WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ФУНКНЕР Елена Викторовна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

РАЗРАБОТКИ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГОВ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Пермь – 2007 2

Работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов филиала Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития РФ «Пермское НПО «Биомед», Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Казьянин Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат медицинских наук Дарбеева Ольга Сергеевна

Ведущая организация: ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург

Защита состоится «_» 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс (342)2446711.

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «»2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, член-корреспондент РАН Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, в том числе Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. в настоящее время представляют существенную проблему, как с клинических, так и с эпидемиологических позиций. Традиционными препаратами этиотропной терапии гнойно-воспалительных заболеваний являются антибиотики.



Однако, применение антибиотиков сопряжено не только с гибелью патогенных агентов, поддерживающих инфекционный процесс, но и с подавлением нормальной микрофлоры человека, ее адгезивных свойств (Трапезов и др., 1990; Кушнарева, 2000). Вопрос об успешной профилактике и терапии гнойно-септических инфекций приобретает чрезвычайную актуальность в условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам (Навашин, 1997; Савицкая и др., 2001; Green, 2001; Ducki et al., 2002; Clarke, 2003). В связи с этим интенсифицируются исследования по совершенствованию и разработке альтернативных методов лечения, в частности фаготерапии. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагам, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии (Иванов, 2000; Лазарева, 2003; Sulakvelidze et al., 2001).

В сфере фагового производства актуальны задачи, связанные с конструированием новых препаратов и усовершенствованием технологического процесса, включая отбор и использование высокочувствительных штаммовпродуцентов, разработку питательных сред для культивирования бактериофагов, изготовление более широкой номенклатуры лекарственных форм. В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, наиболее целесообразно создание поливалентных комбинированных бактериофагов (Бухарин, 1999; Рафиев, Сатаров, 2001;

Хайруллин, 2003). Распространенными формами выпуска препаратов бактериофагов являются жидкие лекарственные формы и таблетированные фаги кишечной группы. В последние годы на фоне значительного увеличения объемов выпуска препаратов ведутся работы по созданию новых лекарственных форм (Георгадзе и др., 1997; Ананьев и др., 1999; Маркоишвили и др., 1999; Чубатова и др., 2000; Thacker, 2003; Sulakvelidse et al., 2004). Среди различных способов введения лекарств широкое распространение в медицинской практике получает ректальный способ, преимуществами которого являются: попадание лекарственного вещества непосредственно в общий кровоток, увеличение скорости всасывания, уменьшение частоты аллергезирующего действия, простота, безболезненность введения, а также удобство использования в детской практике (Козлова и др., 1992). Целесообразность выпуска лекарственных форм бактериофагов для ректального введения, в том числе суппозиториев, диктуется также необходимостью сохранения литической активности фагов, так как при пероральном приеме они в значительной степени инактивируются соляной кислотой желудочного сока.

Цель настоящей работы – создание композиции, изучение биологических свойств и разработка лекарственных форм комплексного фагового препарата на основе отобранных из клинического материала условно патогенных микроорганизмов–продуцентов бактериофагов.

Основные задачи

исследования 1. Детально исследовать морфо-физиологические свойства выделенных из клинического материала штаммов-продуцентов бактериофагов (E. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и создать коллекцию из перспективных в производственном отношении микроорганизмов.





2. Оптимизировать и унифицировать условия производственного процесса репродукции бактериофагов.

3. Разработать способ получения комплексного фагового препарата и охарактеризовать его биологические свойства.

4. Получить лекарственную форму комплексного фагового препарата для ректального введения (суппозитории), исследовать ее фармакодинамику и эффективность применения в клинической практике.

Научная новизна. Проведено изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств большой группы условно патогенных микроорганизмов, выделенных из клинического материала лечебных учреждений Пермского края.

Произведен отбор штаммов - потенциальных продуцентов бактериофагов.

Оптимизирован и унифицирован процесс репродукции бактериофагов на основе использования универсальной питательной среды (Патент RU 2247151 «Способ получения полибактериофага», приоритет от 06.05.2002). На основе высоковирулентных фагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) сконструирован поливалентный комплексный 6-компонентный препарат Секстафаг с широким спектром и высоким уровнем антибактериальной активности. Изучена фармакодинамика различных лекарственных форм Секстафага при пероральном и ректальном путях введения препарата.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о методических подходах к конструированию и изготовлению фаговых препаратов, включая постоянное обновление коллекции штаммов-продуцентов с изучением их свойств, репродукцию бактериофагов на универсальной питательной среде и особенности создания на их основе лекарственных форм.

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления бактериофагов к условиям массового производства препаратов, а также созданием нового комплексного фагового препарата, расширяющего арсенал антибактериальных лекарственных средств. Сформирована коллекция производственных микроорганизмовпродуцентов для изготовления моно - и комплексных препаратов бактериофагов.

Разработана универсальная казеиново-кислотная среда, позволяющая получать препараты бактериофагов со сниженным содержанием балластных веществ.

Предложен способ получения комплексного препарата, включающий раздельное культивирование отдельных компонентов с последующим объединением высокоактивных монофагов с заданными свойствами. Получены лекарственные формы препарата Секстафаг: жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные на основе жидкого концентрата. Созданная технология используется в производстве препарата Секстафаг жидкий (получено более 270 промышленных серий).

Результаты научной работы отражены в нормативной документации (регламент производства № 1105-01, фармакопейная статья предприятия 42-00282322-02 на бактериофаг стрептококковый жидкий; регламент производства № 1103-01, ФСП 42-0028270502 на Секстафаг® (пиобактериофаг поливалентный) жидкий; экспериментально-производственный регламент, проект ФСП и проект инструкции по применению на Секстафаг® суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный).

