WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Майорова

Ангелина Александровна

Идентификация нетуберкулезных микобактерий

и выбор оптимальной комбинации методов

для их видовой дифференциации.

03.00.07 – Микробиология

Автореферат

диссертации

на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва, 2007 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич кандидат биологических наук Степаншина Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кочеровец Владимир Иванович доктор биологических наук Скотникова Ольга Ивановна.

Ведущая организация – Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН.

Защита состоится «» в _на заседании диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.

Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. адм. Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московского научноисследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.

Габричевского Автореферат разослан «» 2007 года Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В последние годы резко возросла частота заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (НТМБ). Главным образом это связано с увеличением количества людей, страдающих иммунодефицитами, в том числе СПИДом, а также с усовершенствованием методов идентификации микобактерий [Falkinham J.O. III, 1996; Bonard D. at al., 2004; Martn-Casabona N. at al., 2004].





Традиционно микобактериозы не относят в группу опасных инфекций, так как считается, что они не передаются от человека к человеку [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Falkinham J.O. III, 1996]. Однако эти заболевания могут протекать очень тяжело, нередко приводя к летальному исходу [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Грузевский А.А., 1999].

Заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, у больных без серьезных нарушений иммунной системы, обычно ограничиваются поражением легких, лимфы или кожи [Falkinham J.O. III, 1996]. Диссеминированные формы микобактериозов у них встречаются редко. Микобактерии часто поражают легкие у людей, страдающих хроническими заболеваниями - пневмокониозом, силикозом, бронхоэктазами, саркоидозом, коллагенозом и другими заболеваниями [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Marras T.K. at al., 2002; Ergin A. at al., 2004]. Нетуберкулезные микобактерии могут быть причиной послеоперационных осложнений или травм [Falkinham J.O. III, 1996]. Микобактериозы по своей клинической картине и течению очень похожи на заболевания, вызываемые микобактериями туберкулеза [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Ellis S.M. at al., 2002].

Нетуберкулезными микобактериями инфицировано от 25 до 50 % больных СПИДом в США и Европе [Falkinham J.O. III, 1996]. Риск развития микобактериозов и бактериемии в отсутствии профилактики у ВИЧ - инфицированных больных составляет 10-20% в год [Holland SM., 2001]. У пациентов со СПИДом обычно развиваются диссеминированные формы микобактериозов, что также является следствием имммунодифицитного состояния [Falkinham J.O. III, 1996].

Род Mycobacterium включает около 100 охарактеризованных видов [Primm T.P.

at al., 2004; Katoch V.M., 2004]. Описано более 20 видов нетуберкулезных микобактерий, способных вызывать заболевания человека [Ellis S.M. at al., 2002].

Различные нозологические формы заболеваний могут быть вызваны одним видом и, наоборот, причиной сходных по клиническим проявлениям заболеваний могут быть разные виды микобактерий [Ellis S.M. at al., 2002]. Следовательно, для лечения микобактериозов требуются разные схемы лечения [Heginbothom M.L, 2001].

Своевременное выявление заболевания и адекватная терапия являются необходимыми условиями успешного выздоровления пациента. Однако, к настоящему времени не существует универсальных методов для быстрой и дешевой идентификации нетуберкулезных микобактерий.

Идентификация клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих в Центральном и Приволжском федеральных округах России и выбор оптимальной комбинации методов для определения видовой принадлежности.

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать штаммы нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических методов.

2. Провести видовую идентификацию штаммов НТМБ с помощью молекулярногенетических методов.

3. Оценить дифференциально-диагностическую способность отдельных методов для идентификации микобактерий.

4. Определить лекарственную устойчивость клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.





5. Создать коллекцию клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованных культуральными, биохимическими и молекулярногенетическими методами.

идентификации нетуберкулезных микобактерий: 1) ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, 2) рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и 3) высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography - HPLC). В случаях генетически близкородственных видов, как, например M.

kansasii/M. gastri и M. ulcerans/M. marinum, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими микробиологическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий. Определена лекарственная устойчивость штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.

Впервые проведено изучение клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, полученных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, с помощью как традиционных микробиологических, так и современных молекулярно-генетических методов.

Практическое значение работы. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам, которую можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов. Проведен анализ ряда основных методов, позволяющих осуществлять идентификацию НТМБ и их внутривидовую дифференциацию. Своевременная идентификация позволяет назначать больным, как туберкулезом, так и микобактериозами адекватную схему лечения или вносить в нее коррективы в течение нескольких суток.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Проведена сравнительная характеристика методов, используемых для идентификации НТМБ (ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и HPLC) для применения в повседневной практике. Применение культуральных и биохимических тестов и ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК в 99 % случаев позволяет определить видовую принадлежность НТМБ.

2. Обнаружена внутривидовая вариабельность вида M. fortuitum. При использовании метода рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК выявлено пять геногрупп данного вида микобактерий.

3. При определении лекарственной устойчивости клинических и лабораторных штаммов НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам – стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину выявлена высокая устойчивость к этим препаратам.

4. Выявлено, что среди НТМБ, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, преобладают виды M. avium, M. intracellulare и M. kansasii.

Создана коллекция НТМБ, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам.

