WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Бреннер Евгений Владиславович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ

ГЕНОДИАГНОСТИКИ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ В РЕГИОНАХ РОССИИ

03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2009 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского Отделения РАН Научные руководители:

кандидат биологических наук Морозов И.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Белявская В.А.

доктор биологических наук, профессор Гуляева Л.Ф.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского Отделения РАН

Защита состоится " 26 " июня 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Федеральном государственном учреждении науки Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу:

ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан " " мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета_ _Карпенко Л.И.

Актуальность проблемы. Фенилкетонурия (ФКУ) является одним из распространенных наследственных заболеваний человека. Разнообразие форм этой болезни обусловлено большим количеством обуславливающих его мутаций. Известно более 500 мутаций гена фенилаланингидроксилазы (ФАГ), приводящих к ФКУ.

Спектры мутаций и нейтральных полиморфизмов ФАГ значительно различаются в разных регионах мира, что, по всей видимости, отражает особенности формирования этих популяций и различное влияние в них факторов естественного отбора. Для того чтобы более точно определить происхождение и клинические последствия той или иной мутации, необходимо как можно более полно охарактеризовать носителей этой мутации в каждой популяции.





Успешность всех подходов к лечению фенилкетонурии полностью определяется своевременностью её диагностики и возможностью получить сведения о типе мутаций, обуславливающих каждый конкретный случай заболевания. Чем раньше происходит диагностика болезни, тем лучше прогноз её терапии. Оптимальной является пренатальная диагностика фенилкетонурии.

Целью настоящей работы являлось исследование спектра мутаций, ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае, а также исследование ассоциации этих мутаций с гаплотипами ФАГ. В цели работы также входила разработка простых и достоверных методов идентификации обуславливающих ФКУ мутаций, в т.ч. пренатально.

Задачами работы являлись:

• Идентификация мутаций гена ФАГ у больных ФКУ и их родственников из указанных регионов России гипотезонезависимыми методами, позволяющими детектировать все, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.

• Разработка на основе фрагментного анализа продуктов ПЦР автоматизированного массового метода идентификации аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ.

• Исследование сцепления идентифицированных мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что при сравнении с аналогичными данными для других стран и регионов позволило судить о механизмах формирования наблюдаемого спектра мутаций.

• Разработка простого и достоверного метода пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем контаминации плодного биоматериала.

• Разработка простого универсального метода детекции точечных мутаций на основе аллель-специфичной ПЦР.

Научная новизна работы.

Исследован спектр мутаций ФАГ обуславливающих ФКУ в Саратовской области, Алтайском крае и ряде регионов Западной Сибири (Новосибирская, Кемеровская области).

Впервые для регионов России идентификация обуславливающих ФКУ мутаций производилась гипотезонезависимым методом – определением нуклеотидных последовательностей районов ФАГ.

Впервые проведено систематическое исследование сцепления всего спектра мутаций ФАГ в указанных регионах России с гаплотипами этого гена, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и возможности возникновения идентифицированных мутаций в исследованных регионах России de novo.

Впервые показано независимое повторное возникновение обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H ФАГ.

Впервые показана возможность использования конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР для обеспечения дискриминации аллельных вариантов по наблюдаемой задержке при гель-электрофорезе продуктов ПЦР.

Практическая значимость работы. Идентифицированы генотипы больных ФКУ по локусу ФАГ в 71 семьях Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края.





Полученные результаты предоставлены врачам местных медико-генетических консультаций и перинатальных центров для контроля правильности выбранной терапии этих случаев ФКУ.

Разработаны методические рекомендации для выполнения фрагментного анализа на автоматических генных анализаторах с использованием реактивов отечественного производства.

Метод внедрён на базе Центра коллективного пользования СО РАН «Секвенирование ДНК».

Разработан скрининговый метод идентификации точковых мутаций, основанный на использовании конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР.

Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты. Осуществлена пренатальная диагностика ФКУ в двух семьях, в которых ранее были зарегистрировано заболевание.

Основные положения, выносимые на защиту.

Спектр мутаций ФАГ, обуславливающих ФКУ и ГФА в Западной Сибири и Саратовской области типичен для регионов России с преимущественно славянским населением.

Мутация Y168H ФАГ возникла повторно и независимо в разных популяциях.

Использование конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в реакции аллель-специфичной ПЦР не снижает её эффективность и специфичность и позволяет надёжно дискриминировать разные аллельные варианты по подвижности продукта ПЦР при форезе.