1. Использование коллекции региональных штаммов-продуцентов бактериофагов (E. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и универсальной казеиново-кислотной питательной среды обеспечивает получение фаговых препаратов, обладающих высокой специфической активностью и низким содержанием балластных веществ.

2. Предложенный способ раздельного культивирования монофагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) с последующим объединением в единую лекарственную форму с активностью не ниже 10-5 каждого компонента обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего выраженным этиотропным действием по отношению к условно патогенным микроорганизмам.

3. Лекарственная форма препарата Секстафага для ректального применения (суппозитории), полученная по разработанной технологии, оказывает терапевтический эффект в лечебной практике и обладает более длительной динамикой выведения, чем жидкий препарат.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научно - практической конференции «Вакцинопрофилактика в ХХI веке», Пермь, 2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001;

Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003;

Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», Уфа, 2005; Научно-практической конференции «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития», Пермь, 2005; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», Пермь, 2005;

Научно-практической конференции «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии. Новые технологии в медицине», Ижевск, 2006; Международной научнопрактической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2006;

Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск, 2006; Международной Российскокитайской научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Полученные результаты защищены патентом на изобретение РФ.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации: 01.9.90 002643).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 150 страницах, содержит 24 таблицы и 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 271 источник, из них отечественных и 98 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Формирование коллекции производственных и контрольных штаммов E. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp. проводили на основе бактериологического анализа клинического материала, изученного в баклабораториях лечебных учреждений г. Перми и Пермского края.

Дифференциальную диагностику выделенных штаммов микроорганизмов осуществляли по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам, результатам серотипирования (сыворотки диагностические эшерихиозные ОК поливалентные сухие для РА производства АО «Биомед» им. И.И. Мечникова) и фаготипирования (международный набор, включающий 23 типа бактериофагов производства Англии) (Приказ № 535, Москва, 1985). Для хранения коллекционных штаммов использовали полужидкие и твердые среды (производства «Пермского НПО «Биомед»): 0,5% агар Мартена (для Ps. aeruginosa); 0,5% агар Мартена с 0,4% глюкозы (для E. coli); 1,5% агар Мартена с 0,4% глюкозы (для Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.). В исследованиях использовали селекционированные нами бактериофаги: стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиеллезный, синегнойный, коли, вошедшие в комбинированный препарат - Cекстафаг (пиобактериофаг), экспериментальные серии препарата Cекстафаг суппозитории ректальные.

Культивирование бактериофагов проводили в реакторах с применением казеиново-кислотной среды, мясо-пептонного бульона и бульона Мартена.

Концентрирование комплексного препарата осуществляли методом ультрафильтрации с помощью разделительных аппаратов на полых волокнах марки ВПУ-15. Для формования суппозиториев использовали гидрофобные (витепсолы, Себао) и поверхностно-активные вещества (МГД, Т-2). Свойства суппозиториев изучали с использованием методов, изложенных в ФСП на клебсифаг в свечах и в Государственной Фармакопее (ГФ XI, вып. 2).

Чувствительность микроорганизмов к бактериофагам определяли путем диффузии фага в питательный агар и по методу Аппельмана (Адамс, 1961).

Диапазон и степень литической активности бактериофагов определяли методом Аппельмана на питательном бульоне для культивирования микроорганизмов (ФС 42-0049-00) (Адамс, 1961), концентрацию фаговых частиц – методом A. Gratia (Gratia, 1936) на двухслойном агаре (производства «Пермского НПО «Биомед»).

Контроль специфической активности препаратов бактериофагов проводили с помощью специально подобранных наборов контрольных штаммов.

Неспецифические свойства препаратов бактериофагов (рН, стерильность, токсичность) изучали регламентированными методами (ФСП 42-002823-23-02 на стафилококковый бактериофаг, ФСП 42-002823-22-02 на стрептококковый бактериофаг, ФСП 42-002824-08-02 на протейный бактериофаг, ФСП 42-002824-07-02 на коли бактериофаг, ФСП 42-002831-24-02 на клебсифаг жидкий, бактериофаг клебсиелл пневмонии, ФСП 42-002827-06- на бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синегнойный), ГФ XI, вып. 2).

Антибиотикочувствительность микроорганизмов определяли дискодиффузионным методом на плотной питательной среде с использованием стандартного набора (пенициллин, ампициллин, оксациллин, цефазолин, ванкомицин, ципрофлоксацин, эритромицин, фурадонин, гентамицин, амикацин, доксициклин, карбенициллин, цефотаксим, цефтазидим, налидиксовая кислота, офлоксацин, имипенем) производства НИЦФ, г. Санкт-Петербург (Биргер, 1982;

Сидоренко, 1999). Концентрацию микробных клеток определяли с помощью оптического стандарта мутности (ОСО 42-28-85 на 10 ед производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича), а также турбидиметрическим методом в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 540 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2. Физико-химические свойства препаратов, питательных сред (аминный азот, белковый и общий азоты, рН) изучали согласно методов, изложенных в ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические, иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов». Ацидорезистентность определяли путем инкубирования Секстафага в цитратно-фосфатном буфере (рН 2,8) при температуре (36 ± 1) С в течение 1 ч с последующим определением специфической активности по Аппельману.

Стабильность компонентов Секстафага к термическому воздействию изучали при экспозиции препарата на водяной бане при температурах 45, 50, 55, 60, 65 С в течение 30-60 мин.

