WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЛАДЫГИНА Александра Владимировна

Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и

Escherichia coli штамм М-17 в бификоле,

изготовленном при совместном культивировании

производственных штаммов

03.00.07 Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Чупринина Раиса Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Грубер Ирина Мироновна кандидат биологических наук Суркова Инна Генриховна

Ведущая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген»

Министерства здравоохранения Российской Федерации ФИЛИАЛ в г. Пермь «Пермское Научно-производственное объединение «Биомед»

Защита состоится «_» 2009 г в _ на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу:117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. Автореферат разослан «»_2009 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Постоянное влияние неблагоприятных факторов на жизнедеятельность человека, нередко превышающее компенсаторные возможности состояния системы «окружающая среда – макроорганизм микробиоциноз», способствует развитию дисбиотического состояния и, как следствие этого, проявлению заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.





Известно, что представители нормофлоры принимают самое непосредственное участие в биохимических, метаболических и иммунологических процессах макроорганизма за счет продукции ими различных ферментов, витаминов, биологически активных (антибиотикоподобных) веществ и других, разных по действию, продуктов метаболизма (Воробьев А.А. с соавт., 1999; Шендеров Б.А., 2002; Бондаренко В.М., 2008). Поэтому для профилактики и лечения таких состояний в медицинской практике широко используют пробиотики.

Лечебное действие монопрепарата ограничено индивидуальным спектром биологической активности штамма, на основе которого изготовлен пробиотик. Для повышения и расширения лечебного действия пробиотиков в практику здравоохранения внедрены комплексные препараты, изготовленные на основе двух и более штаммов одного вида или разных видов представителей нормофлоры: бификол, ацилакт, аципол, флорин форте.

Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов - Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 (Рахимова Н.Г., 1977). Несмотря на длительный срок выпуска препарата, серии бификола отличаются друг от друга по показателям количественного содержания живых бифидобактерий и кишечной палочки в дозе. Это может быть обусловлено несовершенством технологии изготовления бификола, использованием различных по составу питательных сред, изменением свойств микроорганизмов при совместном их культивировании, несовместимостью используемых штаммов и другими факторами.

Лечебная эффективность пробиотиков определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав. Вместе с тем данные литературы свидетельствуют о том, что при совместном культивировании нескольких видов микроорганизмов возможно усиление или ослабление некоторых биологическими свойствами монокультур: кислотообразующей, антагонистической и адгезивной активностей, резистентности к антибиотикам, продукции биологически активных веществ (Ганина В.И., 2001; Фадеева И.В., 2004; Несчисляев В.А.; 2005;

Петров Л.Н., 2008). Механизм взаимодействия культур в смешанной популяции недостаточно изучен и привлекает внимание исследователей для решения технологических вопросов микробиологического производства.

В этой связи, исследования по изучению механизма взаимодействия культур B. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в смешанной популяции при оценке их биологических свойств (биосовместимости, морфо-физиологического состояния клеток в бификоле, антагонистической активности in vitro и безопасности препарата in vivo) актуальны и имеют научную и практическую значимость для повышения качества коммерческого препарата.

Цель настоящей работы – изучение механизма взаимодействия B. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в комплексном препарате бификол в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1. Изучение взаимовлияния культур бифидобактерий и кишечной палочки и продуктов их жизнедеятельности друг на друга при совместном культивировании.





2. Изучение морфологического состояния клеток B. bifidum шт. 1 и Е. coli шт.

М-17 в коммерческих сериях бификола, бифидумбактерина и колибактерина.

3. Оценка антагонистической активности бификола и производственных штаммов B. bifidum шт. 1, Е. coli шт. М-17 в аэробных и анаэробных условиях по отношению к регламентированным и музейным тест-штаммам патогенных микроорганизмов.

4. Изучение безопасности бификола в опытах in vivo на модели «острой» и «хронической» токсичности, и оценка совместного действия двух компонентов бификола на организм экспериментальных животных.

Научная новизна исследования:

На экспериментальной модели оценки совместимости штаммов B. bifidum шт. и Е. coli шт. М-17 установлено стимулирующее влияние кишечной палочки и продуктов ее жизнедеятельности на рост бифидобактерий и ингибирующее действие бифидобактерий и продуктов их метаболизма на рост кишечной палочки.

Впервые изучено морфо-физиологическое состояние клеток B. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 в коммерческих лиофилизированных препаратах бификоле, бифидумбактерине, колибактерине. Сравнительный анализ электронномикроскопических исследований выявил наличие взаимного антагонизма бифидобактерий и кишечной палочки в смешанной популяции при их совместном и раздельном культивировании в процессе производства бификола.

На основании результатов изучения взаимодействия культур в смешанной популяции в бификоле при испытании антагонистической активности в аэробных условиях и с использованием анаэробных систем разработана модификация метода контроля антагонистической активности бификола.

При изучении взаимодействия B. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность ассоциации штаммов в бификоле.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

На модели бификола научно обоснована целесообразность:

- изучения взаимодействия штаммов в комплексных препаратах с помощью различных методов исследования: оценки совместимости, антагонистической активности, кислотообразующей активности, безопасности;

изучения биологических свойств комплексных препаратов в сравнении со свойствами микроорганизмов, входящих в их состав, для оценки взаимовлияния их на основные показатели, определяющие качество готового комплексного препарата;

изучения антагонистической активности комплексного препарата с использованием оптимальных условий культивирования для каждого компонента смешанной микробной популяции;

- изучения безопасности моно- и комплексных пробиотиков в опытах «острой»

и «хронической» токсичности в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.

Электроннно – микроскопические методы исследования морфологического состояния клеток в коммерческих препаратах - бификоле, бифидумбактерине, колибактерине - расширяют существующие представления о взаимодействии культур в смешанных микробных популяциях; оценка морфо-физиологического состояния микроорганизмов в моно- и комплексном препаратах и соотношения физиологически активных и покоящихся форм клеток перспективна для прогнозирования развития микробных сообществ в процессе культивирования с заданными характеристиками.

предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2, 3, 4, 6, 8).

Результаты исследований могут быть использованы в практической и научноисследовательской работе при разработке новых лечебно-профилактических препаратов пробиотиков, а также в работах, направленных на повышение качества комплексных препаратов и совершенствование технологии их изготовления.

