WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Парунов Леонид Александрович

РОЛЬ ИНГИБИТОРА ПУТИ ТКАНЕВОГО ФАКТОРА В

ПРОСТРАНСТВЕННОМ ФОРМИРОВАНИИ ФИБРИНОВОГО

СГУСТКА.

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2013 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии»

Российской академии наук.

Научный руководитель – доктор физико-математических наук, Пантелеев Михаил Александрович.

Официальные оппоненты – доктор биологических наук Спиридонова Вера Алексеевна (старший научный сотрудник, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.

Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова).

доктор медицинских наук, профессор, Мазуров Алексей Владимирович (руководитель лаборатории клеточной адгезии ФГБУ «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Минздрава России) Ведущее учреждение – Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» Российской академии наук

Защита состоится " "2013 г. в час минут.

на заседании диссертационного совета Д 002.252.01 в Федеральном научноклиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д.

Рогачёва по адресу ул.Саморы Машела, д.1, г. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН ЦТП ФХФ РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина,

Автореферат разослан "13" ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук И.С. Николаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Задачей системы гемостаза является предотвращение потери крови при нарушении целостности кровеносной системы. Плазменное звено свертывания – одна из важных составляющих этой системы, задачей которого является формирование геля в месте повреждения сосуда для предотвращения просачивания жидкости. В свертывании плазмы крови участвует более 30 белков, которые взаимодействуют друг с другом, образуя огромную сеть биохимических реакций. Такая сложная система требует соответствующей регуляции. Это приводит к тому, что даже небольшие нарушения в деликатном балансе про- и антикоагулянтных реакций могут приводить к тяжелым последствиям для организма: тромбозам и кровотечениям.





Одним из важных регуляторных белков в системе свертывания является ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). Он функционирует на стадии активации свертывания крови. На данный момент не известны случаи дефицита TFPI у людей. Кроме того, известно, что гомозиготные по отношению к дефициту TFPI мыши погибают внутриутробно, а люди со сниженным уровнем TFPI имеют повышенную склонность к тромбозам. Это говорит о критически важной роли TFPI в организме.

Относительно недавно была высказана новая идея, как улучшить свертывание в гемофилии: инактивировать ингибитор, регулирующий запуск реакций свертывания крови (TFPI). В последнее время появились работы, посвященные разработке ингибиторов к TFPI и их тестированию. В общем, данные подтверждают их положительный эффект на гемостаз в случаях гипокоагуляции. Однако эксперименты in vivo описывают слишком общие эффекты TFPI на свертывание и не способны четко выделить закономерности процессов в связи со многими неопределенностями экспериментальных условий. Все исследования in vitro проводились в гомогенных экспериментах, которые принимают во внимание активности белков свертывания, но не учитывают процессы диффузии. Однако in vivo свертывание активируется на поверхности с тканевым фактором (ТФ), а пространственный рост сгустка происходит во многом за счет диффузии активных факторов. Как было ранее показано, в таких условиях роль некоторых белков в гемостазе может поменяться. Таким образом, пока нет данных о роли TFPI в пространственной динамике свертывания. Не ясно подавляет ли TFPI пространственный рост сгустка и способно ли ингибирование TFPI его улучшить. В свете активного развития идеи ингибирования TFPI у больных гемофилиями полезно было бы знать последствия такой терапии. Для этого требуется понимать механизм, степень влияния TFPI и условия, при которых ингибиторы TFPI будут оказывать положительное действие на пространственный рост сгустка. На сегодняшний день этот аспект остается не изученным. Кроме того, не известно, как будут взаимодействовать лекарственные препараты ингибиторов TFPI и концентрата фактора VIII при одновременном назначении больному гемофилией А.

Для того чтобы разобраться в этих вопросах в данной работе использовали пространственно-неоднородную экспериментальную модель свертывания (тест Тромбодинамики). Ее ключевая особенность состоит в том, что свертывание плазмы крови запускается поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором (ТФ) и затем распространяется в объем плазмы. Наблюдение за ростом фибринового сгустка производили оптически по светорассеянию методом темного поля. Эта экспериментальная модель имитирует условия протекания процесса свертывания in vivo, так как отражает как биохимические реакции каскада свертывания, так и процессы диффузии. Для выбора условий эксперимента, предсказания поведения системы гемостаза и выяснения механизмов влияния TFPI на пространственный рост сгустка в данной работе было проведено математическое моделирование.





Цель работы: Исследовать роль TFPI в пространственном формировании фибринового сгустка в норме и при гемофилии А.

Задачи исследования:

1. Определить диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при которых пространственное свертывание в свободной от тромбоцитов плазме оказывается чувствительным к изменениям концентраций TFPI.

2. В плазме здоровых доноров и больных гемофилией А определить параметры пространственного роста сгустка, на которые оказывает влияние TFPI. Сравнить эффективность усиления внешнего пути свертывания при ингибировании TFPI в плазме нормальных доноров и больных гемофилией А.

3. Сравнить действие ингибитора TFPI и рекомбинантного фактора VIIa (rVIIa) на пространственное формирование сгустка в плазме больных гемофилией А.

4. В математической модели и экспериментах ex vivo исследовать лекарственное взаимодействие концентратов фактора VIII и ингибитора TFPI на пространственное свертывание.

