WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

На правах рукописи

Ямпольский Илья Викторович

Синтез и свойства хромофоров белков

семейства зеленого флуоресцентного белка

специальность – 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук Константин Анатольевич Лукьянов доктор химических наук Виктор Кузьмич Потапов

Официальные оппоненты:

Формановский Андрей Альфредович, доктор химических наук, заведующий группой органического синтеза ИБХ РАН.

Смушкевич Юрий Исаевич, доктор химических наук, профессор кафедры органической химии Российского химико-технологического университета им.

Д.И.Менделеева

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук

Защита состоится 21 октября 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул.

Миклухо-Маклая, д.16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 21 сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бурно развивающиеся в последние годы технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов изучения живой клетки являются флуоресцентные маркеры, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми структурами или процессами в режиме реального времени. Особенно широко используются генетически кодируемые метки – флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP, а также некоторые химические флуоресцентные красители.



Белки семейства GFP широко известны благодаря уникальному механизму формирования хромофорной группы. В отличие от обычных ферментов, производящих какую-либо одну реакцию множество раз, флуоресцентные белки в ходе своего созревания один раз проводят 2-3 совершенно разные реакции, приводящих к синтезу хромофора внутри молекулы белка за счет модификаций собственных аминокислотных остатков. Исследования последних лет показали большое разнообразие спектральных характеристик и структур хромофоров в GFP-подобных белках.

Синтез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой определения химического строения нативных хромофоров. В настоящее время рентгеноструктурный анализ стал основным методом исследования структуры хромофоров в различных флуоресцентных белках. В то же время, кристаллографическое определение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и малоинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Несмотря на то, что ковалентная структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно установленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также реакционной способности возбужденного состояния остаются недостаточно изученными. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных соединений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия известных структур хромофоров.

Таким образом, синтез модельных соединений позволяет установить строение хромофоров в белках, изучить спектральные характеристики их и их аналогов, моделировать влияние белкового окружения. В перспективе модельные соединения могут быть использованы при изучении механизмов созревания и функционирования хромофоров, а также с целью создания новых флуоресцентных красителей с уникальными свойствами.

Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение взаимосвязи структура – спектральные свойства в ряду хромофоров флуоресцентных и окрашенных белков – гомологов GFP, а также исследование структур хромофоров двух белков: пурпурного хромобелка asFP595 (Anemonia sulcata) и желтого флуоресцентного белка zFP (Zoanthus sp.).

В рамках сформулированной цели были поставлены задачи:

• Разработать метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода синтезировать хромофор окрашенного белка asFP595, изучить его спектрохимическое поведение в различных условиях.

• Разработать новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов, имеющих функционализированный этенильный заместитель в положении имидазола. С использованием этого метода синтезировать хромофор флуоресцентного фотопереключаемого белка Kaede (красная форма).

Синтезировать структурные аналоги хромофора Kaede, соответствующие замене гистидина и/или тирозина в хромофоре на другие аминокислоты. Изучить сольватохромные и кислотно-основные свойства в данном ряду хромофоров.





Изучить ауксохромные свойства заместителей в хромофоре Kaede.

• Синтезировать хромофор желтого флуоресцентного белка zFP538. Выяснить структурную основу его сложного рН-зависимого спектрального поведения.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые разработаны методы синтеза хромофоров флуоресцентных и хромобелков – гомологов GFP, поглощающих и флуоресцирующих в красной области видимого спектра.

Указанные хромофоры представляют собой 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-оны, несущие заместители с различными функциональными группами в положении имидазола. Впервые синтезированы хромофоры пурпурного хромобелка asFP595, красного фотоконвертируемого флуоресцентного белка Kaede и желтого флуоресцентного белка zFP538. Синтетические хромофоры позволили провести детальный анализ ауксохромных свойств заместителей в данном ряду окрашенных соединений, а также их сольватохромных и кислотно-основных свойств. На основе полученных данных был предложен ряд перспективных направлений для направленного изменения свойств флуоресцентных и окрашенных белков. Выявлена химическая природа сложного спектрального поведения хромопептидов из белка zFP538, приведшего к неправильному определению их структуры. Уточнена структура хромофора zFP538. Обнаружена необычная перегруппировка 2-ацил-5-арилиден-3,5дигидро-4H-имидазол-4-онов в уникальные производные 2,6-дикетопиперазина, встречающиеся в природе среди метаболитов грибов. Полученные в настоящей работе флуорогены (красители, практически нефлуоресцентные в свободном состоянии в растворе, но приобретающие яркую флуоресценцию после прочного связывания с целевой молекулой, например, белком или ионом металла) и их аналоги могут найти применение для различных флуоресцентных методов детекции.

Апробация полученных данных и публикации. Основные материалы диссертации были доложены на международном симпозиуме Advances in Science for Drug Discovery (Москва, 2005) а также на IX чтениях памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 141 ссылку. Диссертация содержит 14 рисунков, 25 схем и 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Синтез и свойства хромофора красного хромобелка asFP595 (Anemonia sulcata) Хромофор красного хромобелка asFP595 представляет собой 2-ацетил-5-(4гидроксибензилиден)-3-метил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-он 2.1.4 и образуется в результате гидролиза промежуточно образующегося N-ацилимина. В настоящей работе мы разработали метод синтеза 2-ацил-5-(арилиден)-3-алкил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4он, который был применен для синтеза целевого модельного соединения.

1.1 Синтез Общий метод синтеза 5-(арилиден)-3-алкил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-онов включает образование азлактона по реакции Эрленмейера, его аминолиз первичным амином с последующей циклизацией. Мы применили этот подход для синтеза 2-этил-5-(4гидроксибензилиден)-3-метил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она 2.1.3 (Схема 1).

