WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

АХОВА Анна Викторовна

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В АДАПТАЦИИ ESCHERICHIA COLI

К СУБЛЕТАЛЬНОМУ ДЕЙСТВИЮ АНТИБИОТИКОВ

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пермь - 2011

Работа выполнена в лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Ткаченко Александр Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна доктор медицинских наук, профессор Тимашева Ольга Анатольевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Защита состоится «»2011 г. в _ часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13.

Факс: (342) 280 Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: http://www.iegm.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «_» _2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространение антибиотикоустойчивых форм патогенных микроорганизмов в последнее время происходит в широких масштабах и с высокой скоростью. Знание механизмов, лежащих в основе антибиотикорезистентности, могло бы способствовать ее успешному преодолению и повышению эффективности антибактериальной терапии.

Комплексное воздействие неблагоприятных факторов внешней среды на микроорганизмы способствовало формированию у них универсальных механизмов защиты. Функциональные возможности данных систем адаптации могут быть направлены, среди прочего, на противодействие антибиотикам и являться основой формирования множественной антибиотикорезистентности.

Среди таких неспецифических адаптивных механизмов выделяют ограничение проникновения антибиотиков в клетку, а также их активное выведение из клетки посредством работы помп множественного лекарственного выброса (Сидоренко, Тишков, 2004). В последнее время появляются сообщения о вовлеченности активных форм кислорода (АФК) в антибактериальное действие разных групп антибиотиков (Albesa et al. 2004;





Kohanski et al., 2007). Поскольку действие антибиотиков сопровождается окислительным повреждением бактериальной клетки, функционирование систем антиоксидантной защиты могло бы вносить вклад в снижение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. В качестве неспецифических адаптогенов, принимающих участие в процессе приспособления разнообразных организмов (от бактерий до растений и млекопитающих) к неблагоприятным условиям среды, рассматривают полиамины (Rhee et al., 2007; Kusano et al., 2008). Биогенные полиамины (путресцин, спермидин, кадаверин) оказывают влияние на устойчивость клеток E. coli к окислительному, кислотному, тепловому и другим видам стресса (Ткаченко и др., 1997, 1998 и др.). Защитное действие полиаминов, основанное, в частности, на их антиоксидантных свойствах (На et al., 1998;

Ткаченко и др., 2001) и способности ингибировать проницаемость пориновых каналов клеточной стенки (delaVega, Delcour, 1996) послужило основанием для предположения о возможном участии этих соединений в адаптации бактериальных клеток к действию антибиотиков.

Цель работы - изучение роли полиаминов в формировании адаптивного ответа E.coli на действие антибиотиков, относящихся к различным классам.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать активность основных ферментов синтеза полиаминов в условиях сублетального действия -лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.

2. Оценить влияние полиаминов на чувствительность E. coli к антибиотикам разных классов.

3. Исследовать изменение энергетического статуса клеток E. coli в условиях сублетального действия антибиотиков.

4. Изучить роль полиаминов в защите клеток от окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков.

5. Оценить вклад различных полиаминов в регуляцию проницаемости пориновых каналов клеточной стенки E. coli для антибиотиков.

Научная новизна. Установлено, что в ответ на действие -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в клетках E. coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и увеличение их внутриклеточной концентрации. Показано, что накопление в клетках полиаминов (как за счет добавки извне, так и в результате эндогенного синтеза) сопровождается повышением их устойчивости к действию лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков. Впервые показана роль антиоксидантных свойств полиаминов в приспособлении клеток E. coli к сублетальному действию трех исследованных групп антибиотиков. Выявлена роль путресцина и спермидина в защите бактериальной ДНК от повреждений, вызванных действием антибиотиков, в условиях in vivo. На основании различий эффектов полиаминов получены данные об их функциональной специализации в формировании адаптивного ответа клетки на действие антибиотиков: путресцин и спермидин, преимущественно, оказывают антиоксидантное и ДНК-протекторное действие, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости клеточной стенки.





Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах неспецифического защитного ответа бактериальных клеток на действие разных классов антибиотиков и роли полиаминов в этом процессе.

Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета.

Выявленная зависимость устойчивости клеток к антибиотикам от содержания полиаминов в среде культивирования свидетельствует о необходимости стандартизации сред по данному параметру при определении антибиотикочувствительности микроорганизмов и является практически значимым результатом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Воздействие антибиотиков вызывает разобщение энергетического и конструктивного обменов и развитие окислительного стресса в клетках E. coli, что является сигналом для активации системы синтеза полиаминов.

2. Полиамины повышают устойчивость E. coli к действию -лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.

3. В условиях окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков, полиамины оказывают антиоксидантное и ДНКпротекторное действие.

4. Выявлена функциональная специализация полиаминов в условиях воздействия антибиотиков: кадаверин, преимущественно, играет роль регулятора проницаемости клеточной стенки, тогда как путресцин и спермидин защищают бактериальную клетку от окислительного повреждения.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на 11-, 12-, 14-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2007, 2008, 2010); 3-, 4-, 5-ой международных молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2008, 2009); международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008); 7-ой международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет» (Пермь, 2008); 3-ей международной конференции молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2008); 3rd Congress of European Microbiologists FEMS (Gothenburg, Sweden, 2009); 35th FEBS Congress «Molecules of Life» (Gothenburg, Sweden, 2010).