Научная новизна. Впервые влияние TFPI исследовалось в пространственнонеоднородной системе in vitro. Определен диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при котором влияние TFPI на пространственное свертывание оказывается существенным. Определены ключевые параметры пространственного роста, на которые оказывает действие TFPI. Впервые показано, что инактивация TFPI способна улучшить пространственный рост сгустка, сокращая время задержки свертывания и увеличивая скорость его пространственного роста. Показано, что влияние TFPI ограничено тонким приактиваторным слоем в 100-200 мкм, или 10 минутами после начала роста сгустка. Влияние TFPI на пространственную скорость роста вдали от активатора незначительно. Показано, что усиление внешнего пути свертывания через ингибирование TFPI и добавление rVIIa оказывают качественно и количественно разные эффекты на пространственный рост фибринового сгустка. Стимуляция гемостаза фактором rVIIa приводит к дозозависимому ускорению пространственного роста сгустка на всех расстояниях от активатора, а при концентрациях выше 10 нМ к свертыванию во всем объеме экспериментальной кюветы, в то время как инактивация TFPI ускоряет начальную фазу роста сгустка только вблизи активатора, и это действие обладает эффектом насыщения. Впервые дано предсказание взаимодействия лекарственных препаратов, ингибирующих действие TFPI, и концентратов фактора VIII: увеличение концентрации фактора VIII в крови снижает относительный эффект антагониста TFPI на размер сгустка.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о роли и вкладе TFPI в пространственное свертывание плазмы крови могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых лекарственных препаратов для пациентов больных гемофилией А или другими коагулопатиями. Предсказания относительно взаимодействий препаратов, ингибирующих TFPI, и концентратов фактора VIII могут быть полезными при планировании терапии у больных гемофилией А.

Положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что пространственное свертывание плазмы крови чувствительно к изменениям концентрации TFPI в условиях активации системы гемостаза ТФ с низкой плотностью распределения (1- 2. Показано, что при активации свертывания ТФ с низкой плотностью TFPI влияет на пространственный рост сгустка, главным образом, сокращая время задержки свертывания и увеличивая начальную скорость роста сгустка. Область ускорения формирования сгустка ограничивается тонким слоем вблизи активатора.

пространственное свертывание в плазме больных гемофилией А.

4. Показано, что rVII и антагонисты TFPI оказывают качественно разные эффекты на свертывание плазмы крови Апробация работы состоялась 14 мая 2013г. на заседании семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Материалы диссертации докладывались на конференции "Математика, компьютер, образование" (Пущино, февраль 2011), 36th Federation of European Biochemical Societies Congress (Турин, Италия, июнь 2011), XXIIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Киото, Япония, июль 2011), Тромбоз, гемостаз и реология (Москва, Россия, 2011), 58th Аnnual meeting of the Scientific and Standartization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Ливерпуль, Великобритания, июнь 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья в рецензируемом журнале и 6 тезисов в сборниках трудов 5 конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания экспериментальных и теоретических результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов, приложения и библиографического указателя, включающего 264 источника. Текст диссертации иллюстрирован 11 таблицами и 36 рисунками. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории Молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф.-м.н. М.А. Пантелеев).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность выбранной темы диссертации, сформулированы цель работы, ее научная новизна и практическая ценность.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит общие сведения о системе гемостаза, подробное описание внешнего пути свертывания, механизмов работы TFPI, проблемы больных гемофилией А, а также основных подходов и идей терапии гемофилии А. Один из разделов посвящен описанию основных экспериментальных методов исследования свертывания крови и математических моделей гемостаза, учитывающих TFPI.

В главе 2 описываются материалы и методы исследования, в том числе:

используемые реактивы, протоколы выделения и подготовки плазмы крови, общее описание математической модели свертывания и использованных в работе экспериментальных моделей in vitro: измерения активированного тромбопластинового времени (АЧТВ) и метода Тромбодинамики (измерения пространственного роста сгустка).

Главы 3 и 4 содержат результаты работы и их обсуждение.

Краткое описание методики и параметров, характеризующих пространственный рост сгустка Поскольку метод Тромбодинамика является относительно новым, в начале главы описываются основные параметры, которые он измеряет, и их значение. Типичные фотографии, получаемые в эксперименте, показаны на рис. 1а. В результате обработки подобных изображений вычисляют профили светорассеяния, по которым определяют скорости роста сгустка. На рис. 1б и 1в представлены примеры таких профилей в нормальной плазме при активации свертывания иммобилизированным TФ (2 пмоль/м2) в отсутствии или присутствии 300 нМ аптамерного ингибитора TFPI ВАХ499 (Baxter, США).

Графики демонстрируют светорассеяние как функцию расстояния от поверхности активатора. Время между отдельными профилями составляет 2, минуты, общая длительность эксперимента - 90 минут. На рис. 1б и 1в виден первый результат: ингибирование TFPI приводит к увеличению размера сгустка и сигнала светорассеяния, что говорит об увеличении плотности сгустка. На основе профилей вычисляли зависимость размера сгустка от времени (рис. 1г).

На рис. 1г также указаны четыре параметра, выбранные для описания процесса свертывания в тесте Тромбодинамики: время задержки роста сгустка (далее лаг-тайм – время от начала эксперимента до начала роста сгустка); начальная скорость роста сгустка (наклон аппроксимирующей прямой, рассчитанный по методу наименьших квадратов (МНК) в течение первых 10 минут после начала роста сгустка - tg ); стационарная скорость роста сгустка (наклон аппроксимирующей прямой, рассчитанный по МНК, в течение последующих 30 минут - tg ); размер сгустка через 60 минут после начала эксперимента.

Рис. 1. Измерение скорости роста сгустка в пространстве. (а) - Фотографии растущего сгустка через 5 и 50 мин после активации свертывания; профили светорассеяния в нормальной плазме в отсутствии (б) или присутствии (в) 300 нМ BAX499 при активации свертывания поверхностью с ТФ (2 пмоль/м2) и зависимости размеров сгустка от времени (г) для экспериментов показанных на панелях (б) и (в). Описание основных измеряемых параметров см. в тексте.