Апробация работы. Результаты работы доложены на заседании Ученого Совета ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 26 января 2007 г. Результаты работы обсуждены на VII Российском съезде фтизиатров (Россия, Москва, 2003 г.) и на VII межгосударственной научнопрактической конференции (Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 11 работ отечественных и 147 работ зарубежных авторов. Работа содержит 13 рисунков и 14 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего в работе использовано 103 штамма микобактерий. Лабораторные штаммы M. fortuitum, M. chelonei, M. scrofulaceum, M. gordonae, M. avium, M.

smegmatis (M), M. smegmatis (Н), M. bovis 1, M. bovis 2, M. bovis 3 и 54 клинических штамма, выделенных от людей предоставлены Медведевой И.М. (Московская медицинская академии имени И.М.Сеченова). Штаммы НТМБ выделены от больных (возрастная группа 56-84 лет), находившихся на учете в региональных туберкулезных диспансерах на протяжении 3-7 лет. Периодически, при обострении заболевания, больные получали стандартное противотуберкулезное лечение. Это были пациенты с затяжными, трудно поддающимися лечению заболеваниями легких. Все они, согласно историям болезни, имели диагноз туберкулез легких (различные формы). Диагноз подтвержден рентгенологически.

противотуберкулезный диспансер, г. Нижний Новгород), которые были выделены из мокроты пациентов с предварительным диагнозом – микобактериоз. В работе исследованы штаммы, полученные от Левачевой В.А., выделенные из мокроты пациентов с диагнозом туберкулез легких из областного противотуберкулезного диспансера, г. Тула. Тринадцать штаммов нетуберкулезных микобактерий, выделенных от животных (крупного рогатого скота и свиней) получены из Научноисследовательского ветеринарного института (г. Нижний Новгород) от Лазовской А.Л. Лабораторные референс-штаммы M. tuberculosis H37Rv, M. gordonae, M.

fortuitum и M. ulcerans были любезно предоставлены доктором Barry Clifton III (National Institutes of Health, MD, USA). Штамм M. bovis BCG получен из ГИСКа имени Тарасевича. Для культивирования микобактерий использовали среду Левенштейна-Йенсена. Культуру хранили в лактозно-глицериновой защитной среде при температуре -70С.

соответствии с приказом № 109 от 21 марта 2003 г. Учитывали скорость роста культуры при 37°C, способность к росту при 22°C, 45°C, а так же морфологию и цвет колоний, использовали тест на определение способности микобактерий к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия, 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, 5% хлористый натрий. Ниациновый тест проводился согласно методике, предложенной Кубиком и Кильбурном, в модификации Бараускене. Способность микобактерий использовать амиды (мочевину, никотинамид и пиразинамид) в процессе метаболизма определяли по методу Такэ. Наличие формамидазной активности проверяли по модифицированной методике Дыхно.

Активность и термостабильность каталазы определяли по методикам Kent P. T.

et al., 1985. Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Грисса [Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез. М., 2001]. Определение уровней устойчивости штаммов НТМБ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу на среде Левенштейна-Йенсена проводили методом абсолютных концентраций [Приказ № 109].

Выделение хромосомной ДНК осуществляли по методу Маниатис Т. и др., 1984. Наличие инсерционного элемента IS6110 выявляли амплификацией с использованием праймеров, нуклеотидная последовательность которых опубликована в работе Dubiley S. et al., 2005. Сполиготипирование выполняли по методике Kamerbeek J., Schouls L., et al. 1997. ПЦР – секвенирование фрагмента гена, кодирующего синтез 16S рРНК выполняли по методике Kirschner P. et al., 1998.

Метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рДНК осуществляли по методике Lappayawichit P. et al., 1996. HPLC выполняли по методике Butler W.R. et al, 2001.

Дифференциация культур на нетуберкулезные микобактерии и Нетуберкулезные микобактерии в отличие от микобактерий туберкулёзного комплекса растут на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей салициловокислый натрий или р-нитробензойную кислоту. Инсерционный элемент IS6110 присутствует в геномах штаммов только туберкулезного комплекса, что позволило нам использовать его в качестве маркера для дифференциации туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий (Рис 1). Микобактериальные культуры (n=83), которые выросли на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением салицилата натрия и паранитробензойной кислоты, и в геномах которых отсутствовал элемент IS6110, были отнесены в группу НТМБ.

1000 п.н.

Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР с ДНК, микробиологические, так и молекулярно-генетические методы позволяют эффективно дифференцировать микобактерии на туберкулезные и нетуберкулезные.

Культуральные и биохимические характеристики штаммов НТМБ.

При анализе штаммов НТМБ учитывались следующие характеристики:

морфология и пигментация колоний, рост при 22С, 37С, 45С, скорость роста, рост на среде с 5% NaCl, определение каталазной амидазной и нитратредуктазной активности, определение термостабильной каталазы.

M. avium (n=31) - нефотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие сухие, шероховатые (24 штамма – 77%) и гладкие, влажные колонии ( штаммов – 23%). Все культуры росли на среде Левенштейна - Йенсена при 22С и 37С, у 22 из 31 исследованной культуры (71%) наблюдался рост при 45С, для всех культур характерна положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие формамидазной активности, отсутствие способности использовать мочевину в процессе жизнедеятельности, отсутствие роста на среде с добавлением 5% NaCl, отрицательная нитратредуктазная активность (кроме одной культуры), у 23 из 31 культуры (74%) обнаружена термостабильная каталаза. Различий в микробиологических характеристиках между штаммами, выделенными от людей и от животных, найдено не было.

