WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

БАХТЕЕВА

Ирина Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ PH 6 АНТИГЕНА

YERSINIA PESTIS С ПОМОЩЬЮ НАБОРОВ ИЗОГЕННЫХ МУТАНТОВ

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Анисимов Андрей Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Баснакьян Ирина Арташесовна доктор медицинских наук Алешкин Геннадий Иванович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится «»2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»

Автореферат разослан «» 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук С.Ю. Комбарова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Возбудитель чумы, Yersinia pestis, является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов и относится к грам-отрицательным бактериям рода Yersinia [Хоулт Дж. с соавт., 1997]. В патогенезе инфекций, вызываемых грамм-отрицательными микроорганизмами, одну из первостепенных ролей играет адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина. У иерсиний известно несколько белков, обеспечивающих прикрепление патогена к мембране эукариотических клеток: адгезин YadA, инвазин, белок Ail и рН антиген.





pH 6 антиген (пили адгезии, белок PsaA - pH six antigen) является общим для двух видов Yersinia поверхностным белком, синтезирующимся в виде субъединиц с молекулярной массой 15 кДа, которые затем агрегируют с образованием макромолекулярной капсулы [L.E. Lindler et al. 1990]. Экспрессия PsaA кодируется psaEFABC опероном, включающим пять генов: psaA, кодирующий синтез структурной субъединицы; psaB и psaC, кодирующие шаперонный и ашерный белки, обеспечивающие доставку структурных субъединиц из цитоплазмы на поверхность бактериальной клетки; psaE и psaF, отвечающие за температурную и pH-регуляцию синтеза белка PsaA [Yang, Isberg, 1997; Price et al., 1995; Панферцев и др., 1991; Lindler et al., 1990 и др.].

К моменту начала настоящих исследований pH6 антиген наряду с белками внешних мембран Yops, липополисахаридом, V антигеном и др. расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y. pestis, так как его экспрессия необходима для вирулентности чумного микроба. Утрата продукции pH6 антигена в результате делеции гена psaA приводили к 200-кратному снижению вирулентности штамма Y. pestis KIM5 [Lindler et al., 1990], а делеции гена psaF - к полной потере вирулентности штамма Y. pestis [Панферцев и др., 1991].

Одним из свойств pH6 антигена, привлекшим к нему внимание исследователей, была зависимость его синтеза от pH и температуры окружающей среды – его продукция начиналась при температуре 37 С и значениях рН ниже 6,4, близких к рН фаголизосом макрофагов или некротического содержимого абсцессов [Ben-Efraim et al., 1961]. Эксперименты по активной иммунизации лабораторных животных препаратами PsaA показали, что его выраженная способность индуцировать антителогенез не приводила к протективному эффекту при последующем заражении животных Y. pestis [Черепанов и др., 1991;

Водопьянов и др., 1995]. Высказывались предположения, что отсутствие протективности может быть связано с особенностями pH регуляции этого фактора: его синтез внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает невозможным контакт покрытых pH6 антигеном бактериальных клеток с антителами и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [Анисимов, 2002]. Однако до сих пор не было приведено доказательств этой гипотезы.

Исследования функциональной активности PsaA продемонстрировали, что он обладает целым рядом биологических свойств, каждое из которых может обеспечивать его вклад в вирулентность чумного микроба. PsaA+ клетки Y. pestis и препараты белка PsaA обладали цитотоксической активностью по отношению к перитонеальным [BichowskySlonimsky, Ben-Efraim, 1963] и альвеолярным [Степаншина с соавт., 1993; Водопьянов с соавт., 1995] макрофагам. Однако в экспериментах с мутантным по собственным пилевым белкам штаммом Pseudomonas aeruginosa клонированные гены Y. pestis psaABC восстанавливали доставку цитотоксичного экзоэнзима S в цитоплазму клеток хозяина благодаря восстановлению дефекта пилей, но не кодировали дополнительную цитотоксическую активность [Sundin et al., 2002].





Публиковались данные об адгезивной активности PsaA. Многие исследователи отмечали способность PsaA агглютинировать эритроциты различных видов животных [Bichowski-Slonimski, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов, Мишанькин, 1985; Lindler et al., 1990 и др]. Кроме того, при развитии псевдотуберкулезной инфекции PsaA выполняет функцию адгезина, способствуя связыванию клеток Y. pseudotuberculosis с мембраной эпителиальных клеток [Yang et al., 1996; Marra, Isberg, 1997]. Однако позже были опубликованы данные об отсутствии влияния PsaA на способность Y. pestis связываться с мембраной макрофагов [Huang, Lindler, 2004]. В то же время было показано, что pH антиген обладает антифагоцитарной активностью и препятствует захвату клеток чумного микроба макрофагами [Huang, Lindler, 2004].

Таким образом, несмотря на разностороннее изучение функциональной активности PsaA, до настоящего времени нет единого мнения о том, какое из его свойств является определяющим вклад этого фактора в вирулентность Y. pestis. Анализ публикаций показал противоречивость данных о цитотоксической активности и влиянии pH6 антигена Y. pseudotuberculosis, но не подтверждены для Y. pestis. До настоящего времени не изучены механизмы отсутствия протективной активности PsaA, нет данных о митогенной активности PsaA, присущей другим бактериальным адгезинам. В связи с этим для уточнения роли pH 6 антигена в иммунопатогенезе чумы сохраняется актуальность изучения цитотоксических, митогенных и адгезивных свойств белка PsaA, а также определение его вклада в вирулентность чумного микроба.

Цель исследования – получение новых данных о функциональной активности pH 6 антигена и его вкладе в вирулентность возбудителя чумы.

Задачи исследования:

1. Создать на основе штаммов Yersinia spp. коллекцию изогенных нокаутных мутантов по генам оперона psaEFABC.

