WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ШКОПОРОВ

Андрей Николаевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

МОДИФИКАЦИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ

СОЗДАНИЯ ПРЕПАРАТОВ-ПРОБИОТИКОВ НОВОГО

ПОКОЛЕНИЯ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2008

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный медицинский университет»

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ефимов Борис Алексеевич

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Грубер Ирина Мироновна доктор медицинских наук, профессор Царев Виктор Николаевич

Ведущая организация Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва

Защита состоится «_»2008 г. в _ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8)

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6)

Автореферат разослан «_»2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Бифидобактерии – род грамположительных неспорообразующих анаэробных бактерий, являющихся облигатными обитателями желудочно-кишечного тракта человека и многих видов животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. В подавляющем большинстве случаев бифидобактерии находятся в тесных мутуалистических отношениях с организмом хозяина, а разрыв такой симбиотической связи грозит нарушением нормальной физиологии интестинального тракта последнего. Длительная симбиотическая коэволюция бифидобактерий и человека привела к формированию у данного рода микроорганизмов большого количества взаимовыгодных адаптаций, благотворно влияющих на жизнедеятельность макроорганизма хозяина. Среди таких свойств наиболее значимы:





активная и пассивная колонизационная резистентность, направленная на предотвращение заселения желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микробами, участие в катаболических и биосинтетических процессах в кишечной трубке и иммуномодулирующее влияние [M.C. Collado и другие, 2005; A. Pompei и другие, 2007; H.

Tanaka и другие, 2000; F. Backhed и M. Hornef, 2003].

Позитивные пробиотические свойства бифидобактерий с успехом использует как медицина, так и пищевая промышленность. В нашей стране был создан целый ряд биотерапевтических препаратов, имеющих в своем составе живые культуры бифидобактерий и широко применяющихся для лечения широкого круга гастроэнтерологических заболеваний [Г.И. Гончарова, 1982; Б.А. Ефимов и В.М. Коршунов, 1992; С.Н. Барзашка-Попова, 1990].

Бифидобактерии находят все большую популярность как компоненты разнообразных кисломолочных продуктов и продуктов функционального питания.

Благодаря своему общепризнанному благотворному влиянию на физиологию как интестинального тракта, так и всего организма человека в целом бифидобактерии стали объектом многочисленных исследований. Однако до недавнего времени существовали лишь отрывочные сведения о молекулярной биологии и генетике данного рода бактерии.

Значительный прогресс в изучении тонких молекулярных свойств бифидобактерий наметился на рубеже XX и XXI вв. Последние годы ознаменовались завершением секвенирования геномов нескольких видов бифидобактерий [M.A. Schell и другие, 2002] и публикацией значительного числа работ, посвященных вопросам их молекулярной физиологии и молекулярных механизмов взаимодействия с организмом хозяина [M. Ventura и другие. 2005; A. Margolles и другие, 2006; J. De Dea Lindner и другие, 2007].

Отдельной важной темой является изучение плазмид и мобильных генетических элементов бифидобактерий [Б.А. Ефимов и другие, 2008]. Включение в инструментарий исследователя подобных генетических элементов позволяет от описательной генетики перейти к экспериментальной, базирующейся на методологии генетической инженерии.

Вместе с тем, расширение наших знаний о генетике этого рода прокариот и разработка методов генетического манипулирования ими позволит уже в ближайшем будущем направленно создавать пробиотические и биотерапевтические штаммы с принципиально новыми свойствами. В частности, это сделает возможным получение рекомбинантных штаммов-продуцентов белковых, нуклеиновых или иных молекул с терапевтическими свойствами.

Цель настоящего исследования Разработать оригинальный инструментарий и методологию, необходимые для осуществления простой и эффективной генетической модификации бифидобактерий и последующей продукции в них гетерологичных белков с терапевтическими свойствами (цитокинов, ферментов, вакцинных антигенов и пр.).





Задачи исследования:

1. Провести поиск плазмидных ДНК в коллекции штаммов бифидобактерий, выделенных от здоровых детей раннего возраста;

2. Определить полные нуклеотидные последовательности избранных плазмид и проанализировать их методами биоинформатики;

3. На основе описанных плазмид создать челночные клонирующие вектора Bifidobacterium-E. coli, бифидобактерий;

4. Разработать оптимальный протокол генетической трансформации перспективного хозяйского штамма бифидобактерий;

5. Подобрать необходимые генетические элементы (промоторные, терминаторные и лидерные последовательности), обеспечивающие оптимальную транскрипцию и трансляцию гетерологичного гена, а также эффективную секрецию рекомбинантных белков.

Научная новизна В ходе настоящего исследования впервые было проведено изучение плазмидных профилей в индигенных штаммах бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста.

Обнаружена существенная частота встречаемости плазмидных ДНК в бифидобактериях различных видов и выявлено доминирование ограниченного числа консервативных семейств таких плазмид в популяциях бифидобактерий. Определены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности двух новых плазмид, в числе которых одна – первая полностью просеквенированная плазмида из бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, вторая – плазмида с нетипичным для бифидобактерий генным составом, напоминающая некоторые конъюгативные плазмиды бактерий рода Streptomyces.

Продемонстрировано присутствие на описанных плазмидах генов, вовлеченных в процесс конъюгативного переноса данных молекул ДНК. Отдельный интерес представляет присутствие на одной из плазмид набора генов tra необходимых и достаточных, по всей видимости, для осуществления конъюгативного переноса данной плазмиды по уникальному стрептомицет-подобному механизму.

На основе изученных плазмид создана серия челночных клонирующих векторов E. coli – Bifidobacterium, способных к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток и несущих соответствующие селективные маркерные гены для селекции в них.

Продемонстрирована способность большей части полученных векторов к трансформации бифидобактерий вида Bifidobacterium breve с относительно высокой эффективностью.