Динамику выведения бактериофагов изучали на здоровых людях и больных панкреонекрозом. Клинический материал (мочу) обрабатывали хлороформом, а при исследовании мочи здоровых людей использовали метод обогащения (Габрилович, 1968). Обработанные пробы наносили на газон тест - культуры микроорганизма и положительные пробы титровали по методу Аппельмана в разведениях 10-1-10-3. Клиническую эффективность суппозиториев с Секстафагом оценивали в комплексном лечении 11 больных острым необструктивным пиелонефритом (основная группа) в сравнении с традиционной терапией 11 больных (группа сравнения). Изучали динамику изменения и нормализацию клинических и лабораторных показателей (температура тела, боли в поясничной области, бактериурия, лейкоцитурия, уровень лейкоцитов крови).

Анализ фракционного состава препаратов проводили методом жидкостной хроматографии низкого давления с использованием прибора «LKB» (Швеция).

УФ-детекцию осуществляли в проточной кювете при длине волны 280 нм.

Электронная микроскопия Секстафага проводилась на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) под руководством к.б.н. Жиленкова Е.Л. с использованием углеродных пленок-подложек, обработанных тлеющим разрядом в вакууме. Перед нанесением на пленку фаговые образцы фиксировали 1% глютаровым альдегидом, приготовленным на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0).

Нанесенные на подложки препараты контрастировали 1 % водным раствором уранилацетата (Brenner, Horne, 1959). Визуализацию образцов и их фотографирование проводили на электронном микроскопе «Hitachi H-300»

(Япония).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики (Гланц, 1999). Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стъюдента. Различия считали статистически значимыми при p0,05.

Результаты в таблицах представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микробиологические аспекты разработки препаратов бактериофагов За период с 1996 г. по 2000 г. при формировании коллекции продуцентов бактериофагов было проанализировано 7616 штаммов микроорганизмов, выделенных в баклабораториях г. Перми и Пермского края, а также полученных из ГИСК им. Л.А.Тарасевича (рис.1).

Рис. 1. Видовой состав выделенных микроорганизмов.

Максимальное пополнение коллекции было проведено в течение 1999-2000 гг. при исследовании свойств выделенных микроорганизмов St. aureus (245 штаммов), Streptococcus spp. (374 штамма), Enterococcus spp. (335 штаммов), Ps. aeruginosa (245 штаммов), E. coli (226 штаммов), Pr. vulgaris, Pr. mirabilis (573 штамма), Kl. pneumoniae (563 штамма). Бактериальные штаммы представленной таксономической принадлежности и обладающие типичными для каждого вида свойствами, оценивали по чувствительности к монобактериофагам (стафилококковому, стрептококковому, синегнойному, клебсиеллезному, протейному, коли) (рис. 2).

к монобактериофагам.

В дальнейшем микроорганизмы, чувствительные к бактериофагам в разведении не ниже 104, пассировали с маточными бактериофагами под контролем специфической активности. В коллекцию отбирали штаммы, лизируемые маточными бактериофагами в титре 10-6 и выше.

При формировании коллекционного пула St. aureus проводили фаготипирование штаммов с применением типового международного набора стафилококковых фагов. При изучении фагочувствительности 937 штаммов отмечено постоянное изменение чувствительности стафилококков к типовым и лечебным фагам. Выявлена высокая чувствительность к стафилококковому бактериофагу микроорганизмов, выделенных при гнойных инфекциях у взрослых (80 - 98%) и у детей (95 - 98%) (рис. 3). Вызывающие энтеральные заболевания штаммы St. aureus лизировались фагами значительно слабее и существенно отличались по фагочувствительности в зависимости от места выделения штамма.

Принимая во внимание данное обстоятельство, в коллекцию были отобраны штаммы стафилококков с разными фаготипами с учетом чувствительности к лечебному стафилококковому бактериофагу.

Рис. 3. Чувствительность Staphylococcus aureus к лечебному и типовым стафилококковым фагам.

Таким образом, проведенные исследования позволили сформировать коллекцию, которая в настоящее время включает около 600 производственных штаммов условно патогенных микроорганизмов. Пополнение и постоянное обновление коллекции обеспечивают эффективность и адекватность получаемых препаратов бактериофагов современной этиологической структуре циркулирующих возбудителей.

Получение комплексного фагового препарата Процесс культивирования бактериофагов предполагает создание с помощью питательных сред благоприятных условий для размножения фаговых частиц.

Наиболее распространенными питательными средами в производстве бактериофагов являются дорогостоящие и недостаточно стандартные мясные среды. Нами были проведены исследования по изучению возможности использования в качестве альтернативы более экономичных казеиновых сред.

Отличительными особенностями разработанного варианта казеиновой среды является то, что в качестве питательной основы использован кислотный гидролизат казеина со степенью расщепления 0,6-0,7, а также добавлен мультивитаминный комплекс. Кроме того, оптимизирован способ получения гидролизата, включающий одновременное изоосаждение нерасщепленного казеина и обработку гидролизата углем.

При сравнительном изучении характера роста микроорганизмов на мясной среде (бульон Мартена) и казеиново-кислотной среде выявлено, что разработанная среда обладает хорошими ростовыми свойствами и подходит для культивирования ряда условно патогенных бактерий (E. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.).