Окисление 2.1.3 1 эквивалентом диоксида селена в диоксане привело к целевому соединению 2.1.4 с выходом 60%. Спектры ЯМР 1Н и 13С полностью согласуются с целевой структурой. В частности, пик с химическим сдвигом 192.8 м.д. в спектре ЯМР С соответствует ключевой карбонильной группе в ацетильном заместителе.

Cхема 1 Синтез хромофора хромобелка asFP595.

1.2 Спектральные свойства Поглощени е Рис. 1 Кислотно-основное спектрофотометрическое титрование хромофора asFP595.

Спектр абсорбции соединения 2.1.4 – модельного соединения хромофора хромобелка asFP595 обладает отчетливой рН-зависимостью. В водном растворе при кислых значениях рН максимум поглощения наблюдается при 418 нм, а в нейтральных и слабощелочных – при 520 нм. Переход между этими двумя спектральными формами оказался полностью обратим, а также был определен рКа перехода, равный 7.1. Мы приписываем этот переход обратимому депротонированию гидроксильной группы хромофора (структуры 2.1.4а и 2.1.4b, Рис. 1), аналогично хорошо изученному поведению хромофора GFP.

При значениях рН11.0, модельный хромофор претерпевает необратимое разложение (время полужизни 20 минут при рН 12) с образованием сложной смеси продуктов с Природа растворителя оказывает большое влияние на положение максимума поглощения анионной формы хромофора 2.1.4b (Таблица 1).

Таблица 1 Параметры спектров поглощения хромофора 2.1.4 в различных растворителях. Спектры нейтральной и анионной форм были измерены в растворах, содержащих 10 mM HCl и 10 mM NaOH соответственно.

Растворитель Максимум поглощения, нм Наиболее длинноволновый максимум поглощения наблюдался в ДМФА и составил нм, что очень близко к максимуму поглощения белка asFP595 (568 нм) (Рис. 3А).

Рис. 3 Сравнение спектров поглощения (А) и возбуждения-эмиссии (В) раствора хромофора 2.1.4b в ДМФА (тонкие черные линии) и нативного белка asFP595 (жирные серые линии). Для каждой пары линий спектр эмиссии лежит в более длинноволновой области.

Раствор анионной формы хромофора 2.1.4b (рН 8.3) обладает слабой красной флуоресценцией с пиком при 603 нм (Рис. 3В) и квантовым выходом 2.1*10-3. Нативный белок asFP595 обладает флуоресценцией с такой же длиной волны, но, что примечательно, с меньшим на порядок квантовым выходом (2.2*10-4). Близкое сходство спектров поглощения и флуоресценции синтетического хромофора и природного белка позволяет предположить, что анион 2.1.4b воспроизводит структуру хромофора в белке.

Знание спектральных характеристик модельного хромофора позволяет оценить истинный коэффициент экстинкции природных белков, содержащих этот хромофор.

Зачастую, коэффициенты экстинкции GFP-подобных белков рассчитывают, измеряя общее содержание белка в растворе. Такой подход дает заниженные и плохо воспроизводимые результаты в связи с неполным созреванием белка, которое в свою очередь определяется условиями экспрессии (например, значения коэффициента экстинкции DsRed, полученные различными исследователями, составили 22 500, 75 000, и 57 000 M-1cm-1. В образцах денатурированного (например, под действием кислоты или щелочи) белка, аминокислотное окружение практически не влияет на спектральные характеристики хромофора, что позволяет достоверно оценить концентрацию зрелого белка, измеряя поглощение хромофора. Денатурированный asFP595 в кислой среде имеет пик поглощения при 430 нм, совпадающий с пиком поглощения хромофора в кислом 2-пропаноле. Вычисленный на основании значения коэффициента экстинкции протонированного хромофора, коэффициент экстинкции нативного asFP595 составляет около 150 000 M-1cm-1. Это значение намного выше предложенного ранее (56 000 M-1cmна основании общей концентрации белка. Такая заниженная оценка могла быть вызвана присутствием больших количеств незрелого asFP595 в образце.

1.3 Обсуждение В настоящей работе представлен первый синтетический хромофор красного GFPподобного белка. Разработан эффективный метод синтеза целевого соединения с общим выходом 41%. Ключевой стадией этого метода является окисление метиленовой группы в положении 2 гетероциклического кольца диоксидом селена.

В работе Мартынова с соавторами [Martynov, 2001] на основании непрямых методов была предложена структура хромофора asFP595, содержащая вместо имидазолонового кольца шестичленный дигидропиперазиновый гетероцикл в причудливой зарядовой форме (Рис. 4).

Рис. 4 Структура хромофора хромобелка asFP595, предложенная Мартыновым и соавт.

Кристаллографические исследования недвусмысленно указывают на ошибочность такой структуры. По-видимому, Мартынов и соавторы ошибочно приписали пик хромопептида asFP595 с m/z 564.6 в спектре MALDI-TOF катион-радикалу [M·]+. Если предположить, что пик с массой 564.6 отвечает молекулярному иону [M+Н]+, то молекулярная масса хромопептида 563.6 в точности соответствует структуре хромофора представленной в настоящей работе.

В работе Заграничного и соавторов также была предпринята попытка определения структуры хромофора asFP595 [Zagranichny, 2004]. В этой работе утверждается, что разрыв пептидной цепи по связи между карбоксильным углеродом Cys64 и амидным азотом Met65 приводит к образованию N-незамещенной иминной группы в положении гетероциклического кольца. Такой вывод был сделан на основании сходства спектрофотометрического поведения хромопептидов, полученных ферментативным протеолизом asFP595 и аналогичных пептидов из zFP538. Однако не было представлено прямых свидетельств (ЯМР или МС) наличия незамещенной иминогруппы. Хорошо известно, что незамещенные кетимины подвержены быстрому гидролизу в водных растворах, и поэтому такой фрагмент не мог бы остаться неизменным в указанных в работах Заграничного и соавт. условиях выделения и очистки. Другой аргумент против наличия в структуре хромофора asFP595 незамещенной иминогруппы следует из строения и химических свойств ацилиминов. Ацилиминная группа является наиболее вероятным предшественником зрелых хромофоров zFP538 и asFP595. В то же время, Nацилимины подвержены нуклеофильной атаке не по карбоксильному углероду, (например, сольволизом в метаноле) а по связи C=N, что в случае с asFP595 привело бы к хромофору 2.1.4, содержащему оксо-, а не иминогруппу в положении C метионина 65.

