WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ

Игорь Николаевич

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА

В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА

03.00.15 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Новосибирск 2008 Диссертация выполнена в лаборатории цитогенетики Государственного учреждения Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научные консультанты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Пузырёв Валерий Павлович член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Назаренко Сергей Андреевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Воевода Михаил Иванович доктор биологических наук, профессор Рубцов Николай Борисович доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич

Ведущая организация: ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва

Защита диссертации состоится “ ” 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

тел. (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан “” _ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук А.Д. Груздев

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для нормального индивидуального развития и реализации генетической программы онтогенеза существенное значение имеет эпигенетическая регуляция активности генов, обеспечивающая установление и поддержание их дифференциальной экспрессии (Holliday, 1991; Голубовский, 2000; Li, 2002;

Jablonka, Lamb, 2005; Чураев, 2006). Согласно современным представлениям, под эпигенетическими процессами понимают наследуемые, стабильные, но потенциально обратимые изменения экспрессии генов, не связанные с нарушениями их нуклеотидной последовательности (Russo et al., 1996; Bird, 2002; Ванюшин, 2006). Молекулярной основой эпигенетических феноменов являются ковалентные модификации структуры хроматина, представленные метилированием ДНК и модификациями гистоновых белков. Подобные изменения ответственны за осуществление таких генетических процессов как дифференциальная экспрессия генов, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, репрессия мобильных генетических элементов (Robertson, Wolfe, 2000; Costello, Plass, 2001).





Нарушение этих процессов через повреждение эпигенетических механизмов приводит к аномалиям развития организма человека, проявляющимся в виде особого класса патологии, который предложено называть эпигенетическими болезнями (Beaudet, 2002). Примерами таких заболеваний являются болезни геномного импринтинга (Hall, 1990; Баранов, 1991; Пузырёв, 1995; Reik, Walter, 2001), хроматиновые болезни (Johnson, 2000; Hendrich, Bickmore, 2001; Назаренко, 2004; Santos-Rebouas, Pimentel, 2007). Значительным является вклад аберрантных эпигенетических модификаций генома в развитие злокачественных новообразований (Feinberg et al., 2002; Немцова, Залетаев, 2004; Киселёва, Киселёв, 2005). Обсуждается роль эпигенетических нарушений и в этиологии мультифакториальных заболеваний (Petronis, 2001; Pembrey, 2002; Whitelaw, 2006).

Интенсивно накапливающаяся информация о патогенетической значимости аберрантных эпигенетических модификаций обусловливает актуальность исследований, направленных на изучение молекулярных и онтогенетических механизмов возникновения эпимутаций (Holliday, 1987, 1991; Horsthemke, 2006). Показано, что особенностью ранних этапов онтогенеза млекопитающих является тотальное эпигенетическое репрограммирование генома, заключающееся в закономерном чередовании волн деметилирования и реметилирования ДНК в половых клетках и на начальных стадиях развития зародыша (Li, 2002; Dean et al., 2003; Sasaki, Matsui, 2008). Эпигенетическое репрограммирование обеспечивает удаление аберрантных эпигенотипов, последовательную индукцию тотипотентности и дифференциальной экспрессии генов. Нарушения этих процессов могут вести к формированию аберрантных эпигенотипов, обусловливающих установление и долговременное поддержание аномальных профилей генной экспрессии, приводящих к патологии развития организма (Dolinoy et al., 2007; Gicquel et al., 2008). Однако до сих пор остается неустановленным вклад аномальных эпигенетических модификаций генома в нарушение эмбрионального периода онтогенеза, который у человека характеризуется высокой частотой репродуктивных потерь – около 60% зигот элиминируется на пре- и ранних постимплантационных этапах развития, а 15-20% клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в течение первого триместра (Macklon et al., 2002). Доминирующим фактором, обусловливающим раннюю остановку эмбрионального развития у человека, являются геномные мутации, представленные в основном числовыми нарушениями хромосом (Назаренко, 1993; Griffin, 1996; Hassold, Hunt, 2001; Баранов, Кузнецова, 2007). Что касается внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, то генетические причины прекращения их развития остаются, как правило, неустановленными.





Одной из групп генов, в обеспечении функций которых существенная роль отводится эпигенетическим механизмам, являются импринтированные гены. Их моноаллельная экспрессия определяется родительским происхождением активного аллеля и связана с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей, формирующимся строго специфичным образом в гаметогенезе (Reik, Walter, 2001; Solter, 2006; Trasler, 2006). Нарушение функций импринтированных генов, большинство из которых вовлечены в регуляцию дифференцировки плацентарных и плодных тканей, рассматривается как весомый фактор нарушений внутриутробного развития млекопитающих (Tycko, 2006). В экспериментах на мышах было показано, что однородительские дисомии хромосом (ОРД), содержащих импринтированные локусы, как правило, несовместимы с нормальным прохождением эмбрионального развития (Cattanach, Jones, 1994).

В то же время попытки найти ОРД у внутриутробно погибших эмбрионов человека пока не увенчались заметным успехом (Fritz et al., 2001; Kondo et al., 2004;

Tsukishiro et al., 2005). Учитывая эпигенетический характер регуляции экспрессии импринтированных генов можно предположить, что ожидаемый негативный эффект нарушений их дозы в эмбриональном периоде онтогенеза человека будет связан не только с формированием ОРД, но и с эпимутациями – аномалиями дифференциального метилирования регуляторных областей. Для изучения разнообразия и эффектов эпимутаций возникает необходимость в их систематизации, учитывающей стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов генома.

Следующим аспектом действия аберрантных эпигенетических процессов может оказаться возрастание частоты мутаций. Этот эффект наиболее изучен при злокачественной трансформации клеток, при которой глобальное деметилирование генома, с одной стороны, и аномальное метилирование промоторов генов репарации ДНК, регуляции клеточного цикла, апоптоза, с другой стороны, сопровождают появление микросателлитной и хромосомной нестабильности (Costello, Plass, 2001; Feinberg, 2001; Geigl, 2008). Что касается эмбрионального периода развития, то имеются сообщения о повышенной частоте мутаций микросателлитных последовательностей ДНК в клетках погибших эмбрионов (Kiaris et al., 1996; Spandidos et al., 1998), а также данные о высоком уровне хромосомного мозаицизма при нарушениях пре- и постимплантационных стадий онтогенеза (Harper et al., 1995; Griffin et al., 1997; Delhanty, 2005; Vorsanova et al., 2005).

Наличие высокой частоты мозаичных кариотипов свидетельствует о том, что наряду с ошибками мейотической сегрегации хромосом, существенную роль в возникновении летальных геномных мутаций могут играть и нарушения митотического распределения хромосом в соматических клетках зародыша. Однако цитогенетические и молекулярные механизмы индукции хромосомного нерасхождения и, как следствие, возникновения мозаицизма в эмбриональном периоде онтогенеза остаются неясными.

Отмечено, что максимальное накопление мозаичных нарушений кариотипа приходится на этап дробления бластомеров (Los et al., 2004), причем эта особенность характерна и для других изученных видов млекопитающих (Shi et al., 2004). Поскольку преимплантационный период развития характеризуется интенсивной эпигенетической реорганизацией генома, то не исключено, что нарушения этого процесса могут приводить к формированию аберрантных профилей экспрессии генов, ответственных за поддержание геномной стабильности, а также тех локусов, функционирование которых является принципиально важным для обеспечения нормального эмбрионального развития организма.

Цель исследования заключалась в установлении вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека.

Задачи исследования:

1. Установить спектр и частоту хромосомных аномалий при эмбриональной гибели у человека и разработать подходы к оценке факторов, оказывающих влияние на достоверность регистрации цитогенетических показателей при анализе репродуктивных потерь.

2. Оценить вклад однородительского наследования хромосом во внутриутробную гибель эмбрионов с нормальным кариотипом.

3. Обосновать подходы к систематизации эпимутаций импринтированных генов и предложить их классификацию.

4. Определить роль эпимутаций импринтированных локусов генома в нарушении эмбрионального развития человека.

5. Провести сравнительный анализ частоты гаметических мутаций микросателлитных последовательностей ДНК в семьях с нормальной репродуктивной функцией и в супружеских парах с невынашиванием беременности.

6. Оценить частоту соматических мутаций микросателлитных повторов ДНК при нарушениях эмбрионального развития.

7. Изучить цитогенетические механизмы возникновения мозаичных форм нарушений кариотипа при ранней эмбриональной гибели.

8. Определить роль эпигенетической инактивации генов контроля клеточного цикла в формировании хромосомного мозаицизма при нарушении внутриутробного развития.

Научная новизна работы. Основным научным результатом исследования явилось определение роли аберрантных эпигенетических модификаций генома в детерминации нарушений эмбрионального развития человека. Получены новые данные об эпигенетических механизмах, изменяющих дозу импринтированных генов при патологии внутриутробного периода онтогенеза. Впервые показано, что нарушения геномного импринтинга связаны с аномалиями поддержания дифференциального метилирования импринтированных генов в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах развития. Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов в геноме человека.