Сконструированы экспрессирующие челночные вектора, несущие необходимые регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гетерологичных генов в бифидобактериях. Функциональность полученных плазмидных векторов была подтверждена при помощи трех модельных генов – FGF2 человека, IL10 человека и amyB Bifidobacterium adolescentis. Кроме того, в случае с генами FGF2 и IL10, впервые была осуществлена гетерологичная экспрессия человеческого гена в бактериях рода Bifidobacterium.

Практическая значимость работы Полученные нами данные о высокой частоте встречаемости плазмидных ДНК в клетках бифидобактерий, индигенных для интестинального тракта здоровых детей, а также данные об отсутствии каких-либо потенциально опасных маркеров на данных плазмидах могут внести существенные коррективы в распространенное мнение о недопустимости включения плазмидных штаммов бифидобактерий в состав препаратов-пробиотиков.

Разработанные в ходе настоящего исследования челночные клонирующие вектора E.

coli – Bifidobacterium, а также методы их доставки в клетки Bifidobacterium breve имеют высокую практическую значимость. Данный инструментарий может быть использован для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках бифидобактерий как в рамках фундаментальных исследований, направленных на изучение биологии бифидобактерий, так и в рамках прикладных работ, имеющих целью получение пробиотических или биотерапевтических штаммов бифидобактерий с новыми полезными свойствами.

Полученные нами штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2) и интерлейкин-10 человека (ИЛ-10), имеют как демонстрационное, так и самостоятельное прикладное значение. С учетом последних данных о возможности использования белков FGF-2 и ИЛ-10 для лечения различных тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, указанные штаммыпродуценты могут стать прообразами принципиально новых биотерапевтических штаммов, полученных с использованием методов генетической инженерии.

Разработанные нами векторные системы, в комбинации с клонированным геном амилазы amyB Bifidobacterium adolescentis, могут лечь в основу нового поколения безопасных клонирующих векторов для бифидобактерий, соответствующих стандарту «food-grade», полностью лишенных потенциально-опасных фрагментов ДНК и пригодных для получения рекомбинантных пробиотических и биотерапевтических штаммов бифидобактерий.

Разработанные в ходе данного исследования векторные системы уже в настоящее время используются для фундаментальных и прикладных исследований бактерий рода Bifidobacterium как в нашей стране, так и в ряде лабораторий США и Европы.

Апробация работы Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 12 марта 2008 года, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова в 2006 и 2007 годах, а также на международном симпозиуме «Propionibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications» (Wadahl, 2007).

Положения выносимые на защиту:

1. Штаммы бифидобактерий, колонизируюшие кишечник здоровых детей, часто являются носителями небольших кольцевых криптических плазмидных ДНК, которые реплицируются по механизму «катящегося кольца», несут ряд генов, кодирующих консервативные белки с неизвестными функциями, а также обладают потенциальной способностью к конъюгативному переносу;

2. Криптические плазмиды, выделенные из кишечных штаммов бифидобактерий, могут быть использованы для создания челночных клонирующих векторов Bifidobacterium — E.coli, обеспечивающих возможность проведения генетической трансформации бифидобактерий;

3. Полученные в ходе данного исследования челночные клонирующие вектора могут быть использованы для доставки в клетки бифидобактерий генетических конструкций, обеспечивающих продукцию в них гетерологичных белков с полезными свойствами, в том числе цитокинов (FGF-2, ИЛ-10) и ферментов (-амилаза);

4. Генетически-трансформированные штаммы бифидобактерий, полученные с использованием описанных челночных векторов, могут стать основой для создания принципиально нового поколения пробиотических и биотерапевтических агентов.

Публикации По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 8 статей в рецензируемых научных журналах (5 в отечественных и 3 в зарубежных).

Объем и структура диссертации Работа изложена на русском языке, на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована рисунками и 4 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований Материалами исследования были штаммы бифидобактерий (всего 85) выделенные из кишечника здоровых детей, типовые штаммы бифидобактерий различных видов, полученные из коллекций ATCC, Nestle Research Centre и коллекции штаммов микроорганизмов университета Корк (Ирландия). Кроме того, объектами исследования являлись плазмидные и геномные ДНК, выделенные из указанных штаммов, их дериваты, полученные методами генетической инженерии, а также штаммы бифидобактерий, трансформированные различными генетическими конструкциями.

Видовую идентификацию штаммов бифидобактерий проводили путем секвенирования ПЦР-амплифицированных фрагментов генов 16S-рРНК с применением универсальных домен-специфических бактериальных праймеров. Выделение плазмидных ДНК из штаммов бифидобактерий проводили с использованием видоизмененного щелочного метода Бирнбойма и Доли [H.C. Birnboim и J. Doly, 1979] с введением дополнительной обработки клеток лизоцимом и мутанолизином. Плазмиды подвергались рестрикционному анализу и клонировались по обнаруженным уникальным рестрикционным сайтам в вектор pBluescriptIIKS- с использованием «сине-белого теста» и штамма E. coli XL-1Blue.

Определение полной нуклеотидной последовательности плазмид проводили используя подход «праймер-опосредованной прогулки» на секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Компьютерный анализ определенных последовательностей проводили в пакете приложений Vector NTI 9.0 (Informax), а также в сетевых приложениях PFAM, MFOLD, TMPred, SignalP, TMHMM и др. Аннотированные последовательности плазмидных ДНК депонировали в базе данных GenBank под номерами DQ305402 и NC_010930.

Конструирование челночных клонирующих векторов Bifidobacterium – E.coli и генетических конструкций для экспрессии генов FGF2, IL10 и amyB в Bifidobacterium breve проводили в соответствии с общепринятыми методиками [J. Sambrook и D.W. Russel, 2001].

Гены ery194 и FGF2 были выделены как рестриктные фрагменты плазмид pUC19e и pFGFB.