По теме диссертации опубликована 21 печатная работа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками. Список литературы включает 259 работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу», индекс приоритетного направления 5.19, 5.21, 5.24, номер госрегистрации 01.2.01.2. 3 06932. Работа дополнительно финансировалась в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», а также была поддержана грантами РФФИ (04-04-97501, 09-04-99006) и грантом Уральского отделения РАН для молодых ученых.

Список сокращений. АСБ–абсолютно сухая биомасса, АФК–активные формы кислорода, ЛДК–лизиндекарбоксилаза, ОДК–орнитиндекарбоксилаза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использованы культуры различных штаммов Escherichia coli (Табл. 1). Бактериальные клетки выращивали на LBLuria-Bertani)-бульоне при 37°С и частоте вращения 100 об/мин. Биомассу клеток оценивали по оптической плотности культуры (А600). Исследуемые антибиотики, принадлежащие к группам фторхинолонов (налидиксовая кислота, левофлоксацин, ципрофлоксацин, пефлоксацин), -лактамов (цефотаксим, цефепим, цефазолин) и аминогликозидов (нетилмицин, амикацин) вносили в бактериальную культуру при А600=0,3.

Бактериальные штаммы, использованные в работе Штаммы:

Плазмиды:

Корректное сравнение эффектов антибиотиков разных групп возможно лишь при равной силе их воздействия на бактериальные клетки. Исходя из этого, в качестве интегрального параметра, отражающего интенсивность антибактериального воздействия, было выбрано влияние антибиотиков на уровень накопления биомассы. В большей части экспериментов были использованы концентрации антибиотиков, приводящие к 50%-ному ингибированию накопления биомассы к пятому часу культивирования.

Данные сублетальные концентрации (представленные в таблице 2 и Рис. 2) подбирались для конкретного штамма и применялись во всех экспериментах, за исключением исследования повреждения ДНК, которое проводили в условиях 80-90%-ного ингибирования роста.

Для получения бактериальных клеток с разным содержанием эндогенных полиаминов культивирование проводили на минеральной синтетической среде М9 (Miller, 1992), содержащей глюкозу (0,4 %) и предшественники полиаминов – орнитин или лизин (10 г/л). Клетки выращивали при 37°С и частоте вращения 100 об/мин до момента максимального накопления полиаминов. После этого клетки отмывали, доводили до А600=0,1 в свежей среде М9 и подвергали действию антибиотиков.

Уровень экспрессии исследуемых генов оценивали по активности галактозидазы в клетках, несущих слияние промотора соответствующего гена со структурной частью lacZ. Активность -галактозидазы определяли в клетках, предварительно обработанных смесью додецилсульфата натрия и хлороформа, методом Миллера (Miller, 1972).

Активность ферментов синтеза полиаминов клеточного экстракта оценивали по накоплению конечного продукта – путресцина или кадаверина, синтезированного in vitro в орнитин- или лизиндекарбоксилазной реакции (Ткаченко, Чудинов, 1989). Анализ полиаминов проводили методом ТСХ и ВЭЖХ их дансил-производных (Ткаченко и др., 2006). Определение концентрации белка проводили методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Содержание адениловых нуклеотидов оценивали методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.

Антибиотикочувствительность оценивали по значениям минимальной подавляющей концентрации антибиотика методом серийных разведений в бульоне, а также диско-диффузионным методом в соответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04, 2004).

Детектирование гидроксильного радикала проводили флуоресцентным методом с использованием 3'-(p-гидроксифенил)флуоресцеина (Setsukinai et al., 2003).

Транспортную активность пориновых каналов внешней мембраны E. coli определяли в соответствии с модифицированным методом Циммермана и Росселета (Nikaido et al., 1983).

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса с применением набора GenElute Plasmid Miniprep Kit («Sigma»).

Статистическая обработка результатов исследований была проведена с использованием пакета программ Statistica for Windows 5.0 (StatSoft Inc., 1995). На статистических рисунках приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех) в формате среднее ± ошибка среднего. В таблицах данные представлены в формате среднее ± среднее квадратическое отклонение. Нестатистические рисунки демонстрируют один типичный эксперимент из серии. Оценка статистической значимости различий средних сравниваемых групп произведена с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние антибиотиков на активность системы синтеза полиаминов.

Из девяти исследованных антибиотиков только аминогликозиды не оказывали существенного влияния на содержание клеточных полиаминов (Табл. 2).

Влияние антибиотиков на содержание полиаминов в клетках E. coli RO Налидиксовая к-та (4 мкг/мл) 80,9±23,62 30,4±4,86 24,3±4, Нетилмицин (0,3 мкг/мл) 67,8±15,88 78,0±29,56 72,7±47, Жирным курсивом выделены значения, статистически значимо отличающиеся от контроля.

концентрации путресцина и кадаверина по сравнению с контролем уже ко второму часу после их внесения. Кроме того, большая часть фторхинолонов и -лактамов инициировала накопление спермидина.