Комбинация секвенирования и фрагментного анализа STR и VNTR ФАГ позволяет осуществлять надёжную пренатальную диагностику ФКУ.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации сделано 6 публикаций.

Результаты работы были представлены на международных конференциях: «3-я Международная конференция «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007 г.), «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006 г.), «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2005 г.), International Conference “New information technology in medicine, biology, pharmacology and ecology” (Ялта-Гурзуф, 2003 г.), Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав, выводов списка литературы, иллюстрирована 22 рисунками, 9 таблицами. В списке литературы приведено 161 работа отечественных и зарубежных авторов. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Исследовался генетический материал, выделенный из крови больных и членов их семей с ранее поставленным диагнозом ФКУ, а также пациентов с диагнозом «Гиперфенилаланинемия»

(ГФА). Также, когда это было возможно, в исследование включались их ближайшие родственники. Анализируемая выборка составила 256 человек из 71 неродственной семьи, в которых были зафиксированы случаи фенилкетонурии или гиперфенилаланинемии по результатам клинических биохимических тестов. Постановка диагнозов и забор крови осуществлялись врачами Барнаульского, Кемеровского и Новосибирского перинатальных центров. Все обследованные проживают на территории Новосибирской, Кемеровской, Саратовской области или Алтайского края. Проведение всего цикла работ было одобрено локальным комитетом по медицинской этике ИХБФМ СО РАН (протокол №4 заседания Этического комитета Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН от 16 июля 2007 года).

Выделение генетического материала производили стандартным методом с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.

Идентификацию обуславливающих ФКУ мутаций производили методом определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответсвующих экзонам и участкам интронов ФАГ с использованием автоматических генных анализаторов ABI 310, ABI 3100 Avant, ABI 3130xl.

Идентификацию аллелей STR и VNTR ФАГ осуществляли методом фрагментного анализа в денатурирующих условиях на автоматических генных анализаторах ABI 3100 Avant и ABI 3130xl с использованием флуоресцентно меченого праймера.

Результаты и обсуждение Спектр мутаций ФАГ у больных ФКУ и ГФА Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края.

В ходе работы была идентифицированы нуклеотидные последовательности всех экзонов с прилегающими участками интронов 142 аллелей ФАГ больных ФКУ и ГФА Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края. Мутации ФАГ были идентифицированы в 111 аллелях. В таблице 1 произведено сопоставление диагнозов с числом выявленных мутаций.

Значительное число случаев ГФА (3 из 6 наблюдаемых нами случаев) не обусловлены мутациями в обоих аллелях в структурных участках ФАГ. 19 случаев ФКУ, при которых была выявлена единственная мутация ФАГ, возможно вызваны мутациями регуляторной части гена (не исследовавшейся в данной работе), либо являются ГФА. К этой же группе можно отнести 3 случая с неподтверждённым диагнозом ФКУ.

Таблица 1. Сопоставление числа идентифицированных мутаций ФАГ и диагнозов в семьях больных ФКУ и ГФА.

* - Неподтверждённый диагноз: невыраженные клинические признаки при отсутствии лечения, транзиторное повышение уровня фенилаланина в крови. ** - здоровая сестра матери больного ФКУ ребёнка В остальных 111 аллелях ФАГ было идентифицировано 20 различных типов мутаций.

Спектр и частота этих мутаций в исследованных регионах РФ приведены в таблице 2.

Наиболее частой причиной исследованных случаев ФКУ является мутация экзона 12 ФАГ R408W. Эта мутация наиболее распространена в двух географических районах: Северо-Западной Европе, с самой высокой частотой в Ирландии (где она сцеплена с VNTR8 ФАГ), и Восточной Европе, с самой высокой частотой в прибалтийских республиках (где она сцеплена с VNTR ФАГ). По литературным данным превалирование мутации R408W характерно и для регионов РФ с преимущественно славянским населением.

Таблица 2. Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской (НСО), Кемеровской (Кем. обл.), Саратовской (Сар. обл.) областях и Алтайском крае (Алт. Кр.). З.С. – Западная Сибирь Второй, более редкой по частоте причиной исследованных случаев ФКУ, являются мутации экзона 7 гена ФАГ. Так, мутация R261Q была идентифицирована в 6 обуславливающих ФКУ аллелях ФАГ. R261Q имеет наибольшую частоту в Швейцарии и Турции, и, возможно, возникла независимо в разных регионах Европы. Мутация P281L также была идентифицирована в 6 обуславливающих ФКУ аллелях ФАГ. Она распространена в Южной Европе.

Предположительным местом происхождения мутации считают Средиземноморье, а наиболее распространена эта мутация по литературным данным в Хорватии и Греции.