M. intracellulare (n=12) - нефотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие сухие, шероховатые колонии. При биохимическом и бактериологическом иследовании получены следующие результаты: отсутствие роста на среде Левенштейна - Йенсена с добавлением 5% NaCl, рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие формамидазной активности, отсутствие уреазы, отрицательная нитратредуктазная активность, у 9 из 12 культур (75%) обнаружена термостабильная каталаза.

M. gordonae (n=3) - скотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие гладкие, влажные колонии. Штаммы растут на среде ЛевенштейнаЙенсена при 22С и 37С, но не растут при 45С, добавление 5% NaCl в среду Левенштейна-Йенсена ингибирует их рост. Штаммы M. gordonae характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной, никотинамидазной и пиразинамидазной активности, отрицательной нитратредуктазной активностью. Уреаза выявлена только у одного штамма.

M. kansasii (n=15) - медленнорастущие штаммы, образующие сухие, шероховатые фотохромогенные колонии; растут при температуре 22С и 37С, рост при 45С отсутствует. Для всех культур характерна нитратредуктазная и уреазная активность. Рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl отсутствует.

Культуры характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной и пиразинамидазной активности. Положительная никотинамидазная активность выявлена у 6 штаммов M.

kansasii (40%).

M. scrofulaceum (n=4) - медленнорастущие штаммы, образующие скотохромогенные гладкие, влажные колонии. Культуры растут при температуре 22С и 37С, рост при 45С отсутствует. Рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl отсутствует. Культуры характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, способностью использовать мочевину в процессе жизнедеятельности. Отсутствие формамидазной и пиразинамидазной активности характерно для всех культур, а положительная нитратредуктазная и никотинамидазная активность выявлена только у одного штамма M. scrofulaceum.

Штамм M. ulcerans (n=1) характеризуется появлением отдельных сухих, шероховатых нефотохромогенных колоний через 5-6 недель после посева. Культура характеризуется отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, ростом при 22C, отсутствием роста при 37C и 45C, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной, никотинамидазной и пиразинамидазной активности, отрицательной каталазной и нитратредуктазной активностью.

При биохимическом и бактериологическом исследовании M. smegmatis (n=2) выявлены следующие свойства культур: рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, рост при 22С, 37С и 45С, появление отдельных нефотохромогенных гладких, влажных колоний менее чем через одну неделю после посева. Оба штамма используют никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма. Для них характерно наличие термостабильной каталазы, положительная нитратредуктазная и каталазная активность, отрицательная пиразинамидазная активность.

Для M. fortuitum (n=13) получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов: рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний колоний менее чем через неделю после посева. На среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl рост отмечен у 6 культур из 13 (46%). Все анализированные культуры используют никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма. Положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы характерно для всех исследованных культур. Отрицательная пиразинамидазная активность выявлена только у трех штаммов M. fortuitum (23%). Различий в микробиологических характеристиках между штаммами, выделенными от людей и от животных, найдено не было.

Для культуры (n=1) M. peregrinum были получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов: рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний менее чем через неделю после посева. Отмечен рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl. Для культуры характерны положительная никотинамидазная, формамидазная, уреазная и пиразинамидазная активность, положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы.

Для штамма M. chelonae/M. abscessus получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов: рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний менее чем через одну неделю после посева, способность использовать пиразинамид, никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма, положительная каталазная активность, наличие термостабильной каталазы и отсутствие нитратредуктазной активности. Добавление 5% NaCl в среду Левенштейна-Йенсена ингибировало рост этой культуры.

Микробиологические методы тестирования сохраняют свою важность, так в случаях генетически близкородственных видов, как, например M. kansasii/M. gastri и M. ulcerans/M. marinum, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими культуральными и биохимическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов.

В результате работы создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам. Коллекцию можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий. Выявлено, что среди нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России преобладают виды M. avium-complex и M. kansasii.

Использование ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК для видовой идентификации нетуберкулезных микобактерий.

В основе метода ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК лежит амплификация участка гена 16S рРНК с последующим секвенированием двух гипервариабельных регионов. В результате ПЦР микобактериальной ДНК образуется фрагмент между 9 и 1036 положениями нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в геноме референс-штамма M. tuberculosis H37Rv. Секвенирование амплификата осуществляли с использованием двух праймеров (Рис.

4). Нуклеотидная последовательность регионов A (150 п.н.) и B (70 п.н.) исследуемого штамма сравнивалась с известными последовательностями для разных видов.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у 27 штаммов НТМБ в гипервариабельном регионе А выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 182/AT, 184/GA, 185/GA, 188/TC, 198/GC, 213/AT, 229/AG и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T; в гипервариабельном регионе В обнаружена замена 461/CT. У четырех культур, кроме вышеперечисленных, обнаружена дополнительная замена 129/GA. Полученные результаты позволили отнести исследованные культуры к виду M. avium. Для этого вида характерна внутривидовая вариабельность последовательности 16S рРНК гена в 129 позиции.