Гены cat194, IL10 и amyB были амплифицированы при помощи ПЦР на матрице плазмиды соответственно. Промоторы генов hup и gap, а также терминатор гена hup были ПЦРамплифицированы на матрице геномной ДНК B. longum VMKB44. Фрагмент гена sec2, кодирующий секреторный сигнальный пептид, был ПЦР-амплифицирован из геномной ДНК B. breve UCC2003. Для клонирования ПЦР-продуктов с «липкими концами» к 5'-концам праймеров добавляли последовательности соответствующих рестрикционных сайтов.

Верификацию полученных рекомбинантных плазмид проводили с использование методов ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования ДНК-вставок.

Трансформацию штаммов бифидобактерий проводили посредством электропорации после отмывки осадка культуры, находящейся в среднелогарифмической фазе роста в растворе следующего состава: 0,5 М маннит, 1 мМ цитрат аммония, pH 6,0. Электропорацию клеток проводили в приборе GenePulser (BioRad) со следующими настройками: 2,4 кВ, мкФ, 200 Ом, межэлектродное расстояние 2 мм.

Изучение продукции рекомбинантных белков FGF-2 и ИЛ-10 в трансформированных штаммах бифидобактерий проводили путем иммуноблот-анализа концентрированных супернатантов ночных культур. Иммунодетекцию проводили с использованием козьих поликлональных антител к белкам FGF-2 (кат. № SC-1390, SantaCrus) и ИЛ-10 (кат. № ab10775, Abcam) человека и вторичных кроличьих антииммуноглобулиновых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (кат. № SC-2768, SantaCrus). Визуализацию проводили хемилюминесцентным методом с использованием в качестве субстратов люминола, п-кумаровой кислоты и пероксида водорода. Экспозицию выполняли на рентгеновсокой пленке Kodak Retina. Продукцию рекомбинантной -амилазы изучали при помощи йодного теста на культурах бифидобактерий, выращенных на плотной питательной среде с крахмалом. Изучение экспрессии мРНК FGF2 в трансформированных культурах бифидобактерий проводили с использованием методики ОТ-ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим красителем EvaGreen на приборе АНК-32 (Синтол).

Результаты собственных исследований и их обсуждение Поиск плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий Для поиска плазмид в бифидобактериях была использована коллекция из 85 штаммов бифидобактерий, выделенных ранее от здоровых детей в возрасте от 6 до 18 месяцев на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. В ходе исследования среди данных штаммов было обнаружено 15 штаммов-носителей плазмид (17,6%) с молекулярной массой от 3,5 до 5,2 т.п.н. (Рис. 1). Видовое распределение плазмидных штаммов было следующим: 8 принадлежало к группе Bifidobacterium longum/infantis, относилось к виду B. bifidum, 2 к B. breve, а один изолят был идентифицирован как обнаруженных плазмид показал, что часть молекул являются членами двух консервативных семейств (8 — членами семейства pB80/pKJ50, 2 — семейства pB44/pKJ36). Оставшиеся плазмид по рестрикционным картинам оказались не родственны между собой. Для дальнейшего изучения были выбраны плазмиды pB80 (член консервативного семейства из молекул) и pB21a (наиболее крупная из выделенных плазмид).

Рис. 1. Плазмидные ДНК из штаммов бифидобактерий. Дорожки 1 и 10 - маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder («Invitrogen»); дорожка 2 – B. longum B22;

дорожки 3 и 5 B. breve B21a; дорожка 4 - B. longum B6; дорожка 6 - B.bifidum B80; дорожка 7 B. catenulatum B63; дорожка 8 - B. longum B1 (плазмидная ДНК отсутствует); дорожка 9 – плазмидный вектор pBluescriptII KS- (положительный контроль).

Анализ нуклеотидных последовательностей плазмид бифидобактерий pB80 и pB21a Определение полной нуклеотидной последовательности pB80 показало, что эта кольцевая молекула длиной 4898 п.н. (Рис. 2) почти на 98% идентична ранее охарактеризованной плазмиде pKJ50 из штамма Bifidobacterium longum KJ [M.S. Park и другие, 1999]. Как и ее близкий гомолог, плазмида несет 3 открытые рамки считывания (ORF1, ORF2 и ORF3), кодирующие гипотетические белки RepA (34,4 кДа), MobA (42,1 кДа) MembA (24, последовательностей, наличие нескольких точковых фрейм-шифт мутаций и одной протяженной делеции (68 п.н.) снижает сходство предсказанных аминокислотных последовательностей белков RepA и MobA с их гомологами у pKJ50 до уровня 84% и 75% соответственно.

Рис. 2. Структура плазмид pB80 и pB21a. rep, repA – гены репликаз; membA — ген, гипотетического мембранного белка; mobA — ген предполагаемой релаксазы, участвующей в мобилизации; ftsK – ген гипотетического конъюгативного протеина; mem – ген, трансляционно сцепленный с ftsK и кодирующий гипотетический трансмембранный белок.

Гипотетический белок RepA имеет многие черты первичной структуры, характерные для белков-инициаторов репликации по механизму «катящегося кольца». Более того, ранее было экспериментально показано присутствие в цитоплазме клеток B. longum KJ одноцепочечных форм плазмиды pKJ50, что также свидетельствует в пользу репликации плазмид семейства pB80/pKJ50 по такому механизму. Присутствие на плазмиде гена гипотетической релаксазы Mob указывает на ее вероятную способность к мобилизации при наличии в той же бактериальной клетке остальных необходимых генов tra-оперона (в transположении) [E. Grohmann и другие, 2003]. В то же время, до настоящего момента не получено экспериментальных свидетельств существования конъюгации у рода Bifidobacterium.

Гипотетический белок MembA характеризуется кислыми свойствами (pI = 5,1) и наличием трансмембранного гидрофобного альфа-спирализованного домена. В отличие от двух других полипептидов, кодируемых плазмидами pB80/pKJ50 данный белок не имеет функционально охарактеризованных гомологов.