Обнаруженная в двух случаях мутация R243Q является одной из самых распространенных мутаций в странах Азии (Китае, Японии, Корее) с самой высокой частотой (18%) в Китае.

Идентификация этой мутации в нашем регионе, по-видимому, свидетельствует о вкладе аллелей азиатских популяций в распространение ФКУ в регионе. Мутация была идентифицирована в гомозиготном состоянии у больного ФКУ – выходца из Узбекистана.

В то же время нами был идентифицирован ряд мутаций гена ФАГ, не являющихся характерными ни для европейских, ни для азиатских стран. Так мутации сайтов сплайсинга IVS2TG и IVS2+19TC встречаются у больных ФКУ европейских популяций с частотой, не превышающей 1%.

В ходе работы нами также были идентифицированы мутации, описанные ранее лишь в единичных случаях. База знаний о фенилкетонурии www.pahdb.mcgill.ca содержит единственную запись об идентификации у больного ФКУ мутации экзона 12 ФАГ P407L. Однако нет никаких сведений ни о стране, в которой эта мутация была описана, ни об этнической принадлежности этого больного ФКУ. Мутация Y168H, идентифицированная нами у больного ФКУ из Западной Сибири, также до этого была описана лишь единожды – у больного ФКУ из Каталонии (Испания).

Таким образом, в ходе настоящей работы нами был определён спектр обуславливающих ФКУ и ГФА мутаций ФАГ в Саратовской области и ряде регионов Западной Сибири. Всего было идентифицировано 20 обуславливающих ФКУ типов мутаций ФАГ в 111 аллеле этого гена. Было показано, что на формирование спектра обуславливающих в Западной Сибири и Саратовской области ФКУ мутаций в значительной мере оказали влияние потоки генов из Восточной Европы (R408W, R252W), Скандинавии (IVS12nt1, Y414C), Западной Европы (E280K, R158Q), Южной Европы (P281), Турции (R261Q), и, в значительно меньшей степени поток генов из Азии (R243Q).

Также у больных ФКУ из Западной Сибири и Саратовской области был идентифицирован ряд мутаций гена ФАГ, не являющихся характерными ни для европейских, ни для азиатских стран (IVS2-13TG, IVS2+19TC), наряду с уникальными мутациями, описанными в мировой литературе в единичных случаях (P407L, Y168H).

Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями, обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области.

Дополнение исследования спектра мутаций идентификацией сцепленных с этими мутациями гаплотипов исследуемого локуса позволяет со значительно большей уверенностью судить о механизмах формирования наблюдаемого спектра мутаций. «Золотым стандартом»

гаплотипирования ФАГ стало определение аллельных вариантов STR и VNTR повторов этого гена.

В рамках настоящей работы нами впервые производилась широкомасштабная и систематическая идентификация аллельных вариантов STR и VNTR ФАГ, сцепленных с ранее идентифицированными мутациями этого гена у больных ФКУ из ряда регионов Сибири и Саратовской области. Особенности формирования населения Сибири в последние несколько столетий позволяют рассчитывать на идентификацию в этом регионе закономерностей, характерных как для Европы, так и для азиатских популяций. Включение в это исследование жителей Саратовской области было обосновано скудностью доступных данных об ассоциации мутаций и гаплотипов гена ФАГ для Европейской части России.

Для идентификации сцепления аллельного варианта нейтрального маркера с обуславливающей ФКУ мутацией необходимо производить семейный анализ и прослеживать передачу по наследству как мутации, так и аллельного варианта нейтрального маркера. Поэтому группа больных ФКУ и их родственников, участвовавших в этой части исследования, была сокращена по сравнению с группой, участвовавшей в идентификации обуславливающих ФКУ мутаций. Так из неё были исключены больные ФКУ – воспитанники детских домов и члены неполных семей.

Идентификация аллельных вариантов STR и VNTR ФАГ производилась методом фрагментного анализа с использованием генных анализаторов ABI 310 и ABI 3100 Avant (Applied BioSystems, USA). Было апробировано несколько модификаций этого метода: варьировались тип полимера, флуорофоры, метод их введения в продукт ПЦР, последовательности праймеров и температурный профиль ПЦР. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании капиллярного электрофореза продуктов ПЦР с флуоресцентно-меченным праймером в денатурирующих условиях. Последовательности праймеров и условия ПЦР были оптимизированы для минимизации «проскальзывания» полимеразы. Эта модификация метода и была использована в дальнейшем (рисунок 1).