Проведенные исследования явились предпосылкой для создания технологии получения комплексного препарата, включающей раздельное культивирование бактериофагов. В стационарных условиях в реакторах в казеиново-кислотную среду одновременно засевали суточную микробную культуру из расчета (75±25) млн. клеток на 1 мл среды и маточный бактериофаг в количестве 0,2% от объема засеваемой среды. Культивирование вели при температуре (36±1)°С в течение (18±2) часов до полного лизиса культуры. Полученный фаголизат подвергали сначала осветляющей, а затем стерилизующей фильтрации. После этого стерильные фаголизаты (стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиеллезный, синегнойный и коли) с титром по Аппельману не ниже 10- объединяли в равных объемах в 6-компонентный препарат Секстафаг. Такая технология обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего значительной антибактериальной активностью по отношению к условно патогенным микроорганизмам.

К достоинствам препарата следует отнести то, что полученный на казеиновокислотной среде, он содержит балластных веществ в 5-6 раз меньше (по белковому азоту), чем фаголизаты с мясных питательных сред (бульон Мартена, мясо-пептонная среда) (табл. 1).

Азотистый состав питательных сред и препарата Секстафаг Секстафаг, полученный на этих Казеиново-кислотная среда 1,960±0,010 0,040±0, казеиново-кислотной среде Секстафаг, полученный на бульоне Мартена Мясо-пептонный бульон 1,690±0,030*** 0,180±0,010*** Секстафаг, полученный на мясопептонном бульоне Примечание. *** - р0,001 в сравнении с казеиново-кислотной средой, - р0,01; ### - р0,001 в сравнении с препаратом Секстафаг, полученным на казеиново-кислотной среде.

Таким образом, разработанная технология базируется на применении универсальной питательной среды для всех используемых в производстве комплексного препарата культур: стафилококка, стрептококка, клебсиелл, синегнойной и кишечной палочек, протея, что обеспечивает стабильную репродукцию всех бактериофагов и позволяет получать препарат Секстафаг со сниженным содержанием балластных веществ.

В ходе изучения свойств комплексного препарата установлено, что по устойчивости к физико-химическим факторам более стабильными являются клебсиеллезный, синегнойный, коли и протейный фаги, а лабильными – стафилококковый и стрептококковый, особенно это проявляется при высокотемпературных воздействиях (р0,01) (рис. 4).

lg титра Рис. 4. Влияние температурного фактора на компоненты препарата Секстафаг.

С целью изучения сравнительной характеристики антибактериальной активности препарата Секстафаг и антибиотиков оценена чувствительность к ним микроорганизмов, выделенных из клинического материала в течение 2001 - 2002 гг.: St. aureus (627 штаммов), Str. pyogenes (183 штамма), Str. pneumoniae (104 штамма), Str. viridans (137 штаммов), E. coli (649 штаммов), Kl. spp. (165 штаммов), Pr. spp. (94 штамма), Ps. aeruginosa (91 штамм). По нашим данным у стафилококков степень чувствительности к препарату Секстафаг (76,7%) намного превосходила активность пенициллина (8,5%) и ампициллина (22,3%), находилась на уровне таких антибиотиков, как эритромицин (77,5 %) и оксациллин (78,8 %), а уступала только ципрофлоксацину (97,3 %), гентамицину (92,9 %) и цефазолину (89,5 %) (рис. 5).

Рис. 5. Чувствительность Staphylococcus aureus к антибиотикам и препарату Секстафаг.

Примечание. пен – пенициллин, амп – ампициллин, окс – оксациллин, цз – цефазолин, ген – гентамицин, цип – ципрофлоксацин, эри – эритромицин.

***- р 0,001 по t – критерию Стьюдента относительно препарата Секстафаг.

Результаты оценки специфической лизирующей активности препарата Секстафаг по отношению к клиническим штаммам условно патогенных микроорганизмов свидетельствуют о создании высокоактивного препарата, не уступающего по эффективности многим современным антибиотикам.

Сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов, полученных из баклабораторий лечебных учреждений г. Перми к препаратам Секстафаг жидкий и пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий (производства Филиала ФГУП МЗ РФ «НПО «Микроген» в г. Уфа) показало, что спектр действия этих препаратов совпадает и практически не отличается (р0,05) (рис. 6).

и пиобактериофаг очищенный жидкий.

При хроматографическом анализе комплексных препаратов бактериофагов разных производителей (Пермь, Уфа, Н.Новгород) выявлено, что содержание низкомолекулярных веществ в жидком Секстафаге в 2,5-3 раза меньше, чем в пиобактериофаге и интести-бактериофаге (рис. 7). Это свидетельствует о том, что в препарате Секстафаг присутствует меньше балластных веществ, чем в других комплексных препаратах, что связано с составом применяемой питательной среды.

Полученные серии препарата Секстафаг жидкий обладали высокой специфической активностью, были стерильны, не токсичны и стабильны в течение 2-х лет хранения при температуре от 2 до 8 °С. Обращают на себя внимание показатели специфической активности препарата. Титр компонентов Секстафага при определении по Грациа составил (2,0·106 – 6,0·107), что значительно выше, чем показатели титрования по Аппельману (10-5,86 – 10-6,00).

На газоне культур стафилококковый, стрептококковый, синегнойный и коли бактериофаги образуют негативные колонии размером 0,5-1,5 мм, протейный фаг – 0,1-0,2 мм и 1-2 мм, клебсиеллезный – колонии с ореолом, в центре прозрачная зона диаметром 2 мм.

D, 280 нм D, 280 нм бактериофагов на сефарозе 2 В.