Анализ полной нуклеотидной последовательности (5206 п.н.) плазмиды pB21a (Рис. 2) показал, что, в отличие от плазмиды pB80, данная молекула не имеет близких гомологов в базах данных. В то же время общая организация данной плазмидной ДНК сходна с таковой у плазмиды pCIBb1, выделенной из B. breve [K. O’Riordan и G.F. Fitzgerald, 1999], и у недавно описанной плазмиды pASV479, выделенной из B. pseudolongum subsp. globosum [A.

Sangrador-Vegas и другие, 2007]. Плазмида pB21a несет не менее 6 открытых рамок считывания.

Одна из открытых рамок считывания плазмиды pB21a, ORF1, кодирует белок Rep (53, кДа), содержащий три консервативных домена, характерных для белков – инициаторов репликации по механизму «катящегося кольца». Данный протеин обладает значимой степенью гомологии с Rep-белком, кодируемым плазмидой pCIBb1 (36%), а также с Repбелком плазмиды pASV479.

Открытая рамка считывания ORF2 плазмиды pB21a потенциально кодирует белок с молекулярной массой 31,7 кДа, обладающий значительной гомологией по первичной структуре с целым рядом белков семейств FtsK/SpoIIIE и имеющий в своем составе консервативные домены, присущие семейству белков Tra, участвующих в процессе конъюгативного переноса ДНК по необычному механизму, характерному лишь для бактерий рода Streptomyces.

В отличие от хорошо изученного «классического» пути, требующего присутствия множества генных продуктов и переносящего ДНК между клетками в виде одноцепочечной линейной формы, конъюгативный аппарат стрептомицетов основан на функции лишь одного белка – Tra, способного осуществлять мобилизацию и интермицелиальный перенос плазмидных ДНК [E. Grohmann и другие, 2003]. Кроме того, у стрептомицетов описано явление мобилизации хромосомных генетических маркеров (chromosome mobilizing activity, Cma), также зависящее от белка Tra [G.S. Pettis и S.N. Cohen, 2001]. Считается, что мономеры белка Tra способны к олигомеризации и образованию кольцеподобных структур, окружающих интактные двуцепочечные ДНК и направляющих их транспорт сквозь мембраны и клеточные стенки из донорских в реципиентные гифы.

Кроме того ближайшими гомологами продукта открытой рамки считывания ORF2, названного нами FtsK, являются одноименный белок, кодируемый плазмидой pCIBb1 (63% гомологии) и FtsK-подобный белок, кодируемый плазмидой pASV479 (61% гомологии).

Помимо этого, некоторой степенью родства с данным белком обладает Tra-белок, кодируемый плазмидой p4M из B. pseudocatenulatum (23% гомологии) [M.J. Gibbs и другие, Наличие гомологии первичной структуры гипотетических белков FtsK/Tra, 2006].

кодируемых плазмидами pB21a, pCIBb1, pASV479 и p4M, с белками Tra стрептомицетов, а также присутствие в их структуре консервативных мотивов Walker A и Walker B, гидрофобного трансмембранного сегмента и менее консервативного мотива RAAG свидетельствует о высокой вероятности участия данного семейства белков в процессе конъюгации.

Межгенная спейсерная область ftsK-rep плазмид pB21a, pCIBb1 и pASV479 содержит многочисленные повторы и элементы вторичной структуры ДНК, в том числе совершенные и несовершенные инвертированные повторы, а также многочисленные короткие прямые повторы. Эта область характеризуется довольно высокой консервативностью у всех трех плазмид и определенной степенью гомологии с охарактеризованным clt-элементом Streptomyces, играющим роль cis-локуса, необходимого для осуществления мобилизации плазмидной ДНК по Streptomyces-механизму [J. Reuther и другие, 2006].

Остальные открытые рамки считывания, расположенные на плазмиде pB21a, охарактеризованы менее четко. Так, ORF3 кодирует гипотетический белок (17,5 кДа), имеющий в составе своей первичной структуры HTH-мотив и обладающий небольшим уровнем сходства с транскрипционными регуляторами семейств LysR и AraC/XylS.

Полипептид Mem, кодируемый ORF4 (21,4 кДа), характеризуется наличием не менее двух трансмембранных гидрофобных -спирализованных сегментов и гипотетически может являться трансмембранным белком.

Получение челночных клонирующих векторов E. coli - Bifidobacterium Предсказание структуры репликонов в охарактеризованных нами плазмидах pB80 и pB21a позволило сконструировать серию челночных клонирующих векторов E. coli Bifidobacterium. Данные рекомбинантные плазмиды включают в себя высококопийный ориджин репликации E. coli ColE1, ген резистентности к ампициллину bla и BamHIрестриктный фрагмент плазмиды pB80 размером 2564 п.н., содержащий ген репликазы repA и предсказанный двуцепочечный ориджин репликации dso. В связи с тем, что ген лактамазы bla кишечной палочки неактивен в грамположительных бактериях, для обеспечения селекции сконструированных векторов в бифидобактериях в них были внедрены гены ery194 и cat194, обеспечивающие устойчивость к эритромицину и хлорамфениколу соответственно [S. Horinouchi и B. Weisblum, 1982] (Рис. 3).

Рис. 3. Строение челночного клонирующего вектора E. coli – Bifidobacterium pCESH80. сat194 — ген резистентности к хлормафениколу; bla — ген -лактамазы; repA — ген реликазы плазмиды pB80; f1 — ориджин репликации фага f1; pUC — ориджин репликации плазмиды pUC19. Вектор pEESH80 отличается заменой гена cat194 на ery194.

Полученные плазмиды pEESH80 и pCESH80 обладали способностью трансформировать реципиентный штамм Bifidobacterium breve UCC2003 с частотой 103-104 КОЕ/мкг ДНК, что подтверждалось путем определения плазмидных профилей трансформированных клонов (Рис. 4).