Рисунок 1 Типичный пример идентификации вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ в семье больного ФКУ методом фрагментного анализа на автоматическом генном анализаторе В таблице 3 приведены полученные данные об ассоциации мутаций ФАГ в исследованных случаях ФКУ с аллельными вариантами STR и VNTR этого гена.

Таблица 3. Ассоциация идентифицированных мутаций ФАГ с аллельными вариантами STR и VNTR повторов этого гена * - Неразрешимый семейным анализом случай Мутация R408W – наиболее распространённая у исследованных больных ФКУ – оказалась ассоциированной с VNTR3 в 55 из 56 исследованных случаях. Этот факт хорошо согласуется с общепринятой гипотезой о рекуррентном возникновении этой мутации на территории Ирландии и Восточной Европы и распространении восточно-европейского варианта по территории России.

Ассоциация в 51 случаях этой мутации также с единственным вариантом STR238 более изменчивого STR локуса ФАГ, также хорошо согласуется с литературными данными и, возможно, является свидетельством того, что рекуррентное возникновение R408W произошло на территории Восточной Европы относительно недавно.

В одном из 56 исследованных случаев носительства мутации R408W мы наблюдали её ассоциацию с вариантом VNTR7 гена ФАГ, что абсолютно нетипично ни для Западной Европы (где она преимущественно ассоциирована с VNTR8), ни для Восточной Европы (где она преимущественно ассоциирована с VNTR3).

Наблюдаемая в нашей работе ассоциация мутации R261Q с VNTR3 и VNTR8 примерно в равных пропорциях характерна для российских популяций в частности и для европейских в целом.

Также типичными для европейских популяций были наблюдаемые в нашей работе ассоциации с VNTR и STR повторами гена ФАГ мутаций L48S, R158Q, E221D222fsdelAG, P281L, IVS10nt-11ga, E390G, Y414C, IVS12nt+1g-a.

В тоже время в литературе не описаны ассоциации R68S и R243Q с VNTR3.

Таким образом, в настоящей работе впервые для значительных групп больных ФКУ ряда регионов Сибири и Саратовской области была исследована ассоциация обуславливающих ФКУ мутаций и аллельных вариантов STR и VNTR повторов ФАГ. Для большинства исследованных случаев была получена картина типичная для других регионов России с преимущественно славянским населением. В тоже время несколько случаев мутаций ФАГ у больных ФКУ в Западной Сибири оказались ассоциированными с нетипичными аллельными вариантами STR и VNTR повторов, что мы интерпретируем как свидетельство возможного независимого повторного (рекуррентного) возникновения этих мутаций.

Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы Y168H.

В ходе исследования спектра обуславливающих ФКУ мутаций ФАГ в Западной Сибири нами была идентифицирована мутация Y168H ФАГ. Ранее в литературе был описан лишь единственный случай этой мутации у больного ФКУ из Каталонии.

Носители Y168H из России Носители Y168H из Испании Рисунок 2. Семьи – носители мутации Y168H ФАГ Географическая удалённость этих двух регионов, а также первичное изучение генеалогической информации о семьях носителей мутации позволило предположить независимое рекуррентное возникновение мутации Y168H гена ФАГ в России. На рисунке 2 приведены генеалогические деревья обеих семей.

Для исследования этой гипотезы нами были идентифицированы гаплотипы ФАГ, сцепленные с каждым случаем Y168H. Был выбран следующий ряд нейтральных полиморфизмов гена ФАГ: IVS3nt-22T, Q232Q, V245V, L385L, STR, VNTR. Эта система гаплотипов является модификацией одной из самых информативных из описанных в литературе.

В таблице 4 сведены данные об использованных полиморфных маркерах, их локализации, расстоянии до Y168H в т.п.н. и единицах неравновесия по сцеплению (LDU), а также об их аллельных состояниях, сцепленных с каждым из исследуемых случаев мутации Y168H.

Таблица 4. Гаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с обоими известными случаями мутации Y168H этого гена.

Жирным шрифтом выделены различающиеся аллельные варианты.

Название Локализация Расстояние до Аллельный Аллельный Оказалось, что Y168H ассоциирована с гаплотипом IVS3nt-22T (t), Q232Q (g), V245V(g), L385L(a), STR238, VNTR((a1)5-b5-b2-c1) в каталонской семье и с гаплотипом IVS3nt-22T(t), Q232Q(g), V245V(a), L385L(g), STR234, VNTR(a2-b2-c1) в семье из Сибири. Эти гаплотипы различаются аллельными вариантами полиморфизмов, лежащих как в 5’ направлении (STR), так и в 3’ направлении (V245V, L385L и VNTR) от Y168H.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что рекомбинация не может являться причиной сцепления Y168H с разными аллельными вариантами V245V, L385L и VNTR повторов ФАГ в реалистичном (порядка тысяч) числе поколений. Оба идентифицированных гаплотипа V245V (g), Q232Q (g), L385L(a) и V245V (a), Q232Q (g), L385L(g) - являются широко распространёнными в европейских популяциях. Также широко распространены идентифицированные по нуклеотидной последовательности варианты VNTR повторов.