2. На основе созданной коллекции провести комплексную сравнительную оценку биологических свойств PsaA+ и PsaA штаммов Yersinia spp in vitro.

3. Оценить цитотоксические, митогенные и адгезивные свойства белка PsaA.

4. Изучить протективные свойства PsaA и его вклад в вирулентность Yersinia spp в экспериментах in vivo.

Научная новизна. Доказано, что PsaA не обладает цитотоксичностью. Установлено, что PsaA не относится к обязательным факторам патогенности Y. pestis. Показано, что PsaA обеспечивает адгезию возбудителя чумы к эпителиальным клеткам. Выявлена митогенная активность PsaA, а также его влияние на адгезию и дифференцировку макрофагов.

Получены штаммы Y. pestis со способностью к независимому от pH и температуры среды (конститутивному) синтезу pH 6 антигена и с их помощью проверена и опровергнута гипотеза о том, что отсутствие протективных свойств PsaA определяется особенностями pH-регуляции его синтеза. Выявлено, что PsaA+ клетки Y. pestis в организме теплокровного хозяина имеют селективные преимущества перед PsaA бактериями.

Практическая значимость. Полученные данные о селективных преимуществах PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина, объясняющие факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов, являются основанием для разработки диагностических препаратов, направленных на выявление генов, кодирующих pH 6 антиген возбудителя чумы.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы пять авторских штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с мутациями по генам psaA и psaEFABC, которые будут использованы для изучения роли pH 6 антигена Y. pestis в патогенезе чумы.

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности четырех генов, кодирующих белки Y. pestis с предполагаемой адгезивной активностью -YPO1387-YPO1388, YPO1708, YPO1709-YPO1711 и YPO 4044 (№№ доступа EU637081; EU637083;

EU637082 и EU637084 соответственно) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez] Внедрение результатов работы. Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций «Изучение взаимодействия патогенных иерсиний с культурами фагоцитирующих и нефагоцитирующих клеток млекопитающих» (Оболенск, 2007).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:ж 1. pH 6 антиген Y. pestis не обладает цитотоксической активностью в отношении различных типов эукариотических клеток.

2. pH 6 антиген не является обязательным фактором патогенности Y. pestis. Утрата способности к его продукции не приводит к снижению вирулентности возбудителя чумы, но его присутствие дает селективные преимущества PsaA+ бактериям в организме теплокровного хозяина на ранних стадиях инфекции.

3. Большинство присущих белку PsaA биологических эффектов определяется его адгезивной активностью. В зависимости от концентрации PsaA либо стимулирует дифференцировку и адгезию макрофагов, либо вызывает их аутоагглютинацию.

4. Индукция антител к PsaA не обеспечивает защиту при заражении животных штаммами с конститутивной продукцией PsaA, следовательно, отсутствие протективности PsaA не зависит от его синтеза внутри фаголизосом и недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности PsaA в совокупности с феноменом селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 года. Материалы диссертации доложены и представлены на 5 международных научных конференциях: II-й Международной научной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (20-21 октября 2005 г., Москва, Россия); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); 9-ом международном симпозиуме по иерсиниям (10-14 октября, 2006, Lexington, Kentucky, USA); межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г., Саратов); 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007).

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 10 научных публикациях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 56 работ отечественных и 194 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами.

Содержание работы Материалы и методы исследования В работе использовали 25 штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, включая сконструированные в ходе исследования наборы изогенных мутантов, отличающихся по продукции PsaA. Для проведения генетических манипуляций использовали штаммы E. coli:

DH5, и S17-1 pir (все штаммы получены из музея живых культур ФГУН ГНЦ ПБМ).

Штаммы Y. pestis выращивали на жидких и плотных питательных средах Хоттингера или BHI (Brain Heart Infusion Broth) при значениях pH 7,2-7,4 или 5,8- 6,2 и значениях температуры 28 C или 37 C. Штаммы Y. pseudotuberculosis и E. coli выращивали на жидких или плотных питательных средах Луриа-Бертани (LB) при температуре 37 C.

В работе использовали 8-10 недельных мышей линии Balb/C, нелинейных морских свинок и кроликов из вивариев ФГУН ГНЦ ПМБ.

Для проведения экспериментов in vitro использовали перитонеальные макрофаги мыши; перитонеальные и альвеолярные макрофаги морской свинки; лейкоциты крови кролика; лимфоциты и моноциты крови человека; макрофагоподобные мышиные клеточные линии J774.1Aи RAW264.7; линию мышиных фибробластов L929; человеческие промиелоидные линии THP-1 и U937; человеческие линии эпителиальных клеток HelaS3 и HEP-2, которые культивировали в средах DMEM или RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка. Все клеточные линии были получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН.

Определение нуклеотидных последовательностей генов проводили прямым методом секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК на приборе CEQ™ 2000XL DNA Analysis System фирмы Beckman Coulter с использованием набора реактивов CEQTM DTCS KIT: Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, а в качестве праймеров – синтетических олигонуклеотидов, рассчитанных на основании анализа структуры изучаемых генов с использованием базы данных NCBI. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью программы NCBI BLASTn. Этот раздел исследований был выполнен совместно с научным сотрудником отдела иммунобиохимии ФГУН ГНЦ ПМБ В.А.Банновым Генно-инженерные манипуляции и передачу рекомбинантных плазмид в реципиентные клетки выполняли по руководству Maniatis et al. [1982]. Инактивацию гена psaA и оперона psaEFABC в клетках аттенуированных штаммов Y. pestis и в клетках Y. pseudotuberculosis проводили методом прямого сайт-направленного мутагенеза с использованием хелперной плазмиды pKD46 [Datsenko, Wanner, 2000] или с помощью суицидных плазмид pCVD442psaA::kan и pCVD442psaEFABC::kan. Корректность структуры ДНК полученных мутантов подтверждали в ПЦР.