Предварительная оценка влияния TFPI: компьютерное моделирование Влияние TFPI может меняться в зависимости от плотности ТФ на активаторе. Для оценки общих эффектов TFPI и экспериментальных условий, в которых влияние TFPI будет наиболее выраженным, было проведено предварительное компьютерное моделирование. Было рассмотрено четыре сценария роста сгустка: в нормальной плазме, в нормальной плазме без TFPI, при гемофилии А (без фVIII), и при гемофилии А в отсутствии TFPI. Для каждого случая были проведены расчеты с активацией свертывания ТФ с плотностью 5 и 100 пмоль/м2 (рис. 2а и б). При активации свертывания пмоль/м2 ТФ отсутствие TFPI приводило к сокращению лаг-тайма в норме и при гемофилии. При активации ТФ с плотностью 100 пмоль/м2 (рис. 2б) исключение TFPI из системы гемостаза не приводило к существенным изменениям в динамике свертывания.

Расчеты для случаев гемофилии А с и без TFPI в широком диапазоне изменения плотности ТФ (от 5 до 100 пмоль/м2) показали, что роль TFPI должна значительно возрастать со снижением плотности ТФ (рис. 2в). В плазме с дефицитом фVIII на низких плотностях ТФ полное исключение TFPI из модели вызывало сокращение лаг-тайма в 1,5-5 раз.

Рис. 2. Компьютерное моделирование пространственной динамики свертывания плазмы крови: эффект полного отсутствия TFPI на свертывание нормальной плазмы (НП) и плазмы с дефицитом фVIII (ГА). (а), (б) – Зависимости размеров сгустка от времени при активации свертывания ТФ с плотностями 5 и 100 пмоль/м2, соответственно. (в) - Зависимость лагтайма от плотности ТФ на активирующей поверхности в плазме с дефицитом фактора VIII с и без TFPI.

Зависимость эффекта ингибирования TFPI от плотности ТФ Для экспериментальной проверки результатов математического моделирования и определения диапазона условий, при которых TFPI оказывает влияние на пространственное свертывание, были выполнены следующие эксперименты: в нормальную плазму добавляли ингибитор TFPI или буфер, свертывание активировали ТФ в широком диапазоне плотностей (от 1 до 100 пмоль/м2). В качестве селективного ингибитора TFPI был взят аптамер BAX499. Это олигонуклеотид с 40 кДа остатком полиэтиленгликоля, пришитым на 5-конце. Предсказания модели подтвердились: влияние инактивации TFPI на пространственное свертывание зависит от плотности ТФ на активаторе. Оно было значительным при плотностях ТФ 1- пмоль/м2 (рис. 3). В этих условиях ингибирование TFPI приводило к сокращению лаг-тайма в 2,5 раза (рис. 3а) и увеличению начальной скорости в 1,8 раз (рис. 3б). Это, в итоге, приводило к увеличению размера сгустка в 2 раза (рис. 3г). Ингибитор TFPI оказывал слабое влияние на стационарную скорость (рис. 3в) во всем диапазоне плотностей ТФ. В условиях активации ТФ с плотностями 10 пмоль/м2 значительных изменений в динамике свертывания при ингибировании TFPI не наблюдалось.

Из данных предварительного моделирования и экспериментов можно заключить, что в пространственно-неоднородной системе значительная ингибирующая роль TFPI проявляется только на низких плотностях ТФ.

Рис. 3. Влияние ингибитора TFPI на параметры пространственного свертывания в нормальной плазме в зависимости от плотности ТФ на активаторе. (а) - Лаг-тайм; (б) начальная скорость роста сгустка; (в) - стационарная скорость роста сгустка; (г) - размер сгустка через 60 мин после активации свертывания. Представлены средние величины ± стандартное отклонение (n=2-4).

Для дальнейшего изучения роли TFPI в пространственном свертывании было выбрано две плотности ТФ: низкая (2 пмоль/м2) и средняя плотность, где эффект значительно слабее или отсутствует совсем (20 пмоль/м2).

Влияние BAX499 на свертывание в плазме с дефицитом TFPI Чтобы убедиться, что эффект BAX499 на гемостаз связан только с ингибированием TFPI и больше он ни на что не влияет, были проведены контрольные эксперименты на активаторах с низкой плотности ТФ (2 пмоль/м2) в лиофилизированной плазме с дефицитом TFPI. Добавление 10 нМ TFPI в дефицитную по TFPI плазму значительно увеличивало лаг-тайм (рис. 4), тогда как одновременное добавление 10 нМ TFPI и 300 нМ BAX499 восстанавливало лаг-тайм до базового уровня. При этом сам по себе BAX499 не оказывал влияния на свертывание исследуемой плазмы, что говорит о его высокой специфичности к TFPI и делает его хорошим инструментом в исследовании роли этого ингибитора.

Ингибирование TFPI в плазме здоровых доноров Далее было изучено влияние BAX499 на пространственное свертывание в нормальной плазме в широком диапазоне концентраций (от 0 до 1000 нМ). Для активации свертывания использовали только две плотности ТФ: 2,0±0,1 и 20,6±4,0 пмоль/м2 (указаны среднее ± стандартная ошибка, количество измерений равно 22 и 5, соответственно).

При активации свертывания ТФ с плотностью 2 пмоль/м2 увеличение концентрации BAX499 от 0 до 30 нМ приводило к сокращению лаг-тайма в раза и увеличению начальной скорости роста сгустка на 30% (рис. 5а и б).