Основные положения, выносимые на защиту:

наблюдается сложный механизм их взаимодействия: бифидобактерии и продукты их метаболизма оказывают ингибирующее действие на рост кишечной палочки, а кишечная палочка и продукты ее метаболизма стимулируют рост бифидобактерий, что проявляется в накоплении биомассы.

2. С помощью электронно-микроскопических методов исследования моно- и комплексного препаратов выявлен антагонистический механизм взаимоотношений двух видов микроорганизмов в смешанной популяции бификола, выражающийся в усилении фрагментации клеток бифидобактерий и появлении электронно-плотных гранул, в агрегации клеток кишечной палочки и деструктивных изменений в них.

3. Взаимодействие двух культур в смешанной популяции бификола проявляется по-разному при оценке антагонистической активности в аэробных и анаэробных условиях, что диктует целесообразность при наличии в комплексных препаратах представителей аэробных и анаэробных микроорганизмов микроорганизма in vitro.

4. Комплексный препарат бификол по результатам испытания «острой» и «хронической» токсичности безопасен, что проявляется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему, органы иммунной системы и другие внутренние органы подопытных животных.

государственного учреждения науки Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича диссертационной работы доложены и обсуждены на Юбилейной научнопрактической конференции НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, 1996;

Международной научно-практической конференции памяти Г. И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, Международной конференции пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней»; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах, содержит 22 таблицы и 46 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 133 источника, из них отечественных и 60 иностранных, приложения.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории бактерийных вакцин и препаратов из нормофлоры в соответствии с планом НИР ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича, договоры № 737/089/024 и № 034/089/009 с Минздравом России – Отраслевая научноисследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальных исследованиях использовали производственные штаммы Bifidobacterium bifidum 1, Escherichia coli М-17. Для определения антагонистической активности производственных штаммов и коммерческих серий бификола использовали тест-штаммы, полученные из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича:

наборы регламентированных (Shigella flexneri 337 и 170, Shigella sonnei 5063, Escherichia coli 157, Staphylococcus aureus 209, Proteus vulgaris 177, Proteus mirabilis 249) и музейных тест-штаммов (P.vulgaris 4175, P mirabilis 49, Hafnia alvei NCTC 8105 и №1, S. sonnei 20044, S. flexneri 2a 1607, Salmonella enteritidis 5765, Salmonella E. coli kauffmann 026 и 0111, Staphylococcus aerogenes 10006).

typhimurium 79, Коммерческие препараты пробиотиков включали бифидумбактерин, колибактеринин и бификол, изготовленные разными производственными предприятиями.

Взаимодействие бифидобактерий и кишечной палочки в бификоле изучали в следующих смоделированных опытах; 1. при одномоментном посеве в среды Блаурокка или казеиново-дрожжевую (КД-5а) по 1 дозе бифидумбактерина и колибактерина (смоделированный бификол); 2. при посеве 1 дозы колибактерина в центрифугат и фильтрат культуральной жидкости, полученной от суточной, двух- и трехсуточной культуры В. bifidum шт. 1; 3. при посеве 1 дозы бифидумбактерина в центрифугат и фильтрат культуральной жидкости суточной культуры E. coli шт.

M-17. Использовано два варианта смоделированного бификола: 1-вариант (1В)– посев одновременно по 1 дозе бифидумбактерина и колибактерина в 18 мл среды Блаурокка и КД-5а; 2 – вариант (2В)– бифидумбактерин и колибактерин каждый в отдельности сначала засевали по 1 дозе в среды Блаурокка и КД-5а, а затем культуры 1-го пассажа бифидобактерий и кишечной палочки засевали одновременно по 1 мл в пробирки с 18 мл среды Блаурокка и КД-5а. Количество выросших колоний в каждом опыте подтверждали путем высева десятикратных разведений выросшей культуры на питательные среды Блаурокка, Блаурокка с азидом натрия, МПБ. Центрифугаты и фильтраты культуральной жидкости (КЖ) бифидобактерий и кишечной палочки получали путем центрифугирования бактериальной взвеси при 3500 об/мин в течение 10 мин с последующей фильтрацией через фильтр миллипор (размер пор 0,22 мкм).

Питательные среды: Блаурокка, Блаурокка с натрия азидом, КД-5а, МПА, МПБ, Гаузе №2, МРС-5 приготовлены в соответствии с утвержденными нормативными документами.

Морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum шт. 1 и E. coli шт. M-17 в смешанной популяции в бификоле, приготовленном по разной технологии, изучали в сравнении с морфо-физиологическим состоянием этих штаммов в монопрепаратах – бифидумбактерине и колибактерине. Исследования проводили одновременно несколькими модифицированными электронно-микроскопическими методами позитивного окрашивания и ультратонких срезов (Рыбальченко О.В., 2003) совместно с лабораторией электронной микроскопии и спектроскопии ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ»

ФМБА России (г. С. Петербург)*. Для получения статистически значимых результатов материал на исследование брали из 3-х флаконов каждого препарата. При использовании метода позитивного окрашивания в каждом случае в электронном микроскопе просматривали не менее 50 сеточек (3-4-кратные опыты, с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 3 образца, из каждого образца готовили по 2-3 сеточки). При использовании метода ультратонких срезов в каждом случае исследовали не менее ста ультратонких срезов (3-4-кратные опыты с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 3 образца, из каждого образца готовили от 4 до 6 ультратонких срезов).

Антагонистическую активность коммерческих препаратов бификола и производственных штаммов В. bifidum шт. 1, E. coli шт. M-17 изучали с помощью отсроченного антагонизма на плотной питательной среде Гаузе № 2 и МРС-5. Для оценки информативности регламентированного метода контроля антагонистической активности бификола в аэробных условиях был использован модифицированный метод отсроченного антагонизма: использованы две питательные среды – Гаузе №2 и МРС-5 и два способа культивирования – аэробный и с использованием анаэробных систем GENbox СО с концентрацией углекислого газа в среднем 3-6 % (фирма bioMerieux®, Франция) и «OXOID» с концентрацией 5 % О2 и 10 % СО2 (фирма «OXOID», Великобритания).

*Автор выражает глубокую признательность сотрудникам д.б.н., проф.

О.В. Рыбальченко и ведущему научному сотруднику И.Л. Потокину за оказанную помощь в проведении исследований.