Наконец, многочисленные рентгеноструктурные исследования подтверждают наличие в структуре нативного zFP538 6-членного тетрагидропиридинового цикла, содержащего двойную связь C=N, сопряженную с имидазолоновым ядром, общим для GFP-подбных белков. Соответствующий хромопептид был зафиксирован Заграничным с соавторами, но был признан артефактным. Таким образом, мы предполагаем, что предложенная Заграничным с соавторами структура хромофора asFP595, содержащая незамещенную иминогруппу, является ошибочной.

Все известные структуры хромофоров GFP-подобных белков содержат общее 5арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-оновое ядро. Природа заместителя в положении имидазолона ключевым образом влияет на спектральные свойства белка. Хромофор asFP595 несет в этом положении карбонильную группу. Как показано в настоящей работе, наличие такого заместителя обеспечивает очень большой батохромный сдвиг (по сравнению с хромофором GFP) в 50 и 100 нм в спектрах поглощения нейтральной и анионной форм, соответственно. Сходной величиной батохромного сдвига обладает ацилиминная группа (в хромофоре DsRed и аналогичных белков). Другие изученные заместители обладают меньшими ауксохромными свойствами. Например, иминогруппа C=N в zFP538 обеспечивает батохромный сдвиг в 81 нм (для анионной формы, по сравнению с анионной формой хромофора GFP). Как следует из спектральных свойств хромофора Kaede и его структурных аналогов, сопряженные связи С=С обеспечивают еще меньший батохромный сдвиг.

Хромофор 2.1.4 оказался нестабильным в водных растворах в щелочной среде, что согласуется со свойствами денатурированного щелочью asFP595. В ходе щелочной деградации хромофора 2.1.4 вначале образуется вещество с пиком поглощения при нм (Рис. 2В). По-видимому, этот пик соответствует пику при 380 нм в спектре денатурированного asFP595, который был ранее отнесен к обратимо депротонированному хромофору. Мы полагаем, что спектральная форма с пиком при нм (Рис. 2В) соответствует продукту гидролиза 5-членного цикла в 2.1.4, а спектральная форма с пиком при 330 нм – продуктам дальнейшего гидролиза. Возможно, одним из продуктов гидролиза 2.1.4 является 4-гидроксибензальдегид (максимум поглощения в щелочном водном растворе 330 нм). В то же время, в ходе процесса щелочной деградации 2.1.4 наблюдается накопление спектральной формы с максимумом при нм. Эта форма становится ясно различимой на поздних стадиях процесса деградации (кривая 7 на Рис. 2В). Также, в ходе деградации увеличивается отношение поглощения при 450 и при 520 нм. Предположительно, форма при 450 нм представляет собой хромофор GFP-типа. Однако, для выяснения механизма и строения продуктов гидролиза 2.1.4 требуются дальнейшие исследования.

Значения максимумов поглощения хромофоров GFP и asFP595 сильно зависят от природы растворителя. В частности, длина волны максимума поглощения анионной формы 2.1.4b увеличивается в следующем ряду: вода этанол 2-пропанол диметилформамид (Таблица 1). Мы считаем, что данная зависимость в большей степени определяется не полярностью растворителя (как утверждается в работах Niwa), а бренстедовской кислотностью растворителя. Мы предполагаем, что водородные связи, образуемые фенольным кислородом со своим окружением (белковое окружение или растворитель) способствуют увеличению энергии возбуждения, приближая поведение анионной формы хромофора к нейтральной форме 2.1.4а.

В диметилформамиде анионная форма 2.1.4b обладает спектральными свойствами, близкими к спектральным свойствам нативного asFP595 (положения и формы пиков поглощения, возбуждения и эмиссии). Таким образом, мы считаем, что данная форма соответствует состоянию хромофора в белке. Неожиданно, мы обнаружили, что квантовый выход флуоресценции свободного хромофора в растворе намного выше, чем квантовый выход asFP595. Как правило, для флуоресцентных белков верно обратное.

Например, хромофор GFP практически не флуоресцирует в растворах при комнатной температуре, но при этом обладает очень высоким квантовым выходом флуоресценции в составе нативного белка. Принято считать, что безызлучательный сброс энергии возбужденного состояния происходит за счет фотоизомеризации хромофора, которая в нативном GFP затруднена аминокислотным окружением. Отсутствие флуоресценции у asFP595 и других GFP-подобных хромобелков остается до конца не объясненным на данный момент. Наши данные свидетельствуют, что аминокислотное окружение в asFP595 способствует безызлучательной потере энергии возбужденным состоянием, делая хромофор даже менее флуоресцентным, чем в растворе. В свою очередь, из этого следует, что биологическая функция asFP595 связана скорее с поглощением света, чем с флуоресценцией.

2 Синтез и свойства хромофора красного фотоконвертируемого белка Kaede (Trachyphyllia geoffroyi) и его структурных аналогов Хромофор красного фотоконвертируемого белка Kaede представляет собой (5Z)-5-(4гидроксибензилиден)-2-[(E)-2-(1H-имидазол-5-ил)винил]-3-метил-3,5-дигидро-4Hимидазол-4-он (HYG). Он образуется из трех аминокислотных остатков (His-Tyr-Gly) полипептидной цепи белка Kaede под действием света с длиной волны 350-420 нм. В ходе настоящей работы нами было получено соединение HYG, а также его структурные аналоги, соответствующие тройкам аминокислот Trp–Tyr–Gly, Phe–Trp–Gly, Tyr–Trp– Gly, Asn–Tyr–Gly, Phe–Tyr–Gly и Tyr–Tyr–Gly. Эти соединения были названы в соответствии с однобуквенным обозначением аминокислот WYG, FWG, YWG, NYG, FYG, и YYG, соответственно (Рис. 5).