Эффект достигал насыщения при 100-300 нМ BAX499. Стационарная скорость практически не менялась во всем диапазоне концентрации BAX499 (рис. 5в).

Таким образом, можно говорить, что концентрация ВАХ499 100-300 нМ является насыщающей, при которой практически весь TFPI оказывается инактивирован. BAX499 в насыщающей концентрации оказывал заметный эффект на размер сгустка через 60 минут после активации свертывания (рис. 5г). При этом концентрация BAX499, на которой достигалась половина от максимального эффекта, оказалась ниже 10 нМ.

Гистограммы средних значений всех параметров при нулевой и насыщающей концентрации (300 нМ) BAX499 показаны на рис. 6. Эффект от добавления BAX499 оказался статистически значимым для всех измеряемых параметров (р0,05).

Аналогично было исследовано влияние различных концентраций BAX499 на пространственное свертывание в нормальной плазме при активации средней плотностью ТФ 20 пмоль/м2 (дозозависимости не показаны). На рис. представлены средние значения параметров Тромбодинамики при 0 и 300 нМ BAX499. Хотя некоторые различия оказались статистически значимыми, эффект от ингибирования TFPI в этих условиях оказался очень слабым.

Ингибирование TFPI в плазме больных гемофилией А Исследование ингибирования TFPI проводили на свободной от тромбоцитов плазме шести пациентов (табл. 1). У всех исследуемых больных была диагностирована тяжелая форма гемофилии А (активность фVIII1%).

Все пациенты на момент исследования проходили терапию концентратами фактора VIII (25-30 МЕ/кг), но не принимали препарат в течение трех дней перед забором крови.

Табл. 1. Характеристика пациентов, участвовавших в экспериментах.

Воздействие BAX499 на плазму больных гемофилией А изучали в сравнении с широко распространенным в клинике при терапии гемофилии А препаратом рекомбинантного активного фактора VII (rVIIa, Novoseven) в эквивалентных концентрациях (от 0 до 1000 нМ). Типичные фотографии пространственного роста сгустка, активированного ТФ низкой плотности в нормальной плазме, плазме больных гемофилией А, а так же в той же плазме больного с добавлением BAX499 или rVIIa показаны на рис. 8а. На рис. 8б показана зависимость размера сгустка от времени для экспериментов, представленных на рис. 8а.

Рис. 8. Эффекты 300 нМ BAX499 и 30 нМ rVIIa на пространственное свертывание в норме и при гемофилии А. (а) - Типичные фотографии светорассеяния при росте сгустка, активированном 2 пмоль/м2 ТФ, сделанные через равные промежутки времени. Активатор с ТФ на снимках виден в качестве темной полосы слева. Белая полоска на первом кадре показывает масштаб 0,5 мм. (б) - Влияние BAX499 и rVIIa на рост сгустка в нормальной плазме и плазме больного гемофилией А.

Дозовые зависимости эффектов BAX499 и rVIIа в плазме больных гемофилией А снимали в диапазонах концентраций от 0 нМ до 1000 нМ. В экспериментах использовали свежую плазму трех пациентов из табл. (пациенты № 1-3). Активацию свертывания производили 2 пмоль/м2 ТФ. На рис. 9 представлены зависимости усредненных нормированных (на значение при нулевой концентрации препаратов) параметров пространственного свертывания от концентрации препаратов. При увеличении концентрации BAX499 от 0 до 10 нМ его эффект достигал своего насыщения (рис. 9а и б).

При этом лаг-тайм сокращался в два раза, а начальная скорость роста сгустка увеличивалась в 1,5-2 раза. При добавлении rVIIa лаг-тайм достигал своих минимальных значений уже при 3 нМ и снижался в 4 раза по отношению к нулевому значению (рис. 9а). BAX499 не оказывал заметного влияния на стационарную скорость роста сгустка во всем диапазоне исследованных концентраций (рис. 9в), в то время как rVIIa приводил к сильным дозозависимым изменениям этой скорости (30 нМ фактора rVIIa увеличивали стационарную скорость роста сгустка в 7 раз по сравнению с базовым значением). Итоговый размер сгустка в присутствии насыщающей концентрации BAX499 увеличивался на 75-100%. В противоположность BAX499, увеличение концентрации rVIIa способствовало дозозависимому увеличению размера сгустка в диапазоне концентраций 0-30 нМ (до 800%) без эффектов насыщения. Следует отметить, что для более высоких концентраций rVIIa размер сгустка через 60 мин после активации свертывания не мог быть определен в связи с быстрым свертыванием плазмы во всем объеме измерительной кюветы (равномерное увеличение яркости фона на рис. 8а).

Рис. 9. Эффекты добавления BAX499 или фактора rVIIa на пространственное свертывание плазмы больных гемофилией А при активации свертывания ТФ низкой плотности ( пмоль/м2).Представлены средние значения ± стандартные отклонения (n=3).

В плазме больных гемофилией А при активации свертывания 2 пмоль/м ТФ концентрация BAX499, вызывающая полумаксимальный эффект (EC 50), составляла 0.70±0.06 нМ.

Из приведенных данных (рис. 8 и рис. 9) можно заключить, что, несмотря на то, что BAX499 и rVIIa оба усиливают работу внешнего пути свертывания, характер их воздействия на систему качественно и количественно различен.

Ингибирование TFPI улучшает формирование сгустка, сокращая лаг-тайм и увеличивая начальную скорость роста и итоговый размер сгустка. Для эффектов BAX499 наблюдается эффект насыщения. В противоположность этому, rVIIa влияет на все параметры Тромбодинамики. Он дозозависимо увеличивает скорости роста сгустка и стимулирует сильное свертывание во всем объеме кюветы, независящее от ТФ.