У 12 штаммов НТМБ при секвенировании выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 182/AT, 183/CT, 184/GT, 185/GA, 187/AG, 188/TC, 198/GC, 199/TA, 213/AT, 229/AG, 262/CT и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T в гипервариабельном регионе А; в регионе В - замена 461/CT. По результатам секвенирования эти штаммы идентифицированы как вид M. intracellulare.

У двух исследованных культур НТМБ выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях гена 16S рРНК: 124/GA, 138/TA, 173/GA, 184/GA, 188/TC, 189/GA, 196/TC, 213/AT, 229/AG, 262/CT и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T в регионе А; в регионе В обнаружены замены 461/CT, 468/АG, 469/ T C. У одного штамма, в отличие от двух вышеуказанных культур, в 186 позиции обнаружена замена GA. По результатам секвенирования штаммы отнесены к виду M. gordonae, для которого характерна внутривидовая вариабельность в последовательности 16S рРНК гена.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у 15 штаммов НТМБ в регионе А обнаружены нуклеотидные замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 138/TA, 139/TC, 184/GT, 185/GT, 187/A G, 188/TC, 194/TC, 213/AT, 229/AG и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T. Последовательность региона В идентична соответствующей последовательности M. tuberculosis-complex. Согласно полученным результатам культуры относятся к двум генетически близким видам M.

kansasii/M. gastri, имеющим одинаковую последовательность 16S рРНК гена.

У четырех культур НТМБ в регионе А гена 16S рРНК обнаружены замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 184/GT, 185/GT, 187/A G, 188/TC, 194/TC, 213/AT, 229/AG, 285/TA, 262/CT, и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T. В регионе В замены 453-454/TCCT, 459-460-461/TTCACT, 463-464-465/CTCTGT, 468/АG, делеция позиций 456-457-458. Полученные результаты позволили отнести эти штаммы к виду M. scrofulaceum.

У одного штамма НТМБ выявлены замены в следующих позициях: 189/GT, 196/TC, 213/AT, 229/AG, 260/GA и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T в регионе А; в регионе В обнаружены замены 454/CT, 461/CT. Согласно результатам эти штаммы принадлежат к виду M. ulcerans/M. marinum. У этих двух видов последовательность регионов А и В гена 16S рРНК одинакова.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у двух штаммов НТМБ обнаружены замены в следующих позициях: 140/CT, 173/GA, 181-182/CATG, 184/GT, 187-188/ATTC, 194/TG, 200/GA, 202/TG, 213/AT, 229/AG, 262/CT, делеция в позиции 210-211 CGCTC--T, замены и инсерция в позициях 177-178-179/GGACACC, 196-197/TTCTG в регионе А; замены 440/CG, 443TCCA, 452-453/GTCG, 455/CA, 469/TG, 478/GT, 482/GC, 491/CG и делеция 456-467 нуклеотидов в регионе В. Полученные результаты позволили отнести эти штаммы к виду M. smegmatis.

У одного штамма НТМБ в регионе А гена 16S рРНК выявлены замены в следующих позициях: 140/CT, 185/GC, 187/AC, 189/GT, 194-195TCTGTG, 213/AT, 229/AG, 260/GA, 262/CT, делеция в позиции 210CGCTC--T; замены 440-441/CCAT, 443-444/TCGG, 452-453/GTCG, 455/CA, 469/TG, 478-479/GGCC, 481-482/GGAT, 491/CG и делеция 456нуклеотидов в регионе В. У 12 штаммов НТМБ, кроме вышеперечисленных замен, обнаружены замены в позициях 173/GA и 177/GT. По результатам секвенирования эти штаммы относятся к виду M. fortuitum, для которого характерна внутривидовая вариабельность.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у одного штамма в регионе А обнаружены замены в следующих позициях: 140/CT, 173/GA, 177/GT, 182/AG, 185/GC, 186/GA, 187/AC, 189/GT, 191/AC, 194-195TCTGTG, 213/AT, 229/AG, 260/GA, 262/CT, делеция в позиции 210CGCTC--T; замены 440-441/CCAT, 443-444/TCGG, 452-453/GTCG, 455/CA, 469/TG, 478-479/GGCC, 481-482/GGAT, 491/CG и делеция 456нуклеотидов в регионе В. Полученные результаты позволили отнести исследованную культуру к виду M. peregrinum.

У одного штамма в регионе А гена 16S рРНК обнаружены замены в позициях 139/TC, 140/CT, 184-185-186-187/GGGAACAC, 189/GT, 194-195-196TCTTGTGA, 204/GC, 213/AT, 260/GA, 262/CT, делеция в позиции 210-211 CGCTC--T; замены 440-441/CCGT, 443-444/TCGG, 452-453-454GTCCCGAA, 469/TG, 478-479/GGCC, 481-482/GGAC, 491/CG и делеция 456-467 в регионе В. По результатам сиквенса гипервариабельных регионов 16S рРНК гена, культура была идентифицирована M. chelonae/M. abscessus. Эти два вида имеют одинаковую нуклеотидную последовательность гипервариабельных регионов А и В.

Таким образом, метод ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК позволяет эффективно определять видовую принадлежность нетуберкулезных микобактерий.

Достоинства метода заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения ДНК единичных микобактериальных клеток в клиническом материале. Данный метод позволяет идентифицировать широкий спектр видов микобактерий, включая патогенные виды для человека и животных, а также сапрофитные микобактерии.

