WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Рудько Ольга Игоревна

ДОЛГОВРЕМЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ

ПЕПТИДНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ - ИНДУКТОРОВ ТРЕВОЖНОСТИ:

ОТЛОЖЕННЫЕ И ИНВЕРСНЫЕ ЭФФЕКТЫ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

специальность 03.00.13 – физиология МОСКВА 2008

Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова доктор биологических наук,

Научный руководитель:

профессор, Р.А.Данилова доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

профессор, заслуженный деятель науки РФ, Р.У. Островская кандидат биологических наук А.А. Мартьянов

Ведущая организация:

Институт Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 1 декабря 2008 г. в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 31 октября 2008 г.

Ученый секретарь совета доктор биологических наук Б.А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди эндогенных факторов тревожности и страха важную роль играют агонисты широко представленных в мозге рецепторов холецистокинина (ХЦК) типа В (также называемых ХЦК рецепторами). Наибольшее внимание привлекает самый меньший из обнаруживаемых в мозге С-концевых фрагментов холецистокинина тетрапептид Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-4). Большое количество клинических данных указывает на особую анксиогенную активность именно ХЦК-4, вызывающего у людей, изначально не страдающих паническими расстройствами, сильные панические атаки. Пациенты, страдающие паническими расстройствами, более реактивны к анксиогенному действию ХЦК-4 и других агонистов ХЦК-В рецепторов. (Bradwejn J et.al, 1991).





Показано, что анксиогенное влияние ХЦК-4 опосредовано стимуляцией некоторых отделов дофаминергической системы через ХЦК-В рецепторы (Crawley JN, 1995). Однако способность ХЦК-4 и особенно его малоизученных аналогов оказывать анксиогенное действие на животных нуждается в дальнейшем углубленном изучении, так как имеющиеся на сегодняшний день в литературе результаты не лишены противоречий.

Мишенью наших исследований помимо ХЦК-4 были его структурные аналоги – ранее не изученный ХЦК-3 (HCl-Met-Asp-Phe-NH2) и пентагастрин в двух модификациях: Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ПГ) и N-tert-butyloxycarbonylAla-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (БОК-ПГ); влияние их на психоэмоциональный статус крыс и биохимические изменения в мозге, сопровождающие эти эффекты. Особый интерес представляет исследование мало изученного феномена долговременности эффектов пептидов как на поведенческом, так и на биохимическом уровне.

Широкое распространение в клинической практике тревожных состояний, в том числе сопровождаемых приступами панических атак, определяет большой интерес не только к механизмам этих явлений, но и к методам их купирования. До сих пор проблема коррекции патологической тревожности и депрессий далека от успешного решения, методы купирования таких состояний на длительное время отсутствуют. Наши исследования, основанные на идее, выдвинутой академиком И.П.Ашмариным (Ашмарин И.П., Гомазков О.А., 1989), направлены на разработку принципиально нового подхода к длительной коррекции тревожных и панических состояний путем иммунокоррекции. Нами использовался метод инверсной иммунорегуляции – активной иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и его структурного аналога с антигеном-носителем.

В течение последних двух десятилетий опубликовано большое число работ, в которых исследовались эффекты иммунизации к широкому кругу соединений, близких по структуре или даже идентичных соединениям реципиента, в том числе и к регуляторным пептидам (Ашмарин И.П., Гомазков О.А., 1989, Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. и др., 1991, Евсеев В.А., Трекова Н.А.

и др., 1995, Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. и др., 1988.).

Активная иммунизация животных гетерологичным или гомологичным биорегулятором, индуцируя образование аутоантител к нему, ведет к длительным изменениям активности соответствующего биорегулятора и физиологических функций, с которыми он связан (как правило противоположной направленности). Прицельность подавления определенных систем регуляции позволяет успешно использовать такой подход для изучения механизмов патологического поведения и обосновать возможность его иммунокоррекции. Опыт, накопленный в исследованиях с использованием метода инверсной иммунорегуляции, позволяет нам расценивать такой подход, как наиболее направленный, длительный и стабильный в плане вызываемых физиологических изменений. Несмотря на наличие ряда работ по активной иммунизации к регуляторным пептидам, исследования по иммунизации животных к ХЦК-4 и его аналогам как в отечественной, так и в зарубежной литературе не опубликованы. Поэтому были необходимы исследования для оценки возможности и эффективности иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и ХЦК-3, а также изучение корреляции поведенческих эффектов иммунизации с биохимическими изменениями в мозге.





Одной из важных проблем в плане применения метода иммунокоррекции в клинике является подбор допущенных к применению на людях антигеновносителей и адъювантов. При положительных эффектах иммунизации на животных это может позволить без предварительной проверки на безвредность перейти к испытаниям описанного подхода к коррекции тревожных и панических состояний у людей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение кратковременных и долговременных (отставленных и инверсных) поведенческих и биохимических эффектов пептидных регуляторов – индукторов тревожности – ХЦК-4 и его аналогов. В работе были поставлены следующие задачи:

• Оценка эффективности и направленности действия аналогов ХЦК-4 ХЦК-3, БОК-пентагастрина и пентагастрина, и сопоставление их действия с анксиогенными эффектами ХЦК-4.

• Изучение долговременности вызываемых ХЦК-4 и его аналогами эффектов на поведенческом и биохимическом уровнях после однократного парентерального введения.

• Для получения особо длительных инверсных эффектов – проведение активной иммунизации белых крыс синтезированными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигенами-носителями.

• Оценка эффективности иммунизации на:

- иммунологическом - поведенческом - биохимическом уровнях.

• Сравнение направленности и длительности поведенческих и биохимических эффектов пептидов при однократном парентеральном введении и при использовании метода инверсной иммунорегуляции.

• В случае анксиолитического действия иммунизации – проведение исследований с использованием антигенов-носителей и иммуностимуляторов, допущенных к применению в клинике.

Научная новизна. Впервые оценено влияние на поведение белых крыс структурного аналога ХЦК-4 - HCl-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-3), который был впервые синтезирован в институте Молекулярной генетики Л.А.Андреевой.

Выявленный нами анксиогенный эффект ХЦК-3 позволяет говорить, что среди агонистов рецепторов ХЦК В, играющих важную роль в этиологии тревожных состояний, наряду с аналогом ХЦК-4 – пентагастрином и аналогом ХЦК-8 – церулеином, является и трипептид ХЦК-3. Выявлен очень важный феномен отставленных эффектов анксиогенных олигопептидов: эффекты ХЦКи ХЦК-3, идентичные по характеру ранним, наблюдаются до 14 суток после однократного парентерального введения, как на поведенческом, так и на биохимическом уровне. Известно, что анксиогенные олигопептиды характеризуются коротким периодом полураспада in vivo (менее 15 минут), поэтому факты пролонгированных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 заслуживают особенного внимания. Данные по изучению отставленных анксиогенных эффектов ХЦК-4 и синтезированного нами аналога ХЦК-3 как по физиологическим, так и биохимическим показателям на сегодняшний день в литературе отсутствуют.

Впервые проведено ковалентное связывание ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигеном-носителем (М.Ф.Обухова) и исследования по активной иммунизации крыс с оценкой функционального состояния иммунизированных крыс.