обусловлено возрастанием активности ферментов их синтеза. Повышение цефотаксима и левофлоксацина, в отличие от нетилмицина (Рис. 1), согласуется с данными по накоплению полиаминов (Табл. 2).

Рис. 1. Изменение орнитиндекарбоксилазной активности в клетках E. coli RO91 в ответ на сублетальное действие антибиотиков. 1 – контроль, без добавок, 2 – цефотаксим, 3 – левофлоксацин, 4 – нетилмицин. * - отсутствие статистически значимого отличия от контроля.

Фермент синтеза кадаверина, лизиндекарбоксилаза (ЛДК), представлен у E. coli двумя изоформами – CadA и LdcC (Kikuchi et al., 1998). Данные изоферменты различаются оптимумами рН, что позволило оценить влияние антибиотиков на активность каждого из них (Рис. 2А). Все исследованные лизиндекарбоксилазную активность в клетках E. coli. Фторхинолоны и лактамы вызывали равнозначное изменение активности CadA. В то же время, степень влияния на активность LdcC зависела от класса антибиотиков:

фторхинолоны оказывали более выраженный стимулирующий эффект по сравнению с -лактамами.

Уровень индукции, ед Рис. 2. Влияние сублетальных концентраций цефотаксима (1), цефазолина (2), левофлоксацина (3), пефлоксацина (4), нетилмицина (5) и амикацина (6) на активность лизиндекарбоксилаз (А) и экспрессию генов soxS и rpoS (Б). Активность ЛДК и экспрессия гена rpoS определена в клетках E. coli RO91. Экспрессия гена soxS определена в клетках E. coli EH40, подвергнутых действию 0,07 мкг/мл цефотаксима, 2 мкг/мл цефазолина, 0, мкг/мл левофлоксацина, 0,042 мкг/мл пефлоксацина, 0,3 мкг/мл нетилмицина, 0,6 мкг/мл амикацина Уровень индукции - отношение активности фермента в клетках культуры, выращенной в присутствии антибиотика, к его активности в клетках контрольной культуры.

Различие в степени индукции двух изоформ ЛДК в ответ на добавку антибиотиков разных классов предполагает наличие различных механизмов регуляции их активности в данных условиях. Известно, что в регуляции экспрессии генов cadA и ldcC принимают участие транскрипционные регуляторы SoxS и RpoS, соответственно (Kikuchi et al., 1998; Kim et al., транскрипционные регуляторы, показало, что индукция гена soxS, в равной мере, происходит в ответ на добавку и -лактамных, и фторхинолоновых антибиотиков. Вместе с тем, повышение экспрессии rpoS наблюдалось, преимущественно, под действием фторхинолонов. Такая специфичность может быть связана со строением молекулы антибиотиков данного класса, которые по своей структуре близки к 4-хинолонам - сигнальным молекулам «системы ощущения кворума» (quorum sensing), обладающим способностью влиять на экспрессию rpoS у псевдомонад (Pesci et al., 1999; Diggle et al., 2003). Исследование лизиндекарбоксилазной активности в клетках транскрипционных регуляторов в индукции ЛДК в ответ на действие антибиотиков (Табл. 3). В клетках с делецией rpoS активность LdcC была значительно снижена, а отсутствие гена soxS сопровождалось снижением способности CadA индуцироваться в ответ на добавку антибиотиков.

Участие транскрипционных регуляторов SoxS и RpoS в регуляции активности лизиндекарбоксилаз в клетках E.coli в ответ на добавку * - статистически значимое отличие от контрольной культуры без добавки антибиотика, ^ - статистически значимое отличие от соответствующего показателя в клетках дикого типа.

Если для CadA индуцирующие условия были установлены ранее (Meng, Bennett, 1992; Kim et al., 2006), об LdcC было известно лишь то, что ее содержание в клетке возрастает при переходе к стационарной фазе роста (Kikuchi et al., 1998). Нами установлено, что индуцирующим фактором для LdcC является воздействие -лактамных и, в особенности, фторхинолоновых антибиотиков.

Возрастание внутриклеточного содержания полиаминов в ответ на дальнейшего изучения их роли в адаптации E. coli к действию антибиотиков.

антибиотиков. На основе анализа коллекции микроорганизмов лаборатории адаптации микроорганизмов ИЭГМ выбран штамм (E. coli ЕН40), базовое содержание кадаверина в клетках которого в отсутствие стрессорных воздействий было почти в 3 раза выше, чем в клетках E. coli RO91, на котором проведена основная часть экспериментов по данной работе. Определение антибиотикочувствительности этих штаммов диско-диффузионным методом показало, что клетки с повышенным содержанием кадаверина были менее чувствительны к действию фторхинолонов (Табл. 4).

Сравнение антибиотикочувствительности (диаметр зон подавления роста, мм) штаммов E. coli с разным уровнем эндогенного кадаверина * - статистически значимое отличие от контрольной культуры штамма E. coli RO91.