Комплементацию мутантов проводили с использованием плазмиды pJG428, содержащей полный оперон psaEFABC из Y. pestis EV [Makoveichuk et al., 2003], клонированный в космиде pHC79 [Hohn, Collins, 1980], а также плазмиды pIGB924Cm, созданной с использованием плазмидного вектора pKS bluescript (Stratagene), содержащего фрагмент ДНК SauI-ClaI (psaABC) из плазмиды pJG428 и кодирующего синтез белков PsaA, PsaB и PsaС. Плазмида pIGP924cm была сконструирована и любезно предоставлена научным сотрудником отдела иммунобиохимии ФГУН ГНЦ ПМБ Панферцевым Е.А Экспрессию гена psaA и синтез PsaA оценивали методами RT-ПЦР, иммуноблоттинга и дот-блоттинга [Towbin, 1979] и в реакции диффузной иммунопреципитации в геле [uchterlony, 1949]. Электрофоретическое разделение белков осуществляли по методу U.K. Laemmli [1970]. Определение титра антител в иммунных сыворотках животных проводили с помощью иммуноферментного анализа согласно руководству Т.Т. Нго и др. [1988]. Выделение и очистку препаратов рекомбинантного и нативного PsaA из штаммов E. coli DH5pJG428 и Y. pestis KM260(11) проводили по методике E. Makoveichuk et al. [2003]. Выделение «грубого» экстракта клеток Y. pestis проводили по методу L.

Bichowski-Slonimski [1963]. Митогенную активность pH 6 антигена оценивали в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) [Mishell, Shiigi, 1980]. Изучение влияния исследуемых препаратов pH 6 антигена на жизнеспособность клеток теплокровных (цитотоксический тест), на прикрепление адгезионных культур клеток теплокровных к абиотическим поверхностям и на клеточную дифференцировку определяли в тесте МТТ [ Mosmann, 1983]. Дифференцировку человеческих промиелоидных клеток THP-1 и U937 в макрофаги индуцировали добавлением форболмиристилацетата. Адгезию бактериальных клеток PsaA+ и PsaA штаммов Yersinia spp. и E. coli к поверхности макрофагов и эпителиальных клеток, а также фагоцитоз бактерий макрофагами изучали в соответствии с рекомендациями X-Z. Huang, L.E. Lindler [2004]. В качестве макрофагов использовали мышиные макрофагоподобные клетки J774.A1, в качестве эпителиальных – человеческую линию клеток эпителия гортани HEP-2.

Для получения кроличьих моноспецифических антисывороток к pH 6 антигену кроликов иммунизировали рН 6 антигенам подкожно многократно с интервалом 14 дней возрастающим количеством антигена (от 250 до 500 мкг/животное). Для определения протективной активности pH 6 антигена мышей иммунизировали раствором PsaA в PBS в дозе 10 мкг/мышь подкожно двукратно с полным и неполным адъювантом Фрейнда с интервалом 21 сутки. На 28 сутки после второй иммунизации проводили заражение мышей.

Для определения вирулентности PsaA+ и PsaA штаммов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis иммунных и интактных мышей заражали подкожно десятикратными разведениями культур Y. pestis, выращенных при 28 С или Y. pseudotuberculosis, выращенных при 37 С (по 4 мыши на одну дозу). Величины LD50, ImD50 и доверительные интервалы (для вероятности 95 %) вычисляли по методу Krber в модификации И.П. Ашмарина, А.А. Воробьева [1962]. Для изучения стабильности наследования плазмид рекомбинантными штаммами Y. pestis in vivo у мышей, погибших в экспериментах по определению LD50, выделяли из селезенок бактериальные культуры и определяли у выросших клонов сохранение признака антибиотикоустойчивости и способность к синтезу pH 6 антигена.

Результаты исследования Анализ последовательностей генов адгезинов из штамма y. pestis 231 и конструирование psaa и psaefabc мутантов. Учитывая тот факт, что утрата способности к синтезу pH 6 антигена приводила к различной степени снижения вирулентности двух штаммов Y. pestis, 231 и KIM5, было предположено, что эти различия могут быть связаны с неидентифицированными мутациями в генах оперона psa или в генах, кодирующих другие белки с предполагаемой адгезивной активностью. Анализ последовательности генома штамма Y. pestis СО92 [Parkhill, 2001] позволил выявить следующие гены, предположительно кодирующие пилевые и непилевые адгезины: YPO1301-1305 (psaEFABC), YPO1387, YPO1388, YPO3068, YPO1707, YPO1708, YPO1709, YPO1710, YPO1711, YPO2944, YPO2945, YPO2950, YPO4041, YPO4042, YPO4044, YPO3944, YPO1562. Мы определили нуклеотидные последовательности этих генов и сравнили их с аналогичными последовательностями других штаммов Y. pestis из базы данных NCBI, в том числе и штамма KIM. Оказалось, что все последовательности выбранных для анализа генов Y. pestis 231 полностью гомологичны соответствующим фрагментам геномов всех секвенированных к настоящему моменту штаммов Y. pestis. Таким образом, разная степень снижения вирулентности штаммов Y. pestis 231 и KIM5 при утрате способности к синтезу PsaA не была связана с неидентифицированными мутационными изменениями в исследованных нами генах.

Для определения роли отдельных бактериальных факторов в патогенезе инфекционных заболеваний принято использовать комплекс молекулярно-генетических методов, включающих направленный мутагенез и последующую комплементацию признака с помощью плазмид. С использованием сайт-направленного мутагенеза (рис. 1) были получены psaA и psaEFABC мутанты на основе аттенуированных и вирулентных штаммов Y. pestis, а также мутантный по гену psaA штамм Y. pseudotuberculosis B-6259.

