связывания РНК, ни с каталитическим центром.

Кристаллизация химерной Q-репликазы Эксперименты по кристаллизации химерной репликазы автор проводил в группе М.М. Юсупова в Институте генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция). Непосредственно перед кристаллизацией проводили гельфильтрацию репликазы на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) и последующее концентрирование белка до 5 мг/мл. В качестве образцов для поиска условий кристаллизации использовали как химерную репликазу, так и репликазу дикого типа в виде холоферментов и кор-ферментов. Для первичного скрининга использовали коммерческие наборы фирм Qiagen и Hampton Research. Кристаллизацию проводили методом диффузии паров. Для приготовления сидячих капель использовали робот Cartesian Honeybee 8+1 (Harvard Bioscience), затем проводили инкубацию при температурах 4°С и 24°С. Среди порядка 1000 протестированных вариантов были получены кристаллы только коровой части химерной репликазы, при использовании Рис. 5. Кристаллы коровой части химерной Q-репликазы.

Кристаллизацию проводили методом диффузии паров в сидячей капле. Капли готовили смешиванием равных объемов (по 2 мкл) 5 мг/мл репликазы и резервуарного раствора, содержащего 0,1 М Трис-HCl pH 7,5 и 0,7-1,2 М малонат натрия. Кристаллы появлялись в течение первых суток инкубации при 24°С и достигали максимального размера в течение недели.

солей органических кислот в качестве осадителей и температуре инкубации 24°С.

Дальнейшая оптимизация условий позволила воспроизводимо получать кристаллы коровой части химерной репликазы с использованием малоната натрия в качестве осадителя (рис. 5). Максимальное разрешение, которого удалось достичь, используя полученные кристаллы, составило 6,5. Несмотря на невысокое разрешение, были определены параметры элементарной ячейки и пространственная группа кристаллов (P6122, a = b = 200, c = 577, = = 90°, = 120°).

Так как высокого разрешения для кристаллов химерной репликазы получить не удалось, мы обратились к другому варианту повышения жесткости молекулы фермента – путем объединения субъединиц в единый полипептид. Такой способ исключает возможность нестехиометрического соотношения субъединиц и препятствует их диссоциации. Эксперименты со слитой репликазой, включая определение ее структуры, проводили совместно с группами Г. Андерсена и Ш. Кнудсен Университета города Орхус (Дания).

Плазмида, кодирующая слитую репликазу, была получена из лаборатории Т. Йомо Университета города Осака (Япония). В этой плазмиде под контролем арабинозного промотера находятся слитые гены, кодирующие факторы элонгации EF-Ts и EF-Tu и -субъединицу репликазы в указанной последовательности. При экспрессии такой конструкции в E. coli образуется полипептид, в котором факторы элонгации EF-Ts и EF-Tu соединены остатком His, а EF-Tu и -субъединица – линкером из 16-ти аминокислотных остатков. На С-конце полипротеина находится His6Рис. 6. Схематическое изображение генетической конструкции для получения слитой Q-репликазы. Представлена последовательность расположения генов факторов элонгации EF-Tu, EF-Ts и -субъединицы репликазы, а так же нуклеотидная и аминокислотная последовательность линкера, соединяющего EF-Tu и -субъединицу.

Изображение взято из Kita et al. 2006. J. biosci. bioeng. 101, 421-426.

последовательность (рис. 6). Как было показано авторами, слитая Q-репликаза стабильна и размножает RQ РНК с той же скоростью, что и репликаза дикого типа.

Выделение слитой репликазы Слитую репликазу выделяли с помощью трех последовательных хроматографических стадий. После разрушения клеток ультразвуком и получения осветленного лизата сразу, минуя осаждение полиэтиленимином и анионообменную хроматографию, проводили металл-хелатную хроматографию на заряженной Ni2+ Sepharose (GE Healthcare), гидрофобную хроматографию на Butyl Sepharose (GE Healthcare) и гельфильтрацию высокого разрешения на колонке Superdex 200 (GE Healthcare). При концентрировании слитой репликазы перед кристаллизацией часто наблюдали агрегацию белка, особенно в условиях низкой ионной силы. Эту проблему удалось решить путем расщепления связи между EF-Tu и -субъединицей, для чего в связывающий их линкер ввели последовательность, кодирующую сайт расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV; tobacco etch virus): Glu-Asn-Lys-Tyr-PheGln-Gly. Обработку протеазой проводили после металл-хелатной хроматографии.