Исследование коллекции нетуберкулезных микобактерий рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента спейсерной В качестве альтернативного метода был использован метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК. Кроме определения видовой принадлежности нетуберкулезных микобактерий этот метод позволяет выявить внутривидовую вариабельность.

В полимеразной цепной реакции образцов ДНК, выделенных из 13 штаммов M.

fortuitum и одного штамма M. peregrinum получено несколько вариантов ПЦРпродуктов, различающихся по размеру (470-425 п.н.) и количеству (1 или 2) фрагментов спейсера 16S-23S рДНК (Табл. 1, Рис. 2).

У 7 штаммов амплифицируется два фрагмента спейсера 16S-23S рДНК. Шесть из них образуют ПЦР-продукт размером 470/425 п.н. и относятся к геногруппе M.

fortuitum I. Один штамм, образующий два фрагмента размером 450/425 пн, относится к геногруппе M. fortuitum II. У семи штаммов M. fortuitum амплифицируется один фрагмент спейсера 16S-23S рДНК. Штаммы, образующие амплификаты 470 п.н., отнесены нами к паттерну M. fortuitum X. Для дополнительного изучения пяти штаммов M. fortuitum, формирующих в результате ПЦР фрагмент 450 п.н., проведен рестрикционный анализ с использованием фермента HaeIII. Четыре штамма с рестрикционными профилями 220/140/100 п.н. обозначены нами как M. fortuitum Y и один штамм с профилем 240/220 п.н. - M. fortuitum Z (Табл. 1, Рис. 3).

п.н.

Рис. 2. Электрофореграмма фрагмента спейсера 16S-23S рДНК различных У двух образцов ДНК, выделенных из штаммов M. smegmatis, получены фрагменты спейсера 16S-23S рДНК размером 450 п.н. При рестрикции ПЦРпродуктов исследованных штаммов ферментом HaeIII генерируются фрагменты 200/110 п.н. (Табл. 1, Рис. 2). Полученные данные позволяют дифференцировать M.

smegmatis от M. fortuitum Y и M. fortuitum Z.

п.н.

Рис. 3. Электрофореграмма рестрикции амплифицированного фрагмента спейсера 16S-23S рДНК (450 п.н.) микобактерий рестриктазой HaeIII.

При амплификации ДНК, выделенной из штамма M. chelonae/M. abscessus, получен фрагмент спейсера размером 450 п.н. При рестрикции ПЦР-продукта ферментом HaeIII образуются фрагменты 215/125/105 п.н. Полученные данные позволяют дифференцировать M. chelonae/M. abscessus, M. smegmatis, M. fortuitum Y и M. fortuitum Z.

В результате амплификации ДНК, выделенной из двадцати штаммов M.

tuberculosis complex получены ПЦР-продукты размером 370 п.н. Фрагменты рестрикции, продуцируемые HaeIII, имеют длину 215/95/55 п.н. Профиль рестрикции M. tuberculosis complex отличается от профилей рестрикции НТМБ, но не имеет различий между видами внутри комплекса (Табл. 1).

При рестрикции ПЦР-продуктов спейсера 16S-23S рДНК 31 штамма M. avium ферментом HaeIII генерируются фрагменты ДНК 130/115/80/40 п.н. (Табл. 1, Рис. 4.).

При амплификации спейсера 16S-23S рДНК штаммов M. kansasii получены ПЦР-продукты 370 п.н. Известно два вида паттернов, присущих этому виду.

Амплификат одного из них рестрицируется HaeIII на фрагменты 170/130/65 п.н. (M.

kansasii II), а амплификат другого не рестрицируется HaeIII (M. kansasii I) [Lappayawichit P. et al., 1996]. ПЦР-продукт спейсера 16S-23S рДНК (370 п.н.) анализируемых штаммов M. kansasii при обработке ферментом HaeIII не рестрицируется. Проведена дополнительная обработка ферментом BstXI и получены фрагменты размером 215/150 п.н. Эти результаты позволяют отнести штаммы к группе M. kansasii I (Табл. 1).

Результаты исследования коллекции микобактерий методом рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S M. smegmatis abscessus п.н.

Рис. 4. Продукты рестрикции амплифицированного фрагмента спейсера 16S-23S Амплификат спейсера 16S-23S рДНК (370 п.н.) штаммов M. gordonae ферментом HaeIII не рестрицируются. При дополнительной обработке ПЦРпродуктов ферментом BstXI образуются фрагменты размером 205/155 п.н. (Табл. 1).

Штаммы M. scrofulaceum из нашей коллекции были отнесены к группе M.

scrofulaceum II, так как амплифицированные участки спейсера 16S-23S рДНК ( п.н.) расщепляются рестриктазой HaeIII на фрагменты 130/110/95/40 п.н. (Табл. 1).

По опубликованным данным генетическая разнородность фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рДНК вида M. scrofulaceum выражается в различии профилей рестрикции. Описаны следующие паттерны полиморфных по длине фрагментов рестрикции ферментом HaeIII: M. scrofulaceum I - 200/130/40 п.н., M.

scrofulaceum II - 130/110/95/40 п.н., M. scrofulaceum III - 180/130/40 п.н., M.

scrofulaceum IV - 180/170 п.н. [Lappayawichit P. et al., 1996].