внутриклеточного пула эндогенных полиаминов подтвердила обнаруженную закономерность (Рис. 3Б). Для получения клеток с разным содержанием полиаминов их культивировали в присутствии предшественников полиаминов – лизина или орнитина. Наличие в среде культивирования орнитина приводило почти к трехкратному увеличению внутриклеточной концентрации путресцина, а добавка лизина сопровождалась накоплением эндогенного кадаверина, который не обнаруживался в клетках, выращенных в отсутствие аминокислот. На фоне накопления в клетках путресцина происходило снижение их чувствительности к представителям всех трех исследованных групп антибиотиков. Наличие кадаверина обеспечивало повышение устойчивости к действию фторхинолона и -лактама.

В последующих экспериментах проведена оценка влияния добавки экзогенных полиаминов на устойчивость E. coli к антибиотикам. Присутствие в среде культивирования путресцина повышало выживаемость клеток E. coli, подвергнутых действию -лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков (Рис. 3А).

Рис. 3. Влияние полиаминов на выживаемость клеток E. coli RO91, подвергнутых действию левофлоксацина (1), амикацина (2) и цефотаксима (3). При культивировании на LB-бульоне в присутствии 10 мМ путресцина (ПТ) выживаемость определена через 60 минут после добавки антибиотиков (Табл. 2). Выживаемость клеток, выращенных на среде М9 в присутствии 10 г/л орнитина (Орн) или лизина (Лиз), определена на второй час действия 0,030 мкг/мл левофлоксацина, 2 мкг/мл цефотаксима и 2, мкг/мл амикацина. * - отсутствие статистически значимых отличий от контроля.

двукратных серийных разведений показало, что в присутствии полиаминов в чувствительности клеток к трем исследованным группам антибиотиков (Табл.

5). Обращает на себя внимание то, что максимальный эффект оказывал спермидин, который в концентрации 5 мМ повышал минимальные подавляющие концентрации антибиотиков в 4 раза.

Изменение минимальных подавляющих концентраций антибиотиков (мкг/мл) для E. coli RO91 в присутствии полиаминов Концентрация полиаминов, мМ Левофлоксацин Цефотаксим Нетилмицин Таким образом, накопление в клетках полиаминов сопровождается повышением их устойчивости к действию -лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков. Положительный эффект варьирует в ряду различных полиаминов и зависит от класса антибиотика.

обменных процессов в результате сублетального действия антибиотиков.

В последнее время появляются данные о вкладе окислительного повреждения в бактерицидное действие антибиотиков разных классов (Kohanski et al., 2007). В наших экспериментах по изучению сублетального действия антибиотиков также наблюдалось развитие окислительного стресса, о чем свидетельствует увеличение внутриклеточной концентрации АФК и индукция регулона антиоксидантной защиты soxRS. Установлено, что фторхинолоны и -лактамы, в отличие от аминогликозидов, вызывают повышение экспрессии soxS (Рис. 2Б, 4Б). В то же время, увеличение количества гидроксильных радикалов регистрировалось в клетках, подвергнутых действию всех трех исследованных групп антибиотиков (Рис. 4А). Отсутствие индукции гена аминогликозидов может быть связано с особенностями антибактериального действия данных препаратов. Аминогликозиды, как известно, нарушают процесс трансляции, что ведет к остановке синтеза белков, в том числе и галактозидазы, по активности которой судят об интенсивности считывания гена soxS. По всей вероятности, отсутствие отклика полиаминсинтезирующей системы в случае действия аминогликозидов (Табл. 2) также связано с общим угнетением синтеза белка и не является специфическим ответом на действие данной группы антибиотиков.

Интенсивность флуоресценции, у.е.

Рис. 4. Влияние антибиотиков на уровень продукции гидроксильных радикалов (А) и экспрессии гена soxS (Б). Конт – культура без добавки антибиотиков. Уровень продукции гидроксильных радикалов определен в клетках E. coli RO91, экспрессии гена soxS - в клетках E. coli EH40.

антибиотиков - явление неспецифическое, поскольку не зависит от класса антибиотика, а только от силы антибактериального воздействия (Рис. 4). Повидимому, это является частным проявлением закономерности, описанной T.G. Aldsworth с соавторами: сублетальное воздействие любой природы сопровождается развитием в клетках эндогенного окислительного стресса, который является одной из причин их гибели. Предполагается, что накопление АФК в данных условиях происходит вследствие разобщения конструктивного и энергетического обменов (Aldsworth et al., 1999).

Индикатором такого разобщения является изменение внутриклеточной концентрации адениловых нуклеотидов, в частности АТФ (Atkinson et al., 1968). Нами показано, что действие трех исследованных групп антибиотиков сопровождается увеличением внутриклеточной концентрации общего пула адениловых нуклеотидов (Табл. 6). Сопоставление нескольких показателей во времени показало, что начало возрастания концентрации АТФ, указывающего на разобщении обменных процессов, совпадало с моментом замедления роста свидетельствующей о начале развития окислительного стресса (Рис. 5).

Влияние антибиотиков на содержание адениловых нуклеотидов в Антибиотики Концентрация адениловых нуклеотидов, нмоль/мг АСБ

АТФ АДФ

отличающиеся от контроля.