«Острую» и «хроническую» токсичность исследовали на 187 мышах обоего пола линии Black C/57 массой тела (15±1) г, чувствительных к действию токсических веществ, в соответствии с требованиями РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов». Исследования проводили патоморфологии ГИСК им. Л.А. Тарасевича в соответствии с международным соглашением о соблюдении правил гуманного отношения к животным. В опытах по производственные штаммы В. bifidum 1, E. coli M-17. Производственный штамм В. bifidum 1 выращивали в среде Блаурокка в течение 72 ч, центрифугировали при 5000 об/мин для освобождения от питательной среды и разводили 0,9 % раствором натрия хлорида. Производственный штамм E. coli M-17 выращивали в МПБ в течение 5-6 ч, затем пересевали на МПА; выросшую культуру смывали 0,9 % раствором натрия хлорида. Концентрацию микробных клеток в 1 мл бифидобактерий и кишечной палочки определяли по ОСО 42-28-59-85П в сравнении со стандартом мутности 10 ОЕ. В 1 мл взвеси кишечной палочки содержалось 80 ОЕ, бифидобактерий - 40 ОЕ. Равный объем взвеси бифидобактерий и кишечной палочки объединяли, получив смоделированный бификол, содержащий в 1 мл 60 ОЕ (40 ОЕ E. coli шт. M-17 и 20 ОЕ В. bifidum шт. 1). Полученные моно- и комплексные взвеси вводили мышам внутрибрюшинно и перорально в объеме 1 мл. Для определения LD при внутрибрюшинном введении использовали три разные дозы смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ и 5 ОЕ) и монокультуры E. coli шт. M-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕ). Расчет LD50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П. и Воробьева А.А. Наблюдение за животными, после введения препаратов, проводили в течение последующих 7 суток. При изучении безопасности препаратов на модели «хронической» токсичности перорально вводили ежедневно в течение 14 суток терапевтические дозы бификола для человека колибактерий КОЕ/мл), колибактерина (3х108 КОЕ/мл) и бифидумбактерина (5х КОЕ /мл). Вводимые дозы превышали дозы для мышей более чем в 1000 раз.* *Примечание:

- суточную дозу, эквивалентную дозе для человека (Эд) на кг массы тела животного, рассчитывают следующим образом: Эд =МжхЧД/М ч, где Мж – масса тела животного, ЧД - человеческая доза, М ч – масса тела человека (масса тела взрослого человека 70 кг, масса тела ребенка – 10 кг). Пример расчета: Мж = 10 г; М ч= 10 кг = 1х104; ЧД = 1х Наблюдение за животными проводили в течение периода введения препарата и последующих 7 суток. Ежедневной регистрации подлежали гибель животных, масса тела; оценивали внешний вид животных, поведенческие реакции. Для проведения гистологического исследования на 1 и 7 сутки после последнего введения препарата забивали по 5 животных соответственно.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики (Гланц С., 1999) с помощью компьютерной программы BioStat 2008. Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием t – критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р0,05. Результаты в таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m).

Повторяемость опытов (n) 3-6 – кратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение взаимодействия B. bifidum шт. 1 и E. coli шт. М-17 и продуктов их метаболизма на рост каждого штамма при их совместном культивировании Технология изготовления бификола предусматривает совместное культивирование B. bifidum шт.1 и E. coli шт. М-17 на последнем этапе получения производственной биомассы. В специальных опытах по изучению биосовместимости штаммов использованы два варианта смоделированного бификола. Установлено, что при совместном культивировании оба штамма в смешанной популяции вели себя по-разному. Когда в варианте 2В– использовали культуры бифидо- и колибактерий 1-го пассажа для одномоментного посева в среды Блаурокка и КД-5а, через 24 ч совместного культивирования содержание коликомпонента в бификоле 2В было на два порядка меньше по сравнению с суточной культурой (СК) и бификолом 1В В то же время кишечная палочка стимулировала рост бифидобактерий: через 24 ч (вместо 48 - 72 ч) содержание бифидобактерий достигало 108 микр.кл/мл (рис.1. - 1В, 2В).

Особенно четко эта закономерность наблюдалась при оценке взаимовлияния их продуктов метаболизма на рост при использовании центрифугатов и фильтратов культуральных жидкостей. В исследованиях использовали центрифугаты и фильтраты суточной, двух– и трехсуточной культуральной жидкости бифидобактерий (ЦБ1, ЦБ2, ЦБ3) и суточной культуральной жидкости кишечной палочки.

содержанием 109 микр. кл/мл обнаружен рост кишечной палочки в количестве 104-103 микр. кл/мл. На фоне слабого роста кишечной палочки содержание бифидобактерий существенно соответственно, вместо исходного – 101 микр. кл/мл в ЦБ). Посев в МПБ колибактерина подтвердил содержание живых бактерий кишечной палочки в количестве 1010 микр. кл/мл (контроль) (рис.2).

Количество жизнеспособных

П П СК СК ОСО

10 9 микр. кл/мл в ЦБ2 с исходным показателем рН 4,5 и с коррекцией показателя рН до 7,0. При коррекции рН содержание кишечной палочки возрастало в ЦБ2 до (1010 микр.кл/мл).

Количество жизнеспособных бактерий, lg10 KOE/доза центрифугаты культуральной среды бифидобактерий через 24 ч культивирования:

бифидобактерий содержание кишечной палочки увеличилось на два порядка (до микр. кл/мл), однако было значительно ниже их содержания в контроле ( микр. кл/мл).

метаболитов кишечной палочки на рост бифидобактерий. В центрифугат и фильтрат суточной КЖ кишечной палочки засевали по 1 мл бифидумбактерина (рис.3, ст.1) или суточной культуры бифидобактерий 1-го пассажа (рис.3, ст.2) и выращивали в течение 24 ч.

что выбранный режим центрифугирования не полностью освобождал культуральную жидкость от колибактерий (рис. 3а, ст. 1, 2). Культура и продукты метаболизма кишечной палочки оказывали стимулирующее действие на рост бифидобактерий:

через 24 ч количество их достигало 109 микр. кл/мл вместо 108 микр. кл/мл; в контроле рост бифидобактерий учитывали через 72 ч (рис.3а). Эта же закономерность отмечена при использовании фильтрата КЖ кишечной палочки (рис. 3б).