Рис. 1. А. Структура и верификация в ПЦР psaA::kan и psaEFABC::kan мутаций по методу K.A. Datsenko и B.L. Wanner [2000]. H1 и H2 – короткие участки гомологии геновмишеней; k1, k2 – общие тест-праймеры для гена kan; PsaAkm3, PsaAkm4 – локус специфичные праймеры для гена psaA; PsaEkm3, PsaCkm4 – локус специфичные праймеры для оперона psaEFABC.

Б. Карты плазмид pCVD442psaA::kan и pCVD442psaEFABC::kan.

Оценка продукции белка PsaA клетками мутантных штаммов Y. рestis методами RT-ПЦР и иммуноблоттинга показало, что обе мутации приводят к прекращению синтеза PsaA (рис. 2).

Рис. 2. (А) RT-ПЦР-анализ экспрессии мРНК гена psaA в клетках исходных и мутантных по гену psaA штаммов Y. pestis. Линии 1 – EV; 2 – EVpsaA::kan; 3 – KM215; 4 – KM215psaA::kan; 5 – KM260(11); 6 – KM260(11)psaA::kan; 7 – положительный контроль (ПЦРпродукт, полученный с плазмидой pIGB924Cm); 8 – отрицательный контроль (H2O); 9 – маркер молекулярных масс ДНК /HindIII (23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 п.о.).

(Б) ДСН-ПААГ электрофорез и (В) соответствующий иммуноблоттинг с кроличей анти-PsaA сывороткой клеточных лизатов Y. рestis. Линии 1, 8 – KM215; 2, 9 – KM215psaA::kan; 3, 10 – EV; 4, 11 – EVpsaA::kan; 5, 12 – KM260(11); 6, 13 – KM260(11)psaA::kan; 7, 14 – PsaA (2 мкг).

Последующая комплементация psaEFABC мутации с помощью рекомбинантных плазмид, несущих полный оперон psaEFABC или локус psaABC, восстанавливала синтез PsaA (рис. 3), причем в первом случае восстанавливалась зависимость экспрессии PsaA от температуры и pH среды. В то же время отсутствие регуляторных генов psaE и psaF в pIGB924Cm приводило к синтезу PsaA, независимому от температуры культивирования (в пределах от 28 C до 37 C) и pH среды (от 5,8 до 7,2) (рис. 3 - 3, 7, 9).

Таким образом, в результате комплементации psaEFABC мутации плазмидой pIGB924Cm были получены штаммы Y. рestis с конститутивным синтезом белка PsaA.

Оценка влияния PsaA на адгезию и фагоцитоз yersinia spp. Учитывая то, что к моменту начала настоящих исследований не было сведений о том, какой адгезин обеспечивает взаимодействие Y. pestis с клетками хозяина, были изучены адгезивные и антифагоцитарные свойства изогенных штаммов Y. pestis, отличающихся по способности к синтезу PsaA (рис. 4). Оказалось, что утрата PsaA приводила к 4-9 кратному снижению адгезии исследуемых бактерий к эпителиальным клеткам гортани человека HEP-2 и в 4-8 раз увеличивала уровень фагоцитоза иерсиний макрофагами. В то же время присутствие PsaA существенно не влияло на способность иерсиний связываться с поверхностью макрофагов J774.1A. Таким образом, при взаимодействии Y. pestis с эпителиальными клетками PsaA выполняет функцию адгезина, а при взаимодействии с макрофагами - антифагоцитарного фактора, но не адгезина. Возможно, вклад PsaA в связывание клеток Y. pestis с поверхностью макрофагов несущественен, так как макрофаг обладает большим количеством рецепторов для неспецифического связывания с патогенами.

% адгезии Рис. 4. Уровни адгезии к эпителиальным клеткам HEP-2 (А) и фагоцитоза макрофагоподобными клетками J774.A1 (Б) бактериальных клеток исходных и мутантных по гену psaA штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis В ходе исследований было обнаружено, что штамм Y. pestis KM215, утративший способность к синтезу двух основных фимбриальных белков, F1 и PsaA, тем не менее не терял своих адгезивных и антифагоцитарных свойств (рис. 4, А и Б). Вероятнее всего, высокий уровень адгезивной и антифагоцитарной активности бактериальной клетки Y. pestis, утратившей способность к синтезу PsaA и F1, сохраняется благодаря экспрессии другого(их) фактора(ов), компенсирующих функции PsaA. При этом фенотип PsaA+ являлся доминирующим адгезивным и антифагоцитарным фенотипом Y. pestis. Наши результаты были подтверждены данными Liu et al. [2006], которые также свидетельствуют в пользу существования в Y.pestis неохарактеризованного ранее адгезина.

Изучение цитотоксической, адгезивной и митогенной активностей препаратов PsaA. В классических экспериментах с PsaA были получены данные о цитотоксичности «грубых» экстрактов клеток Y. pestis, выращенных в условиях синтеза PsaA. Для оценки цитотоксической активности PsaA в составе «грубого» экстракта были получены «грубые» экстракты из клеток штаммов дикого типа Y. pestis и их PsaA мутантов и проведено сравнение их цитотоксичности. В качестве клеток-мишеней использовали перевиваемые человеческие и мышиные клеточные линии и первичные культуры мыши и человека. Добавление «грубых» клеточных экстрактов Y. pestis в культуральную среду в диапазоне концентраций от 1,56 до 100 мкг/мл приводило к дозо-зависимому снижению жизнеспособности клеток-мишеней, однако «грубые» экстракты из штаммов дикого типа проявляли цитотоксические свойства в той же степени, что и их PsaA-негативные мутанты, (рис. 5). Это предполагает, что цитотоксическое действие «грубых» экстрактов связано не с PsaA, а с другими белками, присутствующими в клеточном экстракте.

Рис. 5. Жизнеспособность мышиных макрофагов J774.1A после 24 ч взаимодействия с «грубыми» клеточными экстрактами из изогенных PsaA+ и PsaA– штаммов Y. pestis.