Продемонстрировано увеличение мутационной изменчивости генома соматических клеток при внутриутробной гибели эмбрионов, проявляющейся в форме мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, а также мозаичных вариантов нарушений кариотипа. Впервые исследован вопрос о связи аномального метилирования генов контроля клеточного цикла с возникновением хромосомного мозаицизма в эмбриональных клетках. Установлено, что нарушения эпигенетического репрограммирования генома зигот с нормальным хромосомным набором ведут к формированию аберрантных эпигенотипов, ассоциированных с тканеспецифичным хромосомным мозаицизмом, тогда как у эмбрионов, развивающихся из зигот с анеуплоидным кариотипом, эпигенетическая инактивация исследованных генов клеточного цикла может сопровождать коррекцию анеуплоидии и также приводить к возникновению хромосомного мозаицизма.

Обоснованы теоретические подходы к анализу цитогенетических механизмов формирования мозаичных вариантов хромосомного набора в эмбриональном периоде онтогенеза, основанные на учете закономерностей возникновения и распределения клеток с числовыми нарушениями хромосом в производных различных зародышевых листков.

Практическая значимость работы. В ходе выполнения исследования проведена оценка факторов, оказывающих влияние на достоверность цитогенетического анализа хромосомных нарушений в клетках внутриутробно погибших эмбрионов человека. Предложен подход к оценке уровня полиплоидизации эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro. Разработана математическая модель оценки эффектов контаминации культур клетками материнского организма. С её использованием становится возможной коррекция частоты регистрируемых хромосомных нарушений и показателя «соотношение полов» у эмбрионов с нормальным кариотипом при проведении цитогенетического анализа. Предложенная модель может быть использована в качестве одного из элементов контроля качества лабораторных цитогенетических исследований.

Разработанные подходы к анализу механизмов формирования хромосомного мозаицизма могут представлять ценность для оценки риска таких клинически значимых феноменов в репродукции человека, как ограниченный плацентарный мозаицизм, гонадный мозаицизм, однородительские дисомии хромосом. Результаты исследования могут способствовать повышению эффективности медикогенетического консультирования супружеских пар с невынашиванием беременности. Полученные данные представляют интерес для специалистов в области цитогенетики, генетики развития, молекулярной генетики, пренатальной и преимплантационной генетической диагностики, акушерства и гинекологии. Материалы исследования используются в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей ВУЗов, а также в циклах постдипломной подготовки специалистов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложена классификация эпимутаций импринтированных генов, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов.

2. Нарушение функций импринтированных генов при патологии эмбрионального развития человека связано с изменениями дифференциального характера метилирования их регуляторных областей. Возникновение эпимутаций обусловлено аномалиями поддержания геномного импринтинга в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах онтогенеза.

3. Однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным хромосомным набором.

4. Индукция хромосомного нерасхождения в клетках эмбрионов с нормальным кариотипом ассоциирована с аберрантным метилированием промоторных регионов генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Возникновение эпимутаций приходится на преимплантационный период развития и связано с нарушением деметилирования родительских геномов при их эпигенетическом репрограммировании.

5. Аномальное метилирование генов контроля клеточного цикла на постимплантационных этапах развития сопровождает коррекцию анеуплоидии мейотического происхождения с возникновением хромосомного мозаицизма.

6. Мутационный процесс в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК в половых клетках родителей не оказывает заметного влияния на нарушение эмбрионального развития потомства, тогда как в клетках внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором обнаруживаются мутации микросателлитных последовательностей ДНК постзиготического происхождения.

7. Контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на частоту регистрируемых аномалий кариотипа и на величину показателя «соотношение полов» в группе внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены в форме устных докладов на 3 Европейской конференции по количественной молекулярной цитогенетике (Стокгольм, 2002); 38 конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2006); 22-24 Ежегодных конференциях Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (Прага, 2006; Лион, 2007; Барселона, 2008); конференциях Фонда Марии Кюри «Молекулярное профилирование генома» (Амстердам, 2007) и «Взаимодействие генетики, эпигенетики и некодирующих РНК» (Мадрид, 2008); III Международной конференции «Проблемы вида и видообразования» (Томск, 2004); XV Международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Чебоксары, 2005); Международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007); Международной молодежной научнометодической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии»

(Томск, 2007); VII и VIII научных конференциях ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН «Генетика человека и патология» (Томск, 2004; 2007); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» (Новосибирск, 2008); научно-практических конференциях «Молекулярно-биологические диагностические технологии в практическом здравоохранении» (Новосибирск, 2002); «Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» (Новосибирск, 2003); «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний:

возможности и перспективы» (Москва, 2006); «Молекулярная генетика наследственных заболеваний и нарушений репродукции» (Новосибирск, 2008); школесеминаре «Актуальные вопросы цитогенетики» (Москва, 2007). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседаниях Президиума Томского научного центра СО РАМН (Томск, 2005) и Президиума СО РАМН (Новосибирск, 2007), а также на межлабораторных семинарах в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2008) и в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме исследования опубликовано 62 работы, в том числе статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Библиографический указатель включает 569 источников, из них 81 – публикации в отечественной литературе, 488 – в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и содержит таблицы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом настоящего исследования явились группы спонтанно абортированных эмбрионов человека, медицинских абортусов первого триместра беременности, супружеские пары с невынашиванием беременности, а также семьи с нормальной репродуктивной функцией, имеющие живорожденных детей. Проведение исследования было одобрено Комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (протокол № 7 от 31.03.2006).

Для работы были использованы внезародышевые ткани 1986 спонтанных абортусов, полученные после оперативного или самопроизвольного прерывания беременности от женщин с диагнозами анэмбриония, неразвивающаяся беременность или собственно спонтанный аборт. Ультразвуковая диагностика нарушений внутриутробного развития проводилась в Генетической клинике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Плацентарные ткани медицинских абортусов были получены от женщин, отказавшихся сохранить нормально протекавшую беременность.

Фрагменты плодных оболочек были введены в культуры с целью получения препаратов метафазных хромосом. Образцы экстраэмбриональной мезодермы (ЭМ) и цитотрофобласта хориона (ЦХ) от каждого эмбриона хранились при -70°С для проведения последующих молекулярно-генетических и молекулярноцитогенетических исследований, а также для анализа статуса метилирования ДНК. Выбор данных тканей для проведения исследования был обусловлен их происхождением из производных различных эмбриональных и внезародышевых листков (ЭМ – производная эпибласта, дифференцирующегося из внутренней клеточной массы бластоцисты; ЦХ – производное трофэктодермы), что позволило определить механизмы и стадии возникновения мозаичных хромосомных аномалий и нарушений характера метилирования ДНК в изученных локусах.

Ретроспективный анализ частоты тетраплоидных клеток у эмбрионов с тетраплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме, установленным в ходе цитогенетического исследования, был проведен с помощью двухцветной флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) на интерфазных ядрах некультивированных клеток с центромероспецифичными ДНК-зондами D11Z1 и D17Z1. Присутствие тетраплоидного клона подтверждали, если его частота статистически значимо превышала верхнюю границу доверительного интервала предела обнаружения мутации при интерфазном FISH-анализе. Определение предела и его доверительного интервала проводили при обследовании некультивированных тканей контрольной группы 12 медицинских абортусов с нормальным кариотипом в соответствии с формулами, предложенными Ломакс с соавторами (Lomax et al., 1994). Средняя продолжительность внутриутробного развития зародышей в анализируемой и контрольной группе не имела статистически значимых отличий.

Для исследования эффектов контаминации культур клетками материнского организма был проведен анализ содержания последовательностей ДНК Yхромосомы у 112 эмбрионов с кариотипом 46,ХХ, установленным в ходе культивирования клеток. Анализ был выполнен с использованием образцов ДНК, выделенных из некультивированных тканей зародышей, с помощью ПЦР с праймерами на гомологичный локус хромосом X и Y – ген амелогенина AMELX (Xp22.3)/AMELY (Yp11.2) (Sullivan et al., 1993). Для регистрации возможных числовых нарушений хромосом, невыявленных у 60 эмбрионов вследствие контаминации, использовался анализ наследования 16 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21.

Анализ однородительского наследования хромосом был проведен в семьях, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом. Исследование выполняли с помощью анализа сегрегации 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21. Критериями отбора хромосом являлись: локализация в них импринтированных генов, участвующих в регуляции роста и развития плода и плаценты; наличие ортологичных с хромосомами мыши участков, ОРД по которым ведет к ранней эмбриональной гибели животных; отсутствие ОРД по исследуемой хромосоме у живорожденных индивидов; регистрация ОРД у спонтанных абортусов в других исследованиях; частое вовлечение хромосомы в мейотическое нерасхождение, увеличивающее риск формирования ОРД.

Поиск эпимутаций импринтированных локусов (SNURF-SNRPN, H19, KCNQ1OT1, CDKN1C) осуществляли у 84 спонтанных абортусов с нарушениями клеточной пролиферации: 30 эмбрионов имели морфологически определяемую гиперплазию ворсин трофобласта, у 54 зародышей клетки оказались неспособными к нормальной пролиферации в культуре. В качестве контрольной группы были обследованы экстраэмбриональные ткани 24 медицинских абортусов.

Средний возраст родителей и продолжительность внутриутробного развития эмбрионов в сравниваемых группах не имели статистически значимых отличий.

После бисульфитной конверсии геномной ДНК была проведена метилспецифичная ПЦР локусов SNURF-SNRPN, H19, CDKN1C с использованием праймеров, предложенных в работах Kubota et al., 1997, Poon et al., 2002, Li et al., 2002. Исследование метилирования центра импринтинга KCNQ1OT1 было выполнено с помощью метилчувствительной ПЦР после обработки геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой NotI в течение 16 час при 37°С (Engel et al., 2000).