Электронно-микроскопическое исследование составляющих компонентов препарата Секстафаг позволило визуально выявить и охарактеризовать морфологические особенности различных видов фагов. Морфологически отдифференцировано 9 фагов, среди которых 3 вида относятся к стрептококковым фагам, 2 – к клебсиеллезным и по 1 виду – к синегнойному, протейному, стафилококковому и коли фагу (рис. 8). Выявлены особенности строения вирионов и разный механизм адсорбции фага на клетке, что является важным аспектом при отборе бактериальных вирусов для лечебных целей. Подтверждено, что все монофаги, входящие в Секстафаг, являются высоковирулентными.

Необходимо отметить эффективность применения Секстафага в лечебной практике. Комбинированный препарат – Секстафаг производства «Пермского НПО «Биомед» успешно использован в качестве средства фагопрофилактики инфекционновоспалительных осложнений при кесаревом сечении. Применение комбинированного бактериофага позволило снизить частоту инфекционно-воспалительных осложнений с 26,7 % до 18,7 % (Трушков, 2003). Эффективность терапии больных хроническим неспецифическим эндометритом составила 72-75 % (Меззи Халед, 2003). Комплексное использование антибиотиков и бактериофагов при пиелонефрите у беременных явилось более эффективным и щадящим по сравнению с традиционной антибиотикотерапией (Захарова, 2004). Оптимизация хирургической тактики, проведение антибактериальной терапии20 учетом чувствительности изолированной микрофлоры к химиопрепаратам и использование в комплексной терапии Секстафага позволили снизить летальность у больных инфицированным панкреонекрозом с 27,8 % до 13,3% (Субботин, 2006).

Рис. 8. Электронно-микроскопический анализ Секстафага А - Бактериофаг Str. pyogenes № 1 (морфотип В1); Б - Бактериофаг Str. pyogenes № (морфотип В1); В - Бактериофаг Str. pyogenes № 3 (морфотип В3); Г - Бактериофаг St. aureus (морфотип А1); Д - Бактериофаг Pr. vulgaris et mirabilis (морфотип В1); Е - Бактериофаг E. coli (морфотип А2); Ж - Бактериофаг Kl. pneumoniae № 1 (морфотип С1); З - Бактериофаг Kl. pneumoniae № 2 (морфотип В1); И - Бактериофаг Ps. aeruginosa (морфотип А1).

Разработка технологии и оценка качества ректальной лекарственной формы препарата Секстафаг бактериофагами, мы остановили свой выбор на суппозиториях. Работа по созданию суппозиториев с Секстафагом включала ряд последовательных этапов.

В первой серии экспериментов отрабатывали технологию получения суппозиториев на модели одного бактериофага – клебсиеллезного. В суппозиторную основу активное вещество вводили либо в сухом, либо в жидком виде. Мы отдали предпочтение последнему варианту, поскольку активность жидких фагов сохраняется дольше, чем лиофилизированных. Для предварительной подготовки биологически активного компонента был использован метод мембранной ультрафильтрации. Достоинством этого метода является совмещение стадии очистки и концентрирования бактериофагов.

Проведенные исследования показали, что с помощью разделительных аппаратов на полых волокнах марки ВПУ-15 можно получить концентрированные клебсиеллезные бактериофаги с активностью в 100-150 раз выше исходной и очисткой по белковому и общему азотам в 78,0 и 63,4 раз соответственно.

Такой подход позволил сохранить практически без потерь специфическую активность бактериофага и обеспечить высокую степень его очистки. Полученные концентраты клебсиеллезного бактериофага были использованы при приготовлении 20 вариантов суппозиториев с применением ряда жировых основ (Себао, витепсолы марок H-15, W-35) и эмульгаторов (Т-2, МГД) в различных пропорциях. Сравнение двух суппозиторных основ (Себао и витепсол) выявило значительные преимущества последнего по физическим свойствам. Была определена оптимальная доза концентрированного бактериофага в суппозиторной массе - 20 %. Установлено, что суппозитории, приготовленные на смеси витепсолов марок Н-15 и W-35 обладали хорошими структурно - механическими свойствами, не оплавлялись в руках и практически полностью сохраняли специфическую активность в течение 1,5 лет при температуре хранения от 2 до 8°С.

Приготовление суппозиториев с Секстафагом проводили по алгоритму, разработанному для клебсиеллезного бактериофага в свечах. Для создания необходимой дозировки в лекарственной форме компоненты Секстафага так же, как и клебсиеллезный бактериофаг предварительно концентрировали.

Необходимо отметить, что специфическая активность концентрированных монофагов должна быть не ниже 10-7. При формовании свечей важную роль играет температурное воздействие на суппозиторную массу. Учитывая это, было изучено влияние различных температур в течение 1 часа на концентрированный Секстафаг и суппозиторную массу. Установлено, что максимально допустимая температура процесса выливания не должна превышать 40 °С.

По разработанной технологии изготовлены экспериментальнопроизводственные серии Секстафага в суппозиториях, состав которых представлен в табл. 2.

На Секстафаг суппозитории ректальные оформлена необходимая нормативная документация (производственный регламент, проект ФСП). экспериментально-производственные серии препарата вместе с документацией прошли контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, получен положительный ответ.

Отмечено, что специфическая активность всех компонентов Секстафага в суппозиториях сохраняется в пределах нормы (не менее 10-4) в течение 1,5 лет хранения при температуре от 2 до 8°С (табл. 3).