В связи с этим было изучено влияние высокоочищенных препаратов нативного и рекомбинантного PsaA (со степенью чистоты не менее 95 %) на жизнеспособность адгезионных типов клеток млекопитающих. Былор установлено, что PsaA в широком диапазоне концентраций (1-100 мкг/мл) не влияет на жизнеспособность клеток при добавлении к сформированному клеточному монослою (табл. 1). В некоторых случаях количество жизнеспособных клеток в присутствии PsaA даже увеличивалось по сравнению с контрольным монослоем, однако эти различия находились в пределах доверительных интервалов.

Таблица 1. Жизнеспособность (%) эукариотических клеток мыши и человека после 24 ч воздействия нативного белка PsaA.

Типы перевиваемых клеточных линий Перитонеальные макрофаги мыши 102,2 10,41 112,8 6, Перитонеальные макрофаги морской свинки Альвеолярные макрофаги морской свинки Одновременно было исследовано влияние PsaA на прикрепление макрофагов и других адгезионных клеточных культур к абиотическим поверхностям (полистиролу).

Известно, что прикрепление и распластывание макрофагов и фибробластов к подложке является необходимой предпосылкой их последующей функциональной активности.

Было показано, что PsaA при его добавлении в среду культивирования на ранних стадиях формирования клеточного монослоя влиял на адгезию эукариотических клеток к абиотическим поверхностям. При концентрации выше 25 мкг/мл он препятствовал формированию клеточного монослоя и вызывал аутоагглютинацию клеток с последующей гибелью около 20 % клеток в центре клеточных агрегатов (рис. 6, Б). Гибель клеток была следствием нарушения нормальных условий их жизнедеятельности, так как жизнеспособность распластанных клеток не страдала. В концентрациях ниже 25 мкг/мл PsaA способствовал адгезии макрофагов к полистиролу и формированию монослоя. Этот эффект максимально проявлялся в экспериментах с первичными культурами клеток, в частности, с мышиными перитонеальными макрофагами (рис. 7).

Рис. 6. Формирование монослоя макрофагов J774.1A в присутствии PsaA (25 мкг/мл). А – контрольный монослой клеток; Б – клеточный монослой, сформированный в присутствии PsaA (25 мкг/мл) Рис. 7. Адгезия перитонеальных макрофагов мыши к полистиролу после 48 ч воздействия низких доз нативного белка PsaA. А – контрольный монослой перитонеальных макрофагов мыши; Б – клеточный монослой, сформированный в присутствии PsaA (6, мкг/мл) Выявленный эффект побудил к изучению влияния PsaA на клеточную дифференцировку. Известно, что моноцитарные и промиелоидные клетки под действием дифференцировочных факторов трансформируются в зрелые макрофаги, приобретая при этом способность к прилипанию и распластыванию на поверхностях. Изучение влияния PsaA на ФМА-индуцированную дифференцировку человеческих промиелоидных линий клеток U937 и THP1 показало, что его присутствие существенно увеличивало количество дифференцированных клеток, что свидетельствует о ко-стимулирующем влиянии низких концентраций PsaA на дифференцировку макрофагов (рис. 8). Нужно отметить, что влияние PsaA на клеточную дифференцировку проявлялось только в присутствии ФМА, то есть он не являлся самостоятельным фактором дифференцировки, но мог усиливать целевую активность других дифференцировочных факторов. Вероятно, выявленный эффект связан со стимуляцией клеточной адгезии к поверхности, которая играет ключевую роль в процессах дифференцировки монослойных клеточных культур.

Рис. 8. Количество дифференцированных клеток THP1 после ФМАиндуцированной дифференцировки (10 нг/мл ФМА), проведенной в присутствии белка PsaA.

Полученные ранее данные об агглютинирующей активности PsaA и связывании его с 1-галактозильными остатками гликосфинголипидов [Payne D, et al., 1998] предполагают принадлежность PsaA к лектиноподобным веществам. Поскольку одним из свойств лектинов является их митогенность, в настоящих экспериментах была изучена митогенная активность PsaA в реакции бласттрансформации на человеческих лимфоцитах, полученных из крови здоровых доноров. Полученные данные свидетельствовали, что очищенный PsaA обладает выраженной митогенной активностью, которая в концентрации 10 мкг/мл была сопоставима с митогенным эффектом КонА - индексы стимуляции лимфоцитов здоровых доноров в ответ на конА были в пределах от 8,5 до 18,1, а в ответ на pH6 антиген – в пределах от 11,9 до 17,7.

Изучение биологических свойств PsaA в экспериментах in vivo. Завершающим этапом исследований была сравнительная оценка вирулентности полученных изогенных наборов штаммов «дикого» типа, их вариантов с PsaA фенотипом и штаммов с восстановленным синтезом PsaA, зависимым или независимым от температуры культивирования и pH питательной среды на интактных и иммунизированных PsaA мышах. Следует отметить, что в процессе нокаутного мутагенеза штамм Y. pseudotuberculosis B-5962psaA утрачивал плазмиду вирулентности pCD и не мог быть использован в экспериментах по определению LD50. Поэтому для определения влияния PsaA на вирулентность Y. pseudotuberculosis была применена методика выращивания клеток этого штамма в условиях, оптимальных для синтеза PsaA. Клетки Y pseudotuberculosis B-5962 выращенные при температуре 37 С и значениях рН 5,8 служили «моделью» мутанта с рН-независимой секрецией PsaA.