Анализ гаметических мутаций 15 микросателлитных последовательностей ДНК, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 16, 17, 19 и 21, был проведен в супружеских парах, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом. В качестве контрольной группы обследовано 95 семей с нормальной репродуктивной функцией (мать, отец, ребенок). Средний возраст родителей в семьях с невынашиванием беременности и в контрольной выборке на момент рождения ребенка статистически значимо не отличался. Критерием регистрации мутации гаметического происхождения являлось наличие у потомка аллеля, несовпадающего по своему размеру ни с одним из родительских аллелей исследуемого локуса.

При этом вероятность биологического родства определялась при анализе наследования аллелей как минимум 10 других информативных микросателлитных локусов и составляла во всех случаях не менее 99,99%.

Анализ соматических мутаций был проведен через исследование сегрегации аллелей 10 микросателлитных локусов в 95 семьях с невынашиванием беременности, а также в контрольной группе, представленной 51 медицинским абортусом и 102 родителями. Продолжительность развития эмбрионов и средний возраст родителей в сравниваемых группах не имели значимых отличий. Наличие соматической мутации в исследуемом локусе предполагалось в случае выявления у зародыша с нормальным кариотипом дополнительного третьего аллеля, отличающегося по размеру от двух других аллелей, наследованных от родителей. Присутствие мутации принималось после исключения с помощью интерфазного FISH-анализа триплоидии или трисомии, невыявленных вследствие контаминации культур клетками матери или хромосомного мозаицизма. Критериями отбора ДНК-маркеров для анализа мутаций являлись: тетрануклеотидная повторяющаяся последовательность; гетерозиготность не менее 0,70; размер продуктов амплификации не более 300 п.н. Информация о локализации ДНКмаркеров в геноме, последовательностях праймеров и условиях амплификации была получена из баз данных: www.genome.ucsc.edu и www.gdb.org. Частоты аллелей и генотипов, а также их соответствие ожидаемому распределению при равновесии Харди-Вайнберга вычисляли с помощью программы «RC», основанной на алгоритме, предложенном Рольфом и Бентзеном (Rolf, Bentzen, 1989).

Сравнение частот мутаций проводили с использованием -критерия Фишера для значений частот, близких к нулю (Лакин, 1973).

Изучение частоты и межтканевого распределения анеуплоидных клеток у 39 эмбрионов с аномальным кариотипом, установленным в ходе цитогенетического исследования, проводили в некультивированных тканях с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на соответствующие хромосомы. Исследуемая выборка была дополнена 11 спонтанными абортусами из архивного материала лаборатории цитогенетики, мозаичный кариотип которых был установлен с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на все хромосомы набора. Анализ достоверности межтканевых различий по частотам анеуплоидных клеток проводили с помощью критерия 2.

Исследование статуса метилирования генов контроля клеточного цикла (RB1, CDKN2A, CDKN2B, P14ARF) было выполнено в экстраэмбриональных тканях 50 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, 20 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и 23 медицинских абортусов. Средняя продолжительность развития эмбрионов в исследованных группах не отличалась. Метилспецифичную ПЦР проводили с использованием праймеров и условий, предложенных в работах Herman et al., 1996, Esteller et al., 2001, GonzalezGomez et al., 2003. В гене CDKN2A характер метилирования был определен в экзоне I с помощью метилспецифичной и метилчувствительной ПЦР (Herman et al., 1996; Xing et al., 1999), а также в промоторе с помощью метилчувствительной ПЦР (Землякова с соавт., 2004), при этом объем контрольной выборки был увеличен до 36 эмбрионов. Частоту эпимутаций определяли как отношение числа метилированных аллелей к общему числу проанализированных последовательностей исследуемого локуса.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цитогенетическое исследование спонтанных абортусов человека Первым этапом работы явился цитогенетический анализ внутриутробно погибших эмбрионов с целью выделения групп зародышей с нормальным кариотипом и с хромосомными аномалиями для проведения дальнейших разделов исследования. Успешное культивирование клеток и стандартный метафазный анализ выполнены для 717 из 1986 спонтанных абортусов, клетки которых были введены в культуры. Нормальный хромосомный набор определен у 42,9% эмбрионов: 116 зародышей имели кариотип 46,XY, а 191 – 46,XX. Нормальное число хромосом было определено также у 19 из 47 спонтанных абортусов с пузырным заносом, что составило 2,6% от общего объема выборки.

Хромосомные нарушения выявлены у 391 эмбриона (54,5%). Наиболее частыми аномалиями кариотипа оказались трисомии аутосом – их частота составила 35,8% от всех выявленных хромосомных аберраций. Далее следовала тетраплоидия, частота которой (23,8%) заметно превышала известные в литературе значения – от 1,7% (Takahara et al., 1977) до 14% (Kalousek, 1993). Наиболее вероятными причинами такого отличия могут служить полиплоидизация эмбриональных фибробластов в длительных культурах in vitro, а также учет тетраплоидно-диплоидного мозаицизма. Так, 73 из 93 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом по результатам цитогенетического анализа имели дополнительную эуплоидную клеточную линию, тогда как только у 20 спонтанных абортусов (22%) были выявлены исключительно тетраплоидные клетки. Таким образом, среди всех спонтанных абортусов с хромосомными аномалиями только 5% эмбрионов имели немозаичный вариант тетраплоидного кариотипа. Интерфазный FISHанализ некультивированных тканей 30 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме позволил зарегистрировать тетраплоидные клетки только у 13 зародышей (43%). У всех этих эмбрионов частота тетраплоидных клеток статистически значимо превышала верхнюю границу предела обнаружения мутации (1,40% для ЦХ и 0,99% для ЭМ). Экстраполируя полученные данные на всю обследованную выборку спонтанных абортусов можно заключить, что частота тетраплоидии в группе эмбрионов с нарушениями кариотипа снизится с 23,8 до 10,2%, что находится в соответствии с данными литературы.

Частота триплоидии в проведенном исследовании составила 20,5%. Нарушения числа половых хромосом найдены в 11,7% случаев, при этом на долю моносомии по Х-хромосоме (в чистой и мозаичной форме) пришлось 6,6% выявленных аномалий кариотипа. Частота структурных перестроек хромосом составила 2,8%. В целом полученные данные по спектру и частоте основных типов хромосомных аномалий (с учетом коррекции частоты тетраплоидии) соответствуют результатам наиболее масштабных цитогенетических исследований спонтанных абортусов (Boue et al., 1975; Hassold et al., 1980; Kline et al., 1987; Kalousek, 1993; Griffin et al., 1997; Menasha et al., 2005).

Необходимо отметить, что полиплоидизация клеток является не единственным феноменом, влияющим на достоверность цитогенетического исследования при анализе репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития. Еще одним заметным фактором может выступать контаминация культур клетками материнского происхождения, затрагивающая, по разным оценкам, от 15 до 40% культур спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ (Griffin et al., 1997; Bell et al., 1999). Предполагается, что материнская контаминация (МК) может приводить к занижению частоты регистрируемых нарушений кариотипа, а также к уменьшению показателя «соотношение полов» в исследуемой выборке. Учитывая необходимость анализа спонтанных абортусов с нормальным кариотипом для решения задач, связанных с изучением эпигенетических феноменов, нами была разработана математическая модель для оценки частот кариотипов и достоверности цитогенетического исследования с учетом риска МК. Для построения модели предложено использовать коэффициент материнской контаминации (k), равный вероятности обнаружения последовательностей ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ, установленным после культивирования клеток. В таблице 1 приведены итоговые формулы для расчета ожидаемых частот кариотипов и определения достоверности проведенного цитогенетического анализа с учетом материнской контаминации. Полное математическое обоснование модели изложено в тексте диссертации, а также в публикациях (Никитина и др., 2004; Nikitina et al., 2005).

С помощью анализа локуса амелогенина у 18 из 112 эмбрионов с кариотипом 46,ХХ, установленным в результате цитогенетического исследования, было обнаружено наличие ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях (k = 16%). Отмечено, что продолжительность пролиферации клеток этих спонтанных абортусов до момента фиксации культур и приготовления хромосомных препаратов оказалась статистически значимо выше, чем продолжительность культивирования клеток эмбрионов, не продемонстрировавших наличие последовательностей Y-хромосомы в некультивированных тканях (35,08±3,98 и 24,05±1, дней, соответственно, p = 0,02). Таким образом, позднее вступление клеточных культур в фазу активной пролиферации, на которой обычно получают препараты метафазных хромосом, может являться маркером МК и требует особого внимания в случае установления повышенной частоты эмбрионов с кариотипом 46,ХХ в исследуемой выборке и при уменьшении показателя соотношения полов.

С целью определения пропорций кариотипов, маскируемых МК, к части цитогенетически обследованной группы эмбрионов (N=450) была применена предложенная модель. Показано, что с учетом МК частота хромосомных аномалий среди зародышей женского пола в исследованной выборке увеличилась с 51,5 до 62,2% (p = 0,01). Также была отмечена тенденция к возрастанию частоты нарушений кариотипа в общей выборке – с 51,8 до 57,8% (p = 0,07). Кроме того, наблюдалось увеличение показателя «соотношение полов» в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом – с 0,66 до 1,02 (p = 0,03). Необходимо отметить, что статистическая значимость всех регистрируемых изменений определяется величиной коэффициента k и объемом исследуемой выборки N.