Полученные данные о длительном (месяцы) анксиолитическом и антидепрессивном эффекте иммунизации, позволили показать принципиально новую возможность направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности, страха и депрессий. Помимо этого, впервые показано изменение уровня биоаминов в стриатуме после иммунизации к ХЦК-4 и -3, направленность которого, особенно по содержанию дофамина и серотонина, противоположна прямому действию исследуемых пептидов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные факты о долговременных отложенных эффектах анксиогенных пептидов ХЦК- и ХЦК-4 соответствуют концепции пептидного функционального континиума, предложенной академиком И.П. Ашмариным (1986) и значительно ее расширяют. Значение этого явления принципиально важно как в фундаментальном аспекте для развития представлений о функции регуляторов центральной нервной системы, так и в прикладном плане – открывается возможность разработки регуляторов тревожности весьма длительного действия.

Несмотря на большие успехи современной медицины и существующее огромное количество анксиолитических и антидепрессивных препаратов, коррекция тревожных и депрессивных расстройств до сих пор продолжает оставаться весьма актуальной проблемой, а методы долговременной (в том числе иммунологической) коррекции таких состояний на длительное время отсутствуют. Показанная нами успешность иммунизации к пептидаманксиогенам, а также подбор антигена-носителя (столбнячный анатоксин) и иммуномодулятора (полиоксидоний), широко применяемых в клинической практике, открывают возможность практического применения метода инверсной иммунорегуляции в целях коррекции патологического состояния тревожности и депрессии. Основное его преимущество состоит в длительности и стабильности вызываемых эффектов при небольшом числе воздействий.

Такой подход в терапии ряда хронических болезней, таких как алкоголизм и психические нарушения, может позволить избежать многократного систематического введения лекарственных препаратов, обладающих кратковременным действием.

Апробация работы. Апробация результатов представленного диссертационного исследования успешно прошла на конференции молодых ученых по проблемам ВНД, посвященной 90-летию со дня рождения Л.Г.Воронина (Москва, 1998), Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999), Международной медицинской конференции «Medicine at the turn of Millenia»

(Люблин, 2000), II-й Российской конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001), 6-ой Пущинской конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2002), Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Высокие Татры, 2003), XI российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), XIX съезде Физиологического Общества Им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), Втором Международном Междисциплинарном Конгрессе «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» (Судак, 2006), XII и XV международной конференции и дискуссионного научного клуба IT + ME (Гурзуф, 2004 и 2007), а также на заседаниях кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ.

По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения в двух главах, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, содержит 39 рисунков и таблиц. Список литературы включает 204 источника, из них 34 отечественных.

Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на крысах-самцах линии Вистар и беспородных крысах массой 200-300 грамм общим числом порядка 1000. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Минздрав СССР, 1977).

Используемые вещества.

• Холецистокинин-4 — Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-4), производства ICN Biomedical Inc.

• Холецистокинин-3 — HCl-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-3), синтезированный в НИИМГ РАН с.н.с., к.б.н. Л.А. Андреевой.

• Пентагастрин — -Аla-Тrp-Мet-Аsp-Рhe-NH2 (ПГ), наиболее близкий по структуре к ХЦК-4 и пентагастрин N-t-BOC- -Аla-Тrp-Мet-Аsp-Рhe-NH2 (ВОСПГ), оба пептида фирмы «SIGMA».

• Адъювант Фрейнда (ПАФ), производства ICN Biomedicals Inc.

• Полиоксидоний (ПО), синтезированный в Институте иммунологии Минздрава РФ.

• Столбнячный анатоксин (СтА), получен в ГосНИИ Стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, культура Closridium tetani, штамм Копенгаген.

Парентеральное введение ХЦК-4 и его аналогов. Опытной группе внутрибрюшинно вводился исследуемый пептид. В разных сериях опытов дозировка составляла для ХЦК-4 100 и 400 мкг/кг; для ХЦК-3 – 10 мкг/кг, для ПГ – 40 и 100 мкг/кг; для БОК-ПГ 100 мкг/кг. Контрольным группам вводился физиологический раствор в том же объеме. Поведенческие тесты проводились в разные сроки, в интервале от 1 часа до 12 суток после введения пептида.

Синтез конъюгатов. Конъюгирование ХЦК-4 и ХЦК-3 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и столбнячным анатаксином (СтА) с молярным соотношением 1:100 проводилось в Институте нормальной физиологии в.н.с., к.б.н. М.Ф. Обуховой. В качестве связующего агента использовался N-этил-N’3-диметиламинопропил карбодиимид солянокислый (КДИ).

Активная иммунизация крыс. Крыс иммунизировали три раза, с интервалом 7-8 дней, в четыре точки спины; доза по белку составляла 150 мкг на крысу (800-1000 мкг/кг), первые два раза с полным адьювантом Фрейнда (в объемном соотношении 1:1) в качестве иммуностимулятора, общий объем вводимого раствора – 0,2 мл. Контрольной группе вводили физиологический раствор (первые два раза с ПАФ). В случае использования полиоксидония (ПО) препарат вводился также первые два раза, в дозе 200 мкг/крысу (1000 мкг/кг).

Оценка физиологического статуса проводилась в разные сроки: в интервале от 1 часа до 12 суток после парентерального введения пептидов и через три-четыре недели (до 10-ти недель) после начала иммунизации с использованием следующих поведенческих тестов.

• Для оценки двигательной и ориентировочно-исследовательской активности использовался прибор "Родео" (автоматизированное открытое поле).

Тестирование проводили в течение 5 или 10 минут как с использованием стрессирующего раздражителя – звука, так и без него.

• Для оценки уровня тревожности и страха в поведении иммунинизированных крыс, использовался приподнятый крестообразный лабиринт (Pellow, 1985) и темно-светлая камера.

• Склонность крыс к возможному развитию депрессивно-подобного состояния в тесте неизбегаемого плавания оценивали по классической методике Порсольта (Porsolt, 1978).

Иммунологический анализ. По окончании опытов крыс декапитировали и отбирали кровь для иммунологического анализа. Пробы крови выдерживали два часа при комнатной температуре, центрифугировали для отделения сгустка 30 минут со скоростью 3000 об/мин. Титры антител методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA определялись в.н.с., к.б.н. М.Ф. Обуховой М.Ф. Обуховой Биохимический анализ стриатума крыс проводился в Институте Патфизиологии РАМН. Животных декапитировали, извлекали мозг, рассекали его в дорзовентральном направлении сразу же за зрительным перекрестом, выделяли слоистые структуры стриатума и замораживали в жидком азоте.

Далее гомогенизировали, гомогенат центрифугировали на скорости об/мин, отбирали супернатант. Полученные образцы анализировали методом ВЭЖХ, определяя уровни ДА, ДОФУК, ГВК, 5-ОТ и 5-ОИУК.

Статистическая обработка полученных данных выполнялась с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни и Фишера. Для построения графиков и гистограмм использовалась программа EXCEL 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Эффекты парентерального введения пептидов.

Кратковременные эффекты.

Тестирование через 1 час после однократного парентерального введения ХЦК-4 в дозах от 100 до 400 мкг/кг показало изменение большинства параметров поведения, свидетельствующих о повышенной тревожности крыс.