В ходе экспериментов на животных было установлено, что в теплокровном организме клетки рекомбинантных штаммов Y. pestis, продуцирующие PsaA, имеют селективные преимущества. Ранее было установлено, что рекомбинантные плазмиды, созданные на основе репликона ColE1, не способны стабильно наследоваться в клетках Y. pestis без селективного давления антибиотиков [Анисимов и др., 1991]. Действительно, проведенный нами анализ пассирования in vitro клеток штаммов Y. pestis, трансформированных плазмидами pJG428 и pIGB924Cm без антибиотиков показал, что через двадцать генераций при температуре 37 С признак антибиотикоустойчивости сохраняли всего 5-7 % бактериальных клеток. Тем не менее, в организме зараженных животных эти плазмиды не элиминировались из клеток Y. pestis – 100 % выделенных из селезенок клонов сохраняли антибиотикоустойчивость и способность к продукции PsaA. Аналогичные селективные преимущества in vivo F1+ штаммов Y. pestis и рекомбинантных F1+ штаммов Y. pseudotuberculosis были показаны Гремяковой [2004] и Бываловым и др. [2008].

Чтобы оценить способность PsaA+ и PsaA вариантов штамма Y. pestis 231 выживать и размножаться в организме экспериментальных животных, был определена динамика обсеменения региональных лимфоузлов и селезенок мышей после подкожного заражения 100 КОЕ штамма Y. pestis 231 и его мутанта с полной делецией оперона psa. Было показано, что через 48 ч после заражения животных штаммом «дикого» типа у них достоверно увеличился вес регионарных лимфоузлов, а через 72 ч уровень обсемененности этих лимфоузлов был на порядок выше (p 0,05), чем у животных, зараженных PsaA вариантом (рис. 9). Однако эти различия исчезали на более поздних стадиях инфекционного процесса через 96 часов.

Рис. 9. Средние показатели веса (мг) и обсемененности (КОЕ/г органа) регионарных лимфоузлов мышей, зараженных штаммом Y. pestis 231 и его psaEFABC вариантом Тем не менее, несмотря на тот факт, что в организме животных происходит селекция клеток рекомбинантных штаммов Y. pestis, продуцирующих PsaA, утрата способности продуцировать PsaA не влияла на вирулентность psaA и psaEFABC мутантов Y. pestis.

В наших исследованиях было показано, что абсолютные величины LD50 и средние сроки жизни зараженных мышей не зависели от способности к продукции PsaA, даже когда эта продукция была конститутивной (табл. 2).

Таблица 2. Вирулентность экспериментальных штаммов возбудителя чумы при подкожном заражении мышей.

В то же время, эксперименты по определению роли PsaA в патогенезе инфекции, вызванной другим представителем рода Yersinia, Y. pseudotuberculosis, продемонстрировали более высокую вирулентность культуры, выращенной в условиях синтеза PsaA: LD при этом снижалась примерно в десять раз (табл. 3). Вероятно, в случае утраты PsaA, оставшихся факторов патогенности Y. pestis может быть достаточно для поддержания величин LD50 на уровне единичных бактериальных клеток. На наш взгляд, в штаммах высоковирулентных патогенов, таких как Y. pestis, именно избыточность механизмов и факторов патогенности до какого-то времени компенсирует отдельные мутации, потенциально снижающие способность эффективно размножаться в организме хозяина. В то же время, умеренно вирулентный энтеропатоген Y. pseudotuberculosis при утрате одного из факторов патогенности (PsaA) снижает свою вирулентность.

Таблица 3. Вирулентность Y. pseudotuberculosis B-5962 при подкожном заражении мышей.

В рамках нашей работы была проверена гипотеза о том, что отсутствие протективности PsaA может быть связано с особенностями его pH регуляции: синтез PsaA внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает PsaA+ бактерии недоступными для контакта с антителами и иммунокомпетентными клетками.

Чтобы обеспечить презентацию PsaA иммунной системе, мышей иммунизировали белком PsaA, а затем заражали штаммами Y. pestis с конститутивным синтезом PsaA либо культурой псевдотуберкулезного микроба, выращенной в условиях оптимальных для синтеза PsaA и оценивали протективность сформированного иммунитета. Полученные результаты показали, что даже при доступности PsaA+ бактерий факторам и клеткам иммунной системы иммунный ответ на PsaA не защищал мышей от чумной инфекции. В случае псевдотуберкулезной инфекции иммунные мыши оказались даже более чувствительными к инфекции, чем интактные (табл. 4).

Таблица 4. Вирулентность Yersinia spp. при подкожном заражении интактных и иммунизированных белком PsaA мышей.

Y. pestis Y. pseudotuberculosis B-5962, 37 C, PH 5, Таким образом, было показано, что отсутствие протективности PsaA не связано с его синтезом внутри фаголизосом и чумных бубонов, где PsaA+ бактерии недоступны для антител и иммунокомпетентных клеток. Для изучения механизма отсутствия протективности PsaA необходимы дополнительные исследования. Возможно, опсонизация клеток бактериальных клеток анти-PsaA антителами потенцирует контакт бактериальной клетки с макрофагом за счет взаимодействия антител с Fc рецепторами макрофагов, что, в свою очередь, стимулирует работу системы секреции III типа и усиливает эффекторное действие других факторов патогенности Y. pestis, в частности, белков Yop.