Отсутствие наблюдений ассоциации этой мутации с другими гаплотипами, которые могли бы являться предковыми или, наоборот, последующими вариантами гаплотипов, идентифицированных нами, позволяет сделать вывод, что мутация Y168H, как минимум, дважды возникла независимо.

Мутации ФАГ, в отношении которых показано рекуррентное возникновение, как правило, являются широко распространенными в одной или нескольких популяциях и затрагивают CpG динуклеотиды. Именно гипермутабильностью CpG динуклеотидов обычно объясняют факт неоднократного возникновения этих мутаций. В случае мутации Y168H оба этих утверждения неверны: она не затрагивает CpG динуклеотид и известно только два её случая. Низкая частота Y168H (только 2 описанных случая) косвенно свидетельствует о том, что она возникла позже других аналогичных мутаций.

Пренатальная диагностика в семьях больных ФКУ.

Максимально ранняя, в т.ч. пренатальная диагностика ФКУ, является необходимым условием эффективной терапии заболевания, улучшения прогноза течения болезни и улучшения качества жизни больных.

Ограничениями пренатальных методов диагностики является их недостаточная оперативность и достоверность. Применяющиеся в настоящее время способы забора плодного материала не дают абсолютной гарантии отсутствия в исследуемом биологическом материале тканей матери. В этих случаях результаты молекулярно-генетического исследования могут быть неверными. В случае ФКУ пренатальная диагностика заболевания оказывается дополнительно затруднённой из-за значительного (более 500) числа мутаций, вызывающих болезнь.

В рамках настоящей работы нами выполнялась пренатальная диагностика ФКУ в двух семьях из Саратовской области. В обеих семьях ранее были зарегистрированы случаи ФКУ.

Мутации ФАГ у членов этих семей нами были идентифицированы в рамках исследования спектра и частоты обуславливающих ФКУ мутаций в этом регионе России.

Диагностика ФКУ осуществлялась комбинацией разработанного метода фрагментного анализа повторов ФАГ и секвенирования экзонов этого гена.

Для первой семьи было по результатам фрагментного анализа STR и VNTR ФАГ показано, что плод унаследовал от обоих родителей иные, нежели больной первый ребёнок, аллели ФАГ.

Идентификация в биоптате плаценты только одного из присутствующих у матери аллелей STR ФАГ свидетельствует об отсутствии контаминации биоптата тканями матери и достоверности проведённой пренатальной диагностики. Впоследствии методом секвенирования соответствующих экзонов ФАГ в биоптате плаценты было подтверждено отсутствие у плода унаследованных от обоих родителей обуславливающих ФКУ мутаций (рисунок 3). Беременность завершилась весной 2006 года рождением не страдающего ФКУ ребёнка.

Рисунок 3 Пренатальная диагностика ФКУ в семье больного ФКУ.

Случай I.

Аналогично для второй семьи было показано, что плод унаследовал от отца иной, нежели больной первый ребёнок, аллель гена ФАГ. На этом основании было предположено, что даже в худшем случае, плод будет являться клинически здоровым носителем мутации R408W гена ФАГ, унаследованной им от матери. На основании проведённой диагностики лечащим врачом было рекомендовано матери придерживаться терапевтической диеты в целях избегания эффекта материнской фенилкетонурии. Беременность была прекращена на раннем сроке по медицинским показаниям, не связанным с носительством обуславливающих ФКУ мутаций.

Таким образом, в ходе настоящей работы, в сотрудничестве с врачами медикогенетических консультаций и перинатальных центров г. Саратова и г. Новосибирска была осуществлена пренатальная диагностика двух случаев ФКУ методами фрагментного анализа и секвенирования участков гена ФАГ из образцов ДНК, выделенных из биоптатов плодной части плаценты.

Универсальный метод идентификации однонуклеотидных замен.

Известно около 500 мутаций ФАГ, обуславливающих ФКУ. При этом в каждой популяции лишь незначительное количество типов мутаций обуславливает подавляющее число случаев ФКУ.