В крестообразном лабиринте (рис. 1А) у опытных животных значительно снизилось число выходов на открытые лучи (32% контроля); время пребывания на открытых лучах (45% контроля); количество посещений закрытых лучей 45% (p0,05); суммарное количество переходов 43% (p0,05); число выглядываний на открытые лучи (50%, p0,05) и количество стоек (70%);

увеличилось время замирания. В темно-светлой камере (рис. 1Б) уменьшился латентный период первого ухода из светлого отсека (42% контроля), также снизилось число выходов на свет и общее время пребывания в светлом отсеке.

При тестировании в «РОДЭО» на фоне стрессирующего раздражителя – звука у опытной группы наблюдались признаки острой панической реакции в ответ на раздражитель (число пробежек 165% контроля, стоек 170%), далее сменявшиеся спадом двигательной и ориентировочно-исследовательской активности до конца эксперимента. Подобные изменения свидетельствуют о значительном снижении устойчивости крыс к стрессу, связанному с анксиогенным эффектом парентерального введения ХЦК-4.

1- выходы на открытые лучи; 2 – время на открытых лучах; 3 – выглядывания;

4 – переходы по закрытым лучам; 5 - суммарное количество переходов;

6 – стойки; 7 - время замирания; 8 – латентный период ухода в темный отсек;

9 – число выходов на свет; 10 – время в светлом отсеке.

Кроме того, представляется важным наличие депрессивных компонентов в поведении крыс - статистически значимое увеличение времени иммобилизации (180% контроля, p0,05) и снижение доли активного и пассивного плавания до 88% и 72% (p0,05) соответственно, наблюдавшееся в тесте Порсолта (рис. 2).

Тестирование синтетического деривата ХЦК-4 – ХЦК-3 показало близкое сходство прямых эффектов аналогов, заключающееся в наличии выраженных анксиогенных и депрессивных компонентов в поведении животных. У опытных животных в крестообразном лабиринте вдвое снизилось число выходов на открытые лучи (49%); время пребывания на открытых лучах составило 67% контроля; суммарное количество переходов – 77%; соотношение числа выходов на открытые лучи к суммарному количеству переходов составило 54% от контроля. Также по сравнению с контролем уменьшилось число выглядываний на открытые лучи (59%); снизилось количество стоек (84%). Одновременно время замирания опытных животных превысило контрольное на 24%, количество дефекаций составило 127% контроля. Данные темно-светлой камеры были также сходны с результатами тестирования ХЦК-4 – латентный период первого ухода из светлого отсека уменьшился до 36% контроля, снизилось количество выходов на свет и общее время пребывания в светлом отсеке (69% и 87% соответственно).

Однако в действии исследуемых препаратов наблюдались некоторые различия. Так, при значительном сходстве прямых поведенческих эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3, последний оказался эффективен в значительно меньших дозах, чем ХЦК-4: минимальная эффективная доза ХЦК-4 составляла мкг/кг, а ХЦК-3 – 10 мкг/кг.

Исследование двух форм пентагастрина (рис. 3) показало ХЦК-4— подобные анксиогенные эффекты ПГ в дозе 100 мкг/кг – в крестообразном лабиринте наблюдалось снижение всех параметров двигательной и ориентировочно-исследовательской активности и увеличение времени замирания (145% контроля) и дефекаций (179%). Соотношение числа выходов на открытые лучи к суммарному количеству переходов составило 53% от контрольных значений.

Внутрибрюшинное введение 100 мкг/кг БОК-ПГ не оказывало анксиогенного действия. Более того, полученные результаты указывали скорее на наличие анксиолитического эффекта и снижение уровня тревожности экспериментальных животных при тестировании в крестообразном лабиринте:

у крыс статистически значимо увеличилось число посещений открытых лучей (236% контроля, p0.01) и время пребывания на них (230%, p0.05), усилилось поведение риска (147%, p0.05), и, в то же время снизилось время замирания (83%) и число дефекаций (40%). Соотношение числа выходов на открытые лучи к суммарному количеству переходов составило 231% контроля (p0.01).

Некоторые из опытных животных прыгали с открытых лучей на пол, передвигались по бортикам закрытых лучей лабиринта, очень быстро бегали по лучам.

1- выходы на открытые лучи; 2 – время на открытых лучах; 3 - суммарное количество переходов; 4 - соотношение числа выходов на открытые лучи к общему количеству переходов; 5 - количество поведения риска; 6 - время замирания; 7 - количество дефекаций Таким образом, в опытах на крысах нами подтвержден анксиогенный и депрессивный эффект ХЦК-4 и ПГ, и впервые показан анксиогенный эффект синтезированного в НИИМГ РАН ХЦК-3. Нами также обнаружено, что один и тот же пептид, но в разных модификациях (ПГ и БОК-ПГ), оказывает противоположное влияние на поведение животных.

Отставленные эффекты.

При тестировании крыс в более поздние сроки было показано значительное сходство в большинстве показателей поведения крыс через 1 час и 5 суток после однократного введения ХЦК-4, причем на 5-е сутки анксиогенный эффект не только не уменьшился, но стал сильнее (рис. 4А). В опытной группе полностью отсутствовали выходы на открытые лучи (p0,05), достоверно снизилось число эпизодов поведения риска (12% контроля, p0,05);

общее количество переходов было значительно меньше, чем в контроле (27%, p0,05). Все эти изменения свидетельствовали о наличии компонентов тревожности в поведении опытных крыс. Данные тестирования в ТСК также указывали на проявления тревожности – уменьшался латентный период первого ухода из светлого отсека (27%) и в три раза снижалось общее время пребывания в светлом отсеке (31%, p0.05).

Рис. 4. Показатели поведения крыс в крестообразном лабиринте через 5 дней после введения:

А. 100 мкг/кг ХЦК-4 (n=12); Б. 10 мкг/кг ХЦК-3 (n=10). (% контроля, n=10) *- p0,05, **-p0,01, ***-p0, 1- выходы на открытые лучи; 2 – время на открытых лучах; 3 – выглядывания;

4 - соотношение числа выходов на открытые лучи к общему количеству переходов; 5 количество поведения риска; 6 - время замирания.

Отставленный анксиогенный эффект ХЦК-3 носил более выраженный и статистически значимый характер, чем сразу после введения. В крестообразном лабиринте профиль изменений совпадал с ХЦК-4: нами отмечалось снижение всех параметров двигательной и ориентировочно-исследовательской активности и увеличение времени замирания (рис. 4Б). Тестирование в ТСК также продемонстрировало наличие статистически значимых изменений в поведении крыс, носящих анксиогенный характер (табл. 1).

Табл. 1. Показатели поведения крыс в тесте «Темно-светлая камера» через 5 дней после введения 10мкг/кг ХЦК-3.

контроль n= Пентагастрин демонстрировал сохранение анксиогенного действия через 3 дня после введения 100 мкг/крысу: крысы опытной группы меньше выходили на открытые лучи (33% контроля) и находились на них (14%), было достоверно меньше эпизодов поведения риска (15% контроля, p0,05). Также значительно меньше, чем в контроле, было общее количество переходов (61%, p0,05).