Суммируя все полученные данные, можно заключить, что PsaA, являясь адгезиY. pestis Y. pseudotuberculosis с эпителиальными клетками макроорганизма и препятствует фагоцитарному захвату. В зависимости от концентрации PsaA способствует либо процессам распластывания и дифференцировки макрофагов, либо их аутоагглютинации, что может играть важную роль в регуляции локального моноцит-опосредованного воспаления в месте первичного накопления возбудителя. В дополнение к известным данным относительно гемагглютинирующей активности PsaA, результаты о PsaA-медиированной агглютинации макрофагов и моноцитов предполагают потенциальную роль PsaA в тромбообразовании и индукции синдрома диссеминированной внутрисосудистой коагуляции, которая является характерной для чумного сепсиса. Отбор PsaA+ клеток в организме хозяина свидетельствует о селективных преимуществах бактериальных клеток, продуцирующих этот адгезин, однако его утрата не влияет на вирулентность Y. pestis. Это говорит о том, что PsaA не является обязательным фактором патогенности Y. pestis, и его наличие не является определяющим для полной вирулентности чумного микроба. Отсутствие у него протективных свойств и положительная селекция PsaA+ клеток в организме хозяина объясняют факт выделения в иммунных популяциях грызунов только PsaA+ штаммов Y. pestis, тогда как бескапсульные F1 штаммы возбудителя чумы выделяются относительно часто. Эти особенности позволяют считать PsaA и кодирующие его гены перспективной мишенью для иммунодиагностики, что является особенно актуальным для очагов чумы, где выделяются бескапсульные F1 варианты Y. pestis и диагностика, основанная на детекции капсульного F1 антигена малоэффективна.

1. Доказано, что pH 6 антиген не обладает цитотоксической активностью.

2. Установлено, что утрата способности продуцировать pH 6 антиген не снижает вирулентность Y. pestis 231.

3. Показано, что pH 6 антиген обеспечивает адгезию Y. pestis к эпителиальным клеткам и предотвращает бактериальный захват Y. pestis макрофагами, однако не вносит существенного вклада в процесс связывания Y. pestis с поверхностью макрофагов.

4. Установлено, что pH 6 антиген в зависимости от концентрации стимулирует либо процессы адгезии и дифференцировки макрофагов, либо их аутоагглютинацию, а также обладает митогенной активностью.

5. Выявлены селективные преимущества PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина, которые проявляются в стабилизации наследования плазмид с генами оперона psa и ускорении сроков генерализации инфекции.

6. Установлено, что отсутствие протективности pH 6 антигена не связано с недоступностью PsaA+ бактериальных клеток для антител и иммунокомпетентных клеток.

Отсутствие протективности белка PsaA в совокупности с феноменом положительной селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.

Cписок работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Филиппов А.А., Панферцев Е.А., Титарева Г.М., Бахтеева И.В. и др. Исследования pH 6-антигена и других потенциальных адгезинов возбудителя чумы. // Молекулярная медицина и биобезопасность: Сборник тезисов II-й Международной научной конференции (20-21 октября 2005 г., Москва, Россия). М., 2005, с. 275.

2 Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Кравченко Т.Б. и др. Иммуногенная и протективная активности pH 6 антигена Yersinia pseudotuberculosis // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государствучастников содружества независимых государств: Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, И.А. Дятлова.

Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 137-138.

3 Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Кравченко Т.Б. и др. Биологические эффекты pH 6 антигена Yersinia pestis // Там же. - С. 112- 5 Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Дентовская С.В. и др. Влияние pH 6 антигена на фагоцитоз Yersinia pestis // Там же. - С. 123-124.

6 Кравченко Т.Б., Левчук В.П., Бахтеева И.В. и др. Экспрессия рН6 антигена различными штаммами Yersinia pestis в зависимости от условий культивирования. // Там же. - С.

Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Kravchenko T.B. et al. Cytotoxic, mitogenic and adhesive activities of Yersinia pestis pH 6 antigen // 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA), S4:1. - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2006., B65. - P. 55-56.

7 Бахтеева И.В., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М. и др. Взаимодействие pH 6 антигена Yersinia pestis с различными типами эукариотических клеток.// Проблемы особо опасных инфекций. 2007. Вып. 94. С. 40-44.

8 Дентовская С.В., Светоч Т.Э., Панферцев Е.А., Бахтеева И.В. и др. Транскомплементация мутаций по отдельным генам psa оперона Yersinia pestis // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: МатериалыVIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (25- сентября 2007 г., Саратов) / Под ред. В.В. Кутырева. - Саратов: ООО «Приволжское издательство», 2007. - С. 197-198.

Ivanov S.A., Dentovskaya S.V., Svetoch T.E., Panfertsev E.A., Bachteeva I.V. et al. Transcomplementation of mutations in the genes of Yersinia pestis psa operon // Program and abstracts of the 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007), p. 67.

Бахтеева И.В., Дентовская С.В., Панферцев Е.А. и др. Вирулентность pH 6+ и pH штаммов Yersinia pestis для мышей // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. № 1;

Список сокращений и условных обозначений ДСН - додецилсульфат натрия кДа - килодальтон КОЕ - колониеобразующая единица кДНК - комплементарная ДНК мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов РДП -реакция диффузной иммунопреципитации в гель РНК - рибонуклеиновая кислота РРНК - Рибосомальная РНК ФГУН ГНЦ ПМБ –Федеральное государственное учреждение науки государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФМА - форболмиристилацетат BHI - brain heart infusion, питательная среда для культивирования микроорганизмов, на основе сердечно-мозговой вытяжки DMEM - среда Игла, модифицированная Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) - среда для культивирования клеток и клеточных линий животных LB - бульон Луриа-Бертани LD50 -летальная доза для 50% животных MTT - (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид), NCBI - База данных Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnology Information) PBS -фосфатно-солевой буфер RPMI-1640 - Roswell Park Memorial Institute – основная среда для культивирования человеческих клеток и клеточных линий.

RT-ПЦР - ПЦР в режиме реального времени, определяет экспрессию мРНК Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю д.м.н.

А.П. Анисимову за неизменно высокий интерес к нашим результатам и помощь в формировании научной концепции работы.

Приношу искреннюю благодарность заведующей лабораторией микробиологии чумы С.В. Дентовской за идейное руководство и большую помощь в области молекулярно-генетических исследований.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность официальным и неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.



 
Похожие работы:

«ЛАВРЕНЧЕНКО Леонид Александрович МЛЕКОПИТАЮЩИЕ ЭФИОПСКОГО НАГОРЬЯ: ПУТИ И ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ФАУНЫ ГОРНЫХ ТРОПИКОВ 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН доктор биологических наук, профессор, Официальные оппоненты : Никольский Александр Александрович доктор биологических наук, Холодова...»