Оценка стабильности препарата Секстафаг суппозитории ректальные № серии 10-5,14±0,26 10-4,86±0,34 10-5,14±0,26 10-5,29±0,29 10-4,71±0,18 10-5,14±0, 2,5 мес. 10-5,00 10-4,71±0,29 10-4,57±0,2 10-4,71±0,36 10-4,57±0,30 10-4,71±0, 10-4,86±0,26 10-4,29±0,29 10-4,43±0,20 10-4,43±0,20 10-4,29±0,18 10-4,57±0, 12 мес. 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,14±0,14 10-4,14±0, 18 мес. 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,14±0,14 10-4,14±0, 21 мес. 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,29±0,18 10-4,14±0,14 10-4,14±0, 24 мес. 10-4,00±0,18 10-3,86±0,14 10-4,14±0,14 10-4,14±0,26 10-4,00±0,31 10-4,00±0, По остальным показателям (описание, микробиологическая чистота, средняя масса, время полной деформации, токсичность) суппозитории по истечении срока хранения соответствовали требованиям нормативной документации. Таким образом, предложена и отработана технология изготовления суппозиториев с Секстафагом, в соответствии с которой концентрат бактериофагов вводится в суппозиторную основу в жидком виде, исключая стадию лиофилизации, что значительно удешевляет производственный процесс и обеспечивает длительное сохранение специфической активности фагов.

Следующий раздел нашей работы включал изучение динамики выведения Секстафага при пероральном и ректальном путях введения у здоровых и больных людей. Исследования показали, что при ректальном способе введения бактериофагов, так же как и при пероральном, происходит всасывание фагов в кровь, циркуляция в организме человека и выведение с мочой. При этом наблюдается длительная циркуляция бактериофагов в организме человека и лучшее сохранение их литической активности. Кроме того, положительными моментами ректального применения Секстафага являются отсутствие воздействия желудочного сока, насыщение венозной системы кишечника с дальнейшим поступлением препарата в общий кровоток, специфическое действие Секстафага на энтеробактерии толстой кишки.

Изучена терапевтическая эффективность препарата Секстафаг суппозитории ректальные в комплексном лечении больных. Работа проведена в 2005 г. во 2-м урологическом отделении ГКБ № 2 г.Перми. В исследование было включено больных острым необструктивным пиелонефритом. Пациенты были разделены на две группы: больные основной группы получали комплексную терапию, включающую Секстафаг суппозитории ректальные 2 раза в день, современные антибиотики широкого спектра, дезинтоксикационную терапию; группа сравнения получала аналогичное лечение, но без суппозиториев.

У больных основной группы при проведении комплексной терапии, включающей суппозитории с Секстафагом, гипертермия исчезала в среднем через 3,1+ 0,3 суток с момента начала лечения, в группе сравнения – через 5,0 + 0, суток. Разница статистически достоверна (Р 0,01). У 1 (9,1%) больного группы сравнения через 14 суток отмечалось сохранение субфебрильной температуры тела. Лейкоцитоз крови снижался значительно быстрее у больных основной группы. Через 14 суток терапии все больные имели нормальное содержание лейкоцитов крови, а среднее значение лейкоцитов составило 6,0х109/л, т.е.

показатель лейкоцитоза снизился на 57,7%. В группе сравнения через 2 недели у пациентов (27,2%) сохранялся гиперлейкоцитоз, среднее число лейкоцитов периферической крови снизилось меньше, чем в основной группе. Все 11 больных основной группы были выписаны на амбулаторное лечение с отсутствием лейкоцитурии и бактериурии. При этом у 8 (81,8%) больных, у которых была выявлена бактериальная флора (преимущественно E. coli) со средним микробным числом 459,1х103, при контрольном посеве мочи не было обнаружено патогенной флоры. В группе сравнения к 14 суткам у 38,8% больных сохранялась лейкоцитурия, у 18,2% в посеве мочи вновь высевались бактерии со средним микробным числом 121,7х103 (табл. 4).

% больных Степень лейкоцитоза крови, х 109/л 14,2+1,1 6,0+0,9* 14,1+0,8 8,8+0, Примечание. * - р0,05 по t – критерию Стьюдента относительно группы сравнения.

В результате проведённого исследования установлено, что применение Секстафага в новой лекарственной форме - суппозиториях в сочетании с антибактериальной терапией является эффективным методом лечения острого необструктивного пиелонефрита. Применение данного препарата возможно до получения результатов бактериологического исследования мочи, что выгодно отличает комплексные бактериофаги от монофагов. Таким образом, целесообразно в схему комплексной терапии острого пиелонефрита включать Секстафаг суппозитории ректальные.

Материалы исследований фармакодинамики и клинической эффективности препарата Секстафаг суппозитории ректальные позволяют отметить его высокую антибактериальную активность в отношении условно патогенных микроорганизмов и являются предпосылкой для дальнейшего использования их в медицине.

ВЫВОДЫ

производственных условно патогенных штаммов – продуцентов бактериофагов, выделенных из клинического материала, позволяющая получать высоковирулентные фаговые препараты.

2. Разработан унифицированный способ репродукции бактериофагов с использованием универсальной казеиново-кислотной питательной среды, обеспечивающий получение препаратов бактериофагов с низким содержанием балластных веществ и высокой специфической активностью.

стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного и коли бактериофагов, оказывающая выраженное этиотропное действие на условно патогенные микроорганизмы.

4. Предложен способ получения препарата Секстафаг, включающий раздельное культивирование монофагов с их последующим объединением в равных количествах, обеспечивающих специфическую активность в композиции не ниже 10-5 по каждому компоненту, и изготовлением лекарственных форм:

жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные.