Количество жизнеспособных бактерий, lg10 KOE/доза Рис. 3. Содержание живых бифидобактерий и кишечной палочки в мл при посеве в центрифугаты и фильтраты суточной культуральной жидкости кишечной палочки:

выращивании. Накопление биомассы E. сoli шт. M-17 и B. bifidum шт.1 при физиологического состояния культур в посевном материале и образования различного типа метаболитов, что может отразиться на соотношении живых бактерий E. coli шт. M-17 и B. bifidum шт. 1 и создавать условия получения нестандартного препарата.

Морфо-физиологические особенности клеток микробных популяций в составе бификола и препаратов бифидумбактерина, колибактерина родов в смешанных микробных сообществах при их совместном развитии в среде обитания позволяет получить электронно-микроскопический анализ препаратов.

Нами впервые проведена оценка морфо-физиологического состояния клеток микроорганизмов в бификоле, изготовленном по разной технологии. В качестве контроля исследовали морфо-физиологическое состояние клеток B. bifidum шт. 1 и E. сoli шт. М-17, выращенных в жидких питательных средах Блаурокка и МПБ, и в лиофилизированных препаратах – в бифидумбактерине и колибактерине.

идентифицировано несколько морфологических типов клеток: электроннопрозрачные - физиологически активные и электронно-плотные – покоящиеся клетки (рис.4,5,6,7), фрагментированные, отличающиеся по характеру протекающих в них деструктивных экстремальных факторов. Изменение ультраструктурной организации электронноплотных (покоящихся) клеток (уменьшение размеров клеток, изменение структуры наружной мембраны и расположения в цитоплазме рибосом, нитей ДНК, зоны нуклеотида, увеличение плотности периплазматического пространства), свидетельствует о снижении уровня их метаболической активности. По-видимому, Рис. 4-7. Ультратонкий срез моно- культур, выращенных в жидкой питательной среде. Увеличение Рис.4.Электронно-прозрачная физиологически активная (ФА) клетка E. сoli шт. М- Рис. 5. Электронно-плотная физиологически неактивная (покоящаяся) клетка (ФН) E. сoli шт. М- Рис. 6.Электронно-прозрачная физиологически активная (ФА) клетка B.bifidum шт. Рис. 7. Электронно-плотная физиологически неактивная (ФН) клетка B. bifidum шт. образование покоящихся форм клеток является одним из механизмов приспособления микробной популяции к изменяющимся условиям окружающей среды, что способствует не только успешному ее выживанию в неблагоприятных условиях, но и обеспечивает возможность обратимого перехода в физиологически активное состояние.

Для электронно-микроскопического исследования морфологической гетерогенности в микробных популяциях E. сoli шт. М-17 и B. bifidum шт. лиофилизированные бифидумбактерин, колибактерин и бификол растворяли в среде Блаурокка при температуре 22 °С и 37 °С и экспозиции 30 мин и 2 часа.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов показало, что микробная популяция в бифидумбактерине, регидратированном при 22 °С и 37 °С и экспозиции 30 мин, на две трети состояла из живых физиологически активных клеток, характеризующихся высоким уровнем метаболизма. Обнаружение в препаратах признаков фрагментации бифидобактерий и остатков разрушенных клеток свидетельствует о частичном аутолизе бифидобактерий, отражающем естественную динамику морфо-физиологических изменений представителей данного рода бактерий В препаратах бифидумбактерина, регидратированного при температуре 22 оС и 37 оС, экспозиция в течение 2 ч выявляются только физиологически неактивные (покоящиеся) клетки, а также усиление фрагментации клеток бифидобактерий и появление большого числа электронно-плотных гранул (рис.8, 9).

Рис.8-9. Бифидумбактерин. Позитивное окрашивание бифидобактерий. Режим регидратации 22 оС, экспозиция 2 ч в среде Блаурокка. Увеличение х Рис.8. Электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при фрагментации бифидобактерий Рис.9. Электронно-плотные (ФН) клетки бифидобактерий и электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при фрагментации бифидобактерий Наличие в препаратах бифидумбактерина большого числа физиологически активных клеток, (62,7 ± 0,4) % и (61,2 ± 0,3) % соответственно при режимах регидратации 22 и 37 оС и экспозиции 30 мин, свидетельствует о том, что культура бифидобактерий перед высушиванием находилась на стадии активного роста и в достаточно высокой степени сохранила свою физиологическую активность. Одна треть клеток, перешедших в фазу покоя, отражает, вероятнее всего, переход в стационарную фазу роста и/или негативное влияние процесса высушивания. При увеличении времени экспозиции до 2 ч, в препаратах выявляются только покоящиеся клетки вследствие, вероятно, аэробных условий регидратации.

Анализ данных морфометрического исследования препаратов колибактерина показал, что изменение параметров процесса его регидратации приводит к незначительному сдвигу в структуре популяции E. сoli шт. М-17. При регидратации колибактерина при температуре 22 оС, экспозиции 30 мин, в препаратах выявлены физиологически активные клетки (68,0 ± 0,4) %, число покоящихся и частично аутолизированных клеток E. сoli шт. М-17 составляет по (16,0 ± 0,3) % в каждой группе, соответственно. При этом к частично аутолизированным клеткам E. сoli шт. М-17 относили клетки с характерными сферическими пустотами в цитоплазме.

Наличие большого числа физиологически активных клеток свидетельствует о том, что значительная часть популяции кишечной палочки перед высушиванием находилась в физиологически активной форме. С увеличением длительности экспозиции до 2 ч число клеток с характерными сферическими включениями возрастает (рис.10). Наблюдаемые деструктивные изменения, по-видимому, носят локальный характер и в дальнейшем, в зависимости от их степени и глубины, клетки могут восстановить свою физиологическую активность либо погибнут.

Сравнительный анализ электронно-микроскопических препаратов бификола, приготовленного с использованием разной технологии подготовки посевного материала и культивирования, свидетельствует о различии морфо-физиологических свойств клеток бифидобактерий и кишечной палочки.