Поэтому в случае массовой идентификации мутаций этого гена является целесообразным комбинация секвенирования с быстрым и доступным скрининговым методом идентификации наиболее частых мутаций.

Для специфичной детекции точковых мутаций нами был предложен метод аллельспецифичной ПЦР (АС-ПЦР), основанный на использовании в качестве одного из аллельспецифичных праймеров конъюгата олигонуклеотида с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля (МПЭГ-5000, Shearwater Polymers, Inc.). При этом продукты ПЦР, соответствующие разным аллельным вариантам, имеют одинаковый нуклеотидный состав и длину нуклеотидной части, но существенно различаются по электрофоретической подвижности и должны легко детектироваться при гель-электрофорезе.

Конъюгат МПЭГ и олигонуклеотида, служащий праймером, был синтезирован в Лаборатории химии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН.

В качестве модели была выбрана мутация R408W ФАГ. В качестве матриц для АС-ПЦР использовали образцы ДНК больных фенилкетонурией и их родственников, содержащие R408W в гомо- или гетерозиготном состоянии, что позволило подтвердить высокую специфичность подхода.

Для обеспечения высокой специфичности метода было предложено использовать в третьих с 3’ концов позициях обоих аллельспецифичных праймеров остатки разных нуклеотидов, некомплементарных геномной матрице. Гибридизация аллельспецифичного праймера такой нуклеотидной последовательности с соответствующим ему продуктом ПЦР происходит уже с участием всех оснований, а, следовательно, эффективнее, чем с геномной ДНК и с продуктом ПЦР, соответствующим праймеру, специфичному для другого аллеля. Для усиления этого эффекта было также предложено начиная с третьего цикла ПЦР поднимать температуру отжига праймера на 1.5-2оС. На рисунке 4 приведена схема предложенного метода.

Рисунок 4 Схема предложенного метода идентификации точковых мутаций на основе мультиплексной аллель-специфичной ПЦР и использования праймера с ковалентно присоединённым к нему остатком МПЭГ.

Нами была показана высокая специфичность описанного метода АС-ПЦР в смесях, содержащих как один (рисунок 4, дорожки 1-6), так и оба аллель–специфичных праймера (рисунок 4, дорожки 7-9). Видно, что использование МПЭГ-содержащего праймера (рисунок 4, дорожки 1,2,7,8) не снижает специфичности метода и обеспечивает существенное изменение электрофоретической подвижности соответствующего продукта ПЦР длиной 540 п.о. аналогичное его удлинению на 80-90 п.о.

ВЫВОДЫ

1. Определён спектр обуславливающих фенилкетонурию мутаций гена ФАГ в Саратовской, Новосибирской, Кемеровской областях и Алтайском крае. У человек из 71 семьи идентифицировано 20 обуславливающих ФКУ типов мутаций 2. Впервые для больных ФКУ этих регионов исследована ассоциация обуславливающих ФКУ мутаций и аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ. В большинстве случаев показана типичная для других регионов России с преимущественно славянским населением ассоциация обуславливающих ФКУ мутаций и аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ.

3. Показано, что на формирование спектра обуславливающих в Западной Сибири и Саратовской области ФКУ мутаций гена ФАГ в значительной мере оказали влияние потоки генов из Восточной Европы (R408W, R252W), Скандинавии (IVS12nt1, Y414C), Западной Европы (E280K, R158Q), Южной Европы (P281), Турции (R261Q), и, в значительно меньшей степени поток генов из Азии (R243Q). Ряд идентифицированных мутаций (IVS2-13TG, IVS2+19TC) не типичен ни для европейских, ни для азиатских стран, или описан в мировой литературе в единичных случаях (P407L, Y168H).

4. Показан факт независимого повторного возникновения обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H гена ФАГ, не затрагивающей «горячей точки» мутагенеза 5. Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты методами секвенирования и фрагментного анализа.

6. Разработан универсальный скрининговый метод идентификации точковых мутаций, основанный на использовании конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

Статьи в журналах:

1. Е.В. Бреннер, Ф.О. Смагулова, И.В. Морозов. Независимое возникновение редкой мутации Y168H гена фенилаланингидроксилазы человека в России // Генетика. – 2008. - Т. 44. - № 10. - С. 1435 - 2. О.А. Батурина, Е.В. Бреннер, О.А. Суслякова, А.Е. Тупикин, Ф.О. Смагулова, А.А.

Бондарь, И.В. Морозов. Определение нуклеотидных последовательностей перспективный метод диагностики наследственных заболеваний // Сборник трудов конференции «Фундаментальные науки – медицине», - Новосибирск. - 2-5 сентября 2008. - С. 76-80.