OH OH OH OH

HYG YYG FYG NYG

Хромофор Kaede (красная форма)

WYG YWG FWG

Рис. 5 Структура хромофора Kaede (HYG) и его аналогов.

2.1 Синтез Окислением легкодоступных 2-метил-5-арилиден-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-онов 2.2. диоксидом селена в кипящем диоксане были получены альдегиды 2.2.2 (Схема 2).

OH OTBS OH

Схема 2 Синтез хромофора Kaede и его аналогов.

Однако, в случае исходного соединения 2.2.1а целевой альдегид оказался неустойчивым, и разлагался с образованием неидентифицированных продуктов при попытке хроматографической очистки. Защита фенольного гидроксила действием третбутилдиметилхлорсилана и диизопропилэтиламина на неочищенный исходный альдегид позволила существенно улучшить устойчивость продукта в условиях хроматографии и альдегид 2.2.2а был получен с общим выходом 57%. Следует отметить, что при хранении при температуре -20°С в течение месяца наблюдалось значительное разложение альдегида 2.2.2а. Защищенные по фенольной группе производные 2.2.1а не давали требуемых альдегидов при действии диоксида селена, а также других окислителей.

Исходное соединение 2.2.1b, содержащее индольный фрагмент, окислялось до соответствующего альдегида 2.2.2b с выходом 73%. Целевые хромофоры были получены по реакции Виттига взаимодействием защищенных альдегидов 2.2.2a и 2.2.2b с соответствующими фосфониевыми солями 2.2.3 (Таблица 2).

Таблица 2 Условия и выходы в реакции Виттига между альдегидами 2.2.2 и фосфониевыми солями 2.2.3.

2.2.2a 4-(TBSO)C6H4CH2PPh3Br (2.2.3b) 2.2.2b 4-(TBSO)C6H4CH2PPh3Br (2.2.3b) [a] 2M водный NaOH / CH2Cl2.

[b] t-BuOK / t-BuOH.

[c] После удаления защитной группы Boc.

Во всех случаях наблюдалась высокая стереоселективность с преобладанием продуктов с Е-конфигурацией вновь образующейся двойной связи (соотношение E/Z 15:1) с характерной константой спин-спинового взаимодействия около 15 Гц. Низкий выход продукта в синтезе HYG может быть вызван побочной реакцией депротонирования имидазольного цикла в соединении 2.2.3e с последующим элиминированием молекулы трифенилфосфина с образованием диазафульвенового интермедиата 2.2.4 вместо требуемой нуклеофильной атаки илида 2.2.5 на альдегид 2.2.2а (Схема 3).

Схема 3 Реакционная способность фосфониевой соли 2.2.3a.

При использовании стерически затрудненного трет-бутилата калия в качестве основания данный побочный процесс преобладал, и образование хромофора HYG не наблюдалось.

Для получения HYG использовалась двухфазная система водный раствор NaOH – дихлорметан. В остальных случаях оба способа проведения реакции Виттига давали сравнимые результаты.

2.2 Спектральные свойства Как мы и ожидали, спектры поглощения хромофора белка Kaede дикого типа HYG обладают отчетливой рН-зависимостью. В водных растворах протонированная форма имеет максимум поглощения при 430 нм (Таблица 3). С увеличением рН пик при 430 нм перетекает в пик при 490 нм с изосбестической точкой при 447 нм и рКа 7.7 (Рис. 6А).

Мы относим данное превращение к депротонированию фенольной гидроксильной группы, аналогично поведению остальных хромофоров GFP-подобных белков. Других спектральных переходов в диапазоне рН 3-14 для HYG не наблюдалось. Природа растворителя оказывает небольшое влияние на величину коэффициента экстинкции и положение максимума абсорбции протонированной формы HYG (Рис. 6В). Напротив, в щелочных условиях спектры поглощения хромофора HYG сильно различаются в зависимости от растворителя. Большой сдвиг в длинноволновую область наблюдается в ряду растворителей вода – этанол – изопропанол – ДМФА – ДМСО (Рис. 6С, Таблица 3).

По сравнению с модельными хромофорами 1.11, содержащими одну или две двойные связи С=С, сопряженных с хромофором GFP, спектры поглощения HYG лежат в более длинноволновой области спектра за счет увеличения системы сопряженных электронов.

Аналоги хромофора Kaede обладают, за некоторыми исключениями, схожими зависимостями спектров от рН и растворителя (Таблица 3 и Рис. 7). Как и ожидалось, хромофор FWG не обладает спектральным переходом в интервале рН 5-10, так как в его структуре отсутствует ответственная за этот переход фенольная гидроксо-группа.

Однако, для этого хромофора наблюдается батохромный спектральный переход с рКа 11.6, связанный, по-видимому, с депротонированием индольного атома азота. При низких значениях рН индол-содержащие хромофоры (WYG, FWG и YWG) обнаруживают спектральный переход с рКа 2.5 – 3.5, давая формы со значительным батохромным смещением. Коэффициенты экстинкции данных форм также значительно возрастают (Таблица 3, Рис. 7С). Вероятно, данный переход объясняется протонированием атома азота индола. Впрочем, для выяснения структуры протонированных WYG, FWG и YWG требуются дополнительные спектроскопические исследования. Остальные Kaede-подобные хромофоры обладают сходным спектральным переходом, но при значительно более низком рН (рКа 1.5). Аналогичный переход с рКа 1.5 описан для хромофора GFP, а также для соединений 1.11. Он соответствует протонированию N-3 имидазолонового цикла. Хромофор NYG, в отличие от остальных представителей ряда, обладает наиболее длинноволновым поглощением в ДМФА, а не в ДМСО.