Верификация предложенной модели была проведена с помощью анализа наследования аллелей 16 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-локусов, расположенных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21, в 60 семьях, имевших спонтанный аборт с кариотипом 46,ХХ, установленным после культивирования клеток.

Согласно модели, ожидаемая частота нарушений кариотипа при k = 16% должна составлять 20,7% (табл. 1), т.е. у 12 эмбрионов можно предполагать наличие невыявленных вследствие МК хромосомных аберраций. Использованный набор микросателлитных ДНК-маркеров позволяет детектировать как триплоидии, так и наиболее частые у спонтанных абортусов трисомии по хромосомам 16 и 21. В среднем, эти аномалии составляют около 40% регистрируемых нарушений кариотипа. Следовательно, с помощью данного подхода могли бы быть выявлены Таблица 1. Моделирование частот кариотипов и вероятности ошибки цитогенетического анализа спонтанных абортусов с учетом риска контаминации эмбриональных культур клетками материнского организма.

аномалиями Частота хромосомных аномалий Вероятность обнаружения ного набора (B, C или D), проAk + C + D пущенного при цитогенетическом анализе вследствие МК (Q) Доля эмбрионов с истинным кариотипом 46,ХХ в выборке после культивирования клеток (Afn - female normal) выявленных при анализе материнских клеток (М) Частота эмбрионов с иным хромосомным набором в исследованной выборке (вероятность ошибки, E) анализа (W) Примечание: А – число абортусов с кариотипом 46,ХХ в обследованной выборке; В – число абортусов женского пола с хромосомными аномалиями; С – число абортусов с кариотипом 46,XY; D – число абортусов мужского пола с хромосомными аномалиями; N – объем выборки (N = A+B+C+D).

не менее 5 из 12 ожидаемых эмбрионов с хромосомными аберрациями. В действительности числовые нарушения хромосом были найдены у 9 спонтанных абортусов (4 случая триплоидии, 4 трисомии по хромосоме 16 и двойная трисомия по хромосомам 16 и 20). Все аномалии были подтверждены интерфазным FISH-анализом с центромероспецифичными ДНК-зондами. У двух эмбрионов женского пола с трисомией по хромосоме 16 был установлен мозаицизм с наличием нормальной клеточной линии (с частотой 24% и 92%). Клетки с нормальным кариотипом могли иметь преимущество при длительном культивировании in vitro, поэтому ошибочный результат цитогенетического анализа мог быть связан как с МК, так и с мозаицизмом. У остальных 7 эмбрионов хромосомные аномалии присутствовали в немозаичном состоянии, свидетельствуя о том, что цитогенетический анализ этих зародышей был выполнен на материнских клетках, случайным образом попавших в культуры. Таким образом, числовые нарушения хромосом, невыявленные вследствие МК, были обнаружены как минимум у 7 из 60 абортусов с кариотипом 46,ХХ (11,7%), что хорошо согласуется частотой 8,3%, предсказанной моделью и дизайном экспериментальной проверки (p = 0,54). В целом, точность цитогенетического анализа (W) при использованных в настоящей работе условиях культивирования клеток составила 91,8%.

Мутации импринтированных локусов генома при патологии С целью изучения вклада однородительского наследования хромосом в раннюю эмбриональную гибель в настоящем исследовании был проведен анализ наследования 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21, в 100 семьях с невынашиванием беременности при нормальном кариотипе в клетках спонтанного абортуса. В ходе анализа из дальнейшего исследования были исключены четыре семьи, в которых было выявлено несоответствие аллелей микросателлитных локусов у отца и эмбриона («ложное» отцовство), а также 9 зародышей, продемонстрировавших отклонения от нормального числа хромосом, причиной которых послужила контаминация культур клетками матери, либо хромосомный мозаицизм. Таким образом, анализ ОРД был проведен у 87 эмбрионов. Ни одного случая ОРД по исследованным хромосомам при информативности анализа, варьировавшей по отдельным локусам в пределах от 55,8 до 89,5%, обнаружено не было.

К настоящему времени опубликованы результаты 7 исследований, направленных на поиск ОРД у спонтанных абортусов (Henderson et al., 1994; Shaffer et al., 1994; Smith et al., 1998; Евдокимова, Назаренко, 2000; Fritz et al., 2001; Kondo et al., 2004; Tsukishiro et al., 2005). При обследовании в общей сложности 392 эмбрионов, с учетом настоящей работы, было найдено 7 абортусов с ОРД: по одному случаю ОРД по хромосомам 7 и 9, три случая ОРД по хромосоме 21, из которых у одного эмбриона ОРД сочеталась с двойной трисомией по хромосомам и 9. У одного зародыша была выявлена сегментная ОРД хромосомы 14. Еще один эмбрион имел сегментную ОРД хромосомы 16. Во всех случаях ОРД имела материнское происхождение, что указывает на ведущую роль хромосомного нерасхождения в мейозе у матери в формировании первично анеуплоидных зигот.

В целом, проанализировано 6156 событий наследования хромосом, из которых найдено только 6 случаев ОРД, не сочетающейся с другими типами хромосомных аномалий. Таким образом, частота формирования ОРД составила 1:1000 событий наследования хромосом и оказалась сопоставимой с ожидаемой частотой (1,65:1000), рассчитанной на основании данных о хромосомном нерасхождении в мейозе (Engel, DeLozier-Blanchet, 1991). Вместе с тем, только лишь 2 случая (ОРД хромосомы 7 и сегментная ОРД хромосомы 14) могут рассматриваться в качестве доказательства возможной ассоциации нарушений дозы импринтированных генов с ранней эмбриональной гибелью. Что касается хромосом 9, 16 и 21, то до настоящего времени отсутствует информация о локализации в них импринтированных генов. Таким образом, частота абортусов с вариантами ОРД, затрагивающими непосредственно импринтированные гены, составляет только 0,5% (2/392). Более того, в части исследований (Henderson et al., 1994; Shaffer et al, 1994) поиск ОРД проводился без предварительного цитогенетического анализа, что не исключает попадания в обследованные выборки эмбрионов с хромосомными нарушениями и еще более снижает полученную оценку вклада однородительского наследования хромосом в раннюю эмбриолетальность.

Необходимо отметить, что ОРД является только лишь одним из механизмов, нарушающих дозу импринтированных генов. Поэтому решение вопроса о вкладе мутаций импринтированных локусов генома в нарушение эмбрионального развития человека, решаемое до настоящего времени через поиск ОРД, не должно ограничиваться анализом этого редкого, с цитогенетической точки зрения, феномена. Действительно, образование ОРД зависит от целого ряда мутационных событий, связанных с последовательными нарушениями сегрегации хромосом в мейозе и при последующих митотических делениях эмбриональных клеток. Тот факт, что геномный импринтинг является эпигенетическим феноменом и его молекулярные основы связаны с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей генов позволяет выдвинуть предположение о том, что нарушение экспрессии импринтированных локусов в раннем эмбриогенезе человека может быть связано в большей степени с их эпимутациями, чем с ошибками сегрегации хромосом, ведущими к формированию ОРД. Очевидно, что в отношении затрагиваемого гена эффекты эпимутаций будут функционально эквивалентны однородительскому наследованию хромосом, содержащих импринтированные гены. Эпимутации импринтированных локусов были описаны при биродительском полном пузырном заносе (Van den Veyver, Al-Hussaini, 2006), онкологических заболеваниях (Plass, Soloway, 2002), у пациентов с болезнями геномного импринтинга (синдромы Видемана-Беквита, Энгельмана, Рассела-Сильвера), в том числе и у детей с данными заболеваниями, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения (Cox et al., 2002;

DeBaun et al., 2003; Kagami et al., 2007). Однако разнообразие и закономерности возникновения аберрантных эпигенетических модификаций импринтированных генов при нарушениях эмбрионального развития остаются неизвестными.

В настоящем исследовании была предложена классификация эпимутаций импринтированных генов. В основу систематизации было положено 3 критерия.

Так, предложено выделять эпимутации, затрагивающие все или отдельные импринтированные локусы генома, а также центры импринтинга. Следующим критерием явилось происхождение эпимутаций, которое может быть связано либо с нарушениями установления импринтинга в гаметогенезе родителей, либо с потерей устойчивости импринтированных локусов к волне эпигенетического репрограммирования генома в соматических клетках эмбриона на самых ранних этапах развития (рис. 1). Соответственно, было предложено выделять гаметиРис. 1. Динамика эпигенетического репрограммирования генома.

- импринтированные гены, метилируемые на отцовских хромосомах;

- отцовский геном (неимпринтированные локусы);

- импринтированные гены, метилируемые на материнских хромосомах;

- материнский геном (неимпринтированные локусы);

- импринтированные гены, неметилируемые на материнских хромосомах;

- импринтированные гены, неметилируемые на отцовских хромосомах.

Цифрами обозначены критические периоды репрограммирования импринтированных генов.

ческие и соматические эпимутации. Наконец, третий критерий дифференцирует эпимутации по их функциональной значимости: гипер- либо гипометилирование импринтированных локусов, приводящее к потере импринтинга. В таблице представлен спектр теоретически ожидаемых эпимутаций, основанный на комбинации двух критериев (происхождение и функциональная значимость), а также приведены примеры некоторых наследственных и онкологических заболеваний, в этиологии которых была продемонстрирована роль нарушений характера метилирования импринтированных генов.