5. Исследована фармакодинамика комплексного фагового препарата при использовании разработанных лекарственных форм и оценена эффективность суппозиториев в клинической практике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Функнер Е.В., Жданова С.В., Ефимова Н.П., Каменева М.А. Динамика выделения пентафага из организма здорового человека при пероральном и ректальном приемах//Матер. научно-практ. конф. Западно-Уральского региона.

«Вакцинопрофилактика в ХХI веке». - Пермь, 2000. - С. 116-117.

2. Функнер Е.В., Мельникова Е.В. Оценка чувствительности клинических штаммов стрептококков к лечебному бактериофагу//Матер. конф. «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов». - Томск, 2001. - С. 90-91.

3. Efimova N.P., Kameneva M.A., Reshetnikov V.I., Funkner E.V. Evaluation of different ways of introduction of therapeutic phages//Abstr. Evergreen International Phage Biology Meeting. Canada, 2001. - P. 20.

4. Ефимова Н.П., Каменева М.А., Функнер Е.В. Бактериофаги – биологические антисептики//Труды Междунар. науч. конф. «Перспективы развития естественных наук в высшей школе». - Пермь, 2001.- Т. 5. - С.206-208.

фагочувствительности золотистых стафилококков, выделенных от больных//Матер. конф. «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в ХХI веке». - Пермь, 2003. - С. 235-238.

6. Ефимова Н.П., Каменева М.А., Грязнова Д.В., Функнер Е.В. Разработка технологии изготовления суппозиториев с клебсифагом//Матер. конф.

«Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в ХХI веке». - Пермь, 2003. - С. 238-242.

7. Функнер Е.В. Чувствительность клинических штаммов микроорганизмов к антибиотикам и бактериофагам//Матер. конф. «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов». - Томск, 2004. - С. 236-239.

8. Ефимова М.Г., Функнер Е.В. Оптимизация способа получения поливалентного бактериофага//Матер. Всеросс. науч. конф. с междун. участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение». - Уфа, 2005. - С. 269-271.

9. Функнер Е.В., Ефимова М.Г., Волкова Л.В., Тюрева Т.А.

Технологические особенности разработки суппозиториев с Секстафагом//Матер.

Всеросс. науч. конф. с междун. участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение». - Уфа, 2005. С. 272-274.

10. Функнер Е.В., Ефимова М.Г., Давидов М.И., Токарев М.В., Муц М.Н.

Первый опыт использования суппозиториев с Секстафагом в лечении острого пиелонефрита//Матер. научно-практ. конф. «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития». - Пермь, 2005. С. 204-210.

11. Токарев М.В., Давидов М.И., Функнер Е.В. Лечение острого пиелонефрита бактериофагами//Сб. науч. трудов «Актуальные вопросы клинической медицины». – Пермь, 2005. - С. 154-159.

12. Функнер Е.В., Ефимова М.Г. Биологические и технологические аспекты разработки поливалентного фагового препарата//Пермский медицинский журнал. - 2005. - Т. 22. - № 4. - С. 92-96.

13. Урман М.Г., Горовиц Э.С., Субботин А.В., Маслов Ю.Н., Одинцова О.В., Функнер Е.В. Оптимизация антибактериальной терапии при инфицированном панкреонекрозе//Сб. научно-практ. статей «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии. Новые технологии в медицине». – Ижевск, 2006. - Вып.3. – С. 309–312.

14. Субботин А.В., Функнер Е.В., Урман М.Г., Горовиц Э.С., Маслов Ю.Н., Одинцова О.В. Применение Секстафага в комплексной антибактериальной терапии инфицированного панкреонекроза//Матер. Междунар. научно-практ.

конф. «Здоровье и образование». – Пермь, 2006. – С. 191–197.

15. Функнер Е.В., Ефимова М.Г., Казьянин А.В., Субботин А.В. Оценка динамики выделения Секстафага у больных панкреонекрозом//Матер. Всеросс.

научно-практич. конфер. «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 2006. - С. 99.

16. Казьянин А.В., Функнер Е.В. Создание производственной коллекции штаммов-продуцентов для получения комплексного фагового препарата//Матер.

Междун. науч. конфер. «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий».- Томск, 2006. - С. 381-383.

17. Kazjanin A.V., Funkner E.V., Efimova M.G. Studying stability of the preparation – sexstaphage suppositories per rectum//Materials of the 2-nd RussianChinese international scientific conferences on pharmacology «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice». - Perm, 2006. - С. 75-76.

18. Ефимова Н.П., Ефимова М.Г., Каменева М.А., Функнер Е.В. Способ получения полибактериофага. Патент на изобретение RU № 2247151 от 27.02.2005. Приоритет изобретения 06.05.2002. Зарегистрирован в Госреестре изобретений РФ 27.02.2005.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

РАЗРАБОТКИ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГОВ

Подписано в печать - 26.04.2007. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1, Формат 6084/16. Набор компьютерный. Заказ № /2007.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т. (342) 219-80-

 
Похожие работы:

«Сибатаев Ануарбек Каримович Филогения и таксономический статус близкородственных видов кровососущих комаров р.р. Anopheles Meigen и Culex Linnaeus фауны России и сопредельных территорий Специальность: 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук ТОМСК – 2007 Работа выполнена в НИИ биологии и биофизики ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный консультант доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир...»

«АРСЛАНОВА Динара Ришатовна СИСТЕМА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ - АНТИОКСИДАНТЫ У КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА И КАНЦЕРОГЕНЕЗА 03.00.13 – физиология 16.00.02 – патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ульяновск – 2009 Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный...»