У штаммов, относящихся к виду M. intracellulare, при обработке рестриктазами HaeIII и MspI ПЦР-продукта (370 п.н.) образуются фрагменты ДНК длиной 200/130/40 п.н. и 240/105/25 п.н., соответственно (Табл. 1). Рестрикция ферментом MspI осуществляется для дифференциации M. intracellulare и M. scrofulaceum I, так как профиль рестрикции HaeIII для вышеперечисленных видов одинаков. У штамма M. ulcerans при амплификации участка спейсера 16S-23S рДНК образуется один фрагмент размером 370 п.н. При обработке продукта ПЦР рестриктазой HaeIII генерируются фрагменты 215/155 п.н.

Полученные данные показывают, что метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК позволяет определять видовую принадлежность нетуберкулезных микобактерий. Кроме этого метод позволил выявить внутривидовую вариабельность штаммов M. fortuitum. Достоинства метода заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения ДНК единичных микобактериальных клеток в клиническом материале. Метод является альтернативой более дорогому и требующему специального оборудования методу секвенирования.

– 15, M. intracellulare – 3, M. gordonae – 2, M. kansasii/M. gastri – 5, M. scrofulaceum – 2, M. fortuitum – 9, M. chelonаe/M. abscessus - 1). В качестве негативного контроля для HPLC использовали Candida albicans, микроорганизм, не продуцирующий миколовые кислоты вообще, в качестве позитивного - Mycobacterium avium. Образцы взяты из коллекции Центра контроля и предупреждения заболеваний (США).

сходные хроматографические паттерны, являющиеся характерными для группы MAIS, которая включает такие виды как M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum (рис. 5). Методы ПЦР – секвенирования фрагмента гена, кодирующего синтез 16S принадлежность культур группы MAIS. Две из них принадлежали к виду M.

scrofulaceum, четырнадцать - идентифицированы как вид M. avium, четыре - M.

intracellulare.

паттерны, являющиеся характерными M. kansasii/M. gastri (рис. 5). В результате сравнения полученных хроматографических паттернов с референсными, две микобактериальные культуры были идентифицированы как M. gordonae (рис. 6).

Результаты видовой идентификации совпадают с данными, полученными методами последовательности 16S-23S рибосомной ДНК. В результате HPLC для девяти микобактериальных культур получены одинаковые хроматографические паттерны, являющиеся характерными для M. fortuitum/M. peregrinum (рис. 6).ПЦР – секвенирование и рестрикционный анализ обеспечивает дифференциацию внутри комплекса видов M. fortuitum/M. peregrinum. Все культуры идентифицированы как M.

fortuitum. Кроме этого, рестрикционный анализ позволил отнести исследованные культуры к различным геногруппам вида M. fortuitum. Для одной культуры получен хроматографический паттерн, соответствующий M. chelonae/M. abscessus (рис. 6). Ни один из использованных нами методов не позволил разделить эти два генетически близких вида.

Таким образом, метод HPLC позволяет определить видовую принадлежность микобактерий. Однако его дифференциально-диагностическая способность несколько ниже, чем у методов ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК и рестрикционного анализа близкородственных видов.

Определение уровней устойчивости штаммов НТМБ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу на среде Левенштейна-Йенсена проводили методом абсолютных концентраций (приказ № 109 от 21 марта 2003 г.).

максимальных концентрациях обладали следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M. chelonаe/M. abscessus, M. peregrinum и M. ulcerans.

Высокий уровень лекарственнной устойчивости отмечен для штаммов M.

fortuitum. Три штамма (23%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях. Все штаммы этого вида устойчивы к концентрации 50 мкг/мл стрептомицина и к 50 мкг/мл рифампицина. Три штамма (23%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, восемь штаммов (61,5%) - устойчивы к концентрации 5 мкг/мл и два штамма (15,5%) устойчивы только к критической концентрации этого препарата (1 мкг/мл). Одиннадцать штаммов (85%) устойчивы к концентрации 50 мкг/мл канамицина, один штамм (61,5%) - устойчив к концентрации 30 мкг/мл. Только один штамм чувствителен к канамицину. Четыре штамма (31%) устойчивы к концентрации этамбутола 5 мкг/мл, шесть – только к концентрации мкг/мл.

Семь штаммов M. avium (22%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях. 25 штаммов M. avium (80,6%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, шесть (19,4%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл. Одиннадцать штаммов (35,5%) устойчивы к концентрации изониазида мкг/мл, 19 штаммов (61,3%) - устойчивы к концентрациям 5 мкг/мл и один штамм (3,2%) устойчив только к критической концентрации этого препарата (1 мкг/мл).

Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) – 27 штаммов (87%) и только четыре штамма M. avium (13%) чувствительны. Устойчивы к концентрации 5 мкг/мл этамбутола – штаммов (90,3%). К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма (9,7%). К критической концентрации рифампицина устойчивы четыре штамма M. avium (13%). Устойчивы к концентрации рифампицина 50 мкг/мл – штаммов (87%).

Два штамма M. intracellulare (17%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях. Три штамма M. intracellulare (25%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, девять (75%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл. Шесть штаммов (50%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл и шесть штаммов (50%) - устойчивы к концентрации 5 мкг/мл. Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) – девять штаммов (75%) и только три штамма M.

intracellulare (25%) чувствительны. Устойчивы к концентрации 5 мкг/мл этамбутола– девять штаммов (75%). К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма (25%). Устойчивы к рифампицину (50 мкг/мл) – девять штаммов (87%). К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма M. intracellulare (25%).