В отличие от репликазы дикого типа и химерной репликазы, как полностью слитая репликаза, так и расщепленная протеазой TEV оказались склонными к димеризации.

Димер и мономер разделяли на стадии гель-фильтрации; при этом бльшая часть препарата, как правило, была представлена димером (рис. 7А). Оба варианта имеют одинаковый субъединичный состав (рис. 7Б).

Рис. 7. Разделение димера и мономера слитой Q-репликазы.

(А) Гель-фильтрация обработанного TEV-протеазой препарата коровой части слитой репликазы. (Б) Денатурирующий электрофорез в 10% ПААГ препарата димера (Д), мономера (М), коровой части репликазы дикого типа (ДТ) и рибосомного белка S1. ММ – маркеры молекулярной массы (кДа). Гель окрашен кумасси G-250.

Рис. 8. Сравнение свойств димера и мономера слитой Q-репликазы. (А) Синтез поли(G) на поли(C) в присутствии 1 пмоль слитой Q-репликазы. (Б) Репликация 5 фмоль RQ135 РНК в присутствии [-32P] UTP и 1 пмоль слитой Q-репликазы. (В) Термостабильность: остаточная активность в поли(C)-зависимой реакции после 10минутной инкубации при указанной температуре в отсутствие лигандов. (Г) Температурный оптимум, в том числе для репликазы дикого типа, в поли(C)-зависимой реакции. Во всех случаях использовали препараты репликазы, лишенных белка S1.

Ферментативная активность слитой Q-репликазы Все последующие эксперименты проводили со слитой репликазой, обработанной протеазой TEV. По всем проведенным тестам – синтез поли(G) на поли(C), репликация RQ135 РНК, термостабильность и температурный оптимум – димерная и мономерная формы слитой репликазы существенно не отличались ни друг от друга, ни от репликазы дикого типа (рис. 8).

Кроме того, мономер и димер оказались неотличимы по способности образовывать инициаторные и элонгационные комплексы, которые удалось различить с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях. Инициация в присутствии GTP (синтез немеченого pppGGG) приводит к появлению одной новой полосы в случае мономера (рис. 9А, дорожка 3) и двух новых полос в случае димера (рис. 9А, дорожка 7), электрофоретическая подвижность которых меньше подвижности соответствующих свободных форм репликазы (рис. 9А, дорожки 2 и 6). Вероятно, появление двух полос в случае димера говорит об образовании инициаторных комплексов, удерживающих одну и две молекулы матрицы. При добавлении CTP и [-32P] UTP, разрешающих синтез пентануклеотида (pppGGGCU*), соответствующие элонгационные комплексы радиоактивно метятся и выявляются при авторадиографии (рис. 9Б, дорожки 4 и 8). В присутствии всех четырех NTP синтезируется полноразмерная комплементарная копия RQ135 РНК, что приводит к дальнейшему уменьшению подвижности меченых элонгационных комплексов; при этом часть новосинтезированной РНК высвобождается в одноцепочечной форме (оцРНК) и в виде дуплекса (дцРНК) с исходной матрицей (рис. 9Б, дорожки 5 и 9). В присутствии GTP происходит диссоциации димера репликазы на мономеры (рис. 9А, дорожки 7-9), однако этот переход не связан с синтезом РНК, так как наблюдается в отсутствие матрицы (рис.

9А, дорожка 10) и не приводит к образованию меченых мономерных инициаторных и элонгационных комплексов (рис. 9Б; ср. дорожки 8 и 9 с дорожками 4 и 5).

Таким образом, объединение факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts в один полипептид, равно как и димеризация Q-репликазы, не изменяют ее функциональных свойств.

Полученные данные также указывают на возможность выделения инициаторных и элонгационных комплексов Q-репликазы, достаточно стабильных для их кристаллизации.