3. Е.В. Бреннер, О.А. Суслякова, Ф.О. Смагулова, И.В. Морозов. Независимое повторное возникновение редкой мутации Y168H гена фенилаланингидроксилазы человека // Приложение к журналу «Открытое образование» Материалы XIII Международной Конференции «Новые информационные технологии в медицине, фармакологии и экологии». - Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. 31 мая - 9 июня 2005. С.47- 4. Е. В. Бреннер, Е. Н. Иванова, Д. В. Пышный, И. В. Морозов. Универсальный метод идентификации однонуклеотидных замен.// Биоорганическая химия. – 2005. - Т. 31.

- № 2. - С. 213-215.

фенилаланингидроксилазы человека.// Успехи современного естествознания. – 2004. - № 6. - С. 29-30.

6. Ф.О. Смагулова, Е.В. Бреннер, Л.Ю. Котова, О.Л. Корень, В.М. Нагайцев, С.Г.

Жабин, И.В. Морозов. Идентификация мутаций гена фенилаланингидроксилазы с использованием автоматического секвенатора ДНК.// Генетика.- 2008. - Т. 40. - № 2. - С. 272- Тезисы конференций:

1. Е.В. Бреннер, О.А Суслякова., А.Е. Тупикин, Ф.О. Смагулова, А.А. Бондарь, И.В.

Морозов. Мутации и гаплотипы гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Западной Сибири и Саратовской области.// Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине». – Новосибирск. – 2006.

2. Е.В. Бреннер, И.В. Морозов. Современные подходы к генодиагностике фенилкетонурии. // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки – медицине». – Новосибирск. - 2005. - С. 3. E.V. Brenner, D.V. Pyshnyi, E.V. Shtufanova, I.V. Morozov. New effective method for phenylketonuria associated mutations identification. //Proceedings of International Conference “NEW INFORMATION TECHNOLOGY IN MEDICINE, BIOLOGY, PHARMACOLOGY AND ECOLOGY”, - Ukraine, Krym, Yalta-Gurzuf, - 1-10 June 2003. - P. 393-394.

4. F.O. Smagulova, E.V. Brenner, G.P. Kitainik, L.Yu. Kotova, O.L. Koren, S.G. Jabin, V.M. Nagaicev, I.V. Morozov. Molecular Genetics of Phenylketonuria in Western Siberia.// Human Genome Meeting. Poster Book. - 2002. - Shanghai, China. - P.171.

Изд. Лиц. ИД № 04060 от 20.02. Подписано к печати и в свет 06.05. Формат бумаги 60х84. Печ. л. 1,1 Уч.-изд. л.1,1. Тираж 100, Заказ № Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск,

 
Похожие работы:

«СИЛКИНА Ольга Владимировна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ХВОИ ABIES SIBIRICA И PICEA ABIES В ПРОЦЕССЕ ВЕГЕТАЦИИ И ЕЕ ФИТОПРОДУКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ Специальности 03.00.16 – Экология 03.00.32 – Биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ — 2006 Работа выполнена на кафедре химии Марийского государственного технического университета и кафедре прикладной экологии Казанского государственного...»

«Рак Наталья Семеновна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТРОФИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ В СИСТЕМЕ РАСТЕНИЕ – ФИТОФАГ – ЭНТОМОФАГ В ЗАЩИЩЕННОМ ГРУНТЕ ЗАПОЛЯРЬЯ 03.02.08. – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск – 2012 Работа выполнена в Полярно-альпийском ботаническом саду им. Н. А. Аврорина Кольского научного центра РАН Консультанты: член-корреспондент РАН, профессор В. К. Жиров кандидат биологических наук Л. П. Красавина...»

«ЛАДЫГИНА Александра Владимировна Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов 03.00.07 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических...»

«УДК 577.217 КОШЕЛЕВ ЮРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ ПОИСК НОВЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКА S100A4(MTS1). Специальность 03.00.26 – “молекулярная генетика” Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 2008 Работа выполнена в лаборатории генной терапии Института биологии гена РАН Научный руководитель : академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев Георгий Павлович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор...»

«МОЛОДЦОВ Максим Игоревич ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРОТРУБОЧЕК И РАЗВИВАЕМЫХ ИМИ СИЛ 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2007 Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук. Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор И.А....»