Время замирания составило 125% контроля, число дефекаций 130%. Изменения в поведении, носящие анксиолитическую направленность после введения БОКПГ сохранялись до 48 часов.

При изучении краткосрочных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 наряду с повышением тревожности нами было показано наличие депрессивных компонентов в поведении крыс (см. рис. 2) - увеличение времени иммобилизации и снижение времени активного плавания в тесте Порсолта.

Через 4-5 суток после введения ХЦК-4 и -3 эти изменения сохранялись, и были статистически значимыми (Рис. 5). Менее выраженные изменения в поведении крыс были отмечены на 10-12-й день после введения ХЦК-3 и ХЦК-4. Они отражали ту же самую тенденцию, что и на 5-й день, но уровень значимости был ниже. На 20-й день не было выявлено различий между опытными и контрольными группами.

Биохимические эффекты Анксиогенный эффект ХЦК-4 сопровождался изменениями на биохимическом уровне. Полученные данные свидетельствуют о значимом снижении уровня метаболитов ДА и их сотношении к ДА (Рис. 6). В то же время отмечалось небольшое, но статистически значимое повышение уровня 5ОТ.

Рис. 6. Биохимические последствия однократного парентерального введения 400 мкг/кг ХЦК-4 (n=18), (% контроля, контр.- n=20).

Светлые столбики - через 1 час после введения, темные - через 5 суток.

*- p0,05, **-p0,01, ***-p0, Через 5 дней (рис. 6) после однократного введения ХЦК-4 наблюдаемые изменения в уровне ДА, его метаболитов и отношения их к ДА имели ту же направленность, что и через 40-60 минут после введения и были гораздо более выраженными. Уровень 5-ОT и его метаболита - ОИУК при этом статистически значимо снижались.

Через час после введения ХЦК-3 изменения по всем исследуемым параметрам биоаминов и их метаболитов не носили статистически значимого характера (табл. 2). Через 5 суток отмечалось снижение уровня дофамина (74% от контроля, статистически не значимо) и статистически значимое снижение ГВК (67%), повышение соотношения ДОФУК/ДА (123% контроля), а также уменьшение соотношения ОИУК/5-ОТ (87%).

Табл. 2. Влияние введения 10 мкг/кг ХЦК-3 на содержание дофамина, серотонина и их основных метаболитов (в нг/мг ткани) в стриатуме крыс через 1 час и 5 суток после введения.

Контроль n= Опыт (1 час) Опыт (5 дней) Таким образом, представленные данные свидетельствуют о способности анксиогенных олигопептидов ХЦК-4, ранее не исследованного аналога ХЦК- и, в меньшей степени, пентагастрина индуцировать пролонгированные эффекты, наблюдающийся не только в пределах нескольких часов, но и на сроки до 12 суток после однократного парентерального введения, как в поведении крыс, так и на биохимическом уровне.

2.Эффекты иммунизации.

Иммунологические эффекты Другим важным аспектом наших исследований является демонстрация долговременных эффектов, смоделированных путем активной иммунизации против эндогенных анксиогенных пептидов – ХЦК-3 и ХЦК-4. Полученные нами результаты показали, что иммунизация сопровождается формированием антител к ХЦК-4 и к ХЦК-3 (табл. 3), показана взаимореактивность антител к ХЦК-3 и ХЦК-4.

Табл. 3. Результаты иммунологического анализа сывороток крови крыс, иммунизированных конъюгатом ХЦК-3 с БСА и ХЦК-4 с БСА Иммунизация к ХЦК-3 с БСА n= Иммунизация к ХЦК-4 с БСА n= Влияние иммунизации на поведение.

Результаты поведенческого тестирования свидетельствовали о том, что иммунизация крыс к ХЦК-4 вызывает ряд глубоких и длительных изменений в поведении. При тестировании в приподнятом крестообразном лабиринте (рис.7А) в поведении крыс, иммунизированных к ХЦК-4, отмечено статистически значимое увеличение таких показателей, как число выглядываний на открытые лучи (295%, р0,05), увеличение числа переходов (180%, р0,01), увеличение поведения риска (193%, р0,01) и снижение времени замирания по сравнению с контрольной группой(20%, р0,005).

Используя темно-светлую камеру, мы наблюдали увеличение числа выходов иммунизированных крыс в светлый отсек (181%) и времени пребывания там (137%, р0,05) (рис.7Б). Эти изменения можно рассматривать как имеющие анксиолитическую направленность и противоположные прямому действию пептида.

1– выглядывания на открытые лучи; 2 – переходы по закрытым лучам; 3 суммарное количество переходов; 4 - время замирания; 5 - количество поведения риска; 6 – число выходов на свет; 7 – время в светлом отсеке.

продемонстрировало наличие анксиолитического эффекта: в крестообразном лабиринте время замирания составило 76% контроля; в полтора раза возросло число выглядываний на открытые лучи, число переходов по открытым лучам составило 125% контроля, до 117% выросло общее количество переходов, соотношение числа выходов на открытые лучи и суммарного количества переходов также было выше, чем в контроле (113%). Тестирование в темносветлой камере показало увеличение количества выходов в светлый отсек почти вдвое (181%, р0,05), а также значительное увеличение периода пребывания на свету (171%, р0,05).

При изучении прямых эффектов ХЦК-4, и -3, в тесте Порсольта нами отмечалось развитие у опытных крыс депрессивно-подобного состояния.

Наблюдаемое нами у крыс, иммунизированных к ХЦК-4, увеличение времени активного плавания (121%) и значительное снижение иммобилизации (69%, p0,01) позволяют говорить об антидепрессивной направленности иммунизации, противоположной прямым эффектам пептида, которая может объясняться снижением его уровня в организме вследствие связывания эндогенного пептида вырабатываемыми антителами. В случае иммунизации к ХЦК-3 результаты теста также противоположны эффектам прямого введения пептида: снижение периода иммобилизации (40 % контроля) и небольшой рост времени пассивного плавания (116% от контроля), позволяют говорить об отсутствии депрессивных элементов в поведении крыс. Следует отметить, что, иммунизация конъюгатом ХЦК-3 вызывала менее выраженный антидепрессивный эффект, чем к ХЦК-4.

Данные изменения наблюдались достаточно длительное время – более месяца после окончания иммунизации, в то время, как максимальный зарегистрированный срок действия ХЦК-4 при прямом введении не превышает нескольких суток.

Биохимические эффекты.

Биохимический анализ стриатума мозга крыс, иммунизированных коньюгатом ХЦК-4 с БСА, выявил наличие ряда изменений в содержании биоаминов и их метаболитов, направленность которых по ряду параметров была противоположна изменениям после однократного введения ХЦК-4 (в первую очередь, это касается ДА и его метаболитов). Нами наблюдалось статистически значимое повышение уровня ДА, снижение метаболита ДА – ГВК и соотношения ГВК/ДА и ДОФУК/ДА. Уровень 5-ОT не менялся (Рис. 9).