«МАЗУНИН Илья Олегович АНАЛИЗ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК ТУБАЛАРОВ ГОРНОГО АЛТАЯ И ЭВЕНОВ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 03.01.07 – молекулярная генетика Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2010 г Работа выполнена на базе Лаборатории молекулярной генетики человека Института цитологии и генетики СО РАН до 2009г., а затем Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск в соответствии с планом научных...»

«ХОДАК Юлия Александровна РНК-ПОЛИМЕРАЗА E.coli: ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОЧИСТЫХ ПРЕПАРАТОВ; НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 03.01.03 молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные кандидат химических...»

«УДК 574.4:504.054 + 631.46 Воробейник Евгений Леонидович Экологическое нормирование токсических нагрузок на наземные экосистемы 03.00.16-экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург - 2003 Работа выполнена в лаборатории популяционной экотоксикологии Института экологии растений и животных Уральского отделения РАН. Научный консультант - академик РАН, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки...»

«Никитина Оксана Викторовна ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА TRAMETES PUBESCENS (SCHUMACH.) PILT Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2006 Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель кандидат биологических наук, С. В. Шлеев Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«У.Д.К.: 634.86:[581.143+631.559+631.541.11] (478) ШТИРБУ АНДРЕЙ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РОСТА И ПРОДУКТИВНОСТИ СТОЛОВЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИВОЙНО-ПОДВОЙНЫХ КОМБИНАЦИЙ 03.00.12 – Физиология растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук КИШИНЭУ, 2012 Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений Государственного Аграрного...»

«Афанасьев Павел Константинович Популяционная идентификация кеты (Oncorhynchus keta Walbaum) по микросателлитным маркерам 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2013 Работа выполнена в лаборатории генетических проблем идентификации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва Научный руководитель : доктор...»

«Бабин Юрий Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПОВ Н3, Н4, Н5 И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА 03.02.02 Вирусология Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ), г. Владимир. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор, заместитель...»

«МАЛЬЧИКОВ ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЗНАЧЕНИЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ В ПАТОЛОГИИ, СВЯЗАННОЙ С НАРУШЕНИЯМИ ПРОТИВОИНФЕКЦИОННОЙ ЗАЩИТЫ, И МЕТОДЫ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ 14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.06 - вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Екатеринбург - 2007 2 Работа выполнена в лаборатории вирусных инфекций ФГУН Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«БАЖЕНОВ Юрий Александрович МЛЕКОПИТАЮЩИЕ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ (ФАУНА, НАСЕЛЕНИЕ, ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СООБЩЕСТВ) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН, Федеральном государственном бюджетном учреждении...»

«МАКАРОВ Андрей Александрович ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЫШЕЧНЫХ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Л.И.Ковалев. Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Афонина Жанна Аркадьевна ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ПОЛИРИБОСОМ 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа в выполнена в Лаборатории механизм а мов биоси интеза беелка Фед дерального о государств венного бююджетного учрежден о ния науки Институт белка Р те Российской академиии наук при сотрудниччестве с Институтом генетики и молекул И м лярной и к...»

«ВЛАДИМИРОВ Михаил Германович СИНТЕЗ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА НА ПИРИТЕ КАК РЕЗУЛЬТАТ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ CO2. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2003 Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии Института биохимии им. А. Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук ОТРОЩЕНКО Владимир Андреевич Консультант...»

«ФЕДОРОВСКИЙ Тарас Григорьевич ЭКОЛОГО-АГРОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УСТОЙЧИВОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АГРОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в ФГУ Московский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Немчиновка Россельхозакадемии Научный руководитель : доктор биологических наук Замана Светлана Павловна Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных...»

«Хамидуллина Лилия Ильдаровна РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ 03.02.07 – Генетика Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор Асанов...»

«Дмитриев Павел Александрович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПСАММОФИТНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ПЕСЧАНЫХ МАССИВАХ БАССЕЙНА ДОНА (В ГРАНИЦАХ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре генетики и в Научно-исследовательском институте биологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, доцент...»

«ЗАХАРОВ Сергей Дмитриевич ИНФОРМАТИВНОСТЬ БИОТИЧЕСКИХ И АБИОТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В СИСТЕМЕ МОНИТОРИНГА ВОДОХРАНИЛИЩ Специальность: 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2006 1 Работа выполнена в Управлении по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды Республики Татарстан и кафедре прикладной экологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский...»

«Лобырева Ольга Владимировна АКТИВНОСТЬ ТИРЕОИДЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ, ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН ПРИ ГИПОТИРЕОЗЕ И ЕГО КОРРЕКЦИИ ОРГАНОМИНЕРАЛЬНЫМ КОМПЛЕКСОМ ЙОДПЕКТИН 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена на кафедре биологической химии ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России и на базе научно-исследовательской лаборатории Пищевые технологии филиала ГБОУ...»

«Ананин Анатолий Николаевич ВИДОВОЙ СОСТАВ, ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И ВЫЖИВАЕМОСТЬ МОЛОДИ РЫБ В ВЕРХНЕЙ ЧАСТИ ВОЛЖСКОГО ПЛЕСА КУЙБЫШЕВСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА 03.02.04 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2012 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Кузнецов Вячеслав...»

«ИВАНИЦКИЙ ЯРОСЛАВ ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕРЫ И КАЛЬЦИЯ НА ЗЕРНОВУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ И КАЧЕСТВО ЗЕРНА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар - 2011 Работа выполнена в лаборатории агроэкологических основ формирования качества зерна (АЭОФКЗ) отдела защиты растений и в лаборатории агрохимических исследований ГНУ Краснодарский научноисследовательский институт...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.