Рис. 5. Влияние левофлоксацина на изменение оптической плотности культуры E. coli, внутриклеточного пула АТФ и экспрессии гена soxS.

1 – контроль, без добавок, 2 – левофлоксацин. Стрелкой обозначен момент внесения антибиотика.

Известно, что важным положительным регулятором ОДК на уровне активности фермента является АТФ (Holtta et al., 1972; Ткаченко и др., 1989).

Поэтому накопление аденозинтрифосфата в клетке вследствие разобщения обменных процессов под действием антибиотиков можно рассматривать как сигнал к запуску синтеза путресцина и спермидина (Рис. 1).

Поскольку установлено, что ген cadA находится под контролем транскрипционного активатора SoxS (Kim et al., 2006), повышение активности лизиндекарбоксилазы CadA в условиях воздействия антибиотиков можно расценить как неспецифический ответ на эндогенный окислительный стресс.

Таким образом, действие антибиотиков сопровождается разобщением конструктивного и энергетического обменов, накоплением АТФ и развитием окислительного стресса, что является сигналом для активации ферментов синтеза полиаминов.

Антиоксидантные свойства полиаминов при адаптации E. coli к действию антибиотиков. Помимо антиоксидантных ферментов, существенную роль в защите от АФК играют низкомолекулярные антиоксиданты способные снижать количество свободных радикалов в клетке.

Известно, что такими свойствами обладают полиамины (Ha et al., 1998).

Поэтому повышение устойчивости клеток E. coli к действию антибиотиков в присутствии полиаминов может быть обусловлено их антиоксидантной активностью.

Добавка полиаминов снижала силу окислительного стресса, вызванного действием антибиотиков, что проявлялось в уменьшении продукции гидроксильных радикалов и экспрессии генов антиоксидантной защиты (soxS) (Рис. 6). Наиболее выраженное действие на экспрессию гена soxS оказывал спермидин, что соответствует способности разных полиаминов реагировать с супероксидными радикалами in vitro (Ткаченко, Федотова, 2007). Результаты флуоресцентного анализа показали, что наиболее эффективно продукцию гидроксильных радикалов снижала добавка путресцина и спермидина, тогда как кадаверин значимого влияния не оказывал.

Интенсивность флуоресценции, у.е.

Рис. 6. Влияние полиаминов на продукцию гидроксильных радикалов (А) и экспрессию гена soxS (Б), вызванных сублетальным действием антибиотиков. 1 – без полиаминов, 2 – 10 мМ путресцина, 3 – 10 мМ спермидина, 4 – 10 мМ кадаверина. Контроль – культура без добавок. * отсутствие статистически значимых отличий от культуры без полиаминов (1).

взаимодействовать с различными компонентами клетки. Известно, что одними из первых атаке АФК подвергаются нуклеиновые кислоты. Результатом такого взаимодействия может стать появление разрывов в молекуле ДНК (Nunoshiba et al., 1999). С целью изучения повреждающего воздействия антибиотиков на ДНК in vivo был проведен анализ плазмидной ДНК, выделенной из клеток, трансформированных pBR322, которые были подвергнуты действию антибиотиков. Повреждения регистрировались по появлению характерного «шмера» по ходу продвижения фракций ДНК в повреждающего воздействия.

антибактериального действия, вызывало фрагментацию бактериальной ДНК (Рис. 7). Как продемонстрировано на примере левофлоксацина, путресцин и спермидин в концентрации 10 мМ практически полностью снимали повреждающий эффект антибиотика, что выражалось в исчезновении «шмера» на электрофореграмме, тогда как кадаверин не оказывал выраженного действия на степень повреждения ДНК (Рис. 8).

ДНК-протекторное действие известного антиоксиданта – тиомочевины (Kohanski et al., 2007) подтверждает окислительную природу повреждений ДНК в условиях воздействия антибиотиков (Рис. 8).

Рис. 8. Влияние полиаминов и тиомочевины на степень повреждения ДНК E. coli RO91 pBR322 в присутствии 0,024 мкг/мл левофлоксацина.

Контроль (к) – без антибиотика, ПТ - 10 мМ путресцина, КД - 10 мМ кадаверина, СД – 10 мМ спермидина, Т10, Т50, Т100 – 10, 50, 100 мМ тиомочевины, соответственно.

Сравнение защитного действия тиомочевины и спермидина в отношении ДНК показало, что эффективность последнего была на порядок выше. Исходя из того, что полиамины и тиомочевина обладают примерно равными возможностями «гасить» свободные радикалы in vitro (Das, Misra, 2004), можно предположить, что защитное действие полиаминов основывается не только на их способности нейтрализовать АФК. ДНК-протекторное действие полиаминов может быть обусловлено также их способностью непосредственно взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами (Abraham, Pihl, 1981). В пользу последнего свидетельствует отсутствие ДНКпротекторного эффекта у кадаверина, который обладает меньшим сродством к ДНК (Liquori et al., 1967). Способность полиаминов взаимодействовать с ДНК обеспечивает высокие локальные концентрации полиаминов и дает им конкурентное преимущество в связывании по сравнению с ионами металлов с переменной валентностью – источниками электронов в реакции образования гидроксильных радикалов, а также вызывает компактизацию ДНК и экранирование сайтов для атаки АФК (Spotheim-Maurizot et al., 1995).