С целью установления вклада эпимутаций импринтированных локусов в нарушение эмбрионального развития был проведен анализ статуса метилирования трех центров импринтинга (SNURF-SNRPN, H19, KCNQ1OT1), координирующих экспрессию кластеров импринтированных генов на хромосомах 11 и 15, а также импринтированного гена CDKN1C, вовлеченного в контроль дифференцировки плацентарных тканей. В обоих типах внезародышевых тканей (ЭМ и ЦХ) у всех эмбрионов был выявлен дифференциальный характер метилирования SNURF-SNRPN, H19 и CDKN1C. На электрофореграммах выявлялось два продукта метилспецифичной ПЦР, соответствующих неметилированному отцовскому и метилированному материнскому аллелям SNURF-SNRPN, либо неметилированному материнскому и метилированному отцовскому аллелям H19 и CDKN1C.

Таблица 2. Классификация эпимутаций импринтированных генов.

Гаметические эпимутации Примечание: БППЗ – биродительский полный пузырный занос; СВБ – синдром Видемана-Беквита; СПВ – синдром Прадера-Вилли; СРС – синдром Рассела-Сильвера; СЭ – синдром Энгельмана; ТНСД – транзиторный неонатальный сахарный диабет; ЦИ-СПВ – центр импринтинга хромосомы 15, мутации которого ответственны за формирование синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана; КП – критические периоды репрограммирования в соответствии с рис. 1; прочерками обозначены несуществующие типы эпимутаций.

KCNQ1OT локус KvL чувствительной ПЦР локуса KCNQ1OT1. KCNQ1OT1 (рис. 2). Амплиматеринский метилированный аллель в ЦХ эм- фикация нативной ДНК, не бриона с низкой пролиферативной активностью обработанной рестриктазой 2 – гипометилирование материнского аллеля в ЭМ продукта, исключая возможтого же эмбриона; ность делеции данного локугипометилирование материнского аллеля в ЦХ 5 – материнский метилированный аллель в ЦХ ме- тилчувствительной ПЦР могла наблюдаться и при однодицинского абортуса.

хромосомы 11 от отца, поскольку в этом случае на электрофореграмме также отсутствовали бы метилированные аллели материнского происхождения. Однако у всех эмбрионов наличие ОРД представляется маловероятным событием, поскольку статус метилирования двух других импринтированных генов в регионе 11p15.5 (H19 и CDKN1C) являлся нормальным. Таким образом, выявленные изменения характера метилирования KCNQ1OT1 следует рассматривать как эпимутации.

При сравнительном анализе метилирования KCNQ1OT1 в разных тканях было отмечено, что у 7 из 8 абортусов обнаруженные эпимутации затрагивали производные только одного зародышевого листка, т.е. регистрировались либо в ЭМ (5 эмбрионов), либо в ЦХ (2 зародыша). Ещё у одного абортуса для обследования оказалась доступной только ЭМ. Учитывая, что обособление и дифференцировка ЦХ и ЭМ происходит уже после этапа имплантации бластоцисты и завершения тотального деметилирования генома, полученные в ходе исследования данные о тканеспецифичности эпимутаций указывают на их соматическое происхождение. Наиболее вероятным механизмом возникновения таких эпимутаций является потеря эмбриональными клетками способности к поддержанию родительского импринтинга через нарушение воспроизводства характера метилирования ДНК в регуляторных последовательностях импринтированных генов на постимплантационных этапах развития (критический период № 4, рис. 1).

Гипометилирование KCNQ1OT1 на материнском гомологе является одной из наиболее частых форм молекулярной патологии, выявляемой у 50% пациентов с синдромом Видемана-Беквита (DeBaun et al., 2003). Более того, оно отмечено практически у всех детей с данным синдромом, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения (Maher, 2005). Обсуждаемый в современной литературе вопрос о возможном влиянии вспомогательных репродуктивных технологий на увеличение риска рождения детей с болезнями геномного импринтинга (Niemitz, Feinberg, 2004; Дыбан А.П., Дыбан П.А., 2006) делает актуальными исследования механизмов и факторов, вызывающих эпимутации импринтированных генов. Доминирующей гипотезой является предположение о том, что используемые для культивирования гамет и эмбрионов среды, а также протоколы гормональной гиперстимуляции яичников, могут не обеспечивать нормального установления и поддержания геномного импринтинга в период тотальных эпигенетических модификаций генома половых и соматических клеток (Khosla et al., 2001; Lucifero et al., 2004). Полученные в ходе проведенного нами исследования данные указывают на то, что эпимутации, по крайней мере в локусе KCNQ1OT1, могут регистрироваться и при спонтанном прерывании беременностей, наступивших естественным путем. Эти результаты свидетельствуют в пользу альтернативной гипотезы, согласно которой технологии искусственного оплодотворения, позволяя преодолевать некоторые репродуктивные барьеры, могут приводить к проявлению у потомства скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости, в том числе и несовместимой с нормальным течением эмбриогенеза (Horsthemke, Ludwig et al., 2005). Возможно, что некоторые супружеские пары с нарушениями фертильности или невынашиванием беременности имеют предрасположенность к эпигенетической нестабильности, что делает геном их потомства подверженным эпигенетическим изменениям, независимо от того, использовались или нет методы искусственного оплодотворения.

Анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК С целью характеристики уровня мутационной изменчивости генома при ранней остановке внутриутробного развития в настоящем исследовании был проведен анализ частот гаметических и соматических мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, а также хромосомного мозаицизма в клетках спонтанных абортусов первого триместра беременности. Для изучения вопроса о вкладе гаметических мутаций микросателлитных локусов ДНК в этиологию нарушений внутриутробного развития нами был выполнен анализ сегрегации аллелей 15 тетрануклеотидных повторяющихся последовательностей в семьях с невынашиванием беременности (при нормальном кариотипе у спонтанного абортуса) и в супружеских парах с нормальной репродуктивной функцией. В исследованных выборках гетерозиготность всех изученных локусов варьировала от 0,80 до 0,94, а число выявленных по каждому локусу аллелей колебалось от 6 до 17. Распределение частот генотипов не отличалось от ожидаемого при равновесии Харди-Вайнберга (p 0,05).

В семьях с невынашиванием беременности было проанализировано информативных результатов мейоза и обнаружено 10 мутаций – две мутации в локусе D16S2624, по одной мутации – в 8 локусах. Средняя частота мутаций составила 4,3610-3 на локус/гамету/поколение. В семьях с нормальной репродуктивной функцией было изучено 1725 событий передачи аллелей микросателлитных локусов от родителей потомкам и выявлено 4 мутации в 4 разных локусах D17S1185, D19S394, D21S11 и D21S1435. Средняя частота мутаций всего комплекса изученных микросателлитных ДНК-маркеров составила 2,3210-3 на локус/гамету/поколение. Достоверных различий по частоте гаметических мутаций между исследованными группами семей не обнаружено (p = 0,25). Полученные данные свидетельствуют о том, что мутации в микросателлитных локусах ДНК в половых клетках родителей потомства с остановкой внутриутробного развития и у родителей живорожденных детей возникают с одинаковой частотой.

Следующим разделом работы явился анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, возникающих непосредственно в соматических клетках самих эмбрионов. При обследовании 95 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом у 13 зародышей было обнаружено наличие дополнительного аллеля микросателлитного локуса, отличающегося по размеру от двух родительских аллелей, что указывало на возможные соматические мутации. Однако дополнительный интерфазный FISH-анализ показал, что в 4 случаях эмбрионы имели триплоидный кариотип, невыявленный вследствие материнской контаминации. Еще у 5 зародышей были найдены трисомии по хромосомам 16 или 20, в том числе и в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией. Таким образом, наличие соматических мутаций было подтверждено только у 4 из 95 эмбрионов (4,2%). Из 10 изученных локусов мутации были зарегистрированы в четырех, при этом в локусе D20S168 было выявлено два мутационных события, по одной мутации найдено в локусах D16S2624, D16S685 и D21S1413. Один эмбрион имел соматические мутации в двух локусах.

В среднем частота соматических мутаций тетрануклеотидных повторов ДНК у спонтанных абортусов составила 5,9610-3 на локус/поколение (5 мутаций в 839 обследованных генотипах). В то же время в 504 проанализированных генотипах эмбрионов контрольной группы ни одной мутации постзиготического происхождения обнаружено не было (p = 0,01). При сравнительном анализе частот гаметических и соматических мутаций в обследованных выборках достоверных отличий между ними не наблюдалось (p = 0,57). Этот факт, с одной стороны, подчеркивает то, что в основе возникновения мутаций микросателлитных последовательностей в половых и соматических клетках, по-видимому, лежат повреждения общих механизмов репарации ДНК. С другой стороны, наличие соматических мутаций исключительно у внутриутробно погибших эмбрионов свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной изменчивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах развития.

Как правило, появление мутаций микросателлитных последовательностей служит индикатором функциональных нарушений в системе репарации ошибочного спаривания оснований ДНК. Полученные данные подтверждают гипотезу об ассоциации нарушений мисс-матч репарации ДНК в соматических клетках с ранней эмбриолетальностью у человека (Kiaris et al., 1996). Возможно, что нестабильность генома, выявляемая на уровне повторяющихся последовательностей ДНК, затрагивает не только генетически нейтральные локусы, но и участки генома, играющие существенную роль в раннем развитии организма.