Рис. 10 наглядно демонстрирует эффекты, достигаемые при ингибировании TFPI и добавлении 30 нМ rVIIa, в плазме больных гемофилией А. Для сравнения на рисунке приведены данные из экспериментов в нормальной плазме. В плазме больных гемофилией А ингибирование TFPI статистически значимо влияло на лаг-тайм, начальную скорость роста и размер сгустка через 60 мин после активации свертывания.

При этом лаг-тайм в плазме больных сократился почти в 2 раза по сравнению с исходной величиной в этой плазме в отсутствии ВАХ499, и сократился на 30% по сравнению с уровнем в норме (рис.10а). Начальная скорость роста сгустка увеличилась с 40 до 75% от нормы (рис. 10б), что в итоге привело к удвоению размера сгустка (с 30 до 60% значений нормы) (рис. 10г).

Рис. 10. Нормализация свертывания добавлением 300 нМ BAX499 или 30 нМ rVIIa в плазме больных гемофилией А. Плотность ТФ 2 пмоль/м2. Графики (а,б,в,г) показывают лаг-тайм, начальную и стационарную скорости роста сгустка, а также через 60 мин, соответственно. Указаны средние значения ± стандартные отклонения (n=3-6). Знаком (*) отмечены статистически значимые отличия (p0,05).

В плазме больных гемофилией А при активации свертывания ТФ средней плотности (20 пмоль/м2) (табл. 1, пациенты № 4-6), BAX499 (0-1000 нМ) не приводил к какому-либо значительному ускорению динамики роста сгустка, в то время как rVIIa продолжал сильно ускорять свертывание (не показано).

Чтобы наглядно сопоставить эффективность ингибирования TFPI ВАХ499 в нормальной плазме и плазме больных гемофилией А, были построены гистограммы отношений параметров свертывания, измеренных в присутствии 300 нМ BAX499, к базовому уровню 0 нМ (рис. 11). Из приведенных данных можно заключить, что влияние TFPI (и эффективность BAX499) в плазме с дефицитом фVIII выше, чем в нормальной плазме.

Совместное влияние TFPI и фVIII на пространственное свертывание плазмы крови. Так как в клинической практике ингибиторы TFPI и фактор VIII могут применяться одновременно, важно знать как эти лекарственные препараты будут взаимодействовать и какой эффект от их совместного применения можно ожидать. Чтобы это исследовать, было проведено компьютерное моделирование пространственного свертывания при различных комбинациях концентраций TFPI и фVIII. Уровень фактора VIII изменялся в диапазоне 0-0,7 нМ, а TFPI 0-2,5 нМ. Активация проводилась ТФ с плотностью 10 пмоль/м2, которая в модели рассматривается как низкая (см. рис. 2в). Модель показала (рис. 12), что при снижении концентрации TFPI будет сокращаться лаг-тайм и увеличиваться начальная скорость роста сгустка, в то время как изменение концентрации фVIII будет оказывать наибольшее влияние на пространственные скорости роста сгустка и слабее всего действовать на лагтайм.

Из данных на рис. 12г можно заключить, что TFPI оказывает влияние на размер сгустка во всем диапазоне исследованных концентраций фактора VIII.

При этом абсолютное увеличение размера сгустка, обусловленное удалением TFPI из системы, слабо зависит от уровня фактора VIII (более наглядно на рис. 13а), а относительный вклад значительно снижается при увеличении уровня фVIII (рис. 13б). Таким образом, модель предсказывает, что относительная эффективность антагонистов TFPI (в том числе и BAX499) будет падать при повышении концентрации фактора VIII в плазме крови.

Рис. 12. Результаты математического моделирования. формирования сгустка в зависимости от концентраций TFPI и фVIII в системе. Предсказание эффектов взаимодействия ингибиторов TFPI и концентратов фVIII. Представлены зависимости следующих параметров пространственного свертывания: лаг-тайм (а); начальная и стационарная скорость роста сгустка (б и в, соответственно) и размер сгустка на 60 мин (г).

Активация свертывания проводилась ТФ с плотностью 10 пмоль/м2, которая для модели считается низкой.

Рис. 13. Абсолютное (а) и относительное (б) увеличение размера сгустка при снижении концентрации TFPI (от начальных 2,5 нМ) в зависимости от концентрации фактора VIII.

Экспериментальное изучение одновременного влияния BAX499 и фактора VIII на пространственное свертывание было выполнено на плазме 9-ти пациентов, страдающих от тяжелой формы гемофилии А. После периода отмывки от фактора VIII (2-3 дня) плазма забиралась до введения концентрата фактора VIII (точка 0 часов), а также через 1 час и 24 часа после введения фактора. Таким образом, для каждого пациента было получено 3 пробы с различным уровнем фактора VIII. Данные по пациентам в разные моменты времени, а так же вводимые дозы фактора VIII представлены в табл. 2.

Пациент Табл. 2. Характеристика больных гемофилией А до и после введения фактора VIII.

Представлены активность фактора VIII и АЧТВ в плазмах.

Для каждого образца плазмы были также измерены in vitro дозовые зависимости эффектов BAX499 (0-600 нМ) при активации свертывания ТФ низкой плотности (2 пмоль/м2) (не показано). Аналогично предыдущим результатам ингибирование TFPI сокращало лаг-тайм и увеличивало размер сгустка с насыщением в области 30-100 нМ BAX499. Начальная и стационарная скорости роста сгустка слабо увеличивались в пределах всего диапазона исследованных концентраций BAX499.