Рис. 9. Электрофоретический анализ инициаторных и элонгационных комплексов мономера и димера слитой репликазы на RQ135 РНК.

Дорожки содержат: одноцепочечную RQ135 РНК (1), свободные мономер (2) и димер (6), инициаторные комплексы, полученные в присутствии только GTP (3 и 7), элонгационные комплексы, полученные в присутствии GTP, CTP и [-32P] UTP (4 и 8) и в присутствии всех NTP (5 и 9), смесь димера репликазы с GTP в отсутствие матрицы (10). Электрофорез проводили в неденатурирующих условиях в 8% ПААГ. (А) Гель окрашен серебром. (Б) Радиоавтограф того же геля. Положение радиоактивных маркеров (точек) на панели Б соответствуют положению точек на панели А.

Кристаллизация слитой Q-репликазы Среди всех вариантов слитой репликазы (димер и мономер, ± белок S1) удалось получить кристаллы только димерной формы коровой части. Кристаллизацию проводили методом диффузии паров в сидячей капле с использованием пентаэритритолпропоксилата в качестве осадителя при температуре инкубации 4°С Рис. 10. Кристаллы димера слитой Q-репликазы.

Капли готовили смешиванием 2 мкл 10-20 мг/мл димера коровой части слитой Qрепликазы и 2 мкл резервуарного раствора, содержащего 0,1 М MES-NaOH pH 5,7; 0,2 М KCl и 27% пентаэритритолпропоксилат. Инкубацию проводили при 4°С. Кристаллы появлялись в течение первых суток инкубации и достигали максимального размера в течение недели.

Рис. 11. Пространственная структура коровой части Q-репликазы.

(А) Элементарная кристаллическая ячейка, содержащая димер коровой части репликазы.

(Б) Структура мономера репликазы, состоящего из каталитической субъединицы () и слитых факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts.

(рис. 10). Полученные кристаллы обеспечивали дифракцию вплоть до 2,5, что позволило решить структуру Q-репликазы с высоким разрешением.

Определение структуры Для решения структуры репликазы использовали метод молекулярного замещения и известную структуру комплекса факторов элонгации EF-Tu-Ts из E. coli в качестве модели. В элементарной кристаллической ячейке был обнаружен димер репликазы (рис. 11А), который, по-видимому, соответствует димеру репликазы в растворе.

Мономер коровой части репликазы состоит из -субъединицы и полипептида, образованного слитыми факторами элонгации EF-Tu и EF-Ts (рис. 11Б). Атомные координаты структуры депонированы в базе данных PDB под кодом 3MMP.

Данная структура является первой для репликаз РНК-содержащих бактериофагов из семейства Leviviridae и первой структурой комплекса каталитической субъединицы вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы с хозяйскими белками. Образование комплексов с хозяйскими белками характерно для РНК-репликаз не только бактериофагов, но и вирусов эукариот (Ortn and Parra, 2006. Annu. Rev. Microbiol. 60, 305-326), поэтому значение данной структуры выходит за пределы левивирусов.

Рис. 12. Сравнение структуры факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts в комплексе Tu:Ts и в составе Q-репликазы. Структура слитых EF-Tu и EF-Ts в составе Q-репликазы (выделено оранжевым) выровнена со структурой комплекса факторов (код 1EFU в базе PDB, выделено синим) при помощи программы PyMol (панель А). Пунктиром выделен мотив coiled-coil в EF-Ts, положение которого изменяется при образовании комплекса с субъединицей (панель Б).

Структура факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts в составе Q-репликазы Структура слитых факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts, входящих в состав Qрепликазы, практически не отличается от структуры свободного комплекса факторов.

Исключение составляет расположение мотива coiled-coil в EF-Ts (рис. 12). В составе репликазного комплекса этот мотив EF-Ts повернут по часовой стрелке примерно на 18° в сторону от -субъединицы (рис. 12Б).

Взаимодействие факторов элонгации и -субъединицы обеспечивается прежде всего гидрофобными взаимодействиями, которые дополнительно стабилизируются водородными связями и солевыми мостиками.