регидратированном при температуре 22 °С, экспозиции 30 мин, соотношение физиологически активных (66,4±0,3) % и покоящихся клеток бифидобактерий (33,5±0,4) % было близко к их соотношению в монопрепарате. Все клетки кишечной палочки находятся в физиологически активном состоянии. Отличие электронно микроскопических препаратов бификола и монопрепаратов заключается лишь в наличии выраженных признаков антагонистической активности двух неродственных видов микроорганизмов: более активный процесс секреции бифидобактериями продуктов метаболизма (рис.11), более выраженные деструктивные изменения в клетках кишечной палочки, наличие в их клетках ультраструктурных изменений в области клеточной стенки, нуклеотида и цитоплазмы, возникающие при антагонистическом воздействии бифидобактерий (рис. 12).

ФНББ Рис.11-12. Бификол. Ультратонкий срез бифидо- и колибактерий, регидратация при температуре 22 оС, экспозиция 30 мин. Увеличение Рис. 11. Электронно-плотные клетки B. bifidum шт. 1 (ФНББ), секреция электронноплотного вещества, из которого образуются характерные гранулы (ЭПГ) Рис. 12. Электронно-прозрачные физиологически активные (ФАКП) клетки E. coli шт. М- с ультраструктурными изменениями в области клеточной стенки, нуклеоида и цитоплазмы.

Электронно-плотные (ФНББ) клетки B. bifidum шт. 1, характерные электронно-плотные гранулы (ЭПГ) В электронно-микроскопических препаратах бификола, изготовленного на основе смешивания двух раздельно выращенных культур при их раздельном культивировании, соотношение физиологически активных и неактивных клеток бифидобактерий примерно равное (52,7±0,4 и 47,3±0,3 % соответственно). При этом морфологические свойства клеток бифидобактерий отличаются от клеток в бифидумбактерине и бификоле, изготовленном по технологии совместного культивирования двух штаммов. Так, физиологически активные клетки бифидобактерий в бификоле характеризуются более высоким уровнем метаболической активности по сравнению с клетками в бифидумбактерине и бификоле, изготовленном при совместном культивировании штаммов. Обнаружение фрагментированных клеток бифидобактерий и остатков разрушенных клеток связано с секрецией биологически активных веществ, направленных на подавление части популяции кишечной палочки, и их частичным аутолизом (рис. 13). Почти все клетки кишечной палочки (физиологически активные) находятся в агрегированном состоянии. Отсутствие в препаратах покоящихся клеток Е. coli шт. М-17, возможно, связано с тем, что бифидобактерии подавляют их настолько активно, что они не успевают перейти в фазу покоя, а остаются в физиологически активном и агрегированном состоянии (рис.14). По-видимому, при используемой технологии раздельного культивирования бифидобактерий и кишечной палочки и их смешивании для получения биомассы обе культуры испытывают сильное антагонистическое влияние друг на друга путем воздействия продуктами метаболизма. Это выражается в большем количестве фрагментированных клеток и появлении многочисленных остатков разрушенных бифидобактерий, повышенной агрегации клеток кишечной палочки, наличии в них изменений на разной стадии деструкции практически полном отсутствии покоящихся форм клеток (рис. 14 - 16).

Таким образом, с помощью электронно – микроскопических методов исследования микробных клеток в популяциях моно- и комплексного препарата, выявили сложный характер взаимодействия культур на уровне отдельных клеток и на популяционном уровне. Так как используемые производственные штаммы в смешанных микробных популяциях подвержены значительным изменениям, это следует учитывать при дальнейшем совершенствовании и стандартизации технологии совместного и раздельного культивирования не только при производстве бификола, но и при разработке других комплексных пробиотиков.

ФАКП ЭПГ

Рис. 13-16. Бификол. Позитивное окрашивание бифидо- и колибактерий Рис.13 Электронно-плотные клетки бифидобактерий (ФНББ) и электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при их фрагментации. Регидратация при 37 оС, экспозиция мин. Увеличение х Рис.14. Электронно-прозрачные физиологически активные клетки Е. coli шт. М-17 (ФАКП) в агрегированном состоянии и электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при фрагментации бифидобактерий. Регидратация при 22 оС, экспозиция - 30 мин.

Увеличение х Рис. 15. Е. coli шт. М-17, окруженная электронно-плотными гранулами (ЭПГ). В верхней части рисунка разрушенная клетка Е. coli шт. М-17 (РККП). Регидратация при 22 С, экспозиция - 2 ч Увеличение х Рис. 16. Частично лизированная клетка Е. coli шт. М-17 (ЧЛКП), клеточные стенки (КСКП) окружены электронно-плотными гранулами (ЭПГ). Регидратация при 22 С, экспозиция - 2 ч Увеличение х Изучение взаимодействия B. bifidum шт. 1 и E. coli шт. M-17 в бификоле при оценке антагонистической активности in vitro Лечебное действие препарата обусловлено биологическими свойствами штаммов, используемых для их изготовления. Одной из важных характеристик производственных штаммов является их антагонистическая активность.

Согласно требованиям НД антагонистическая активность определяется в тесте отсроченного антагонизма. Несмотря на то, что коммерческие серии различались по соотношению бифидо- и коликомпонентов в дозе препарата ( существенных различий между сериями бификола по антагонистической активности информативности регламентированного метода контроля антагонистической активности был использован модифицированный метод отсроченного антагонизма.

При этом количество выросших бифидо- и колибактерий определяли на питательных средах Гаузе №2 и МРС-5 в аэробных условиях культивирования и с использованием анаэробных систем. Выросшую на чашках культуру бификола смывали 10 мл 0,9 % раствором натрия хлорида через 24, 48, 72 ч. Количество выросших колоний в каждом опыте подтверждали путем высева десятикратных разведений выросшей культуры на питательные среды Блаурокка с азидом натрия для бифидобактерий и МПБ для кишечной палочки. Результаты учитывали через 24 ч для кишечной палочки и 72 ч для бифидобактерий.