Эпигенетические модификации генов клеточного цикла у эмбрионов Хромосомный мозаицизм, определяемый как наличие у организма, развившегося из одной зиготы, двух или более клеточных линий с разным кариотипом является следствием нарушений сегрегации хромосом при митотическом делении клеток. Согласно результатам стандартных цитогенетических исследований, около 13-20% спонтанных абортусов имеют мозаичные нарушения кариотипа, ограниченные производными различных зародышевых листков (Kalousek et al., 1992; Lombardi, Dev, 1992; Griffin et al., 1997). Однако наиболее существенное возрастание частоты мозаицизма наблюдается на преимплантационных этапах дробления бластомеров, когда около 60% зародышей на стадии 8-клеточной морулы демонстрируют мозаичную хромосомную конституцию (Los et al., 2004).

Столь высокая частота хромосомного мозаицизма позволяет рассматривать его в качестве одной из форм нестабильности эмбрионального генома. Следует отметить, что увеличение частоты мозаичных кариотипов приходится на период тотального эпигенетического репрограммирования генома на преимплантационных стадиях развития. Возможно, что деметилированное состояние гетерохроматина негативным образом сказывается на точности хромосомной сегрегации, а нарушения последующих этапов установления метилирования ДНК могут приводить к аберрантной эпигенетической инактивации генов, ответственных за контроль клеточного цикла и распределение хромосом.

Существенная часть мозаичных эмбрионов элиминирует уже на преимплантационных этапах развития, однако некоторые из них могут проходить имплантацию и продолжать свое развитие. Вероятность такого события зависит от типа хромосомной аномалии, вовлеченной в мозаичное состояние, от частоты аномальных клеток, а также от их локализации в производных различных зародышевых листков. Кроме того, возникновение мозаицизма возможно и на постимплантационных этапах развития. В рамках настоящего исследования был проведен анализ особенностей распределения анеуплоидных клеток в тканях эмбрионов с мозаичной хромосомной конституцией. На основе разработанной модели формирования хромосомного мозаицизма (Лебедев, Назаренко, 2001) было определено, что в подавляющем большинстве случаев (90%) возникновение мозаичного кариотипа являлось следствием коррекции анеуплоидии мейотического происхождения в одной или обеих обследованных тканях. У остальных эмбрионов возникновение мозаицизма было связано с аномалиями сегрегации хромосом в соматических клетках зародышей, развивающихся из эуплоидных зигот.

Далее спонтанные абортусы с хромосомным мозаицизмом были обследованы на предмет характера метилирования генов RB1, CDKN2A, CDKN2B и P14ARF, вовлеченных в RB- и P53-зависимые пути регуляции клеточного цикла.

Анализ проводили в ЦХ и ЭМ с целью определения тканеспецифичности эпимутаций и периодов их наиболее вероятного возникновения. У 9 из 45 эмбрионов (20%) впервые было зарегистрировано метилирование промоторной области гена RB1 (рис. 3). При этом у 5 зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы как в ЭМ, так и в ЦХ, что свидетельствовало о возникновении эпимутаций ещё до обособления исследованных тканей (табл. 3).

Аберрантное метилирование промотора гена P14ARF (рис. 4) было выявлено у 4 из 45 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, что составило 9%. При этом у 2 эмбрионов оно оказалось ограниченным ЦХ, у одного эмбриона – ЭМ, еще у одного зародыша метилированные аллели выявлялись в обеих тканях (табл. 3). При анализе статуса метилирования гена CDKN2B у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом ни одной эпимутации обнаружено не было. Метилирования генов RB1, P14ARF и CDKN2B также не было найдено в тканях спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и в контрольной группе.

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов Рис. 4. Электрофореграмма продуктов метилспецифичной ПЦР промоторного метилспецифичной ПЦР промоторного U – неметилированный аллель (172 п.н.); U – неметилированный аллель (132 п.н.);

M – метилированный алелль (172 п.н.); M – метилированный алелль (122 п.н.);

1 – геномная ДНК из лимфоцитов перифе- 1, 2 – геномная ДНК из ЦХ эмбриона с рической крови здорового индивида; хромосомным мозаицизмом с метилирогеномная ДНК из лимфоцитов перифе- ванным и неметилированным аллелями;

рической крови, обработанная CpG- 3, 4 – геномная ДНК из ЭМ абортуса с заицизмом и метилированными аллелями; обработанная CpG-метилазой M.SssI;

7, 8 – геномная ДНК из ЦХ эмбриона с мо- 6 – геномная ДНК из лимфоцитов перизаицизмом с неметилированным и метили- ферической крови здорового индивида.

рованным аллелями.

При исследовании характера метилирования гена CDKN2A с помощью метилспецифичной ПЦР у 22 из 36 эмбрионов контрольной группы (61%) были выявлены метилированные последовательности в составе экзона I. Для уточнения эпигенетического статуса этого гена в плаценте нормально развивающихся эмбрионов нами были проведены дополнительные исследования. С помощью метилчувствительной ПЦР после предварительного гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой HpaII, метилированные аллели были выявлены у всех 36 эмбрионов. Отличия между результатами исследования, полученными с помощью двух различных подходов, могут быть объяснены анализом 8 потенциальных сайтов метилирования (CpG-динуклеотиды) в составе экзона I в случае применения метилспецифичной ПЦР и только одного из этих 8 сайтов при использовании метилчувствительной ПЦР.

Имеются противоречивые данные относительно влияния метилирования последовательности экзона I гена CDKN2A на уровень его экспрессии. С одной стороны, сообщается о значимом снижении экспрессии гена при метилировании экзона (Huang et al., 2002; Xue et al., 2004). С другой стороны показано, что метилирование CpG-динуклеотидов в составе экзона I ассоциировано с присоединением метилцитозин-связывающего белка MeCP2, запускающего каскад реакций компактизации хроматина, однако это не препятствует транскрипции. Существенное снижение транскрипции наблюдается только в том случае, если метилирование затрагивает промоторный регион, где наряду с присоединением Таблица 3. Профили метилирования генов контроля клеточного цикла у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом.

Примечание: в скобках указано соотношение клеточных клонов в %, установленное с помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток; н/о – не обследован; M (Methylated) – метилированный аллель; U (Unmethylated) – неметилированный аллель; P14 – промоторный регион гена P14ARF; P15 – промоторный регион гена CDKN2B (P15INK4B); P16exI – экзон I гена CDKN2A (P16INK4A).

MeCP2 происходит деацетилирование гистонов и ремоделирование хроматина (Nguyen et al., 2001). Нами был проведен анализ характера метилирования промоторной области гена CDKN2A с помощью метилчувствительной ПЦР. У всех 36 эмбрионов контрольной группы были выявлены метилированные последовательности. Таким образом, метилирование наблюдалось как в экзоне I, так и в промоторном регионе.

Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о значимости эпигенетической регуляции активности гена CDKN2A в плацентарных тканях.

Следует отметить, что в литературе имеются сообщения о метилировании ряда опухолесупрессорных генов (PTEN, RASSF1A) в плаценте человека на протяжении нормально протекающей беременности (Chen et al., 2005; Chiu et al., 2007).

Высказывается гипотеза, что такой эпигенетический статус генов может обеспечивать необходимый инвазивный и пролиферативный потенциал клеток плаценты (Chiu et al., 2007). Что касается гена CDKN2A, то его метилирование описано в 20,4% случаев пузырного заноса и в 40% хорионкарцином (Xue et al., 2004), а также у 14% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом (Park et al., 2008).

Однако, при анализе 10 плацент нормально развивающихся эмбрионов I триместра беременности в одном из исследований (Xue et al., 2004), 5 плацент I-го и плацент III-го триместров в другой работе (Chiu et al., 2007) метилирования данного гена обнаружено не было. Необходимо отметить, что во всех этих работах на небольших по объему выборках анализировался исключительно экзон I и только с помощью метилспецифичной ПЦР. Что касается частоты метилирования последовательности из 8 CpG-динуклеотидов в составе экзона I гена CDKN2A у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, то в нашем исследовании она составила 76% и статистически значимо не отличалась от соответствующего показателя (61%) в контрольной группе (p = 0,28).

Таким образом, информативными для анализа связи аберрантного метилирования генов клеточного цикла с возникновением мозаицизма оказались гены RB1 и P14ARF, эпимутации которых были обнаружены у 10 из 50 спонтанных абортусов с мозаичным кариотипом (табл. 3). Отсутствие или недостаток протеина pRB в клетке приводит к изменению уровня основных белков-регуляторов клеточного цикла (CDC20, MAD2, циклины B и E) и, как следствие, к появлению разрывов хромосом, мостов, анеу- и полиплоидии (Knudsen, Knudsen, 2006).

Кроме того, нарушение взаимодействий pRB c хроматин-ремоделирующими факторами (HDAC1-3, DNMT, BRC1) обусловливает дефекты центромерного гетерохроматина и нерасхождение хромосом (Gonzalo et al., 2005). Белковый продукт гена P14ARF связывает P53 и RB-зависимые пути регуляции клеточного цикла, препятствуя взаимодействию Mdm2 и pRB белков, что приводит к накоплению последнего и остановке клеточного цикла. Уменьшение количества или полное отсутствие р14 приводит к снижению уровня pRB (Chang et al., 2007).