Структура каталитической субъединицы Пространственную структуру каталитической -субъединицы можно описать моделью сжатой правой руки, характерной для всех известных РНК-зависимых РНК-полимераз (Ferrer-Orta et al. 2006. Curr. Opin. Struct. Biol. 16, 27-34). Присутствуют консервативные домены большого пальца, пальцев и ладони (рис. 13). Обычно домены пальцев и большого пальца образуют желоб, вдоль которого происходит продвижение РНК-матрицы в процессе синтеза, а каталитический центр расположен Рис. 13. Структура каталитической субъединицы Q-репликазы. Указаны консервативные элементы: домены пальцев, ладони, большого пальца и Bridge, а так же спирали T и Bridge, участвующие во взаимодействии с фактором элонгации EF-Tu.

Рис. 14. Взаимодействие -субъединицы репликазы с фактором элонгации EF-Tu.

Спираль T -субъединицы взаимодействует с доменом II фактора элонгации EF-Tu (А) в том же месте, где фактор EF-Tu связывает ССА-конец тРНК (Б) в комплексе с аминоацилтРНК (код 1OB2 в базе PDB).

на ладони, содержащей консервативный мотив GDD. Остатки аспартата в этом мотиве участвуют в координации двувалентных катионов, участвующих в катализе образования межнуклеотидной связи (Steitz, 1998. Nature 391, 231-232). В структуре -субъединицы так же был обнаружен элемент Вridge, представленный двутяжевой шпилькой и соединяющий домены пальцев и большого пальца. Подобный элемент также присутствует и в других вирусных РНК-зависимых РНК-полимеразах.

Помимо элементов, присущих всем РНК-репликазам, в структуре каталитической субъединицы обнаружены две -спирали, участвующие в образовании комплекса с фактором элонгации EF-Tu. Это спираль T и следующая за ней спираль, примыкающая к участку Bridge. Во взаимодействии с фактором EF-Ts принимает участие домен большого пальца -субъединицы.

Стоит отметить, что спираль T -субъединицы взаимодействует со вторым доменом фактора элонгации EF-Tu в том же месте, где происходит связывание CCA-конца аминоацил-тРНК, а спираль Bridge расположена на границе второго и третьего домена EF-Tu в непосредственной близости с регионами switch I и switch II (рис. 14).

Регион switch II EF-Tu в составе репликазы имеет ту же конформацию, что и в свободном комплексе EF-Tu•EF-Ts. Регион switch I в полученной структуре репликазы не виден.

Таким образом, структуры, участвующие в образовании комплекса фактора элонгации EF-Tu и тРНК, в структуре Q-репликазы взаимодействуют с вирусной субъединицей.

Сравнение с известными структурами РНК-зависимых РНК-полимераз За исключением индивидуальных особенностей, структуру всех РНК-зависимых РНКполимераз можно описать моделью правой руки, о чем говорилось выше. Среди известных структур РНК-зависимых РНК-полимераз можно выделить две основные группы (Ng et al., 2008. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 320, 137-156; Lescar and Canard, 2009. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 759-767). К первой группе относятся РНК-репликазы, осуществляющие инициацию синтеза РНК de novo, то есть без использования праймеров. Для этих полимераз характерно компактное расположение доменов пальцев и большого пальца, так что ограниченное ими пространство может вместить только одноцепочечный участок РНК. Для праймер-зависимых РНК-репликаз, напротив, характерна более открытая структура. При этом желоб, образованный доменами пальцев и большого пальца, может вместить двуцепочечный участок Аформы РНК. Из сравнения структуры каталитической субъединицы Q-репликазы с известными структурами РНК-репликаз (рис. 15) можно сделать вывод, что для нее характерна открытая конформация, присущая праймер-зависимым РНК-репликазам.

Однако известно, что Q-репликаза в норме осуществляет инициацию синтеза РНК de novo, хотя и может использовать праймеры in vitro.

Известно, что при взаимодействии с Q-РНК происходит значительное изменение конформации репликазы. При этом -субъединица репликазы теряет возможность сшиваться с факторами элонгации бифункциональным агентом – диметил суберимидатом (Young and Blumenthal, 1975. J. Biol. Chem. 250, 1829-1832). Учитывая Рис. 15. Сравнение структур РНК-зависимых РНК-полимераз.