Шесть штаммов M. kansasii (40%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, девять (60%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл. Три штамма (20%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, три штамма (20%) - устойчивы к мкг/мл и девять штаммов M. kansasii (60%) устойчивы к критической концентрации этого препарата. Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) все штаммы (100%). Шесть штаммов M. kansasii (40%) устойчивы к этамбутолу (5 мкг/мл), шесть штаммов (40%) устойчивы только к концентрации 2 мкг/мл этого препарата. Три штамма (20%) чувствительны к этамбутолу. Устойчивы к рифампицину (50 мкг/мл) – 12 штаммов (80%). Три штамма M. kansasii (20%) чувствительны к этому препарату.

Штаммы M. scrofulaceum устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, устойчивы к концентрации стрептомицина 10мкг/мл и устойчивы к критической концентрации этамбутола (2 мкг/мл). Штаммы M. scrofulaceum чувствительны к канамицину и рифампицину. Штаммы M. smegmatis устойчивы к максимальным концентрациям стрептомицина (50 мкг/мл), изониазида (25 мкг/мл) и рифампицина (50 мкг/мл); чувствительны к этамбутолу и канамицину. Штаммы M. gordonae устойчивы к концентрации стрептомицина 10 мкг/мл и изониазида 5 мкг/мл. Два штамма устойчивы к концентрации рифампицина 50 мкг/мл. Штаммы M. gordonae чувствительны к канамицину.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высоком уровне устойчивости НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам. В настоящее время методы тестирования лекарственной чувствительности in vitro разработаны только для M. tuberculosis. Существует необходимость разработки методов тестирования лекарственной устойчивости нетуберкулезных микобактерий.

В результате проведенного исследовании создана коллекция штаммов нетуберкулезных микобактерий, включающая в себя 83 штамма, относящихся к видам (M. avium, M. intracellulare, M. gordonae, M. kansasii, M. scrofulaceum, M.

ulcerans, M. smegmatis, M. fortuitum, M. peregrinum, M. chelonae/M. abscessus).

Штаммы охарактеризованы с помощью микробиологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических методов. Определена лекарственная устойчивость клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.

1. Определен видовой состав клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России. Создана коллекция штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованная культуральными, биохимическими и молекулярно-биологическими методами 2. Показано, что каждый из использованных методов - ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и HPLC можно использовать для идентификации нетуберкулезных микобактерий.

3. Установлено, что для дифференциации некоторых генетически близкородственных видов, как, например M. kansasii/M. gastri и M. ulcerans/M.

marinum, имеющих сходные последовательности генов, лучше осуществить с помощью культуральных и биохимических тестов 4. При рестрикционном анализе амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК установлена внутривидовая вариабельность штаммов M. fortuitum. Выявлено пять различных геногрупп данного вида микобактерий 5. Определена лекарственная устойчивость клинических штаммов НТМБ.

Лекарственной устойчивостью к пяти основным противотуберкулезным препаратам (стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу) обладали следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M.

chelonаe/M. abscessus, M. fortuitum и M. avium-complex. Штаммы M.

scrofulaceum чувствительны к рифампицину и канамицину, штаммы M.

smegmatis чувствительны к этамбутолу и канамицину.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Видовая идентификация микобактерий методом ПЦР – секвенирования гена 16S rRNA. // Туберкулез сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. – М., 2003. - С. 111.

2. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Шемякин И.Г., Лазовская А.Л., Ильина Е.А. Использование ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК для видовой идентификации микобактерий нетуберкулезного комплекса.// Молекулярная генетика, микробиология, вирусология - 2004. - 3. - С. 11-20.

3. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Исследование коллекции микобактерий нетуберкулезного комплекса рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2004. - 11. - С.

34-37.

4. Майорова А.А., Степаншина В. Н., Миронова Р.И., Шемякин И.Г. Видовая идентификация микобактерий методом HPLC. Сборник тезисов. ”Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита “Группы восьми” и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств”, Материалы VII межгосударственной научно-практической конференции. Россия, Оболенск, 3- октября 2006 г., с. 114.

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека НТМБ – нетуберкулезные микобактерии п.н. - пар нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция рибосомная ДНК - нуклеотидная последовательность, кодирующая РНК.

спейсер - нуклеотидная последовательность, разделяющая кодирующие области в геноме СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита EMB - этамбутол HPLC - (high performance liquid chromatography) - высокопроизводительная жидкостная хроматография.

IS - инсерционная последовательность MAIS – группа включающая виды M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum

 
Похожие работы:

«ЛАЗАРЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ СЕМЯН У ВИДОВ И СОРТОВ ГРЕЧИХИ FAGOPYRUM MILL. 03.00.12 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург– 2007 2 Работа выполнена в лаборатории биохимии Всероссийского научноисследовательского института зернобобовых и крупяных культур (Орел) в 2003гг. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Павловская Нинель Ефимовна Официальные...»