Таблица 3 Спектральные свойства хромофора Kaede HYG и его аналогов.

Максимум поглощения, нм В воде при pH 5 или в чистых растворителях.

В воде при pH 10 или в растворителях, содержащих 50 мM NaOH.

В ДМФА + 50 мМ NaOH.

При pH Все хромофоры – аналоги Kaede в щелочных растворах ДМФА и ДМСО обладают заметной красной флуоресценцией с квантовыми выходами, превышающими таковые хромофоров GFP и asP595 (Табл. 3, Рис. 7). Наибольшими квантовыми выходами (порядка 0.017) обладают хромофоры – производные триптофана WYG и YWG (для сравнения, измеренный нами квантовый выход хромофора GFP в щелочном ДМФА составил 0.00005). Возможно, объемный остаток триптофана затрудняет фотоизомеризацию, и таким образом препятствует безызлучательному сбросу возбуждения.

Поглощение Поглощение Поглощение HYG. (А) Спектры поглощения растворов структурных аналогов хромофора Kaede.

растворителях при рН 3.5 (В) и 10.1 (С). поглощения хромофоров FYG, NYG и YYG В спектрах эмиссии хромофора HYG в ДМФА и ДМСО наблюдаются максимумы при 582 и 598 нм соответственно. Таким образом, ДМФА хорошо моделирует окружение хромофора в белке Kaede, где наблюдается максимум флуоресценции при 582 нм.В настоящей работе уже было отмечено сходство спектров раствора синтетического хромофора в щелочном ДМФА со спектрами нативного белка asFP595. В отличие от своих структурных аналогов, а также от хромофоров GFP и asFP595, хромофор HYG имеет в спектре эмиссии хорошо различимое плечо при 620-640 нм (Рис. 6А). Такое плечо (пик) в длинноволновой области является характерной особенностью всех белков, гомологичных Kaede. Таким образом, можно сделать вывод, что за такую особенность формы спектров эмиссии Kaede и родственных ему белков отвечает остаток гистидина.

Таблица 4. Спектральные свойства индолсодержащих хромофоров (50 мМ HCl) Все из исследованных нами структурных аналогов хромофора Kaede обладают эмиссией длинноволновой эмиссией обладает хромофор NYG. В щелочном ДМФА максимумы соответствует большому стоксовскому сдвигу (Рис. 8Е). В случае успешного создания функционального мутанта Kaede с заменой H65N, такой мутант будет являться представителем новой группы дальне-красных фотоконвертируемых флуоресцентных Серия синтезированных в настоящей работе структурных аналогов хромофора Kaede позволяет непосредственно сравнить ауксохромные свойства некоторых заместителей Нормализованная флуоресценция могут быть использованы для предсказания оптических свойств Kaede-подобных белков и их хромофоров с помощью квантово-химических расчетов.

Насколько нам известно, в настоящей работе впервые описано депротонирование индольного фрагмента в составе GFP-подобного хромофора. Измеренный нами рКа такого депротонирования составляет 11.6 (для индольной группы WYG), что намного меньше, чем для самого индола (рКа 17 в воде). Мы обнаружили, что модельное соединение, соответствующее хромофору в составе CFP (GFP-Y66W, структура 2.2.1b, Схема 2) в щелочных условиях переходит в спектральную форму с батохромным сдвигом около 80 нм (данные не приведены). По-видимому, данное состояние соответствует депротонированному индольному фрагменту. Возможно, введение основных остатков в окружение хромофора ECFP (или аналогичных мутантов) позволит получить новый (и потенциально практически значимый) тип флуоресцентных белков, содержащих в хромофоре депротонированный остаток триптофана.

Одним из наиболее интересных результатов данной части работы мы считаем обнаружение большого батохромного сдвига в хромофоре NYG. В свете полученных данных, а также учитывая небольшой размер остатка Asn, представляется перспективным создание функционального мутанта Kaede His65Asn.

В настоящее время мы проводим исследования механизма образования хромофоров красных флуоресцентных белков, в том числе Kaede. Если механизм образования хромофора Kaede не включает непосредственное участие имидазольного цикла остатка гистидина, то в этом случае замена His65Asn с сохранением функциональных свойств является принципиально возможной. Также интересным представляется создание мутатнов флуоресцентных белков, содержащих остаток аспарагина в хромофоробразующей триаде в положении 66 (вместо остатка тирозина). В этом случае можно ожидать образование синих флуоресцентных белков, содержащих новый тип хромофора, и соответственно, обладающих необычным фотофизическим поведением. Работы по созданию подобных мутантов в настоящее время ведутся в нашей лаборатории.

3 Синтез и свойства хромофора желтого флуоресцентного белка YFP (Zoanthus sp.) Желтый флуоресцентный белок zFP538 из кораллового полипа Zoanthus проявляет уникальные спектральные свойства, промежуточные между свойствами зеленых и красных флуоресцентных белков (max,ex=528 нм, max,em=538 нм) [Matz, 1999 #409].

Хромофор этого белка образован остатками лизина, тирозина и глицина. Недавно были опубликованы противоречивые версии структуры хромофора zFP538 [Zagranichny, 2004;

Remington, 2005; Pletneva, 2007].

В настоящей работе синтез модельного соединения был использован для разрешения противоречий между кристаллографическими и биохимическими данными. Данный подход позволил выяснить структурную основу сложных спектральных превращений хромофора, описанных в работе Заграничного и соавт.

3.1 Синтез Для получения структуры 2.3.5 был применен разработанный в настоящей работе подход, включающий окисление диоксидом селена на ключевой стадии (Схема 4).