(А) РНК-репликаза вируса гепатита С (код 1QUV в базе PDB) относится к группе репликаз, осуществляющих синтез РНК de novo имеющих компактную организацию. (Б) РНКрепликаза вируса ящура (FMDV, код 1U09 в базе PDB) относится к праймер-зависимым репликазам, которые менее компактны, а пространство между доменами пальцев и большого пальца может вместить участок двуцепочечной РНК. (В) Каталитическая субъединица Q-репликазы по структуре больше похожа на праймер-зависимые РНКрепликазы, хотя и осуществляет синтез РНК de novo. F, P, T – домены пальцев, ладони и большого пальца соответственно.

формирование при инициации закрытой репликативной конформации, которая была охарактеризована биохимически (Ugarov et al., 2003. J. Biol. Chem. 278, 44139-44146), можно предположить, что на стадии инициации Q-репликаза приобретает компактную структуру, а описанная здесь структура отражает свободное состояние репликазы до стадии инициации.

Модель элонгационного комплекса Q-репликазы Представленная на рис. 16 модель построена на основании сравнения с кристаллической структурой РНК-репликазы норовируса (Norwalk virus), связанной с CTP и дуплексом матрицы и праймера (код 3BSN в базе PDB), и не учитывает вероятные конформационные изменения белка и РНК. В этой модели элемент Bridge находится у выхода из туннеля, в котором находится дуплекс матрицы и растущей цепи и разделяет отверстия для выхода матрицы и растущей цепи. Когда достигает в длину 6-7 пар оснований, он упирается в Bridge, который расплетает цепи дуплекса подобно замку молнии, так что при дальнейшей элонгации матрица и продукт покидают репликативный комплекс в виде одноцепочечных молекул, что является обязательным условием при синтезе РНК Q-репликазой.

Согласно предложенной модели, в активном центре Q-репликазы формируется короткий двуцепочечный участок РНК, существование которого прямо показано не Рис. 16. Модель элонгационного комплекса Q-репликазы.

Показаны каналы для входа матрицы (М) в активный центр и выхода матрицы и продукта (П). Так же указан канал, по которому NTP поступают к активному центру, расположенному на домене ладони. (А) вид модели элонгационного комплекса со стороны домена ладони (P, palm); (Б) вид со стороны домена большого пальца (T, thumb).

было, однако косвенно подтверждается тем, что репликаза может использовать праймеры in vitro. При этом наиболее эффективными праймерами являются олигонуклеотиды длиной 2-7 нт, а олигонуклеотиды большей длины не активны (Feix and Hake, 1975. Biochem. Biophys. Res. Commun. 65, 503-509).

Сравнение со структурой Q-репликазы, опубликованной другими авторами Спустя три месяца после публикации представленной структуры была опубликована еще одна структура коровой части Q-репликазы, полученная японскими исследователями (Takeshita and Tomita, 2010. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 15733Для кристаллизации они так же, как и мы, использовали слитую репликазу, однако не отщепляли -субъединицу от факторов элонгации. Полученная ими структура практически идентична нашей. Отличие состоит в том, что они определили структуру комплекса репликазы с двухвалентными катионами Ca2+ и Mg2+, проведя кристаллизацию в присутствии высокой концентрации их солей. Как и ожидалось, связывание двухвалентных катионов происходит в районе консервативного мотива GDD в домене ладони и сопровождается небольшим изменением положения боковых цепей остатков аспарагиновой кислоты, но не приводит к изменению конформации основной цепи.

1. Получены кристаллы коровой части Q-репликазы благодаря использованию двух способов повышения жесткости ее структуры: замене фактора элонгации EF-Ts на его термофильный аналог и введению ковалентной связи между субъединицами EF-Ts и EF-Tu.

2. Показано, что способные к кристаллизации формы способны узнавать и экспоненциально размножать реплицирующиеся РНК и, следовательно, адекватно отражают свойства Q-репликазы дикого типа.