С целью определения характера связи между метилированием исследованных генов и возникновением мозаицизма нами были изучены особенности распределения клеток с эпимутациями и с хромосомными нарушениями в производных различных зародышевых листков (трофэктодермы и эпибласта), обособляющихся в период имплантации бластоцисты и характеризующихся разной динамикой установления метилирования. Геном клеток трофэктодермы подвергается незначительному метилированию на постимплантационных этапах развития, тогда как уровень метилирования ДНК в производных эпибласта, из которого впоследствии будут развиваться все эмбриональные структуры, существенно возрастает (рис. 1).

Известно, что анеуплоидия в эмбриональных клетках может являться следствием нерасхождения гомологичных хромосом в гаметогенезе у родителей, либо возникать при митотическом делении соматических клеток зародыша. Однако появление мозаицизма всегда является результатом митотических ошибок на постзиготических этапах развития. При этом если зигота имеет нормальный кариотип, то митотическое нерасхождение хромосом будет продуцировать два клона клеток – с трисомией и моносомией. Поскольку клетки с моносомией аутосом обычно не жизнеспособны, то в дальнейшем в организме будут присутствовать только два типа клеток - с нормальным кариотипом и с трисомией. Маркером митотического нерасхождения в этом случае будет являться невысокая доля анеуплоидного клона, ограниченного, как правило, одним типом ткани. Альтернативным механизмом возникновения мозаицизма может являться анафазное отставание хромосомы, приводящее к появлению моносомных клеток, что и было обнаружено в одном из обследованных нами случаев (№ 3, табл. 3).

В случае наличия трисомии в зиготе, мозаицизм может быть следствием анафазного отставания дополнительной хромосомы на постзиготических этапах развития. Этот механизм, известный как «коррекция трисомной зиготы» (Kalousek, 2000), также приводит к формированию двух клеточных клонов – с трисомией и с нормальной хромосомной конституцией. Нерасхождение в случае трисомного кариотипа зиготы даст нормальный клеточный клон и тетрасомию, которая обнаруживается в эмбриональных клетках достаточно редко. Маркером коррекции выступает небольшой процент эуплоидных клеток, присутствующих в одном или в нескольких типах тканей. Однако частота таких клеток в определенной степени зависит и от стадии развития, на которой произошла коррекция, а также от пролиферативной активности нормальных и анеуплоидных клеток.

В проведенном нами исследовании суммарная частота эпимутаций генов RB1 и P14ARF статистически значимо возрастала от 2,610-2 на аллель в группе спонтанных абортусов с высоким уровнем анеуплоидных клеток до 32,510-2 на аллель у абортусов с низким уровнем анеуплоидных клеток в обследованных тканях (p 0,05). Кроме того, эпимутации обнаруживались у абортусов с преимущественной локализацией анеуплоидных клеток либо в экстраэмбриональной мезодерме, либо в цитотрофобласте хориона. При этом ни одного случая аберрантного метилирования промоторных регионов исследованных генов у абортусов с равномерным распределением анеуплоидных клеток в производных двух зародышевых листков зарегистрировано не было. Полученные данные свидетельствуют об ассоциации тканеспецифичного хромосомного мозаицизма с аномальным метилированием генов контроля клеточного цикла.

У эмбрионов с тканеспецифичными хромосомными нарушениями, ограниченными цитотрофобластом (№ 1-3, табл. 3), возникновение мозаицизма было связано с ошибками митотической сегрегации хромосом на постимплантационных этапах дифференцировки трофэктодермы. При этом у всех зародышей метилирование RB1 было выявлено как в цитотрофобласте, так и в экстраэмбриональной мезодерме, что свидетельствовало о возникновении эпимутации еще до выделения трофобласта и внутренней клеточной массы, и, соответственно, до появления хромосомного нарушения. Поскольку обособление трофэктодермы и внутренней клеточной массы происходит во время имплантации бластоцисты на фоне гипометилированного состояния генома, полученные данные указывают на нарушение процесса деметилирования родительских геномов при эпигенетическом репрограммировании в преимплантационном периоде.

У 7 из 10 зародышей возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения до или после обособления цитотрофобласта и экстраэмбриональной мезодермы. У эмбрионов с мозаичными трисомиями по хромосомам 16 и 10 в обеих тканях (№ 4 и № 9, табл. 3) метилирование промоторного региона гена RB1 также присутствовало в производных обоих зародышевых листков, что может свидетельствовать о потенциальной значимости такого эпигенетического статуса данного гена в механизме коррекции трисомии. Ассоциация тканеспецифичного метилирования RB1 с коррекцией анеуплоидии прослеживалась и для эмбрионов № 5, 8 и 10: у всех этих зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы в ткани с более интенсивными процессами коррекции трисомии, приводящими к значимому увеличению частоты эуплоидных клеток, по сравнению с другой тканью.

При рассмотрении всех возможных случаев формирования мозаицизма за счет коррекции трисомии частота эмбрионов с метилированными последовательностями RB1 в экстраэмбриональной мезодерме составила 27,8%, тогда как в цитотрофобласте хориона – только 5,7% (p = 0,04). Полученные данные указывают на то, что метилирование промоторного региона гена RB1 у анеуплоидных зародышей может являться одним из эпигенетических механизмов, который повышает шансы коррекции трисомии с восстановлением нормального числа хромосом.

При этом вероятность такого события оказывается выше для клеток производных внутренней клеточной массы, из которой впоследствии формируются все эмбриональные ткани. Не исключено, что подобный механизм может обеспечивать выживание некоторой части зародышей с аутосомными трисомиями за счет коррекции анеуплоидии непосредственно в эмбриональных клетках на ранних этапах развития с формированием ограниченного плацентарного мозаицизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование было направлено на оценку вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека. Предпосылками к его проведению явились, с одной стороны, данные об интенсивных процессах эпигенетической реорганизации генома эмбриональных клеток на начальных этапах онтогенеза, а с другой стороны, отсутствие концепций, удовлетворительно объясняющих высокую частоту внутриутробной гибели зародышей с нормальным хромосомным набором. Исследование было сфокусировано на анализе изменчивости характера метилирования промоторных регионов генов, как одного из основных эпигенетических механизмов контроля их экспрессии. Предметом изучения явились импринтированные локусы генома, в регуляции экспрессии которых существенное значение отводится эпигенетическим механизмам, а также ряд генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла.

Исследование проводилось на выборке спонтанных абортусов, кариотип которых был установлен и верифицирован с использованием комплекса цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов анализа. В работе были предложены подходы, позволяющие учитывать возможность возникновения ошибок при проведении цитогенетического анализа клеток внутриутробно погибших зародышей человека, связанных с полиплоидизацией эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro, а также с контаминацией культур клетками материнского организма. В то же время необходимо отметить, что у части спонтанных абортусов с нормальным кариотипом могут иметься микроструктурные аберрации хромосом, выявить которые с использованием стандартного метафазного анализа не представляется возможным. Согласно результатам исследований, выполненных с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации, доля таких эмбрионов может составлять 4-5 % (Schaeffer et al., 2004; Shimokawa et al., 2006).

Изменение баланса дозы родительских геномов вследствие наличия феномена геномного импринтинга признается весомым фактором, нарушающим ранние этапы онтогенеза млекопитающих. Вместе с тем, молекулярные и цитогенетические механизмы, приводящие к нарушению такого баланса в эмбриональном периоде развития человека, за исключением случаев пузырного заноса, до настоящего времени оставались практически неизученными. В настоящем исследовании был проведен поиск ОРД у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, однако ни одного случая ошибочного наследования хромосом выявлено не было. При обобщении полученных данных с результатами аналогичных исследований было показано, что частота внутриутробно погибших эмбрионов с ОРД по хромосомам, несущим импринтированные гены, не превышает 0,5%.

Полученные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии заметного влияния ОРД на нарушение эмбрионального развития человека. Однако данный вывод не снимает вопроса о роли мутаций импринтированных локусов генома в этиологии нарушений эмбрионального периода онтогенеза.

Учитывая, что экспрессия импринтированных генов контролируется эпигенетическими механизмами, в настоящей работе был проведен анализ дифференциального метилирования ряда импринтированных локусов хромосом 11 и 15.

Впервые у эмбрионов с нарушениями клеточной пролиферации обнаружено гипометилирование центра импринтинга KCNQ1OT1 на материнской хромосоме 11. Получены данные, свидетельствующие о возникновении эпимутаций на постимплантационных этапах развития. Принимая во внимания тот факт, что аналогичные эпимутации в локусе KCNQ1OT1 зарегистрированы практически у всех детей с синдромом Видемана-Беквита, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения, результаты выполненного исследования подтверждают гипотезу о проявлении у потомства супружеских пар с репродуктивными проблемами скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости, несовместимой с нормальным развитием организма.

Еще одним ожидаемым эффектом аберрантных эпигенетических модификаций генома могло явиться увеличение частоты мутаций и в целом повышение нестабильности генома при нарушениях эмбрионального развития. С целью регистрации этих феноменов в настоящем исследовании были изучены мутации микросателлитных последовательностей ДНК и хромосомный мозаицизм в тканях внутриутробно погибших эмбрионов. Исследование микросателлитных локусов было сфокусировано на сравнительном анализе частоты мутаций гаметического и соматического происхождения при нарушении внутриутробного развития организма. Установлено, что мутации микросателлитных последовательностей ДНК возникают примерно с сопоставимой частотой в гаметах родителей, имеющих живорожденных детей, и в супружеских парах с невынашиванием беременности, тогда как соматические мутации микросателлитных последовательностей ДНК были выявлены исключительно в клетках спонтанных абортусов с нормальным хромосомным набором. Полученные данные свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной изменчивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах онтогенеза человека.