Сравнительный анализ полученных данных выявил, что в аэробных условиях наибольшее содержание бифидобактерий (103 микр. кл/мл) отмечается через 24 ч совместного роста с кишечной палочкой. В анаэробной системе GENbox СО2 с концентрацией углекислого газа в среднем 3-6 %, содержание жизнеспособных клеток бифидобактерий постепенно возрастало от 10 микр. кл/мл (через 24 ч) до микр. кл/мл (через 48 ч и 72 ч) при росте на среде МРС-5; на среде Гаузе № максимальное количество бифидобактерий было на 1-2 порядка меньше чем на среде МРС-5. Рост кишечной палочки в концентрации 10 микр. кл/мл отмечали через 24 ч в аэробных условиях, а в анаэробной системе - только через 48 ч независимо от используемой питательной среды. Возможно, это было связано с ингибирующим действием бифидобактерий. Таким образом, наибольшее содержание бифидо- и колибактерий в посеве бификола выявлено через 72 ч (108 микр. кл/мл). Ожидалось, что в этих условиях антагонистическая активность бификола должна была проявиться в большей степени. Однако, достоверного различия в показателях антагонистической активности при аэробном культивировании и с использование данной анаэробной системы при культивировании на среде МРС-5 и Гаузе №2 отмечено не было несмотря на одинаковую посевную дозу обоих компонентов р0,05), 108 микр.кл./мл (табл. 1). При использовании другой анаэробной системы - «OXOID»

с концентрацией 5 % О2 и 10 % СО2, испытуемые препараты достоверно различались по антагонистической активности (p0,05). Так, в условиях анаэробной системы «OXOID» выявлено, что бификол и B. bifidum шт. 1 проявили выраженный антагонизм по отношению к регламентированным и музейным тест-штаммам: зоны угнетения роста регламентированных тест-штаммов находились в пределе от 30 до 48 мм (табл.2), музейных тест-штаммов – от 30 до 43 мм (среда МРС-5).

Оценка антагонистической активности бификола по отношению к регламентированным штаммам в аэробных условиях и в анаэробной системе S. flexneri 170 19,25±1,5 17,25±2,06 19,75±0,5 15,5±4, S. flexneri 337 19,25±1,5 18,0±2,45 19,5±1,0 16,5±2, S. sonnei 5063 20,5±1,0 20,0±1,63 17,75±2,06 16,5±3, P. vulgaris 177 16,25±2,5 14,5±1,0 19,0±1,15 14,75±3, P.mirabilis 237 15,75±3,40 18,75±2,5 19,5±1,0 15,75±2, Оценка антагонистической активности бификола, В. bifidum шт.1, E.coli шт. М- по отношению регламентированным тест-штаммам в анаэробной системе «OXOID»

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о сложном взаимодействии бифидобактерий и кишечной палочки в бификоле при оценке в разных условиях показателя антагонистической активности. Было выявлено, что свидетельствует о формировании в популяции полноценных по биологическим свойствам клеток культур, входящих в состав комплексного препарата. Проявление данного свойства зависит от условий, в которых развиваются культуры: состава питательных сред, температуры культивирования, содержания кислорода в системе и других. Исходя из этого, при разработке комплексных препаратов, изготовленных на основе разных видов микроорганизмов, и испытания их антагонистических свойств следует учитывать оптимальные условия культивирования каждого микроорганизма in vitro производственными штаммами, входящими в их состав.

Изучение взаимодействия культур B. bifidum шт. 1 и E. coli шт. М-17 на модели «острой» и «хронической» токсичности комплексного препарата бификола и составляющих его монокомпонентов При оценке качества моно- и комплексных препаратов пробиотиков особо свидетельствует о том, что недостаточно иметь только характеристику безопасности штаммов, используемых для изготовления пробиотиков, без оценки безопасности готового препарата. В наших исследованиях взаимодействие двух штаммов в бификоле на организм подопытных мышей линии Black С/57 изучено на модели «острой» и «хронической» токсичности.

внутрибрюшинного введения в объеме 1 мл 80 ОЕ взвеси культуры Е.соli шт. М-17, 40 ОЕ взвеси культуры B. bifidum шт. 1 и 60 ОЕ смоделированного бификола (40 ОЕ Е.соli шт. М-17 и 20 ОЕ B. bifidum шт.1 в 1 мл) все мыши, получившие культуру Е.соli шт. М-17 и смоделированный бификол, пали с явлениями шоковой реакции, выражавшейся в полнокровии и кровоизлияниях во внутренних органах. В то же время внутрибрюшинное введение 40 ОЕ взвеси культуры B. bifidum шт. 1 все подопытные животные переносили без проявления каких - либо симптомов интоксикации. Вместе с тем при вскрытии их на 1 и 7 сутки после введения при макроскопическом изучении внутренних органов обнаружено выраженное полнокровие внутренних органов, особенно в легких, печени и почках, подтвержденное микроскопическими исследованиями, связанное с большой антигенной нагрузкой при внутрибрюшинном введении.

Для определения LD50 при внутрибрюшинном введении использовали три разные дозы смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ и 5 ОЕ) и монокультуры E. coli шт. M-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕ). Несмотря на то, что в состав бификола входит равное количество живых бифидо- и колибактерий, отмечена тенденция снижения количества погибших животных при его введении: LD50 для Е.соli шт. М- составляет 6,41, бификола – 14,13 ОЕ. Гибель животных наблюдали в первые сутки.

Всех павших животных вскрывали и проводили макроскопическую оценку внутренних органов. При этом отмечали выраженное полнокровие печени, легких и других внутренних органов. Следовательно, добавление к культуре Е. соli шт. М- такого же количества культуры B. bifidum шт. 1 не приводило к увеличению токсического действия препарата.

Сравнительная оценка результатов «острой» токсичности при пероральном введении препаратов показала, что введение больших доз культур Е.соli шт. М-17, B. bifidum шт. 1 и комплексного препарата бификола (80 ОЕ, 40 ОЕ и 60 ОЕ, соответственно), не приводило к развитию шоковых реакций и лишь у отдельных животных сопровождалось развитием во внутренних органах умеренного полнокровия и очаговых дистрофических изменений.

При изучении безопасности препаратов на модели «хронической» токсичности перорально вводили в течение 14 суток терапевтические дозы бификола для человека (5х108 бифидобактерий + 3 х108 колибактерий КОЕ/мл), колибактерина (3х108 КОЕ/мл) и бифидумбактерина (5х108 КОЕ /мл). Вводимые дозы превышали дозы для мышей более чем 1000 раз. Морфологическое исследование внутренних органов не выявило признаков токсического действия указанных препаратов на ЦНС, дыхательную и иммунную системы, желудочно-кишечный тракт и другие органы.

Таким образом, в опытах на модели «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность смешанной микробной популяции в комплексном препарате бификол.