3. Решена структура коровой части Q-репликазы с разрешением 2,5. Таким образом, впервые определена структура РНК-зависимой РНК-полимеразы, содержащей вирусный и клеточные белки.

4. Предложена модель структуры элонгационного комплекса, объясняющая такие свойства Q-репликазы как способность расплетать дуплекс между матрицей и растущей цепью и неспособность использовать праймеры длиннее нуклеотидов.

5. Показано, что введение EF-Ts Thermus thermophilus в состав Q-репликазы приводит к повышению ее термостабильности и позволяет более чем вдвое повысить эффективность размножения РНК по сравнению с репликазой дикого типа.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах Статьи в научных журналах:

1. Васильев Н.Н., Дженнер Л., Юсупов М.М., Четверин А.Б. Выделение и кристаллизация химерной Q-репликазы, содержащей фактор элонгации EF-Ts Thermus thermophilus.// Биохимия. – 2010 – Т.75 – С. 1091-1097.

2. Kidmose R.T., Vasiliev N.N., Chetverin A.B., Andersen G.R., Knudsen C.R.

Structure of the Q replicase, an RNA-dependent RNA polymerase consisting of viral and host proteins.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2010 – V.107 – P. 10884Тезисы конференций:

1. Васильев Н.Н., Тнимов З.К., Угаров В.И., Дженнер Л.Б., Юсупов М.М., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Химерная Q-репликаза, содержащая термофильный EF-Ts.// Ежегодная научная конференция Института белка РАН.

– Сборник тезисов – 8-9 июня 2010 – С. 18.



 
Похожие работы:

«Апалько Светлана Вячеславовна Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов 03.00.03 –молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Кольцово – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии человека Сибирского отделения РАН доктор медицинских наук Научный руководитель : Глушков Андрей Николаевич доктор биологических наук, Официальные...»

«РАУЭЛИАРИВУНИ АНДРИАНТСАЛАМА Ситрака Агроэкологическая оценка воздействия обогащенных микробиологическими деструкторами компостов на основе ОСВ на дерново-подзолистую супесчаную почву Владимирской Мещеры. 03.02.08 – экология (биология) 06.01.04 – агрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«Головатских Инна Васильевна ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ НЕКОТОРЫМИ БИОЭЛЕМЕНТАМИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ И ЙОДА У ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ЮЖНОГО РЕГИОНА БАШКИРИИ (НА ПРИМЕРЕ Г.МЕЛЕУЗА И МЕЛЕУЗОВСКОГО РАЙОНА) 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск — 2014 2 Работа выполнена на кафедре биологической химии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»

«Тиллиб Сергей Владимирович Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster Специальности: 03.01.03 - молекулярная биология и 03.01.07 - молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в Университете Томаса Джефферсона...»

«ПЛЫЛОВА Ирина Анатольевна СОСТАВ ГУМУСА ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ СУПЕСЧАНЫХ И СУГЛИНИСТЫХ ПОЧВ ПРИ ИЗВЕСТКОВАНИИ, ОКУЛЬТУРИВАНИИ И СОСТОЯНИИ ЗАЛЕЖИ Специальности: 06.01.01 – общее земледелие 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Санкт-Петербург – Пушкин 2011 Диссертационная работа выполнена на кафедре почвоведения им. Л.Н. Александровой ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный аграрный университет...»

«ХАТЕФОВ Эдуард Балилович Семенная продуктивность тетраплоидной кукурузы и пути ее повышения в условиях Кабардино-Балкарии Специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений, 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург - 2012 2 Исследования проведены в ГНУ Кабардино-Балкарском научноисследовательском институте сельского хозяйства Россельхозакадемии в лаборатории селекции и...»

«Логинов Дмитрий Сергеевич СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАТИВНОГО И РЕКОМБИНАНТНОГО ЛИГНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА – ЛАККАЗЫ Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА 2010 Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ биотрансформации Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор О.В. Королева Официальные...»

«УДК 572 МАУРЕР Андрей Маркович ОБОБЩЕННЫЙ ФОТОПОРТРЕТ КАК ИСТОЧНИК АНТРОПОЛОГИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ Специальность 03.00.14 - Антропология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - Работа выполнена в НИИ и Музее антропологии...»