BocNH(CH2)5COOH Схема 4 Синтез хромофора zFP538 (в нециклизованной форме 2.3.5). i) a)гидрохлорид этилового эфира глицина,спиртовой NaOH, DCC b) водный NaOH, этанол, 50°C затем HCl (78%) ii) DCC, затем 4ацетоксибензальдегид, NaOAc iii) MeNH2 iv) Cs2CO3, ДМФА, кипячение 5 мин (64% на 3 стадии) v) SeO2, диоксан, кипячение (51%) vi) CH2Cl2, TFA, комн. темп., 30 мин (100%) Нами был синтезирован имидазолон 2.3.3, содержащий Boc-защищенный аминопентильный заместитель в положении 2 имидазолона путем стандартной последовательности превращений, включающей образование азлактона по Эрленмейеру, его нуклеофильный аминолиз, и циклизацию дегидротирозинового производного 2.3.2 в щелочных условиях. В данной части работы нам удалось подобрать оптимальные условия для трансформации 2.3.2 в 2.3.3, а именно нагревание в ДМФА с карбонатом цезия в качестве основания. Данные условия позволяют достичь количественных выходов, при этом время реакции сокращается до нескольких минут. Мы опробовали данные условия на различных примерах (данные не приведены). В предшествующих работах подобное превращение осуществлялось путем продолжительного (несколько часов) нагревания в водной или спиртовой среде с гидроксидами или карбонатами щелочных металлов в качестве оснований. В тех случаях, когда в положениях 2 и имидазолона находятся простейшие алкильные заместители, оба метода дают хорошие выходы, но последний метод является преимущественным в случае объемных заместителей или при протекании побочных реакций.

Имидазолон 2.3.3 был подвергнут окислению SeO2 в разбавленном диоксановом растворе с образованием Boc-защащенного предшественника 2.3.4 хромофора zFP538.

На последней стадии была удалена защита с аминогруппы выдерживанием 2.3.4 с 20% раствором трифторуксусной кислоты в дихлорметане при комнатной температуре в течение 15 минут, что привело к образованию 2.3.5 в виде трифторацетата.

3.2 Химические и спектральные свойства Несмотря на то, что структура 2.3.5 не воспроизводит состояние хромофора в нативном белке zFP538, мы ожидали, что 2.3.5 самопроизвольно превратится в циклический имин 2.3.7 за счет внутримолекулярной циклизации (схема 5).

Схема 5 pH-Зависимые химические превращения хромофора zFP538.

Действительно, мы наблюдали упомянутое превращение при защелачивании раствора трифторацетата 2.3.5 (увеличение рН от 5.5 до 8.9) в воде или изопропаноле. Данные ЯМР убедительно показали, что в кислой среде (D2O или дейтероизопропанол) состояние вещества описывается структурой линейного аминокетона 2.3.5. В частности, химический сдвиг сигнала C-10 в спектре ЯМР 13C был равен 196.0 м.д. (D2O), что характерно для карбонильной группы (Таблица 5).

Таблица 5 Химические сдвиги ЯМР 1H и 13C соединений 2.3.5, 2.3.6 и 2.3.7, по данным спектров 1H, 13C, HMBC, HSQC, COSY и TOCSY.

Номер

H C H C H C

Нумерация атомов в соответствии со схемой 5.

Раствор 3 мг/мл в смеси H2O-D2O, pH 3.3, 20°C.

Раствор 7мг/мл в изопропаноле -d8, насыщенном Cs2CO3.

Интегральная интенсивность уменьшена в ~10 раз, из-за обмена с дейтерием из растворителя.

Также, не наблюдался кросс-пик между CH2-14 и C-10 в спектре C-H HMBC (нумерация атомов на схеме 5). Спектр ЯМР 1Н в D2O при рН 8.7 был сложным, и включал набор из нескольких различных сигналов от каждой группы протонов (данные не приведены).

Однако такой вид спектра не был результатом разложения 2.3.5, т.к. при подкислении образца до рН 5.5 спектр 1Н оказывался идентичным таковому до подщелачивания.

Сложный вид спектра ЯМР 1Н при рН 8.7 (возможно отражающий сложное конформационное поведение, вызванное затрудненным вращением вокруг некоторых связей) затруднил однозначное определение структуры. Для преодоления этой трудности мы использовали насыщенный раствор карбоната цезия в дейтероизопропаноле в качестве растворителя для ЯМР. В этом случае нам удалось наблюдать в спектрах один набор сигналов, соответствующих циклическому имину 2.3.7. В частности, в спектре 13С химический сдвиг C-10 составил 161.8 м.д., что характерно для иминов, а также наблюдался интенсивный кросс-пик между CH2-14 и C-10 в двумерном спектре C-H HMBC. Интересно отметить, что интегральная интенсивностьсигнала от CH2-11 в спектре 1H была снижена примерно в 10 раз. Данный эффект, очевидно, вызван дейтериевым обменом с растворителем за счет имин-енаминной таутомерии.

Неожиданно, при рН ниже 5, как в воде, так и в изопропаноле, соединение 2.3. медленно превращается в производное 2,6-дикетопиперазина 2.3.6, структура которого была определена методами ЯМР 1H, 13C, HMBC, HSQC, COSY и TOCSY. По данным этих спектров в ходе указанного превращения связанность углеродного скелета не претерпевает изменений, а химический сдвиг С-10 смещается от 196.0 к 156.1 м.д.

Указанные химические превращения вызывают значительные изменения в спектрах поглощения. В водном растворе трифторацетата 2.3.5 при рН 5.5 максимум в спектре поглощения наблюдается при 417 нм (Рис. 9А).

Рис. 9 Спектры поглощения (A-C) и флуоресценции (D-E) водных растворов модельных соединений 2.3.5 -2.3.7. (A) Спектр поглощения 2.3.5 при pH 4.0 (прерывистая линия) и 2.3.7 при pH 8.9 (сплошная линия). (B) Изменение спектра поглощения раствора 2.3.5 при подщелачивании среды до рН 8.9.