На примере бификола выявлено, что механизм взаимодействия культур Е. соli шт. М-17 и B. bifidum шт. 1 в бификоле, полученном как при совестном, так и при раздельном их культивировании достаточно сложен и зависит от многих факторов:

технологии изготовления, состава используемых питательных сред, методов испытания биологических свойств и других факторов. На основании данных литературы и результатов исследования сформулированы требования к доклиническому изучению пробиотиков. При разработке комплексных препаратов, включающих разные виды микроорганизмов или несколько штаммов одного вида, необходимо:

- обосновать подбор штаммов для комплексных препаратов;

- изучить биосовместимость штаммов, составляющих основу комплексных препаратов, с использованием разных методов исследования;

- лимитировать количественные соотношения производственных штаммов и определить достаточно ограниченные пределы их колебаний;

- при количественной оценке специфической активности отработать методику идентификации каждого штамма, составляющего основу пробиотика, по морфологическим и культуральными свойствам;

- определить биологические свойства комплексных пробиотиков в сравнении с биологическими свойствами штаммов, входящих в их состав;

- изучить безопасность комплексных пробиотиков на модели «острой» и «хронической» токсичности в сравнении с моноштаммами и их смешанной популяцией.

1. Установлено, что при совместном выращивании культура B. bifidum шт. ингибирует рост кишечной палочки, а культура Е.соli шт. М-17 стимулирует рост бифидобактерий.

Впервые при использовании электронно-микроскопических методов исследования выявлено антагонистическое взаимодействие двух неродственных видов микроорганизмов – B. bifidum шт.1 и E. coli шт. М-17 в готовом препарате бификоле вне зависимости от способа его изготовления.

3. Установлены различия морфологического состояния клеток бифидобактерий и кишечной палочки в составе бификола, изготовленного по разной технологии.

Данный факт следует учитывать при совершенствовании и стандартизации технологии не только производства бификола, но и при разработке других комплексных препаратов.

4. При испытании антагонистической активности бификола в аэробных и анаэробных условиях выявлено, что в анаэробных условиях антагонистическая активность бификола выше и определяется антагонистической активностью бифидокомпонента.

5. В опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность ассоциации культур B. bifidum шт.1 и E. coli шт. М-17 в бификоле. Изучение безопасности комплексных пробиотиков следует проводить в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.

6. Результаты исследований реализованы разработкой МУК «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2, 3, 4, 6, 8).

КЖ – культуральная жидкость КД-5 – казеиново-дрожжевая среда КОЕ – колониеобразующие единицы Микр. кл. – микробных клеток МПА - мясо-петонный агар НД – нормативная документация об/мин – оборотов в минуту РД – руководящий документ ЦБ – центрифугат бифидобактерий LD50 – минимальная доза препарата, вызывающая гибель половины Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Лукьянова О. Ю., Рыбачок (Ладыгина) А.В. К вопросу о стандартизации технологии изготовления бификола // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Материалы международного симпозиума, посвященного 150 - летию со дня рождения И.И. Мечникова и 90 - летию Уфимского НИИВС НПО «Иммунопрепарат» – Уфа. - 1995. – ч. 1.- С. 179 - 182.

2. Рыбачок (Ладыгина) А.В. К вопросу об усовершенствовании контроля антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий, лактобацилл и кишечной палочки М-17 // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине.

Материалы международного симпозиума, посвященного 150 - летию со дня рождения И.И. Мечникова и 90 - летию Уфимского НИИВС НПО «Иммунопрепарат» - Уфа. - 1995.

3. Чупринина Р.П., Конькова Н.К., Евлашкина В.Ф., Рыбачок (Ладыгина) А.В. Перспективы повышения качества препаратов эубиотиков // Современная вакцинология. Тезисы докладов 2 - ой Международной конференции, посвященной 100 - летию Пермского НПО "Биомед". - Пермь, 16 - 18.06.98. - С. 143.

4. Чупринина Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В. Доклинические испытания новых пробиотиков // Сборник материалов. Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания.

Современное состояние и перспективы». - Москва, 2 - 4 июня 2004. - С. 10.

5. Чупринина Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В. Доклиническая оценка безопасности (безвредности) производственных штаммов и лекарственной формы пробиотиков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21 - 22 ноября 2006. - С. 105.

6. Ладыгина А. В. Изучение влияния бифидобактерий и кишечной палочки при совместном культивировании // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21 - 22 ноября 2008. - С. 69.

7. Чупринина Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В, Терешкина Н.В., Абрамцева М.В. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности пробиотиков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21 - 22 ноября 2008. - С. 124.

8. Ладыгина А.В., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В., Чупринина Р.П. Взаимодействие культур Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Еscherichia coli штамм М-17 в бификоле в опытах in vivo на модели «острой» и «хронической токсичности»

//Биопрепараты. – 2009. - № 1 - 2. – С. 24 - 28.

9. Ладыгина А.В. Особенности взаимодействия Bifidobacterium bifidum 1 и Еscherichia coli М-17 в бификоле при совместном их выращивании //Вестник Российского университета дружбы народов. – 2009. - № 3. – С. 10 - 14.

Ладыгина Александра Владимировна (Россия) Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов B. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле - биосовместимости, морфофизиологического состояния клеток, антагонистической активности в опытах in vitro и оценке безопасности препарата в дозах, превышающих терапевтические в опытах in vivo.

Полученные результаты свидетельствуют о сложном механизме взаимодействия культур, составляющих бификол: выявлено стимулирующее влияние кишечной палочки и продуктов ее метаболизма на рост бифидобактерий и угнетающее влияние бифидобактерий и продуктов их метаболизма на рост кишечной палочки. Электронномикроскопические исследования выявили более высокий уровень метаболической активности двух культур в бификоле по сравнению с монопрепаратами. При испытании в анаэробных условиях высокая антагонистическая активность бификола обусловлена бифидокомпонентом. Показана безопасность больших доз культур в смешанной популяции бификола. Разработаны требования к доклиническому изучению производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков.

Alexandra Ladygina (Russia) The interaction of the Bifidobacterium bifidum strain 1 and E. coli strain M-17 in the Bificol prepared during the simultaneous cultivation of the industrial strains The investigations are dedicated to the study of the mechanisms of the in vitro interaction of the cultures of B. bifidum strain 1 and E. coli strain M-17 in the experiences on biocompatibility, morpho-physiological state of the cells, antagonistic activity and the in vivo assessment of the safety of the preparation following the use of higher than therapeutic doses.