Некоторые различия по сравнению с иммунизацией к ХЦК-4 были выявлены при биохимическом анализе мозга крыс, иммунизированных к ХЦКТак, отмечено, что содержание ДА не меняется, но наблюдается статистически значимое снижение содержания ГВК и снижение соотношения ГВК/ДА. В то же время отмечено статистически значимое снижение уровня 5ОТ и его метаболита – 5-ОИУК. Также, как и при иммунизации к ХЦК-4, направленность наблюдаемых у иммунизированных крыс изменений, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна тем, которые мы наблюдали после однократного парентерального введения ХЦК-3, где содержание ДА снижалось, а уровень 5-ОТ не менялся.

Рис. 9. Биохимические последствия иммунизации (% контроля, контроль n=12).

светлые столбики - конъюгат ХЦК-4 с БСА (n=13);

темные столбики - конъюгат ХЦК-3 с БСА (n=13).

Если сравнить биохимические следствия иммунизации к ХЦК-3 и ХЦК- (табл.4), то можно отметить, что при иммунизации к ХЦК-3 наибольшие изменения наблюдаются в системе серотонина, а при иммунизации к ХЦК-4 - в системе дофамина. Межгрупповые различия по содержанию 5-ОT и метаболита ДА – ГВК статистически значимы. Возможно, именно снижением уровня 5-ОT обусловлен факт меньшего антидепрессивного действия иммунизации к ХЦК-3, чем к ХЦК-4.

Таким образом, ХЦК-3 и ХЦК-4, ковалентно связанные с антигеномносителем, вызывают длительный (в течение двух месяцев и более) анксиолитический и антидепрессивный эффект. Наряду с этим показаны изменения уровня биоаминов в стриатуме, направленность которых, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна прямому действию исследуемых пептидов.

катехоламинов в мозге.

к ХЦК- Подбор режима иммунизации, возможного к применению в клинике.

Показанная нами эффективность иммунизации к пептидам-индукторам тревоги и ее анксиолитическая направленность позволяют положительно оценить перспективность данного направления в плане длительной иммунокоррекции патологических состояний тревожности. Однако, используемый нами при иммунизации иммуностимулятор (ПАФ) и антигенноситель (БСА) не рекомендованы для применения на людях. Поиск разрешенного в клинике адъюванта для иммунизации к ХЦК-4 заставил нас обратить внимание на полиоксидоний (ПО), созданный в Институте иммунологии Минздрава РФ. Препарат широко применяется в клинике как иммуномодулятор, детоксикант, пролонгирующий носитель фармакологически активных соединений (НекрасовА.В., и др., 2000). В качестве высокомолекулярного антигена-носителя мы использовали столбнячный анатоксин (СтА).

Иммунизация крыс конъюгатом ХЦК-4 с СтА сопровождалась формированием аутоантител к ХЦК-4, причем титр антител был даже несколько выше, чем при иммунизации ХЦК-4 с БСА (1/6400 – 1/12800). На поведенческом уровне также отмечался достоверный анксиолитический и противодепрессивный эффект во всех используемых тестах. Направленность биохимических изменений при оценке уровня дофамина, серотонина и их метаболитов была близка к описаной выше для иммунизации конъюгатом ХЦК-4 с БСА.

Иммунизация конъюгатом ХЦК-4 с БСА с использованием ПО в качестве иммуномодулятора, показал его эффективность (титр антител к ХЦК-4 1/3200).

При оценке поведения иммунизированных крыс было показано снижение уровня тревожности, сходное с эффектами иммунизации с ПАФ.

И, наконец, на заключительном этапе, нами была показана эффективность иммунизации к ХЦК-4 при использовании столбнячного анатоксина и полиоксидония одновременно, о чем свидетельствовал как иммунологический анализ (титр 1/6400), так и выраженный анксиолитический эффект в поведении крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачей настоящего исследования было изучение кратковременных и отложенных эффектов пептидных регуляторов - индукторов тревожности. Мы обнаружили значительное сходство прямых поведенческих эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3. Традиционно считается, что минимальный биологически активный фрагмент гастрина/холецистокинина – это C-концевая амидированная тетрапептидная последовательность (Morley JS et.al, 1965). Согласно гипотезе, высказанной Ренфельдом (Rehfeld JF, 2000) в реализации основных биологических эффектов ХЦК4 большая роль принадлежит строению Nтерминали тетрапептида. Было показано, что наиболее важным для узнавания молекулы рецептором является гидрофобное взаимодействие, в данном случае взаимодействие с участием боковых радикалов двух ароматических аминокислот ХЦК-4 – фенилаланина и триптофана, причем важность триптофана в качестве фармакофорной группы несомненна (Гудашева Т.А. и др., 2007). Например, эндогенные пептиды ХЦK-8 и ХЦK-5, обладающие анксиогенными свойствами (Harro J et.al., 1990, Rex A et.a.,l 1994), представляют собой расширения N-терминали ХЦK-4.

Основываясь на этом, разработка веществ, способных взаимодействовать с ХЦК-В рецепторами шла в направлении усложнения дизайна молекулы тетрапептида (Horwell et al., 1991; Анохина И.П. и др., 1998; Проскурякова Т.В.

и др., 2005; Гудашева Т.А. и др., 2007). Однако, впервые выявленный нами анксиогенный эффект ХЦК-3, позволяет предположить, что среди агонистов рецепторов ХЦК В, играющих важную роль в этиологии тревожных состояний, наряду с аналогом ХЦК-4 – пентагастрином и аналогом ХЦК-8 – церулеином, является и ХЦК-3.

Сравнительная оценка дериватов пентагастрина показала, что разные модификации пептида оказывают противоположное влияние на поведение животных. ПГ оказывал анксиогенное действие, а БОК-ПГ - анксиолитическое.

Однако, скорее всего, одного добавления БОК-структуры недостаточно для столь кардинального изменения свойств пептида: известно, что эффекты модифицированного тетрапептида БОК-ХЦK-4 идентичны действию ХЦК-4 во всех используемых тестах и носят ярко выраженный анксиогенный характер (Rex A et.al 1994; Koks S, et.al., 1999 и др.). Как уже отмечалось, коммерческий препарат пентагастрина не идентичен эндогенному ХЦК-5 (Gly заменен на Ala). Возможно, именно это объясняет, почему эффекты БОК-пентагастрина не всегда идентичны анксиогенному действию ХЦК-4 (Palmour RM et.al 1992, Rupniak NMJ et.al, 1993), а иногда (как в нашем случае) имеют анксиолитическую направленность.

Весьма важным является впервые выявленное нами существование отставленных во времени изменений как в поведении крыс, так и на биохимическом уровне после однократного введения ХЦК-4 и ХЦК-3.

Проблема объективной оценки длительности действия регуляторных пептидов (РП) и путей продления их эффектов имеет особое значение для их использования в качестве лекарственных средств. Нестабильность большинства регуляторных пептидов в организме ( 20 мин) побудила к созданию очень большого числа аналогов, но лишь немногие из них вышли на предклинические и клинические испытания. Основными их недостатками остаются низкая биодоступность и нежелательные побочные эффекты.

Полученные нами данные свидетельствуют о способности анксиогенных олигопептидов ХЦК-4, ХЦК-3 и, в меньшей степени, пентагастрина индуцировать не только поведенческие, но и биохимические пролонгированные эффекты, идентичные по характеру ранним эффектам этих пептидов в течение 1-12 суток.