Для дальнейшего анализа были отобраны только данные по пробам, содержащим нулевую и насыщающую концентрацию BAX499 (100 нМ). Для каждой выбранной концентрации данные были отсортированы по уровню фактора VIII и разделены по 3-м диапазонам: от 0 до 5%, от 5 до 30% и более 30% фактора VIII. Затем в каждом диапазоне данные были усреднены (рис. 14).

В присутствии менее чем 30% фактора VIII ингибирование TFPI сокращало лаг-тайм в 2 раза. В присутствии более чем 30% фVIII BAX499 не оказывал значительного влияния на лаг-тайм. Ингибирование TFPI слегка увеличивало скорости роста в 1,2-1,4 раза во всем диапазоне активности фVIII.

Для начальной скорости эффект был значимым в диапазоне 0-30% фактора VIII; для пространственной (стационарной) скорости роста сгустка достоверное различие было найдено только при уровне активности менее 5%. В полном соответствии с результатами компьютерного моделирования относительный эффект BAX499 на размер сгустка снижался с увеличением концентрации фактора VIII. В диапазонах активности фактора VIII 0-5, 5-30 и 30-100% BAX499 увеличивал размер сгустка на 180%, 70% и 40% соответственно. Таким образом, можно утверждать, что при увеличении активности фVIII снижается роль TFPI в формировании пространственного сгустка.

Усредненные данные на рис. 14 демонстрируют также влияние только фактора VIII на пространственное свертывание (черные точки). При увеличении уровня фактора VIII лаг-тайм изменялся меньше всего - на 25% (с 40 до 30 минут), начальная и стационарная скорости увеличивались в 2 раза, а размер сгустка в 3 раза. При этом основные улучшения показателей свертывания наблюдались в диапазоне активности фактора VIII от 0 до 30%.

Однако анализ пациентов по отдельности дал интересный результат: для одних больных относительный эффект BAX499 на размер сгустка снижался с увеличением активности фактора VIII (рис. 15а), а для двух из девяти пациентов (пациенты № 2 и 9) - не зависел от времени забора образца плазмы и был одинаковым при разных концентрациях фактора VIII (рис. 15б).

Для пациента № 2 отношение размера сгустка при 600 нМ BAX499 к базовому значению составляло 2,2 (увеличение на 120%) для всех временных точек, хотя активность фактора VIII в исследуемых образцах изменялась в широком диапазоне: 1.8% в точке 0 ч, 86% спустя 1 ч, 24% спустя 24 часа после введения фактора VIII. Для пациента № 9 не было возможности изучить случай очень низкой концентрации фактора VIII, поскольку в точке 0 ч она составляла 37%. Однако для данного пациента описанные выше отношения составляли одинаковые значения 1,25 для всех трех образцов (при активностях фактора VIII 37, 70 и 28%). Для пациента № 3 не было возможности определить относительный эффект BAX499, поскольку в контрольных экспериментах (при 0 нМ BAX499) размер сгустка равнялся нулю (запрет деления на ноль).

Чтобы объяснить, почему у большинства пациентов относительный эффект BAX499 снижается при увеличении уровня VIII, опять использовали математическую модель. Фактор VIII и BAX499 ускоряют свертывание через активацию фактора X, но по разным путям: фактор VIII ускоряет формирование Xa через внутреннюю теназу (комплекс фIXa:фVIIIa), а BAX499 способствует наработке фXa внешней теназой (комплексом фVIIa:ТФ). Модель была модифицирована таким образом, чтобы можно было рассчитывать фXа, созданный внешней и внутренней теназами по отдельности. Было смоделировано 4 случая: нормальная плазма (100% фVIII) с 0 и 2,5 нМ TFPI и случаи тяжелой гемофилии А (0% фVIII) с 0 и 2,5 нМ TFPI. Рассчитанные зависимости размеров сгустка от времени для перечисленных случаев показаны на рис. 16а. Профили концентраций фактора Ха во времени, наработанного отдельно внешней и внутренней теназой, показаны на рис. 16б.

Расчеты показали, что в нормальных условиях (рис. 16б, ряд 1) фXа, произведенный внешней теназой, находится возле активатора, быстро ингибируется и далеко не диффундирует. В отличие от этого фXa, произведенный внутренней теназой, наблюдался в глубине объема плазмы, что и обеспечивало нормальный рост сгустка. Надо отметить, что в приактиваторной зоне концентрация фХа, произведенного внешней теназой, медленно возрастает до 0,09 нМ к 45 минутам, а после снижается из-за присутствия TFPI. В случае нормальной плазмы без TFPI (рис. 16б, ряд 3), концентрации фXa, наработанного внешней теназой в приактиватоной области, существенно возрастают. Максимальная концентрация была в 6,5 раз больше около 0,6 нМ фХа и в дальнейшем не снижалась (из-за отсутствия TFPI).

Отсутствие ингибирования приводит к большей скорости наработки фXa в начальные моменты времени в приактиваторной области. Это в свою очередь приводит к ускоренной наработке тромбина, сокращению лаг-тайма и начальной фазы роста сгустка. Несмотря на то, что в отсутствии TFPI фактора Xa в приактиваторной области производится больше, он все так же не способен далеко диффундировать (быстрая инактивация плазменными ингибиторами).

Таким образом, в норме рост сгустка вдали от активатора был обусловлен производством Xa внутренней теназой. В гемофилии фаза распространения подавлена (рис. 16б, ряд 2). Удаление TFPI из системы приводит только к ускорению производства фXa внешней теназой в приактиваторной области, но из-за неспособности далеко диффундировать он ускоряет только начальную фазу роста сгустка.