Определение сегрегационной стабильности плазмиды pEESH80 показало, что данный вектор обладает стабильностью наследования при культивировании трансформированного штамма B. breve на протяжении 100 генераций в неселективной питательной среде при 370С. В то же время инкубация при температуре 420С приводила к резкой потере стабильности плазмиды до уровня 1%. Тот же уровень стабильности при 420С был характерен и для контрольного вектора pSUW64/123, однако данная плазмида, в отличие от pEESH80, обладала лишь 21%-ной стабильностью сегрегации и при 370С на протяжении 100 генераций.

Рис 4. Определение плазмидных профилей штаммов-дериватов B. breve UCC2003, трансформированных плазмидами pSUW64/123 (дорожки 2 и 3) и pEESH80 (дорожки 4 и 5); дорожка 1 – маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder (Invitrogen) Для дальнейшего улучшения свойств клонирующего вектора pEESH80 нами была неэссенциальных компонентнов. С этой целью из вектора был удален рестриктный фрагмент BamHI- Eam1105I, содержащий ген bla и ориджин f1. Полученный вектор pESH83 имеет размер всего лишь 4900 п.н., что существенно меньше, чем у большинства других описанных на сегодняшний день челночных клонирующих векторов E. coli — Bifidobacterium.

Использование челночных векторов E. coli — Bifidobacterium для экспрессии гетерологичных генов в клетках B. breve UCC pEESH80/pCESH80 и изучения функциональности последних нами были выбраны: 1) синтетический ген, кодирующий основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2); 2) ген amyB B. adolescentis, кодирующий -амилазу; 3) кДНК гена IL10 человека, кодирующего интерлейкин-10.

На первом этапе из рестриктных фрагментов и ПЦР-амплифицированных последовательностей были собраны две экспрессирующие кассеты, содержащие ген FGF2, трансляционно слитый с последовательностью, кодирующей секреторный сигнальный пептид Sec2 из B. breve [L.E. MacConaill и другие, 2003]. Для обеспечения адекватной экспрессии данной химерной конструкции, она была помещена под контроль конститутивноактивных промоторов генов hup (гистоноподобный белок HU [A. Takeuchi и другие, 2002]) либо gap (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа), а также транскрипционного терминатора гена hup (Рис. 5).

Рис. 5. Схема строения экспрессирующих кассет с химерным геном sec2- FGF2 в плазмидах pESH46 и pESH86 (А), а также в плазмидах pESH47 и pESH87 (Б). Phup — промотор гена hup B. longum, Pgap — промотор гена gap B. longum, Sec2 — фрагмент гена sec2 B. breve, кодирующий сигнальный пептид. Ломанной стрелкой отмечена точка начала транскрипции.

Путем клонирования данных кассет в челночные вектора Bifidobacterium — E. coli были получены две серии экспрессирующих плазмид: 1) плазмиды pESH46 и pESH47 были основаны на существующем векторе pSUW64/123 и содержали промоторы Phup и Pgap соответственно; 2) плазмиды pESH86 и pESH87 были основаны на векторе pEESH80, но также различались присутствием промоторов Phup и Pgap.

Все четыре полученных плазмиды (pESH46, pESH47, pESH86 и pESH87) были способны трансформировать хозяйский штамм B. breve UCC2003. Однако культура, трансформированная pESH87, демонстрировала очень медленный рост и фенотипическую диссоциацию колоний, что вероятно было связано с токсичностью высокого уровня экспрессии слитного белка Sec2-FGF2. В результате этого, штамм, трансформированный pESH87, был исключен из дальнейшей работы. Факт присутствия рекомбинантных плазмид pESH46, pESH47 и pESH86 в трансформированных ими культурах был подтвержден путем постановки ПЦР с праймерами, специфичными в отношении гена FGF2, а также путем определения плазмидного профиля (Рис. 6).

Результаты иммунодетекции FGF2 в супернатантах трансформированных культур приведены на Рис. Наиболее высокий уровень экспрессии растворимой иммунореактивности FGF2 определялся в культуре, трансформированной плазмидой pESH86, в то время как в случае со штаммом, трансформированным pESH46, выявлялась лишь слабая полоса. Часть иммунореактивности в супернатанте штамма B. breve UCC [pESH86] располагалась в зоне предсказанной молекулярной массы процессированного слитного белка Sec2-FGF2 (19 кДа). В это же время во всех образцах выявлялась полоса с меньшей молекулярной массой (14 кДа), возможно появившаяся в результате аберрантной терминации трансляции либо посттрансляционной деградации слитного белка.

Известно, что основной фактор роста фибробластов обладает мощным митогенным воздействием на эндотелиальные клетки микрососудов. Таким образом, штаммы-продуценты bFGF потенциально могут быть использованы в качестве биотерапевтических препаратов для лечения целого ряда патологических состояний кишечника, таких как неспецифический язвенный колит и постлучевой гастроинтестинальный синдром [T. Kojima и другие, 2007; F.

Paris и другие, 2001].

С целью получения вектора для экспрессии -амилазы в Bifidobacterium breve была произведена замена последовательности, кодирующей FGF-2 в векторе pESH86, на ПЦРамплифицированный ген amyB, лишенный собственного сигнального пептида. В результате этого, ген -амилазы B. adolescentis был поставлен под контроль промотора hup и сигнального пептида Sec2. Полученная плазмида pESH90 обладала способностью к стабильной трансформации реципиентного штамма B. breve UCC2003. Изучение амилазной активности штамма UCC2003 [pESH90] и исходного штамма UCC2003 чашечным методом показало, что исходный штамм обладает небольшой амилазной активностью, в то время как вокруг колоний трансформированного штамма видны значительные зоны просветления среды (Рис. 7).