Объяснить этот феномен прямым действием исследуемых пептидов на ХЦК-В рецепторы вряд ли возможно. Периоды полураспада ХЦК-4 в грубой синаптосомальной фракции составляет 3 мин (Deschodt-Lanckman M., et al., 1981а), в плазме крови – 13 мин (Koulisher D., et al., 1982), и, следовательно, уже к 10-15 часу после парентерального введения можно полагать их отсутствие в организме (Ашмарин И.П. и др., 2004, Ашмарин И.П. и др., 1996).

Однако уже давно была установлена способность РП не только вызывать прямые эффекты, но и индуцировать выход других регуляторов, в том числе других РП, нейротрофинов, гормонов и регуляторных соединений (Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986; Королева C.В., Ашмарин И.П., 2006), что ведет в ряде случаев к возникновению гораздо более длительных опосредованных эффектов.

Например, многочисленные рилизинг-факторы гипоталамуса способны вызывать непосредственно быстрые физиологические эффекты и одновременно регулировать выход значительно более устойчивых гормонов. Проблема в том, что процессы такого типа характеризуются существенными отличиями быстрых начальных и последующих длительных эффектов. Для лабильных пептидов – таких, как холецистокинины-3 и -4, такой механизм длительных эффектов, представляется маловероятным. Поздние и начальные эффекты этих пептидов, представленные выше, весьма сходны.

С другой стороны представляется вполне вероятным объяснить эффекты, продолжающиеся до 12 суток с момента однократного введения, предположив возможность включения механизмов, сходных с теми, которые функционируют при формировании оперативной или долговременной памяти. Можно предположить, что наблюдаемый нами феномен может быть следствием длительного изменения чувствительности рецепторов после кратковременного воздействия пептида, обусловленного существованием некоторой цепной реакций или индукции процессов, аналогичных процессам консолидации памяти. Наличие отставленных биохимических изменений в мозге подтверждает это предположение.

Для восприятия предложенного нами объяснения (Ашмарин И.П. и др., 2007), необходимо иметь в виду, что, при тестировании тревожности или депрессивности животных в используемых тестах возможен выброс эндогенного ХЦК-4, действующего на рецепторы обычного уровня чувствительности. Если же до тестирования животное уже подвергалось воздействию вводимых извне агонистов ХЦК-В рецепторов, то возможно повышение чувствительности, гиперсенситизация рецепторов. В результате, при тестировании на 1-12 сутки после введения ХЦК-4 или ХЦК-3, секретируемый эндогенный ХЦК-4 воздействует на гиперсенситизированные рецепторы, что и объясняет явление пролонгированного анксиогенного эфекта.

Однако это предположение требует проверки на биохимическом уровне.

Публикаций об отставленных эффектах регуляторных пептидов очень немного. По-видимому, общее положение о нестабильности РП в организме являлось “психологическим тормозом” для исследования отставленных во времени вторичных эффектов. Полученные нами результаты согласуются с данными по применению церулеина (Харро Дж. и др., 1989, Harro,J. et al, 1990) на мышах, где показано, что через 30 мин после внутрибрюшинного введения анксиогенный эффект отсутствовал, а при тестировании через 72 часа наблюдался. В 1983-1984 гг. было показано изменение уровня серотонина и активности МАО на 3-5-й дни после введения аналога энкефалина (Tyr-D-AlaGly-Phe-NH2) (Узбеков М.Г., 1983; Доведова Е.Л., 1984). В 1989 г. была показана способность ХЦК-8 и церулина оказывать длительное (до 3х суток) воздействие на ГАМК-эргическую систему мозга мышей (Nagahama H., 1989).

Другим важным аспектом наших исследований является демонстрация долговременных инверсных эффектов, смоделированных путем активной иммунизации против эндогенных анксиогенных пептидов – ХЦК-3 и ХЦК-4.

Иммунизация крыс синтезированными ковалентными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигеном-носителем сопровождалось формированием антител к ХЦК-4 (титр 1:6400) и ХЦК-3 (титр 1:12800). Направленность вызванных иммунизацией длительных поведенческих эффектов была противоположна прямому действию ХЦК-3 и ХЦК-4. В поведенческих экспериментах у крыс отмечался выраженный анксиолитический эффект. Более того, показано и наличие атидепрессивного эффекта. Наряду с долговременным антидепрессивным и анксиолитическим действием иммунизации к ХЦК-4 и ХЦК-3, нами впервые показаны изменения уровня биоаминов в стриатуме, направленность которых, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна прямому действию исследуемых пептидов. Полученные нами результаты, показавшие, что иммунизация к ХЦК-3 и ХЦК-4 сопровождается биохимическими изменениями в мозге, дают основание предполагать, что образующиеся в результате иммунизации антитела к ХЦК-3 и ХЦК-4 проходят через ГЭБ. В настоящее время ревизован ряд представлений о непроницаемости ГЭБ для аутоантител и крупных пептидов (Meeker M.L. et al., 1987; Ашмарин И.П. и др., 1997; Крыжановский Г. Н., Магаева С. В., 1990; Марьянович А. Т., Поляков Е. А., 1991; Passaro E Jr et al., 1982b; Reiber H et al., 1988; Reiber H et al., 1984).

Выполненные нами исследования по активной иммунизации крыс с использованием эндогенного регуляторного пептида ХЦК-4 и его аналога ХЦК-3, являющихся анксиогенами, позволили впервые показать возможность направленной и длительной (месяцы) иммунокоррекции патологических состояний тревожности и страха и, возможно, депрессий.

Полученные данные, и опыт, накопленный в исследованиях, выполненных на кафедрах ВНД и ФЧЖ Биофака МГУ, свидетельствуют о том, что инверсная иммунорегуляция – иммунизация ковалентными конъюгатами эндогенных регуляторов с антигенами-носителями, - представляется весьма перспективным путем долговременной коррекции ряда патологических состояний. Развитие этого метода может привести к созданию практичных способов долговременной коррекции различных форм хронических психических заболеваний - методов, которые не требуют систематического введения лекарств.

Показанная нами возможность и эффективность использования при иммунизации разрешенных для применения к клинике столбнячного анатоксина в качестве антигена-носителя и иммуномодулятора – полиоксидония, расширяют возможности такого направления. Полученные нами данные о возможности направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха, в том числе и с использованием столбнячного анатоксина и полиоксидония, в настоящее время не имеют аналогов ни в России, ни за рубежом.

Таким образом, проведенные в рамках нашей работы исследования позволили не только уточнить роль ХЦК-4 в этиологии тревожных и панических состояний, но и впервые выявить анксиогенные свойства его меньшего структурного аналога - ХЦК-3. Данные по изучению отставленных анксиогенных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 как по физиологическим, так и биохимическим показателям на сегодняшний день в зарубежной литературе отсутствуют. Также получены принципиально новые данные о возможности направленной и длительной (месяцы) иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха иммунизацией ковалентными конъюгатами этих пептидов.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ эффектов ХЦК-4, обладающего анксиогенными свойствами, и его аналогов выявил значительное сходство прямых поведенческих эффектов ранее не исследованного меньшего структурного аналога ХЦК-4 – трипептида ХЦК-3 (HCl-Met-Asp-Phe-NH2) и пентагастрина (Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2).