«ШИПУНОВ Алексей Борисович ПОДОРОЖНИКИ (РОДЫ PLANTAGO L. И PSYLLIUM Mill., PLANTAGINACEAE ) ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ 03.00.05 Ботаника Автореферат диссертации на соискание учной степени е кандидата биологических наук Москва 1998 Работа выполнена на кафедре высших растений биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова. Научный...»

«Урусов Александр Евгеньевич РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ ЭКСПРЕССНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук Научные руководители: доктор химических наук, профессор...»

«Сазыкин Иван Сергеевич РОЛЬ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ 03.01.04 – биохимия 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2012 2 Работа выполнена в НИИ биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Южный федеральный университет (г. Ростов-на-Дону) доктор биологических наук, профессор...»

«БАТАШОВ ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ ПОЛУЧЕНИЕ ХИТОЗАНСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ НЕКОНДИЦИОННЫХ ЦИСТ ARTEMIA SP. И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЛИЯНИЯ НА РАСТЕНИЯ специальность 03.00.16 — экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул 2006 1 Работа выполнена на кафедре Общей химии и экспертизы товаров Бийского технологического института (филиал) ГОУ ВПО Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова Научный руководитель доктор...»

«Исаева Ольга Валерьевна ЭКОЛОГИЯ ЭНДОФИТНЫХ ДРОЖЖЕЙ Специальность 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель член-корр. РАН Чернов Иван Юрьевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Терехова Вера Александровна кандидат биологических наук...»

«СИМОНОВ Евгений Петрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ПЕРИФЕРИЙНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ОБЫКНОВЕННОГО ЩИТОМОРДНИКА (GLOYDIUS HALYS (PALLAS, 1776)) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«МУЛЛАГУЛОВА ЭЛЬВИРА РАФИКОВНА ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА И ПРИНЦИПЫ ОХРАНЫ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА КАЗАЦКОГО (JUNIPERUS SABINA L.) НА ЮЖНОМ УРАЛЕ Специальность 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2009 2 Работа выполнена в Сибайском филиале Академии наук Республики Башкортостан доктор биологических наук Научный руководитель : Редькина Нина Николаевна доктор биологических наук Официальные оппоненты : Путенихин Валерий...»

«РАЗИН Александр Николаевич Технология получения биологически активной субстанции Phallus impudicus и е применение для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 2 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина (ФГОУ...»

«Эрдэнэгэрэл АРИУНБОЛД ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ СУХИХ СТЕПЕЙ СРЕДНЕЙ ХАЛХИ (СОМОН БАЯН–УНДЖУЛ, МОНГОЛИЯ) 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт–Петербург 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском государственном лесотехническом университете им. С. М. Кирова доктор биологических наук, профессор...»

«БЕЛЯКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА ТЕСТЫ НА ОСНОВЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Специальность: 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРЕТ диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2002 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета Научный руководитель : доктор химических наук, доцент Евтюгин Г.А. Официальные оппоненты :...»

«ШАТИЛОВ ДЕНИС ВАЛЕРЬЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ ПЕРЕХОДА МРНК ИЗ ИНФОРМОСОМ В ПОЛИРИБОСОМЫ У РАЗНЫХ ВИДОВ АМФИБИЙ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва –2003 1 Работа выполнена в лаборатории регуляции биосинтеза белка Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук А. С. Воронина Официальные оппоненты : доктор биологических наук В.П. Божкова доктор биологических наук...»

«Кияева Елена Викторовна ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭТАНОЛА И КАДМИЯ НА ЭЛЕМЕНТНЫЙ ГОМЕОСТАЗ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНИЗМА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 03.00.01 - физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2010 2 Работа выполнена на кафедре профилактической медицины Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Научный руководитель : доктор медицинских наук,...»

«БЕРСЕНЕВА Оксана Андреевна ЭКОЛОГО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ В РАЙОНЕ ПРЕДПРИЯТИЙ АЛЮМИНИЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 03.02.08 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2010 Работа выполнена на кафедре физико-химической биологии Иркутского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Саловарова Валентина Петровна Официальные оппоненты : доктор...»

«Щёголева Наталья Валерьевна РОД RANUNCULUS L. АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ФЛОРИСТИЧЕСКОЙ ПРОВИНЦИИ 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2006 Работа выполнена на кафедре ботаники Томского государственного университета. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты : Куприянов Андрей Николаевич доктор биологических...»

«МИРОШНИКОВА Ольга Николаевна ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ КРОВООБРАЩЕНИЯ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА 03.00.13 – физиология 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток 2006 2 Работа выполнена в лаборатории фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН Научный руководитель : доктор медицинских наук Кириллов Олег Иванович Официальные оппоненты : доктор...»

«Фомичева Галина Михайловна ЭКОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГРУППЫ ASPERGILLUS VERSICOLOR, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ МЕСТООБИТАНИЙ Специальность 03.00.07 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2007 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научный руководитель : доктор...»

«МЕРКУЛОВ Антон Владимирович ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МАГНИТНОГО ПОЛЯ ПРОМЫШЛЕННОЙ ЧАСТОТЫ 50 ГЦ ВО ВНЕПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ 03.00.01 – Радиобиология 14.00.07 – Гигиена Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в ГНЦ – Институте биофизики ФМБА России, Центре электромагнитной безопасности и ГУ НИИ медицины труда РАМН, г. Москва доктор биологических наук Научные руководители: Н.Б. Рубцова кандидат...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.