Данные о мутационном процессе в эмбриональных клетках были дополнены результатами исследования хромосомного мозаицизма, возникновение которого также приходится на постзиготические этапы развития. С использованием интерфазного FISH-анализа была изучена частота анеуплоидных клеток и их распределение в производных различных зародышевых листков, что позволило определить механизмы и стадии развития, на которых произошло появление мозаичного кариотипа. В результате все эмбрионы были дифференцированы на две группы. Первую группу составили спонтанные абортусы с мозаичным кариотипом, сформированным вследствие ошибок митотической сегрегации хромосом в клетках зародышей, развивающихся из зигот с нормальным кариотипом. Примечательно, что у этих эмбрионов аномальное метилирование гена клеточного цикла RB1 было выявлено в производных трофэктодермы и внутренней клеточной массы, что свидетельствовало о раннем возникновении эпимутации, предшествующем событию хромосомного нерасхождения.

Во второй более многочисленной группе спонтанных абортусов возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения. У этих зародышей также была продемонстрирована ассоциация аномального метилирования гена RB1 с возникновением хромосомного мозаицизма. Показано, что частота эпимутаций оказывается выше в тканях с более интенсивными процессами коррекции трисомии. При этом аномальное метилирование было выявлено преимущественно в экстраэмбриональной мезодерме, производной эпибласта, из которого формируются все эмбриональные структуры.

Возможно, что метилирование некоторых генов, вовлеченных в контроль клеточного деления и сегрегации хромосом, при аутосомных трисомиях мейотического происхождения повышает шансы коррекции анеуплоидии в эмбриональных клетках с восстановлением нормального хромосомного набора. Это предположение требует дополнительных исследований, вместе с тем, полученные в ходе настоящей работы данные относительно статуса метилирования еще одного гена клеточного цикла (CDKN2A) в плацентарных тканях контрольной группы зародышей указывают на значимость эпигенетической регуляции клеточного деления в обеспечении нормального эмбрионального развития.

Обобщая результаты исследования можно отметить, что нарушения эмбрионального периода онтогенеза человека сопровождаются повышением уровня мутационной изменчивости генома. Ее возникновение может являться следствием повреждения некоторых универсальных механизмов регуляции структурно-функциональной организации генома, в том числе и через аберрантные эпигенетические процессы. Наиболее вероятной причиной эпигенетических аномалий являются ошибки репрограммирования генома, приводящие к формированию аберрантных эпигенотипов, несовместимых с нормальным течением эмбрионального развития. Патогенетические механизмы нарушений развития эмбрионов с аномальными эпигенотипами могут быть связаны, как с повышением частоты мутаций в их соматических клетках, так и с повреждением эпигенетически контролируемых феноменов (в частности, геномного импринтинга), обеспечивающих нормальное течение эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что нарушение эмбрионального развития человека может быть обусловлено эпимутациями импринтированных генов. У 9,5% спонтанных абортусов выявлено тканеспецифичное гипометилирование центра импринтинга KCNQ1OT1 на материнском гомологе хромосомы 11. Тканеспецифичность эпимутаций свидетельствует об их соматическом происхождении после обособления экстраэмбриональных и зародышевых листков на постимплантационных этапах развития.

2. Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов генома человека, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возникают нарушения характера метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных генов.

3. Установлено, что однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным кариотипом.

4. Возникновение хромосомного мозаицизма при нарушениях эмбрионального развития преимущественно связано с механизмом коррекции анеуплоидии мейотического происхождения. Только у 10% эмбрионов мозаичная хромосомная конституция является следствием ошибок митотической сегрегации хромосом в соматических клетках зародыша, развивающегося из зиготы с нормальным кариотипом.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«ЕВИНА Елена Игоревна ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ САККАДИЧЕСКИХ ДВИЖЕНИЙ ГЛАЗ ПРИ ЭКСТРАПИРАМИДНЫХ РАССТРОЙСТВАХ 03.00.13 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой – профессор В.В. Шульговский) кандидат биологических наук, доцент Научный руководитель...»

«Воробьев Алексей Викторович ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕТАНО- И МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА BEIJERINCKIACEAE Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель : доктор биологических наук С.Н. Дедыш Официальные оппоненты : доктор...»

«ФРОЛОВ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ рН-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА В ХЛОРОПЛАСТАХ Специальность 03.00.02 - Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр...»

«Воронкин Денис Алексеевич МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОРГАНАХ И КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ХРОНИЧЕСКОМ АЛКОГОЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Краснодар – 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ростовский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный...»

«УДК 597-153:591.524:11(571.64) Френкель Светлана Эдуардовна Дрифт беспозвоночных как кормовая база молоди лососей в типичной малой реке Сахалина Специальность 03.02.10 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2011 Работа выполнена в лаборатории воспроизводства лососевых рыб Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО) Научный руководитель : доктор биологических...»

«ФОМИНА ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АСИММЕТРИЯ МОЗГА И АДАПТАЦИЯ ЧЕЛОВЕКА К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ СПОРТИВНЫМ НАГРУЗКАМ 03.00.13 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Тюмень - 2006 Работа выполнена в Сибирском государственном университете физической культуры и спорта Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Виталий Петрович Леутин Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор Вячеслав Иванович...»

«Дейкин Алексей Васильевич Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей Специальность 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории трансгенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН. Научный руководитель кандидат химических наук Садчикова Елена Рубеновна Научный консультант доктор биологических...»

«КИРЖАНОВ Дмитрий Викторович Теоретическое исследование взаимосвязи флуоресценции фотосистемы II и состояния цепи электронного транспорта Специальность: 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико–математических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова...»

«БАЖЕНОВ Юрий Александрович МЛЕКОПИТАЮЩИЕ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ (ФАУНА, НАСЕЛЕНИЕ, ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СООБЩЕСТВ) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН, Федеральном государственном бюджетном учреждении...»

«Бабро Анастасия Александровна РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ Rhododendron schlippenbachii Maxim. и Rhododendron luteum Sweet (Ericaceae) 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена Учреждении Российской академии наук Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук Шамров Иван Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший...»

«Гашев Сергей Николаевич МЛЕКОПИТАЮЩИЕ В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА (на примере Тюменской области) 03.00.16 - экология Автореферат Тюмень-2003 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Организация мониторинга окружающей среды как построение комплексных пространственно-временных рядов трансформации различных биогеоценозов под действием естественных и антропогенных факторов...»

«КАЛИНИНА Екатерина Андреевна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОНТОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ (Zea mays L.) ПОД ДЕЙСТИВИЕМ АУКСИНА И ЦИТОКИНИНА 03.01.05 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2010 Работа выполнена на кафедре агрономии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет (ФГОУ...»

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«САВИНОВА ИРИНА ВИКТОРОВНА СОДЕРЖАНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ В ПЕЧЕНИ И МЫШЦАХ И ПРОДУКТОВ ГЛИКОЛИЗА В КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ МЕТИЛФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российский научный центр Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова (РНЦ ВТО) Министерства...»

«Николаева Дария Александровна БИОСИНТЕЗ ПОЛИ-3-ГИДРОКСИБУТИРАТА РАЗНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ КУЛЬТУРОЙ AZOTOBACTER CHROOCOCCUM И ЕГО БИОДЕГРАДАЦИЯ 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2004 2 Работа выполнена в группе биохимии азотфиксации Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Г.А. Бонарцева Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Е.П....»

«ИВАНИЦКИЙ ЯРОСЛАВ ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕРЫ И КАЛЬЦИЯ НА ЗЕРНОВУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ И КАЧЕСТВО ЗЕРНА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар - 2011 Работа выполнена в лаборатории агроэкологических основ формирования качества зерна (АЭОФКЗ) отдела защиты растений и в лаборатории агрохимических исследований ГНУ Краснодарский научноисследовательский институт...»

«Спасик Светлана Евгеньевна ТОЛЕРАНТНОСТЬ ПЧЕЛ APIS MELLIFERA L. К КИСЛОРОДНОМУ ГОЛОДАНИЮ Специальности 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Балашиха 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный заочный университет Научный руководитель : доктор биологических наук Еськова Майя Дмитриевна Официальные оппоненты : Маннапов Альфир Габдуллович, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО...»

«КОВАЛЬЧУК ОЛЬГА АЛЕКСЕЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ БАЛТИЙСКОЙ КОСЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕРЫ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ РАЗРУШЕНИЯ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов 2011 Работа выполнена в Калининградском государственном техническом университете Научный доктор сельскохозяйственных наук, руководитель: профессор Паракшина Элеонора Михайловна Официальные доктор биологических наук, с.н.с. оппоненты: Сибикеев...»

«Гапочка Михаил Германович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА С БИОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2013. 1 Работа выполнена на кафедре гидробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный...»

«Лискова Елена Викторовна ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПРИ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург – 2012 2 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Минздрава России и в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Усвяцов Борис Яковлевич...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.