2. Выявленный анксиолитический эффект деривата пентагастрина – Бокпентагастрина (N-t-BOC-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2) свидетельствует о том, что один и тот же пептид в зависимости от модификации может оказывать разнонаправленное действие на поведение животных.

3. Продемонстрирован весьма важный факт отставленных во времени изменений как на поведенческом, так и на биохимическом уровне, наблюдающихся не только в пределах нескольких часов, но и нескольких суток после однократного введения.

4. Показана возможность и эффективность активной иммунизации крыс не только к фрагменту ХЦК (30-33), но и ХЦК (31-33) (ковалентно связанных с БСА), которая вызывает долговременные анксиолитические изменения в поведении крыс, по своей направленности противоположные анксиогенному действию самих пептидов. Иммуноферментный анализ свидетельствует о наличии антител к ХЦК-4 и ХЦК-3 в сыворотках крови иммунизированных крыс.

5. Инверсные эффекты иммунизации как к ХЦК-4, так и ХЦК-3, направленность которых противоположна тем, что наблюдаются после однократного парентерального введения этих пептидов, выражаются не только в поведении, но и в содержании биоаминов и их метаболитов в мозге крыс.

6. Наличие анксиолитических компонентов в поведении иммунизированных крыс, их длительность, а также разработанный режим иммунизации с использованием наиболее оптимальных и эффективных для людей антигеновносителей и иммуностимуляторов, разрешенных к применению в клинике указывает на перспективность развития данного направления в плане длительной иммунокоррекции патологических состояний тревожности.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Данилова Р.А., Рудько О.И., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П.

Индукторы и ингибиторы тревожности: дифференциальное действие пентагастринов на поведение белых крыс. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 1998, т.84, №10, стр. 1100-1107.

2. Федорова И.М., Рудько О.И., Кушнир Е.А. Дифференциальное действие пентагастринов на поведение белых крыс. Конференция молодых ученых по проблемам высшей нервной деятельности, посвященная 90-летию со дня рождения Л.Г.Воронина. Тезисы докладов М., 1998, стр. 36.

3. Данилова Р.А., Рудько О.И., Короткова Т.М., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Длительные изменения поведения белых крыс при иммунизации к холецистокинину-4. Международная конференция «Механизмы функционирования висцеральных систем». Тезисы докладов, Спб., 1999, стр. 109.

4. Korotkova T.M., Rudko O.I. Correction of panic states and other effects of active immunization Against cholecystokinin–4 in rats. 2-nd International Medical Conference "Medicine at the turn of Millenia". Abstracts, Lublin, Poland, 2000, P.84.

5. Данилова Р.А., Рудько О.И., Короткова Т.М, Обухова М.Ф., Ашмарин И.П.

Влияние иммунизации к фрагменту ХЦК 30-33 на поведение белых крыс.

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2000, т.86, № 9, стр. 1167-1174.

6. Рудько О.И., Короткова Т.М. Коррекция поведения тревожности и страха иммунизацией к холецистокинину-4. II-я Российская конференция молодых ученых России с международным участием “Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины”. Тезисы докладов М., 2001, т.1. стр. 281.

7. Рудько О.И. Влияние иммунизации к фрагменту ХЦК (30-33) на болевую чувствительность белых крыс. 6-ая Пущинская конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”. Тезисы докладов, Пущино, 2002, т.1.

стр. 133-134.

8. Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Рудько О.И., Кушнир Е.А. Изучение экспрессии гена холецистокинина у белых крыс с алкогольной зависимостью. 6-ая Пущинская конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”. Тезисы докладов, Пущино, 2002, т.1. стр. 255-256.

9. Рудько О.И. Эффекты прямого введения и активной иммунизации к синтетическому аналогу фрагмента ХЦК 30-33 на поведение белых крыс.

Научная конференция молодых ученых, Институт ВНД РАН. Тезисы докладов, М., 2002, стр. 13.

10. Danilova RA, Rud'ko OI, Korotkova TM, Obukhova MF, Ashmarin IP. The effects of immunization against cholecystokinin fragment 30-33 in the behavior of white rats. Neurosci Behav Physiol. 2002, v 32(2), P189-94.

11. Белопольская М.В., Рудько О.И., Данилова Р.А., Ашмарин И.П.

Моделирование дезрегуляторной патологии. Иммунологические подходы к созданию долговременных моделей депрессивных и тревожных состояний и их коррекции. "Дизрегуляционная патология", М., «Медицина» 2002, стр.

483-505.

12. Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И., Обухова М.Ф., Белопольская М.В. Долговременная иммунологическая коррекция состояний тревожности и страха. Международный междисциплинарный семинар «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина», Словакия, Высокие Татры. Тезисы докладов, М., 2003, стр. 21.

13. Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И., Обухова М.Ф., Андреева Л.А.

Долговременное действие пептидных регуляторов, отложенные и инверсные эффекты холецистокинина –4 и –3. Медицинский академический журнал, 2004, т. 4, №1, стр. 4-13.

14. Кушнир Е.А., Рудько О.И., Ловать М.Л.,.Обухова М.Ф, Данилова Р.А., Ашмарин И.П. Полиоксидоний как адъювант при активной иммунизации к алкогольдегидрогеназе и холецистокинину-4 с целью коррекции патологии поведения. XI российский национальный конгресс «Человек и лекарство».

Тезисы докладов, М., 2004, стр. 218.

15. Ashmarin I.P., Rud'ko O.I., Danilova R.A., Andreeva L.A. Postponed effect of cholecystokinin fragments 30-33 (CCK-4) and 1-33 (ССК-3) on albino rats behavior. Neuroscience research communications v.34 (3), P 165- 16. Рудько О.И., Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Оценка эффективности новых схем активной иммунизации к ХЦК-4 с целью долговременной терапии тревожных расстройств в клинике. Материалы XII международной конференции IT+ME’2004 (Гурзуф, Украина) в журнале «Успехи современного естествознания», 2004, №6, Приложение 1, т. 1, стр.

17. Рудько О.И., Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Отставленные эффекты нейропептидов – индукторов тревожности. Материалы XIX съезда Физиологического Общества Им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004 в Российском физиологическом журнале им. И. М. Сеченова, 2004, т.90, № 8, 18. Ashmarin IP, Danilova RA, Rud'ko OI, Belopolskaya MV, Obukhova MF, Shmalgausen EV. An immunochemical approach to model and long-term suppression of depressive and anxiety behavior. Span J Psychol. 2006 Nov;

9(2):219-27.

19. Ashmarin I.P., Danilova R.A., Rudko O.I., Amelchenko E.M. Postponed effects of short-living anxiogenic peptides. Second international interdisciplinary congress "Neuroscience for medicine and psychology" Sudak, Crimea, Ukraine (Abstracts P.55-56).

20. И.П. Ашмарин, Р.А. Данилова, М.В. Белопольская,О.И. Рудько, М.Ф.

Обухова, Е.В. Шмальгаузен. Индукция аутоиммунитета к эндогенным нейрорегуляторам изатину и холецистокинину - путь к моделированию и коррекции депрессивного поведения. Нейрохимия 2006, №23, стр. 228-233.