экспрессирующими векторами pESH46, pESH47, pESH86 и определение экспрессии белка Sec2-FGF2 в этих штаммах методом иммуноблоттинга. А – подтверждение трансформации штамма B. breve UCC2003 методом ПЦР с праймерами FGF-F и FGF-R;

дорожки 1-3 – трансформация вектором pESH46; дорожки 4-6 – трансформация вектором pESH47; дорожки 7-9 трансформация вектором pESH86; дорожка 10 – исходный штамм. Б – трансформированных pESH86 (дорожки 2-4), pESH46 (дорожка 5) и pESH47 (дорожка 6);

дорожка 1 – маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder (Invitrogen). В – выявление присутствия белка FGF2 в концентрированных супернатантах трансформированных культур B. breve методом иммуноблоттинга; дорожки 1 и 2 – штамм, трансформированный pESH46;

нетрансформированный штамм; дорожки 7 и 8 – штамм, трансформированный pESH86.

Рис. 7. Выявление амилазной активности в штамме B. breve UCC2003, трансформированном плазмидой pESH90 (сектора 1 и 2), и в исходном штамме UCC (сектор 3).

Искусственное введение гена амилазы в пробиотические штаммы бифидобактерий способно повысить их терапевтическое значение и улучшить производственные свойства.

Кроме этого, ген amyB обладает определенным потенциалом в качестве селективного маркерного гена для конструирования челночных векторов категории «food-grade».

Для получения бифидобактерий — продуцентов интерлейкина-10 человека было проведено замещение последовательностей, кодирующих FGF-2 в векторах pESH86 и pESH87, на ПЦР-амплифицированный фрагмент кДНК гена IL10 человека, кодирующий зрелый полноразмерный полипептид ИЛ-10. Полученные в результате этой манипуляции плазмиды были названы pESH92 и pESH93 соответственно. Оба вектора обладали способностью к трансформации штамма B. breve UCC2003, что подтверждалось результатами ПЦР с праймерами к гену ИЛ-10, а также результатами определения плазмидных профилей трансформированных штаммов.

Для изучения экспрессии рекомбинантного ИЛ-10 в супернатантах культур трансформированных штаммов бифидобактерий был применен метод иммуноблоттинга.

Результаты иммунодетекции представлены на Рис. 8. Сравнение молекулярных масс, соответствующих окрашенным зонам свидетельствует о присутствии в супернатанте ночной культуры как полноразмерной зрелой формы белка с молекулярной массой 20 кДа, так и полипептидов с меньшими молекулярными массами (14 кДа и менее), появление которых может быть связано как с аберрантной трансляцией, так и с посттрансляционной протеолитической деградацией исходного полипептида. Кроме того, нельзя исключить и вероятность неферментативного гидролиза ИЛ-10 в кислой среде бактериальной культуры, что было описано ранее [L. Steidler и другие, 2000].

трансформированных культур B. breve методом иммуноблоттинга. дорожка 1 – штамм, трансформированный pESH92; дорожка 2 – штамм, трансформированный pESH93; дорожка 3 – нетрансформированный штамм B. breve UCC2003.

Ранее была показана высокая эффективность данного цитокина для лечения различных воспалительных заболеваний кишечника, таких как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона [M.C. Li и другие, 2004]. В этой связи, предпринимаются попытки разработки пробиотических штаммов — продуцентов ИЛ-10, которые после введения в желудочнокишечный тракт способны продуцировать данный цитокин непосредстенно в очаге поражения [L. Steidler и другие, 2000]. Таким образом, разработка штаммов бифидобактерий — продуцентов терапевтического интерлейкина-10 несомненно актуальна, а созданная нами векторная система может послужить основной для получения промышленного штамма уже в ближайшем будущем.

ВЫВОДЫ

Бифидобактерии, колонизирующие толстый кишечник детей раннего возраста, с высокой частотой (17,6%) являются носителями плазмидных ДНК.

Значительная часть плазмид бифидобактерий представляют собой небольшие криптические молекулы, реплицирующиеся по механизму катящегося кольца и относящиеся к двум консервативным семействам (pB80/pKJ50 и pB44/pKJ36).

Плазмиды pB80 и pB21a, выделенные из штаммов B. bifidum B80 и B. breve потенциально способны к мобилизации или самостоятельному конъюгативному переносу, в том числе и по уникальному стрептомицетподобному механизму.

Сконструированные челночные клонирующие вектора E. coli – Bifidobacterium эффективностью трансформировать реципиентный штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve UCC2003.

Клонирование гетерологичных генов FGF2, IL10 и amyB совместно с гомологичными регуляторными элементами бифидобактерий (промоторами Phup и Pgap, терминатором Thup, последовательностью сигнального пептида sec2) в разработанные нами векторные плазмиды позволяет получать штаммы терапевтическими свойствами.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хромова С.С., Ефимов Б.А., Тарабрина Н.П., Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Сепиашвили Я.Р. Иммунорегуляция в системе микрофлора — интестинальный тракт // Аллергология и иммунология, 2004, Т 5, № 2.- С. 265-271.

2. Хромова С.С., Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Тарабрина Н.П., Черная З.А., Кафарская Л.И. Микрофлора кишечника и механизмы иммунорегуляции // Вопросы детской диетологии, 2005, Т 3, № 1.- С. 92-96.

3. Донских Е.Е., Шкопоров А.Н., Постникова Е.А., Ван Ликуй, Кафарская Л.И.

Молекулярный мониторинг микрофлоры кишечника недоношенных новорожденных // Материалы Четвертого конгресса педиатров-инфекционистов России.- Москва, 2005.С. 66-67.

4. Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., Кафарская Л.И, Ефимов Б.А. Изучение видового состава бифидобактерий в толстой кишке у детей раннего возраста // Материалы Четвертого конгресса педиатров-инфекционистов России.- Москва, 2005.- С. 201.

5. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Podoprigora G.I., Kafarskaya L.I.

Molecular characterization of 84 Bifidobacterium spp. isolates cultured from human infant feces // Материалы конгресса «The 8th Biennial Congress of the Anaerobe Society of the Americas».- Boise, 2006.- P. 82.

бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей раннего возраста // Материалы I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции.- Москва, 2006.- С. 443-444.

7. Кафарская Л.И., Володин Н.Н., Ефимов Б.А., Афанасьев С.С., Шкопоров А.Н.

Особенности микробной колонизации кишечника новорожденных и недоношенных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии // Вестник РАМН, 2006, № 1.С. 10-15.

8. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С., Смеянов В.В., Кириллов М.Ю., Постникова Е.А., Максимов Ф.Е., Хохлова Е.В., Ефимов Б.А. Молекулярногенетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста // Вестник РАМН, 2006, № 1.- С. 45-50.

9. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Smeianov V.V., Kafarskaia L.I. Application of several molecular techniques to study dominant Bifidobacterium spp. strains in healthy Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications».- Wadahl, 2007.- Р. 88.

10. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Steele J.L., Kafarskaia L.I., Smeianov V.V.

Characterization of plasmid DNAs from human infant Bifidobacterium strains: sequence analysis and construction of E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors // Материалы международного симпозиума «Propionibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications».- Wadahl, 2007.- Р. 25.

11. Шкопоров А.Н., Смеянов В.В., Ефимов Б.А., Хохлова Е.В., Кафарская Л.И. Изучение плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей: анализ нуклеотидной последовательности и конструирование челночных клонирующих векторов // Сборник тезисов докладов к международному конгрессу «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания.

Фундаментальные и клинические аспекты».- Санкт-Петербург, 2007.- С. 77.

12. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Хохлова Е.В., Кулагина Е.В., Кафарская Л.И.

Использование комбинации молекулярно-генетических методов для изучения доминантных штаммов бифидобактерий, колонизирующих кишечник здоровых детей // Сборник тезисов докладов к международному конгрессу «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты».-Санкт-Петербург, 2007.- С. 76-77.

13. Shkoporov A.N., Khokhlova E.V., Kulagina E.V., Smeianov V.V., Kafarskaia L.I., Efimov B.A. Application of several molecular techniques to study numerically predominant Bifidobacterium spp. and Bacteroidales order strains in the feces of healthy children // Biosci Biotechnol Biochem, 2008, № 72:3.- Р.-742-748.

14. Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., Афанасьев С.С., Кулагина Е.В., Кафарская Л.И. Плазмиды бифидобактерий и их использование в генетической инженерии // Вестник РАМН, 2008, № 2.- С. 16-21.

15. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Steele J.L., Kafarskaia L.I., Smeianov V.V.

Characterization of plasmids from human infant Bifidobacterium strains: sequence analysis and construction of E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors // Plasmid, 2008, № 60:2.- P.

136-148.

16. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Kafarskaia L.I., Smeianov V.V. Production of human basic fibroblast growth factor (FGF-2) in Bifidobacterium breve using a series of novel expression/secretion vectors // Biotechnol Lett, 2008, №30:11. - С. 1983-1988.

17. Шкопоров А.Н, Хохлова Е.В., Ефимов Б.А., Кафарская Л.И. Экспрессия гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) Aequoria victoria в бактериальных клетках Lactobacillus plantarum // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008, №4. С. 33-37.

18. Kulagina E.V., Shkoporov A.N., Donskikh E.E., Khokhlova E.V., Kafarskaia L.I., Efimov B.A. Comparative study of species and strain distributionof bifidobacteria in the feces of breast-fed infants and thier mothers. // Материалы конгресса «The 9th Biennial Congress of the Anaerobe Society of the Americas».- Long Beach, 2008.- P. 27.

«Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания Изучено содержание плазмидных ДНК в коллекции штаммов бифидобактерий, выделенных от здоровых детей. Для двух из пятнадцати обнаруженных плазмид (pB21a и pB80) последовательности. Выявлено присутствие генов, гипотетические продукты которых могут обеспечивать автономную репликацию указанных плазмид по механизму «катящегося кольца», мобилизацию и конъюгативный перенос плазмид, в том числе и по уникальному Streptomyces-подобному механизму, а также ряда генов, чье функциональное значение остается неясным. Репликон плазмиды pB80 был использован для получения серии челночных клонирующих векторов E. coli — Bifidobacterium, содержащих регуляторные элементы для обеспечения эффективной транскрипции и трансляции клонированных гетерологичных генов. Функциональность сконструированных векторных систем была подтверждена в ходе получения штаммов Bifidobacterium breve — продуцентов фактора роста фибробластов человека, интерлейкина-10 человека и -амилазы Bifidobacterium adolescentis.

Development of methods for genetic modification of bifidobacteria and creation of novel Content of plasmid DNAs in the collection of Bifidobacterium strains isolated from infant feces was studied. Two out of fifteen found plasmids (pB21a and pB80) were sequenced to completion and analyzed extensively. Among the putative products of the detected open reading frames were found homologs to “rolling circle” replication proteins, DNA mobilization proteins, including unique Streptomyces-like conjugative transfer factors, and other conserved proteins which functions remain unclear. The predicted replicon of plasmid pB80 was used to construct a series of E. coli – Bifidobacterium shuttle cloning vectors, harboring regulatory DNA elements which enable efficient transcription and translation of cloned heterologous genes. Functionality of these vectors was confirmed by using them to create Bifidobactium breve strains which produce and secrete human FGF-2, human IL-10, and B. adolescentis -amylase.



 
Похожие работы:

«Гимранов Дмитрий Олегович РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГОРНОСТАЕВЫХ В ЮЖНО-УРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2012 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Башкирский государственный педагогический университет...»