Спектры регистрировались с временным промежутком 10 секунд и свидетельствуют о превращении короткоживущей промежуточной формы (депротонированный кетон 2.3.5) с максимумом поглощения 530 нм в циклический имин 2.3.7 с максимумом поглощения 468 нм. (C) Спектры поглощения 2.3.6 при рН 3.0 (прерывистая линия) и при рН 8.0 (сплошная линия). (D) Спектры возбуждения и эмиссии 2.3. при pH 4.0 (серым) и 2.3.7 при pH 8.9 (черным). (E) Спектры возбуждения и эмиссии короткоживущей промежуточной формы (депротонированный кетон 2.3.5), записанные моментально после подщелачивания раствора 2.3.5 до pH 8.9. (F) Спектры возбуждения и эмиссии 2.3.6 при pH 3.0 (серым) и при pH 8.0 (черным). На вкладках D-E для каждой пары спектров возбуждения и эмиссии спектр эмиссии лежит в более длинноволновой области.

При увеличении рН до 8.9 максимум поглощения смещается к 468 нм, через короткоживущую промежуточную спектральную форму (время полужизни около 8 с), с максимумом полгощения при 530 нм (Рис 9А, В). Указанные спектральные превращения могут быть интерпретированы как быстрое депротонирование кетона 2.3.5 (форма с максимумом поглощения 530 нм) и последующая циклизация с образованием депротонированного по фенольному гидроксилу циклического имина 2.3.7 (максимум поглощения 468 нм).

При продолжительной инкубации 2.3.5 в кислой среде (рН5) максимум поглощения смещается в коротковолновую область (от 417 к 397 нм, Рис. 9С), что соответствует превращению 2.3.5 в 2.3.6. В щелочном буфере (рН 8.0) в спектре поглощения 2.3. наблюдается максимум при 505 нм, что соответствует депротонированию фенольной группы.

Спектры флуоресценции 2.3.5, 2.3.6 и 2.3.7 при различных рН также находятся в соответствии с химическими превращениями, показанными на Схеме 5. Соединение 2.3. в кислом водном рстворе обладает слабой флуоресценцией с максимумами возбуждения и эмиссии 419 и 545 нм, соответственно (Рис 9D). При подщелачивании мы наблюдали короткоживущий интермедиат (депротонированный кетон 2.3.5) с максимумами возбуждения и эмиссии 530 и 597 нм соответственно (Рис. 9Е), который претерпевал быстрое превращение в коротковолновую спектральную форму 2.3.7, максимумы возбуждения и эмиссии которой составили 470 и 538 нм (Рис 9D). Структура 2.3.6 в кислой и щелочной среде характеризуется максимумами возбуждения и эмиссии 405/ и 510/579 нм соответственно (Рис. 9F).

3.3 Обсуждение В 2004 году Заграничный и соавторы сообщили о выделении и характеризации хромопептидов, полученных из zFP538 [Zagranichny, 2004]. Ферментативным гидролизом zFP583 были получены три хромопептида, обозначенных авторами как пептиды I, II, и III. Пептид I соответствовал незрелому хромофору GFP-типа, в то время как пептиды II и III образовались из зрелого желтого белка. Основываясь на спектрах поглощения и флуоресценции, а также на неполных данных ЯМР авторы приписали этим пептидам следующие структуры. Пептиду II – структуру линейного аминокетона, аналогичную структуре 2.3.5 в настоящей работе. Пептиду III – необычную и, повидимому крайне нестабильную структуру незамещенного кетимина 2.3.8 (Рис.10).

Рис. 10 Структура, приписанная пептиду III Заграничным и соавт. [Zagranichny, 2004].

Причем именно структура 2.3.8 была постулирована авторами как структура хромофора в нативном зрелом zFP538. В то же время, по данным рентгеноструктурного анализа кристаллов zFP538 хромофор имеет структуру шестичленного циклического имина 2.3.7.

Заграничный и соавт. объяснили данное несоответствие тем, что, якобы, в структуре 2.3.8 может наблюдаться образование циклического аминаля 2.3.9 с вновь образующимся хиральным центром в виде смеси двух диастереомеров, что могло привести к неправильной интерпретации данных РСА за счет усреднения дифракционной картины.

Данное предположение на наш взгляд является абсурдным, так как при химической реакции внутри белковой глобулы крайне маловероятна низкая стереоселективность.

Настоящая работа позволяет прояснить кажущееся противоречие между биохимическими и кристаллографическими данными. Мы обнаружили, что спектральное поведение пептидов II и III из работы [Zagranichny, 2004] практически идентично спектральному поведению соединений 2.3.6, 2.3.5 и 2.3.7. Наблюдается близкое совпадение максимумов поглощения, возбуждения и эмиссии, а также характерное появление промежуточной спектральной формы с длинноволновым поглощением, наблюдаемое при подщелачивании растворов пептида III и соединения 2.3.5 (Таблица 6).


Таблица 6 Сравнение спектральных характеристик синтетических хромофоров 2.3.5 и хромопептидов II and III из работы [Zagranichny, 2004].

Соединение Кислота Щелочь Кислота Щелочь Кислота Щелочь 2.3.6 397 (412) 505 (512) 405 (412) 510 (512) 530 (538) 579 (579) (Пептид II) (Пептид III промежуточная формы) (Пептид III конечная форма) Мы предлагаем следующее объяснение экспериментальных данных, полученных авторами [Zagranichny, 2004]. В ходе денатурации, ферментативного гидролиза и хроматографических процедур при кислых значениях рН, сопровождающих выделение хромопептидов II и III, нативный трициклический хромофор (аналогичный 2.3.7) вначале претерпевает гидролиз до линейной формы (аналогичной 2.3.5), что приводит к образованию пептида III. При более низких значениях рН пептид III частично или полностью трансформируется в пептид II со структурой 2,6-дикетопиперазина (аналогичной 2.3.6). Действительно, относительное содержание пептида II было тем больше, чем более низкие значения рН использовались для денатурации и выделения хромопептидов. Авторам работы [Zagranichny, 2004] не удалось наблюдать сигналы от ключевых атомов в ЯМР-спектрах хромопептидов II и III, что привело к неправильному определению их структуры.