Таким образом, в условиях окислительного стресса, вызванного действием антибиотиков, полиамины, главным образом путресцин и спермидин, оказывают антиоксидантный эффект.

Роль полиаминов в ограничении проницаемости внешней мембраны E. coli для антибиотиков. Ограничение проницаемости внешней мембраны широко используется грамотрицательными микроорганизмами как средство адаптации ко многим видам стресса и связано с регуляцией количества и транспортной активности пориновых белков. Существенную роль в регуляции поринового транспорта играют полиамины, обладающие способностью взаимодействовать с пориновыми каналами и блокировать их просвет (delaVega, Delcour, 1996). На первых этапах воздействия антибиотиков мы наблюдали противоположно направленное изменение степени пориновой проницаемости и уровня накопления эндогенных путресцина и спермидина.

Однако корреляционной зависимости между данными параметрами установить не удалось. В то же время, изучение влияния индуцированного антибиотиками накопления эндогенных полиаминов на изменение пориновой проницаемости выявило достоверную отрицательную корреляцию (r=-0, при р0,03) между транспортной активностью пориновых каналов и внутриклеточной концентрацией кадаверина (Рис. 9). Это дает основание проницаемости пориновых каналов в ряду других полиаминов.

Коэфициент проницаемости, 10-5 см/с Рис. 9. Изменение проницаемости клеточной стенки (1), содержания кадаверина (2), путресцина (3) и спермидина (4), вызванное сублетальным действием пефлоксацина. Момент внесения антибиотика обозначен стрелкой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что полиамины принимают активное участие в адаптации E. coli к действию антибиотиков. Накопление полиаминов в бактериальных клетках (как за счет эндогенного синтеза, так и в результате добавки извне) обеспечивает повышение их устойчивости. Более детальное изучение роли полиаминов в приспособлении к действию антибиотиков показало их участие, по меньшей мере, в трех адаптивных механизмах: 1) ограничении проницаемости клеточной стенки для антибиотиков, 2) антиоксидантной защите клетки, 3) протекторном действии, направленном на сохранение целостности ДНК. В формировании адаптивного ответа E. coli на действие антибиотиков кажется обоснованной следующая цепь событий (Рис. 10). Воздействие антибиотика на клетки микроорганизмов вызывает разобщение энергетического и конструктивного обменов, что сопровождается накоплением АТФ и развитием эндогенного окислительного стресса. Это является сигналом для активации ферментов синтеза полиаминов и накопления полиаминов в проницаемости поринов внешней мембраны, тогда как путресцин и спермидин защищают бактериальную клетку от окислительного повреждения.

Рис. 10. Роль полиаминов в адаптивном ответе E. coli на действие антибиотиков. ПТ – путресцин, СД – спермидин, КД – кадаверин, АМ – аминогликозиды, -Л - -лактамы, ФХ – фторхинолоны. Серые стрелки – стимулирующее действие, черные стрелки – репрессирующее действие.

механизмов является то, что полиамины повышают устойчивость клеток E. coli к действию -лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что результатом сублетального воздействия фторхинолонов, -лактамов и аминогликозидов на клетки микроорганизмов является разобщение обменных процессов, приводящее к накоплению АТФ и развитию эндогенного окислительного стресса.

2. Сублетальное действие -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков индуцирует в клетках E. coli активность ферментов синтеза полиаминов, включая орнитиндекарбоксилазу, изоферменты лизиндекарбоксилазы CadA и LdcC, что приводит к внутриклеточному накоплению полиаминов.

3. Показано, что полиамины оказывают антиоксидантный эффект, снижая количество АФК в клетках E. coli в условиях развития эндогенного окислительного стресса, вызванного воздействием антибиотиков.

4. Адаптивные функции полиаминов в условиях воздействия антибиотиков специализированы: путресцин и спермидин, преимущественно, выступают в роли протекторов ДНК, защищая ее от разрывов, индуцированных АФК, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости поринов внешней мембраны, ограничивая транспорт антибиотиков в бактериальную клетку.

5. Установлено, что возрастание содержания полиаминов в клетках микроорганизмов приводит к повышению их устойчивости к воздействию антибиотиков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Ахова А.В. Путресцин как модулятор содержания S-субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при кислотном стрессе // Биохимия. – 2006. - T. 71, № 2. - С. 237-246.

2. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Ахова А.В. Адаптивные функции полиаминов E. coli при сублетальных воздействиях антибиотиков // Микробиология. – 2009. - T. 78, № 1. - С. 32-41.

3. Ахова А.В., Ткаченко А.Г. Лизиндекарбоксилазная активность как фактор резистентности Escherichia coli к фторхинолонам // Микробиология. – 2009. - Т. 78, № 5. - С. 636-640.

4. Ахова А.В., Шумков М.С., Ткаченко А.Г. Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости у Escherichia coli // Матер. Всероссийской научной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии». – С.-Петербург, 2007. – С. 153-155.