«Пескарев Александр Александрович Экологическая оценка применения осадков сточных вод на дерново-подзолах Владимирской Мещеры Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре экологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Яшин Иван Михайлович Официальные...»

«СКАЧКОВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА АНАЛИЗ ГЕНОВ MFN2, GDAP1 И NEFL У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫМИ МОТОРНО - СЕНСОРНЫМИ НЕЙРОПАТИЯМИ ИЗ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа - 2013 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Научный руководитель...»

«ЛЕБЕДЕВА Ольга Евгеньевна ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОГРАММЫ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР, НУЖДАЮЩИХСЯ В ПРОВЕДЕНИИ ИНТРАЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ИНЪЕКЦИИ СПЕРМАТОЗОИДА В ООЦИТ, ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ 14.01.01 – акушерство и гинекология 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – Работа выполнена в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия Федерального...»

«ШАХ МАХМУД РАИХАН ВЛИЯНИЕ 2-(ПАРА-АМИНОБЕНЗОЛСУЛЬФАМИДО)-ТИАЗОЛА НА РОСТ КУЛЬТУРЫ SERRATIA MARCESCENS W1050 И БИОСИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ И В ОТСУТСТВИE ПУРИНОВ 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2010 Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета Научный руководитель : доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Филимонова Мария...»

«Терёшкина Ксения Борисовна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА ПЕПТИДНЫХ СТРУКТУР И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ИОННОГО КАНАЛА ГЛИЦИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Специальность 03.00.02. - Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин...»

«КОРОЛЕВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА ОСОБЕННОСТИ ГЕМОДИНАМИКИ И БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У ЖЕНЩИН 20-40 ЛЕТ ПРИ ЗАНЯТИЯХ ФИТНЕСОМ 03.00.13 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2009 1 Диссертация выполнена на кафедре Теории и методики физической культуры и спорта ГОУ ВПО Южно-Уральский государственный университет (г. Челябинск) Научный руководитель – доктор медицинских наук, профессор Мкртумян...»

«Францева Наталья Николаевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПОЛЕВОЙ ДОРОЖНОЙ СЕТИ АГРОЛАНДШАФТА В ЗОНЕ НЕУСТОЙЧИВОГО УВЛАЖНЕНИЯ СТАВРОПОЛЬЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2009 2 Работа выполнена в ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхозакадемии Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Дзыбов Джантемир Сосренович Официальные оппоненты : доктор биологических наук Орлова Ирина Георгиевна...»

«Петрова Инга Васильевна ГРАДИЕНТ БИОТОПИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ В ЭКОЛОГИИ ВИДОВ ОФИДИОФАУНЫ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ ВОЛЖСКО-КАМСКОГО КРАЯ Специальность 03.02.08 — экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре общей экологии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Павлов Алексей Владиленович Официальные...»

«Нсангу Молу Мама Дезире Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2007 Работа выполнена на кафедре биохимии и в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ГОУВПО Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина Научный руководитель : доктор биологических наук, Абрамова Зинаида Ивановна Официальные...»

«Сорокина Наталья Владимировна АНТРОПОГЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЕВЕРО-ТАЕЖНЫХ ЭКОСИСТЕМ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ (на примере Надымского района) Специальность 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тюмень – 2003 3 Работа выполнена в институте криосферы Земли СО РАН. Научные руководители: доктор географических наук, главный научный сотрудник Москаленко Наталия Георгиевна кандидат географических наук, доцент Емельянова Людмила...»

«ЧУПИНА Ольга Андреевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПЛАНТАТОВ ТРАХЕИ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ И ЦЫПЛЯТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ 03.00.06 Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир-2009 Работа выполнена в федеральном государственном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных (г. Владимир) Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ДИЕВ Вячеслав Иванович...»

«НЕПОМНЯЩАЯ ЯНА НИКОЛАЕВНА ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В ТЕРМОФИЛЬНЫХ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ СООБЩЕСТВАХ Специальность 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2010 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.