Таким образом, объяснением независимости эффектов BAX499 и фVIII на пространственный рост сгустка является их функционирование в разных пространственно-разделенных фазах, слабо взаимодействующих друг с другом.

Вклад BAX499 и фVIII в размер сгустка оказывается практически аддитивным, что приводит к снижению относительной эффективности каждого из веществ при повышении концентрации другого.

Рис. 16. Механизм взаимодействия фVIII и ингибитора TFPI BAX499: вклады внешней и внутренней теназы в производство фXa. (а) - Зависимость размера сгустка от времени для четырех комбинаций концентраций факторов VIII и TFPI. (б) - Концентрация фактора Xa, произведенного отдельно внешней и внутренней теназами, во времени и пространстве для тех же экспериментов. Компьютерное моделирование проводили для активации свертывания ТФ с плотностью распределения 10 пмоль/м2.

1. В пространственно-неоднородной системе ингибирование TFPI существенно сокращает время задержки свертывания и увеличивает начальную скорость роста фибринового сгустка при активации гемостаза тканевым фактором с низкими плотностями распределения (1- пмоль/м2). Роль TFPI оказывается не существенной при активации свертывания ТФ со средними (10-20 пмоль/м2) и высокими (50- пмоль/м2) плотностями распределения, наблюдаемыми, например, в присутствии атеросклеротических бляшек или на фибробластах, соответственно.

In vitro ингибирование TFPI оказывает более выраженный ускоряющий эффект на пространственное свертывание в плазме с дефицитом фактора VIII, чем в плазме здоровых доноров.

3. Усиление гемостаза через внешний путь свертывания за счет инактивации TFPI или добавления фактора rVIIa имеет качественно разный характер. Ингибирование TFPI ускоряет только процессы инициации свертывания и начальную фазу роста сгустка, при этом эффект имеет насыщаемый характер. В отличие от этого, rVIIa в диапазоне концентраций 1-1000 нМ дозозависимо улучшает одновременно все параметры пространственного свертывания и способствует формированию сгустка во всем объеме плазмы крови, вне зависимости от ТФ.

4. Неспособность фактора Xa диффундировать далеко от активатора из-за его быстрого ингибирования приводит к ограничению влияния TFPI на свертывание в пространстве приактиваторной областью (слой 100- мкм). Это, в свою очередь, приводит к аддитивному эффекту на размер сгустка фактора VIII и ингибитора TFPI.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Parunov LA, Fadeeva OA, Balandina AN, Soshitova NP, Kopylov KG, Kumskova MA, Gilbert JC, Schaub RG, McGinness KE, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation.

J Thromb Haemost. 2011 Sep;9(9):1825-34.

L.A. Parunov, F.I. Ataullakhanov, M.A. Panteleev. Blood coagulation is not sensitive to the concentrations of the tissue factor pathway proteins: possible mechanisms and physiological implications. 36th Federation of European Biochemical Societies Congress. Torino, Italy, June 2011, (Conference proceedings, page 290,

Abstract

P15.26).

L.A. Parunov, N.P. Soshitova, O.A. Fadeeva, A.N. Balandina, K. G. Kopylov, M.A. Kumskova, K.E. McGinness, M.A. Panteleev, F.I. Ataullakhanov, R.G.

Schaub, J.C. Gilbert. Spatial blood coagulation in the presence of anti-tfpi aptamer bax499 in hemophilia a patients after FVIII infusion.58th annual meeting of the Scientific and Standartization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Liverpool, United Kingdom, June 2012 (Conference Proceedings, SSC12-1095).

Parunov LA, Fadeeva OA, Balandina AN, Soshitova NP, Kopylov KG, Kumskova MA, Gilbert JC, Schaub RG, McGinness KE, Ataullakhanov FI and Panteleev MA. Improvement of spatial brin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation.

XXIIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis.

Kyoto, Japan, July 2011. Conference proceedings, page 230, P-MO-546.

5. Баландина А.Н., Пантелеев М.А. Плющ О.П., Копылов К.Г., Кумскова М.А., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Тарандовский И.Д., Парунов Л.А., Атауллаханов Ф.И. Подбор замещающей терапии у пациентов с гемофилией А и Б: новый метод регистрации пространственного роста сгустка, Материалы Пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, Россия, Февраль 3-5, 2011, стр. 47.

Парунов Л.А., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. Почему свертывание крови малочувствительно к концентрациям белков пути тканевого фактора: возможные механизмы и физиологический смысл? Материалы Пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, Россия, Февраль 3-5, 2011, стр. 47.

Парунов Л.А., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. Почему свертывание крови малочувствительно к концентрациям белков пути тканевого фактора: возможные механизмы и физиологический смысл? Материалы восемнадцатой Международной конференции «Математика компьютер образование», Пущино, Россия, Январь 24-29, 2011, Выпуск 18, стр 110.



 
Похожие работы:

«ЯЗЫНИНА Елена Валентиновна РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕРБИЦИДОВ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2003 Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научные руководители: доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев, кандидат биологических наук А.В. Жердев. Официальные оппоненты : доктор химических наук Б.А. Кузнецов, кандидат химических...»

«ГЕТМАНЕЦ Ирина Анатольевна ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И БИОМОРФОЛОГИЯ РОДА SALIX L. ЮЖНОГО УРАЛА 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Омск – 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Челябинский государственный педагогический университет Заслуженный деятель науки РФ, Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Жукова Людмила Алексеевна доктор биологических наук, профессор Викторов Владимир...»

«ШАПОВАЛОВ Максим Игоревич ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОДНЫХ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ (COLEOPTERA: DYTISCIDAE, NOTERIDAE, GYRINIDAE, HALIPLIDAE, HYDROPHILIDAE) СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Адыгейский государственный университет Научный руководитель : доктор...»