5. Ахова А.В., Шумков М.С. Лизиндекарбоксилазы как фактор адаптации Escherichia coli к действию сублетальных концентраций антибиотиков // Матер. 11-ой Пущинской международной конф. молодых учёных «Биология – наука ХХI века». – Пущино, 2007. – С. 230-231.

6. Ахова А.В., Ткаченко А.Г. Регуляция активности лизиндекарбоксилаз Escherichia coli в условиях действия сублетальных концентраций антибиотиков // Матер. региональной конф. молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». Пермь, 2007. - С. 40-41.

7. Ахова А.В. Роль окислительного стресса в формировании адаптивной реакции Escherichia coli на воздействие сублетальной концентрации различных классов антибиотиков // Матер. III Международной молодёжной конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». – Москва, 2007. – С. 4-6.

8. Ахова А.В. Механизмы неспецифической антибиотикоустойчивости у Escherichia coli: роль транскрипционных регуляторов SoxS и RpoS // Матер. 1-ой Всероссийской молодежной научной конф. «Молодежь и наука на Севере». – Сыктывкар, 2008. – С. 16-17.

9. Ахова А.В., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Федотова М.В., Ткаченко А.Г.

Роль глобального транскрипционного регулятора RpoS в адаптации Escherichia coli к действию антибиотиков // Матер. Международной научной конф. «Проблемы биоэкологии и пути их решения» – Саранск, 2008. – С. 299-300.

10. Ахова А.В., Федотова М.В., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г.

Антиоксидантная функция полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков // Матер. VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет». Пермь, 2008. - С. 30.

11. Ахова А.В., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Федотова М.В., Ткаченко А.Г.

Адаптивные функции RpoS и полиаминов в клетках Escherichia coli при сублетальном воздействии фторхинолоновых антибиотиков // Матер. VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет». - Пермь, 2008. - С. 31.

12. Ахова А.В., Федотова М.В., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г.

Роль системы защиты от окислительного стресса в формировании неспецифической антибиотикоустойчивости Escherichia coli // Матер. VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет». - Пермь, 2008. - С. 62.

13. Ахова А.В., Федотова М.В. Индукция генов антиоксидантной защиты как адаптивная реакция E.coli на действие антибиотиков // Матер. 12-ой Пущинской международной конф. молодых учёных «Биология – наука ХХI века». – Пущино, 2008. – С. 68-69.

14. Ахова А.В., Федотова М.В. Роль антиоксидантной системы защиты в формировании неспецифической антибиотикорезистентности E. coli // Матер. IV Молодёжной конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». – Москва, 2008. – С. 56-57.

15. Федотова М.В., Ахова А.В. Роль полиаминов в формировании неспецифической антибиотикоустойчивости E. coli // Матер. III Международной конференции молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы». - Харьков, 2008. – С. 236- 16. Ахова А.В., Зырянова Е.В. Разобщение энергетического и конструктивного обменов как причина развития окислительного стресса при сублетальном действии антибиотиков // Матер. II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009». – Пермь, 2009. – С. 189- 17. Shumkov M., Akhova A., Tkachenko A. Polyamine influence on E. coli antibiotic resistance under sublethal fluoroquinolone treatment [computer file] / // Abstracts of the 3rd Congress of European Microbiologists FEMS 2009. Gothenburg, Sweden, 2009. - 1 CD-ROM.

18. Ахова А.В., Шумков М.С., Зырянова Е.В. Роль полиаминов в защите бактериальной ДНК от повреждающего действия фторхинолонов // Матер.

V Молодежной конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии».

– Москва, 2009. - С. 9.

19. Ахова А.В., Шумков М.С., Зырянова Е.В. Антиоксидантные функции полиаминов в адаптации Escherichia coli к действию антибиотиков // Матер. 14-ой Пущинской международной конф. молодых учёных «Биология – наука ХХI века».– Пущино, 2010. – С. 5.

20. Ткаченко А.Г., Ахова А.В. Антистрессорные функции полиаминов в защите микроорганизмов от антибиотиков // Матер. VII Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». – Минск, Беларусь, 2010. – С. 164-166.

21. Akhova A., Shumkov M., Tkachenko A. Polyamine protective functions under antibiotic-mediated bacterial DNA damage // Abstracts of the 35th FEBS Congress: FEBS Journal. – 2010. - V. 277. – Supplement 1. – P. 93.

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В АДАПТАЦИИ ESCHERICHIA COLI

К СУБЛЕТАЛЬНОМУ ДЕЙСТВИЮ АНТИБИОТИКОВ

Подписано в печать 11.01.2011. Тираж 110 экз. Усл. печ. л. 1,0.

Формат 60х84/16. Набор компьютерный. Заказ № 2/ Отпечатано в типографии издательства «Книжный формат»



 
Похожие работы:

«КАЛМЫКОВА ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИЙ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ 03.00.15 генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования государственный Белгородский университет Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор...»

«АЛФЕРОВ СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДА В СИСТЕМЕ СУБСТРАТ – БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ GLUCONOBACTER OXYDANS – МЕДИАТОР – ЭЛЕКТРОД В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2010 Работа выполнена в лаборатории биосенсоров УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, г. Пущино и на кафедре химии...»