21. Ashmarin IP, Danilova RA, Obukhova MF, Rud'ko OI, Andreeva LA. Longlasting Changes of Albino Rats Behavior and Brain Bioamines Content After Immunization Against Cholecystokinin-3 and -4. Neurochem Res. 2007, 32:395Е.А. Климов, Л.А. Коробейникова, О.М. Рябинина, Ю.Э. Азимова, О.И.

Рудько. Полиморфизм гена CCK и тревожные расстройства. Материалы XV международной конференции и дискуссионного научного клуба “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (IT + M&Ec’2007)”. Украина, Гурзуф, 2007, стр. 32-34.

пролонгированного действия короткоживущих анксиогенных олигопептидов на крысах», Биомедицина, 2007, №6, стр.103-110.

24. Ashmarin I.P., Danilova R.A., Rudko O. I., Belopolskaya M.V., Obukhova M.F., Shmalgausen E.V. “Induction of autoimmunity against endogenous neuroregulators isatin and cholecystokinin as a method of modeling and correction of depressive behavior”. Neurochemical Journal, 2007, v.1, N 2, p.133-137.

25. Рудько О.И., Амельченко Е.М., Зятикова М.Ю., Сергеева Н.И., Данилова Р.А., Андреева Л.А., Ашмарин И.П. Влияние пептидов - индукторов тревожности на поведение белых крыс, феномен совместного введения.

Материалы XV международной конференции и дискуссионного научного клуба “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (IT + M&Ec’2007)”. Украина, Гурзуф, 2007. стр.

114-115.



 
Похожие работы:

«Шамсувалеева Эльмира Шамилевна ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ СОБАК) С ДИКОЙ ФАУНОЙ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ - 2008 Работа выполнена на кафедре биоэкологии естественно-географического факультета Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (ТГГПУ) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Рахимов Ильгизар Ильясович...»

«Рыжакова Ольга Сергеевна ИНТЕРСТИЦИАЛЬНАЯ КОЛЛАГЕНАЗА (ММП-1) И ЕЁ ЭНДОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ГЕНОМ Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ТИПА (HPV16) 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук Научный руководитель : доктор...»

«Артамонова Валентина Сергеевна ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ИСКУССТВЕННО ПОДДЕРЖИВАЕМЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (Salmo salar L.) 03.00.15 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 1 Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской Академии наук Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Глазко Валерий Иванович доктор...»

«Тихонов Алексей Владимирович ВОСЬМИГЕМОВЫЕ НИТРИТРЕДУКТАЗЫ ИЗ ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА THIOALKALIVIBRIO: КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ АДАПТАЦИИ Специальность 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2012 Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук Научный...»

«ПОДОСОКОРСКАЯ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА НОВЫЕ АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ Специальность 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН) Научный руководитель : Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна доктор биологических наук...»

«Работа выполнена в Зоологическом институте РАН и Мурманском морском биологическом институте КНЦ РАН ДЕНИСЕНКО Официальные оппоненты : доктор биологических наук, Станислав Григорьевич профессор Бергер В.Я. доктор биологических наук, профессор МАКРОЗООБЕНТОС БАРЕНЦЕВА МОРЯ Брязгин В.Ф. В УСЛОВИЯХ МЕНЯЮЩЕГОСЯ КЛИМАТА И АНТРОПОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ доктор биологических наук Гебрук А.В. Специальность 03.00.18 – гидробиология Ведущая организация : Всероссийский...»

«Рудик Анастасия Владимировна КОМПЬЮТЕРНЫЙ ПРОГНОЗ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ 03.00.28 - биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2007 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук. Научный руководитель : кандидат физико-математических наук Филимонов Дмитрий Алексеевич Официальные оппоненты : доктор...»

«Романова Юлия Джафаровна Механизмы регуляции активности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2009 Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов при кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина. Научный руководитель : доктор биологических наук Филимонова Мария Николаевна...»

«НОГОВИЦИНА Екатерина Михайловна БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ -СИТОСТЕРОЛА И ЕГО 3-АЦИЛ ПРОИЗВОДНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS 03.00.07 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2007 2 Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«Свинарева Людмила Владимировна Влияние модифицированных ДНК- и РНКолигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2010 Работа выполнена в ГУЗ Московском НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы и на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии...»

«Алехина Ольга Михайловна КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Институте белка РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, академик Спирин Александр Сергеевич кандидат физико-математических наук Василенко Константин Станиславович Официальные оппоненты : доктор химических наук,...»

«УДК 572 ГОРБАЧЕВА Анна Константиновна ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И СОМАТИЧЕСКОГО СТАТУСА ДЕТЕЙ Г.МОСКВЫ В СВЯЗИ С СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКИМИ, ЭКОЛОГИЧЕСКИМИ И МЕДИЦИНСКИМИ ФАКТОРАМИ Специальность 03.00.14 - Антропология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – Работа выполнена на...»

«Суханова Ирина Васильевна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ВОДОЕМОВ В УСЛОВИЯХ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ (НА ПРИМЕРЕ Г. ТОМСКА) 03.00.16. – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск - 2007 Работа выполнена на кафедре экологического менеджмента ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Адам Александр Мартынович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор...»

«АБРАМОВА Ксения Ивановна АУТОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЛЬГИЦИДНОЙ И САНИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ РОГОЗА УЗКОЛИСТНОГО (TYPHA ANGUSTIFOLIA L.) В УСЛОВИЯХ НАГРУЗКИ ПО НИТРАТНОМУ АЗОТУ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Н.Новгород 2009 Работа выполнена в лаборатории гидробиологии Государственного бюджетного учреждения Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан (ГБУ ИПЭН АН РТ) Научный...»

«ФРОЛОВ Даниил Анатольевич ФЛОРА БАССЕЙНА РЕКИ СВИЯГИ 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Масленников Андрей Викторович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мартыненко Вера Антоновна...»

«БЕККЕР ОЛЬГА БОРИСОВНА СОЗДАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ СКРИНИНГА ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ФОСФОТРАНСФЕРАЗ 03.02.07 - генетика. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1 Москва 2011. Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Даниленко Валерий Николаевич УРАН Институт общей генетики им. Н.И....»

«Брежнева Ирина Николаевна МЕТОДИКА ОЦЕНКИ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФИТОСТРОМУ ПРИ СТРОИТЕЛЬСТВЕ СКВАЖИН (на примере Оренбургского Предуралья) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2010 2 Работа выполнена в Волго-Уральском научно-исследовательском и проектном институте нефти и газа, г. Оренбург доктор биологических наук, профессор, Научный Рябинина Зинаида Николаевна руководитель доктор...»

«БАВРИНА АННА ПЕТРОВНА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ В КОЛЛОИДНЫХ УЗЛАХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА 03.00.04 – биохимия 03.00.13 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2008 Работа выполнена в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского и ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор...»

«Минич Александр Сергеевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ ПОД ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ПЛЕНКАМИ Специальность 03.02.08 – Экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск – 2011 2 Работа выполнена на кафедрах ботаники и органической химии биологохимического факультета ФГБОУ ВПО Томский государственный педагогический университет Научный консультант : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.