«Цыремпилов Энхэ Галсанович ПОЧВЫ БАРГУЗИНСКОЙ КОТЛОВИНЫ: РАЗНООБРАЗИЕ, ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И РАЦИОНАЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2013 Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экспериментальной агрохимии ФГБУН Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН и ФГБОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р....»

«ИВАХНЕНКО ВЕРА ИГОРЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ МЕТАЛЛ ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ 03.00.04. – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2008 3 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт питания Российской академии медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук...»

«НЕФЕДОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ЖИВОТНЫХ К АНТРОПОГЕННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ (НА ПРИМЕРЕ РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.08 – экология 0З.03.01 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск - 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева Научный консультант доктор сельскохозяйственных наук, профессор Иванов Евгений...»

«ПОХИЛЬКО Лидия Олеговна Экологические принципы формирования ассортимента древесных растений в озеленении г. Ростова-на-Дону 03.00.16 – экология АФТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Паршин Витольд Георгиевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Дзыбов...»

«КОРЕНДЯСЕВА Татьяна Константиновна Регуляция метаболизма метионина в суспензии свежевыделенных гепатоцитов 03.01.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель : Атауллаханов доктор биологических наук, профессор Фазоил...»

«ЯВМЕТДИНОВ ИЛЬДАР САМИУЛЛОВИЧ ЛАККАЗА И Mn-ПЕРОКСИДАЗА БАЗИДИОМИЦЕТА CERRENA MAXIMA: ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ В БИОСИНТЕЗЕ ГУМИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва –2003 1 Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (временный научный коллектив “Ферментативные основы биодеградации”). Научный руководитель : кандидат биологических наук О.В. Королева Официальные оппоненты : доктор...»

«ГЫНИНОВА АЮР БАЗАРОВНА ПОЧВЫ ДЕЛЬТЫ р. СЕЛЕНГИ (ГЕНЕЗИС, ГЕОГРАФИЯ, ГЕОХИМИЯ) 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории географии и экологии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный консультант : Член-корреспондент РАН, профессор Шоба С.А. Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Г.Д. доктор биологических...»

«Гризель Анастасия Владимировна ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ Kv2.1 И Kv10.2 Специальность: 03.01.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2011 Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова. Научный руководитель : Соколова Ольга Сергеевна кандидат биологических наук,...»

«Свиряева Ирина Владимировна СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ КИСЛОРОДА И АНТИОКСИДАНТЫ В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ Специальность 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс...»

«ВАЛЕЕВА РАУЗА ТИМУРОВНА ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВЫХ ДРОЖЖЕЙ НА ОСНОВЕ СПИРТОВОЙ БАРДЫ 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань - 2007 Работа выполнена на кафедре химической кибернетики Казанского государственного технологического университета Научный руководитель : кандидат технических наук Мухачев Сергей Германович Официальные оппоненты : доктор технических наук, профессор Решетник Ольга...»

«УДК 575.224.22:577.214 Антонцева Елена Вячеславовна ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 2 ГЕНА K-ras МЫШИ, СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ РАКА ЛЕГКИХ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук НОВОСИБИРСК 2006 Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Научный руководитель : доктор биологических наук Т.И. Меркулова Официальные...»

«ЗАМОТАЙЛОВ Александр Сергеевич ФИЛОГЕНИЯ И ТАКСОНОМИЯ ЖУЖЕЛИЦ ПОДСЕМЕЙСТВА P A T R O B I N A E ( C O L E O P T E R A, CARABIDAE) 03.00.09 – Энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2004 2 Работа выполнена на кафедре энтомологии Кубанского государственного аграрного университета. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор А. Ф. Е м е л ь я н о...»

«Иметхенова Оксана Васильевна SPIRAEA AQUILEGIFOLIA PALL. В РАСТИТЕЛЬНОСТИ СЕЛЕНГИНСКОГО СРЕДНЕГОРЬЯ (ЗАПАДНОЕ ЗАБАЙКАЛЬЕ) 03.00.05 Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2008 Работа выполнена в Бурятском государственном университете Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Намзалов Бимба-Цырен Батомункуевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Дулепова Бэлла Ивановна...»

«УДК 577.3 Птушенко Василий Витальевич ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА В ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ОКСИГЕННОГО ТИПА С ПОМОЩЬЮ СПИНОВЫХ МЕТОК 03.00.02 – биофизика 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 г. Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного...»

«Отман Садек Ахмед Мукред Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических...»

«ПОТАПОВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ И ГАЗОТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ В УСЛОВИЯХ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРА 03.00.13 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Архангельск - 2007 Работа выполнена на базе Перинатального центра Республики Коми и в лаборатории проблем гипоксии ГОУ ВПО Сыктывкарский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Иржак Лев Исакович...»

«ДУЛЕПОВА Наталья Алексеевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ РАЗВЕВАЕМЫХ ПЕСКОВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – “Ботаника” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения Российской академии наук. Научный руководитель — доктор биологических наук, с.н.с. Королюк Андрей Юрьевич. Официальные оппоненты : Силантьева...»

«ПРОКОФЬЕВА Мария Юрьевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ СЕМЯН В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КОРНЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в группе специализированного метаболизма корней Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва....»

«Прокопьев Алексей Сергеевич БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА SEDUM В ПРИРОДЕ И В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ В ЛЕСНОЙ ЗОНЕ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2008 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, ст. науч....»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.