«БОРИСОВА Ирина Александровна РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ И МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ 03.00.06. - Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных, г. Владимир. - кандидат ветеринарных наук, Научный руководитель : старший научный сотрудник...»

«УДК 597.553.2:597-114.78 ПАВЛОВ Ефим Димитриевич Состояние половых желёз лососевых рыб в условиях интродукции Специальность 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва - 2011 г. Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО). Научный руководитель : профессор, доктор биологических наук Микодина Екатерина Викторовна Официальные доктор...»

«Хозяинова Екатерина Юрьевна ФЛОРА ТРАВЯНИСТЫХ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ УРБАНИЗИРОВАННОЙ СРЕДЫ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА ТЮМЕНИ) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Тюмень – 2004 Работа выполнена на кафедре ботаники и биотехнологии растений Тюменского государственного университета Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Боме Нина Анатольевна Официальные оппоненты : доктор географических наук,...»

«МАРКОВ Денис Игоревич Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации Специальность 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Д....»

«Цаплина Людмила Александровна КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЦИКЛООКСИГЕНАЗНОЙ И ПЕРОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИЙ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ПРОСТАГЛАНДИН-Н-СИНТАЗОЙ Специальность 03.00.02. - Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва – 2007 Работа выполнена на биологическом факультете и факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор...»

«Малолеткина Ольга Игоревна ВЛИЯНИЕ 2-ГИДРОКСИПРОПИЛЦИКЛОДЕКСТРИНА НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук К.А. Маркосян Официальные...»

«АРЛЯПОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА И АНАЛИЗА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СМЕСЕЙ 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2009 Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. кандидат химических наук, доцент Научный руководитель : Алферов Валерий Анатольевич доктор...»

«Дергунов Александр Дмитриевич СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НОРМО- И ГИПЕРТРИГЛИЦЕРИДЕМИИ 03.00.04 – биохимия и 03.00.02- биофизика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Государственный научноисследовательский центр профилактической медицины Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи...»

«Орлова Елена Сергеевна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ 03.00.06 Вирусология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Владимир - 2007 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных (г.Владимир) Научный руководитель - кандидат биологических наук ЩЕРБАКОВ Алексей Владимирович Официальные оппоненты : - РЫБАКОВ Сергей Сергеевич доктор биологических наук,...»

«БЕРНИКОВ Кирилл Александрович Фауна и экология рукокрылых (Chiroptera) равнинной тайги Западной Сибири (на примере Ханты-Мансийского автономного округа) Специальность 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии ГОУ ВПО Сургутский государственный университет ХМАО – Югры. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Стариков Владимир Павлович...»

«Минич Александр Сергеевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ ПОД ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ПЛЕНКАМИ Специальность 03.02.08 – Экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск – 2011 2 Работа выполнена на кафедрах ботаники и органической химии биологохимического факультета ФГБОУ ВПО Томский государственный педагогический университет Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«Белкин Денис Леонидович Семейство Caryophyllaceae Juss. Алтайской горной страны 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2010 Работа выполнена в Южно-Сибирском ботаническом саду ГОУ ВПО Алтайский государственный университет, г. Барнаул Научный руководитель : докторбиологических наук, профессор Шмаков Александр Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Силантьева Марина Михайловна...»

«ФАТЫХОВА ДИАНА ГАЗИНУРОВНА АНТИМУТАГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ БИОКОМПЛЕКСОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2012 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет. Научный руководитель : Доктор...»

«Ситников Максим Николаевич ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАНТНЫХ ЛИНИЙ САХАРНОЙ КУКУРУЗЫ Специальности: 03.00.15 – Генетика 06.01.05 – Селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2006 Диссертационная работа выполнена на кафедре общей генетики, селекции и семеноводства биологического факультета КБГУ им Х.М. Бербекова. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор М.К. Керефова Официальные...»

«Калмыкова Ольга Геннадьевна ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ БУРТИНСКОЙ СТЕПИ (ГОСЗАПОВЕДНИК ОРЕНБУРГСКИЙ) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2008 Работа выполнена в лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна Официальные...»

«Федосова Светлана Игоревна ЭКОЛОГО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВИЗУАЛЬНОЙ СРЕДЫ КРУПНОГО ГОРОДА Специальность: 03.00.16 - Экология 18.00.04 - Градостроительство, планировка сельских населенных пунктов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2008 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Брянская государственная инженернотехнологическая академия Научный...»

«ГУЛГЕНОВ Сергей Жаргалович ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЕЛЕНИЯ СООБЩЕСТВА ПТИЦ СЕЛЬСКИХ НАСЕЛЁННЫХ ПУНКТОВ БАЙКАЛЬСКОЙ СИБИРИ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2007 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Доржиев Цыдыпжап Заятуевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Елаев Эрдени Николаевич...»

«МОРОЗОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ ХИТОЗАНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ КУЛЬТУРЫ специальность 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул 2011 Работа выполнена на кафедре общей химии и экспертизы товаров Бийского технологического института (филиал) ГОУ ВПО Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова Научный руководитель – доктор химических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.