«ДЫМОВ Алексей Александрович ИЗМЕНЕНИЕ ПОЧВ В ПРОЦЕССЕ ЕСТЕСТВЕННОГО ЛЕСОВОССТАНОВЛЕНИЯ (НА ПРИМЕРЕ ПОДЗОЛОВ СРЕДНЕЙ ТАЙГИ, СФОРМИРОВАННЫХ НА ДВУЧЛЕННЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ) 03.00.16 – экология 03.00.27 – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2007 Pабота выполнена в отделе почвоведения Института биологии Коми научного центра Уральского отделения Pоссийской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«РОЖДЕСТВЕНСКАЯ Анастасия Сергеевна ДВУХКОМПОНЕНТНАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ СИСТЕМА SAK188/SAK189 И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СВОЙСТВА STREPTOCOCCUS AGALACTIAE 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук...»

«Биломар Елена Евгеньевна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ ГЕРПЕТОБИОНТНЫХ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ ЛУГОВЫХ СООБЩЕСТВ ПРИХОПЕРЬЯ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж – 2009 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет (ГОУ ВПО ВГУ) Научный руководитель доктор биологических наук, проф. О.П. Негробов Официальные оппоненты Доктор...»

«ХОЖАЙ ЛЮДМИЛА ИВАНОВНА КЛЕТОЧНЫЕ И ТКАНЕВЫЕ РЕАКЦИИ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 03.00.13 - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2008 2 Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте эксперименталной медицины РАМН и в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург. НАУЧНЫЙ...»

«ПОЛЯКОВ АРТЕМ ИГОРЕВИЧ ВЛИЯНИЕ ВЫРУБКИ ЛЕСА НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГОРНЫХ ПОЧВ ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Южного федерального университета Научный руководитель : доктор географических наук, профессор Казеев Камиль Шагидуллович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Волынкин Антон Валерьевич Видовое разнообразие и экология совок (Insecta, Lepidoptera, Noctuidae (s. l.) Русского Алтая 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2012 2 Работа выполнена на кафедре экологии, биохимии и биотехнологии биологического факультета ФГБОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Соколова Галина Геннадьевна Официальные...»

«ПЕРВУШИНА Ксения Александровна МИКРООРГАНИЗМЫ ЦИКЛА УГЛЕРОДА В ОСАДОЧНЫХ ПОРОДАХ ВЕНДА МОСКОВСКОЙ СИНЕКЛИЗЫ Специальность 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ярославль – 2007 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и микробиологии в Ярославском государственном университете им. П.Г. Демидова. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Шеховцова Нина Валентиновна Официальные оппоненты : доктор...»

«БИРЮКОВ Сергей Александрович ПАРАМФИСТОМИДОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ХОЗЯЙСТВАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА НЕЧЕРНОЗЕМНОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 2014 Работа выполнена на факультете ветеринарной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина Научный руководитель : ЛЕМЕХОВ Полиэкт Анатольевич...»

«Минич Александр Сергеевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ ПОД ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ПЛЕНКАМИ Специальность 03.02.08 – Экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск – 2011 2 Работа выполнена на кафедрах ботаники и органической химии биологохимического факультета ФГБОУ ВПО Томский государственный педагогический университет Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«ГУСАРОВА ВЕРА СЕРГЕЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЗОТНОГО ФОНДА ЛЕСНЫХ ПОЧВ УЛЬЯНОВСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ульяновск – 2006 2 Работа выполнена на кафедре общей экологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Горбачев Владимир...»

«Сидоренко Марина Леонидовна ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПОЧВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ НА РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ 03.00.27 - Почвоведение 03.00.07 - Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток - 2003 2 Работа выполнена в лаборатории почвоведения и экологии почв Биологопочвенного института ДВО РАН и в лаборатории экологии патогенных бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Научные...»

«Зобова Анастасия Валерьевна ПРОБЛЕМЫ ОПТИМИЗАЦИИ СТРУКТУРЫ СВЕТОСОБИРАЮЩИХ СУПЕРАНТЕНН ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ЗЕЛЕНЫХ БАКТЕРИЙ 03.01.02-Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в отделе фотобиофизики НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители:...»

«ДУПЛИК Надежда Владленовна ПОВЕРХНОСТНЫЕ СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ SCPB И CSPA В КАЧЕСТВЕ КАНДИДАТОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (НИИЭМ СЗО...»

«Панчелюга Виктор Анатольевич О ЗАКОНОМЕРНОСТЯХ ПОДОБИЯ ФОРМЫ СПЕКТРОВ АМПЛИТУД ФЛУКТУАЦИЙ В ПРОЦЕССАХ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ Специальность 03.00.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Пущино - 2008 1 Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН. проф., доктор биологических наук Научный руководитель : Шноль Симон Эльевич доктор физ.-мат. наук, с. н. с., Официальные оппоненты : Намиот...»

«ОЛЕЙНИК Алла Геннадьевна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ГОЛЬЦОВ РОДА SALVELINUS: ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ФИЛОГЕОГРАФИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Владивосток – 2013 Работа выполнена в лаборатории генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук Официальные оппоненты : Картавцев Юрий Федорович,...»

«ПАВЛОВА ИРИНА ИВАНОВНА НАКОПЛЕНИЕ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ В АЛЛЮВИАЛЬНЫХ ПОЧВАХ ДЕЛЬТЫ Р. СЕЛЕНГИ 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Макушкин Эдуард Очирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Абашеева...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007 Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.