«ВАЩИЛИН ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ АУТОСОМНОГО ДНК ПОЛИМОРФИЗМА В ПОПУЛЯЦИЯХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ 03.00.15 генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 2 Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Белгородский государственный университет. Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор...»

«Горюнова Юлия Дмитриевна ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СОДЕРЖАНИЕ В РАСТЕНИЯХ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТОВ Специальность 03.00.16 – Экология 03.00.12 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград – 2009 Работа выполнена в Российском государственном университете имени Иммануила Канта. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Чупахина Галина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007 Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»

«Панчелюга Виктор Анатольевич О ЗАКОНОМЕРНОСТЯХ ПОДОБИЯ ФОРМЫ СПЕКТРОВ АМПЛИТУД ФЛУКТУАЦИЙ В ПРОЦЕССАХ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ Специальность 03.00.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Пущино - 2008 1 Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН. проф., доктор биологических наук Научный руководитель : Шноль Симон Эльевич доктор физ.-мат. наук, с. н. с., Официальные оппоненты : Намиот...»

«МИЧУКОВА МАРИНА ВАЛЕНТИНОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ DAPHNIA MAGNA STRAUS, 1826 В БИОИНДИКАЦИИ, УЛУЧШЕНИИ БИОПРОДУКТИВНОСТИ И КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДОЕМОВ 03. 00. 16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2008 Работа выполнена на кафедре Пищевая биотехнология Казанского Государственного технологического университета Научный руководитель доктор технических наук, профессор Канарский Альберт Владимирович Официальные оппоненты доктор...»

«ГУЛГЕНОВ Борис Жаргалович ЭКОЛОГИЯ ГНЕЗДЯЩИХСЯ ПТИЦ В СЕЛЬСКИХ НАСЕЛЕННЫХ ПУНКТАХ БАЙКАЛЬСКОЙ СИБИРИ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2007 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Доржиев Цыдыпжап Заятуевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Давыдов Владимир Никандрович кандидат биологических...»

«Абашеев Роман Юрьевич ЭКОЛОГИЯ ОБЩЕСТВЕННЫХ СКЛАДЧАТОКРЫЛЫХ ОС (HYMENOPTERA, VESPIDAE: VESPINAE, POLISTINAE) В СЕЛЕНГИНСКОМ СРЕДНЕГОРЬЕ Специальность 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 Работа выполнена в Бурятском государственном университете Научный руководитель : Доржиев Цыдыпжап Заятуевич доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты : Плешанова Галина Ивановна доктор биологических...»

«Манаева Елизавета Сергеевна Влияние полевок (Microtus rossiaemeridionalis и Clethrionomys glareolus) на биологическую активность почв 03.02.08 – экология (биологические наук и) 03.02.13 – почвоведение (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2013 Работа выполнена в Лаборатории экологии и функциональной морфологии высших позвоночных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем...»

«БУРСКИЙ Олег Владиславович СТРУКТУРА НАСЕЛЕНИЯ И ДИНАМИКА ПОПУЛЯЦИЙ ВОРОБЬИНЫХ ПТИЦ ЦЕНТРАЛЬНОЙ СИБИРИ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Евгений Николаевич Панов Официальные оппоненты : доктор биологических наук Аркадий Борисович Савинецкий доктор биологических...»

«НАМЗАЛОВА БАИРМА ДАМДИН-ЦЫРЕНОВНА ПАПОРОТНИКИ БУРЯТИИ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2011 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Алтайский государственный университет, г. Барнаул Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Шмаков Александр Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ревякина Надежда Васильевна кандидат биологических наук Крещенок...»

«Балега Анна Александровна ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СУЩНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПАРАЗИТАРНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЭСТРОЗЕ ОВЕЦ И РАЗРАБОТКА МЕР БОРЬБЫ 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Ставрополь – 2011 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, профессор Толоконников Василий Петрович Официальные оппоненты : доктор ветеринарных наук Оробец...»

«ПИВОВАРОВА Анастасия Викторовна Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Дмитрий Иванович...»

«ЛЮТОВА Елена Михайловна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ШАПЕРОНОПОДОБНОГО ДЕЙСТВИЯ АМФИФИЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор С.С....»

«Тимофеев Максим Анатольевич Экологические и физиологические аспекты адаптации к абиотическим факторам среды эндемичных байкальских и палеарктических амфипод 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск – 2010 Работа выполнена в лаборатории Проблемы адаптации биосистем Научноисследовательского института биологии при ГОУ ВПО Иркутский государственный университет. Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«Фадина Оксана Алексеевна СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ BRASSICA Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2014 Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН в 2010-2014 гг. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Эмиль Ефимович Хавкин. Официальные оппоненты : в.н.с....»

«Горбатова Ольга Николаевна ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА АТРАЗИНА БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ И ИХ ФЕРМЕНТАМИ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена в группе Ферментативные основы биодеградации Института биохимии имени А.Н.Баха РАН Научные руководители: доктор биологических наук О.В. Королева кандидат биологических наук А.В.Жердев Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Жамбалова Анна Александровна РОД PEDICULARIS L. В ЗАБАЙКАЛЬЕ: ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭКОЛОГО-ФИТОЦЕНОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ. 03.00.05 - ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный технологический университет (ВСГТУ) Научные руководители: доктор биологических наук, проф. Анцупова Татьяна Петровна; доктор...»

«АФАНАСЬЕВА Евгения Георгиевна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МЕЖВИДОВЫХ БАРЬЕРОВ В ПЕРЕДАЧЕ ПРИОННОГО СОСТОЯНИЯ У ДРОЖЖЕЙ Специальность 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ. Научный руководитель : доктор биологических наук Кушниров Виталий Владимирович Официальные оппоненты : доктор...»

«СМАЗНОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА BoLA-DRB3, ВЛИЯЮЩЕГО НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЛЕЙКОЗУ, И ГЕНОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ Специальность 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.