The results obtained demonstrate the presence of the complex mechanism of interaction of the strains composing the Bificol; the stimulating effect of the E. coli and it’s metabolism products on the growth of the Bifidobacteria was shown as well the inhibitory effect of the Bifidobacteria and their metabolism products on the growth of E. coli. The electron microscopic investigations revealed an increased level of the metabolic activity of both Bificol cultures in comparison with the monocultures. During the tests under the anaerobic conditions the increased antagonistic activity of the Bificol was shown to be caused by the bifidum component. The safety of the large doses of the strains in the mixed population of the Bificol was demonstrated. The conditions for the pre-clinical investigation of the industrial strains used in the probiotic production were developed.



 
Похожие работы:

«Свиряева Ирина Владимировна СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ КИСЛОРОДА И АНТИОКСИДАНТЫ В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ Специальность 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс...»

«Ситников Максим Николаевич ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАНТНЫХ ЛИНИЙ САХАРНОЙ КУКУРУЗЫ Специальности: 03.00.15 – Генетика 06.01.05 – Селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2006 Диссертационная работа выполнена на кафедре общей генетики, селекции и семеноводства биологического факультета КБГУ им Х.М. Бербекова. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор М.К. Керефова Официальные...»

«ЛАРИОНОВ Николай Сергеевич ЭКОЛОГО-АНАЛИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ КОМПОНЕНТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ В ЗОНЕ ВЛИЯНИЯ ОБЪЕКТОВ РАЗМЕЩЕНИЯ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ Специальность 03.00.16 - Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Архангельск – 2009 Работа выполнена на кафедре теоретической и прикладной химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Архангельский государственный технический...»

«Фомичева Наталья Викторовна РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОФАЗНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СРЕДСТВ Специальность 03.00.07 – Микробиология 03.00.23 – Биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь – 2007 2 Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственного использования мелиорированных земель (ВНИИМЗ) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Рабинович Галина Юрьевна...»

«Хоменков Василий Григорьевич Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков Специальность 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2005 1 Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Попов Владимир...»

«СТАВИНСКАЯ Ольга Александровна ВЛИЯНИЕ ГИСТАМИНА И СЕРОТОНИНА НА РЕГУЛЯЦИЮ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ 03.00.13 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Архангельск – 2008 Работа выполнена в отделе экологической иммунологии Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения Российской академии наук заслуженный деятель науки РФ, Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Лилия Константиновна...»

«Половинкина Светлана Викторовна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ Triticum vulgare L. НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА В УСЛОВИЯХ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2010 2 Работа выполнена на кафедре физиологии растений, микробиологии и агрохимии ФГОУ ВПО Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Научный руководитель : Илли Иван Экидиусович доктор биологических...»

«Лихачева Ольга Викторовна ЛИШАЙНИКИ УСАДЕБНЫХ ПАРКОВ ПСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Псков, 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре альгологии и микологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на кафедре ботаники и экологии растений...»

«МАНУХОВ Илья Владимирович СТРУКТУРА LUX-ОПЕРОНОВ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТИПА QUORUM SENSING У МОРСКИХ БАКТЕРИЙ. (03.02.07 – Генетика) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2011 2 Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП Государственного научноисследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) Научный консультант доктор биологических наук, профессор Завильгельский...»

«СКВОРЦОВ ТИМОФЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМА MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ПРИ РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИИ IN VIVO Специальность 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской...»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2014 Работа выполнена в лаборатории эволюционной зоологии и генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биологопочвенного института ДВО РАН Научный руководитель :...»

«ЛУНИНА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА БИОРАЗНООБРАЗИЕ АНОКСИГЕННЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛЬ В ПРОДУКЦИИ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА В МЕРОМИКТИЧЕСКИХ ВОДОЕМАХ Специальность 03.00.07 – микробиология автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. доктор биологических наук Научный руководитель : Н.В. Пименов доктор биологических наук...»

«Рубцова Анна Викторовна БРИОФЛОРА УДМУРТСКОЙ РЕСПУБЛИКИ Специальности 03.02.01 – ботаника 03.02.08 - экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии растений ФГБОУ ВПО Удмуртский государственный университет. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Баранова Ольга Германовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Баишева Эльвира Закирьяновна...»

«Черобаева Анна Сергеевна АММОНИЙОКИСЛЯЮЩИЕ БАКТЕРИИ И АРХЕИ В ПОЧВАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ. Специальность 03.02.03. – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, молекулярно-биологические исследования проводились в институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и Абердинском...»

«ЛОБОВ СЕМЕН ЛЕОНИДОВИЧ СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОВ ПЕНДРИНА (SLC26A4) И ПРЕСТИНА (SLC26A5) У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ГЛУХОТОЙ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук УФА – 2013 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный руководитель :...»

«Вокин Алексей Иннокентьевич ЭКОЛОГИЯ ХАРИУСОВЫХ РЫБ (THYMALLIDAE) ГОРНЫХ ВОДОЕМОВ БАЙКАЛЬСКОЙ РИФТОВОЙ ЗОНЫ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2008 3 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных и экологии и кафедре водных ресурсов ЮНЕСКО Иркутского государственного университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Самусёнок Виталий Петрович Официальные оппоненты : доктор...»

«Воробьев Алексей Викторович ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕТАНО- И МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА BEIJERINCKIACEAE Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель : доктор биологических наук С.Н. Дедыш Официальные оппоненты : доктор...»

«Артамонова Валентина Сергеевна ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ИСКУССТВЕННО ПОДДЕРЖИВАЕМЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (Salmo salar L.) 03.00.15 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 1 Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской Академии наук Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Глазко Валерий Иванович доктор...»

«Скобанев Алексей Васильевич Ксилотрофные базидиомицеты (Basidiomycota) Пензенской области и накопление тяжелых металлов и мышьяка их базидиомами Специальность 03.02.12. – Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии и экологии ФГОУ ВПО Пензенская ГСХА и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ...»

«ФЕДОТОВА Надежда Владимировна Разработка технологии получения из зернового сырья азотсодержащих компонентов для процессов ферментации Специальность 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва - 2009 Диссертационная работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре Экологическая и промышленная биотехнология. Научный руководитель : доктор технических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.