«Федорова Ольга Андреевна РОЛЬ ПРОТЕАСОМ И ИХ СУБЪЕДИНИЦ -ТИПА В ГИДРОЛИЗЕ РНК И СПЛАЙСИНГЕ 03.01.03. – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Научный руководитель : Барлев Николай Анатольевич, доктор биологических наук Институт цитологии РАН, заведующий лабораторией...»

«НЕЧАЕВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИМЕРНЫХ И ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК НА МИКРООРГАНИЗМЫ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ ИННОВАЦИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский...»

«АГАФОНОВА Жанна Игоревна ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАС ПЧЕЛЫ МЕДОНОСНОЙ - Apis mellifera L. ЮГА ПРИЕНИСЕЙСКОЙ СИБИРИ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2004 Работа выполнена на кафедре биогеоценологии Красноярского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Виктор Михайлович Яновский Официальные оппоненты : доктор биологических наук Елена Николаевна...»

«ЛОСИЧ Милана Анатольевна ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА ERA-СВ 20М ВИРУСА БЕШЕНСТВА И РАЗРАБОТКА НА ЕГО ОСНОВЕ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 03.02.02. – вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского Минздрава РФ и Автономной некоммерческой организации Научноисследовательский...»

«АНТИПОВА Анастасия Юрьевна ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КРАСНУШНОЙ И ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ В ПЕРИОД ЭЛИМИНАЦИИ КРАСНУХИ 03.02.02 – вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Научный руководитель : доктор медицинских наук Лаврентьева Ирина Николаевна...»

«Антонец Денис Викторович Разработка методических подходов к рациональному дизайну полиэпитопных Т-клеточных антигенов 03.01.03 – Молекулярная биология 03.0 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Кольцово - 2013 1 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Научный Бажан Сергей Иванович, доктор биологических наук, руководитель заведующий теоретическим...»

«Ли Аньбан МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА ИОННОГО КАНАЛА НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Специальность 03.00.02 -биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович Официальные оппоненты :...»

«ДИДАНОВА ЕЛЕНА НАЖМУДИНОВНА ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И КАДАСТРОВАЯ ОЦЕНКА ПОЧВ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ КАБАРДИНО-БАЛКАРСКОЙ РЕСПУБЛИКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена на кафедре почвоведения, агрохимии и физиологии растений Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии имени В.М. Кокова Научный руководитель : доктор...»

«ПЕТРОВА НАДЕЖДА ЭДУАРДОВНА ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЛЕГОГЛОБИНА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2002 Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук А.Ф.Топунов. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор А.С.Капрельянц...»

«УДК 597.552.5:591.3:57.044 ЕФРЕМОВА Екатерина Владимировна РАННИЙ ГАМЕТОГЕНЕЗ СИГОВЫХ РЫБ р. COREGONUS В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Центре экологических исследований и реконструкции биосистем биологического отделения Института математики, естественных наук и информационных технологий ФГБОУ ВПО Тюменский государственный...»

«ДЖЕМИЛЕВА Лиля Усеиновна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук МОСКВА – 2011 1 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный консультант : доктор биологических наук, Хуснутдинова Эльза Камилевна профессор...»

«ЗВЕРЕВА Елена Анатольевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ДРЕВОРАЗРУШАЮЩИХ ГРИБОВ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва –2002 2 Работа выполнена в научно-учебном отделе биохимических проблем экологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор М.Л. Рабинович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор М.С. Крицкий...»

«Казарникова Анна Владимировна СТРУКТУРА И ВЗАИМООТНОШЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ЭКОСИСТЕМЫ ОСЕТРОВЫЕ РЫБЫ – ПАРАЗИТИЧЕСКИЕ ГИДРОБИОНТЫ – СРЕДА В ИХТИОПАТОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ ВОДОЕМОВ ЮГА РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Южный научный центр РАН Научный консультант : Академик Национальной академии наук Республики...»

«ГЫНИНОВА АЮР БАЗАРОВНА ПОЧВЫ ДЕЛЬТЫ р. СЕЛЕНГИ (ГЕНЕЗИС, ГЕОГРАФИЯ, ГЕОХИМИЯ) 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории географии и экологии почв Института общей и экспериментальной биологии. Научный консультант : Член-корреспондент РАН, профессор Шоба С.А. Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Г.Д. доктор биологических наук...»

«Лынов Александр Васильевич ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЖУКОВ-ЖУЖЕЛИЦ (INSECTA, COLEOPTERA, CARABIDAE) АГРОЭКОСИСТЕМ ВОРОНЕЖСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук ВОРОНЕЖ – 2008 Работа выполнена на кафедре экологического образования Воронежского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Жердев Владимир...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.