В настоящей работе нами впервые описана необычная изомеризация 2-ацилимидазолона в производное 2,6-дикетопиперазина (превращение 2.3.5 в 2.3.6). Интересно, что 2,6дикетопиперазиновый скелет, присутствующий в соединении 2.3.6, встречается в природе среди вторичных метаболитов грибов, в частности во флутимиде. Флутимид и его структурные аналоги обладают противовирусной и противомикробной активностью.

Ведется разработка лекарств на их основе. Описанный нами синтез 2-ацилимидазолонов с последующей самопроизвольной перегруппировкой в 2,6-дикетопиперазины может рассматриваться как новый эффективный метод синтеза аналогов флутимида. Интересно также отметить, что хромофоры, содержащие ядро 2-ацил-5-арилиден-3,5-дигидро-4Нимидазол-4-онов встречаются в природных белках, а именно в хромобелке asFP595.

Таким образом, можно предполагать, что перегруппировка, аналогичная превращению 2.3.5 в 2.3.6 может наблюдаться в природных или генно-инженерных GFP-подобных белках.

Данное исследование выдвигает аргументы в пользу трициклической иминной структуры хромофора желтого флуоресцентного белка zFP538, выдвинутой авторами рентгеноструктурных исследований, а также предлагает интерпретацию экспериментальных данных, полученных при изучении хромопептидов из zFP538.

Хромофор zFP538 оказался сложной системой с необычными химическими и спектральными свойствами, что вызвало сложности при определении его структуры.

ВЫВОДЫ

1. Разработан общий метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор окрашенного белка asFP595, изучено его спектрохимическое поведение в различных условиях.

Показана тождественность структуры модельного соединения структуре 2. Разработан новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4онов, имеющих функционализированный этенильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор флуоресцентного фотопереключаемого белка Kaede (красная форма). Также синтезированы 6 структурных аналогов хромофора Kaede, соответствующих замене гистидина на другие аминокислоты в хромофоре. Изучены спектрохимические характеристики полученных хромофоров. Показано, что хромофор Kaede-типа, содержащий остаток аспарагина вместо гистидина обладает наиболее длинноволновым поглощением.

3. Получен хромофор желтого флуоресцентного белка zFP538. Независимо показано, что в нативном zFP538 хромофор существует в форме внутримолекулярного имина. Выявлена химическая природа сложного рНзависимого спектрального поведения хромофора zFP538.

4. Обнаружена самопроизвольная перегруппировка 5-арилиден-2-ацил-3,5дигидроимидазол-4-онов в 3-арилиден-5-алкил-2,6-дикетопиперазины в водных и спиртовых растворах в кислой среде.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Yampolsky, I.V., Remington, S.J., Martynov, V.I., Potapov, V.K., Lukyanov, S., and Lukyanov, K.A. (2005) Synthesis and properties of the chromophore of the asFP Chromoprotein from Anemonia sulcata, Biochemistry 44, 5788-5793.

2. Yampolsky, I.V., Kislukhin, A.A., Amatov, T.T., Shcherbo, D., Potapov, V.K., Lukyanov, S., and Lukyanov, K.A. (2008) Synthesis and properties of the red chromophore of the greento-red photoconvertible fluorescent protein Kaede and its analogs, Bioorganic Chemistry 36, 96-104.

3. Yampolsky, I.V., Balashova, T.A., Lukyanov, K.A. (2009) Synthesis and spectral and chemical properties of the yellow fluorescent protein zFP538 chromophore.

Biochemistry 48, 8077– 4. Ивашкин П.Е., Ямпольский И.В., Лукьянов К.А. (2009) Синтез и свойства хромофоров флуоресцентных белков, Биоорганическая химия 35, 726-743.

1. Yampolsky, I. V., Potapov, V. K., Lukyanov, S., and Lukyanov, K. A. (2005).Synthesis and properties of the chromophore of asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata.

International symposium “Advances in Science for Drug Discovery”, Москва, июль 2005, сборник тезисов стр. С-54.

2. Ямпольский И.В. Синтез и свойства модельных хромофоров флуоресцентных белков.

IX Чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), сборник тезисов стр.

280-281.

Заказ № 139-a/09/09 Подписано в печать 21.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1, ООО “Цифровичок”, тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-

 


Похожие работы:

«КОТОВА Яна Николаевна Исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович Официальные оппоненты : доктор медицинских наук,...»

«Иванищева Елизавета Александровна ЛАНДШАФТНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КАРКАСА СЕВЕРО-ЗАПАДА ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08. – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2013 Работа выполнена в лаборатории моделирования экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук Научный руководитель...»

«СКВОРЦОВ ТИМОФЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМА MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ПРИ РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИИ IN VIVO Специальность 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской...»

«Рущук Александр Дмитриевич РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОКРОВ СТЕПЕЙ ЛЕВОБЕРЕЖЬЯ ДНЕСТРА: АНАЛИЗ ФЛОРЫ И КЛАССИФИКАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ Специальность 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Тирасполь 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии естественно-географического факультета ПГУ имени Т.Г. Шевченко Научные доктор сельскохозяйственных наук, руководители...»

«ЕГОРОВ Александр Владимирович ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ -МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2004 2 Работа выполнена в лаборатории Инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Суханова Ирина Васильевна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ВОДОЕМОВ В УСЛОВИЯХ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ (НА ПРИМЕРЕ Г. ТОМСКА) 03.00.16. – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск - 2007 Работа выполнена на кафедре экологического менеджмента ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Адам Александр Мартынович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор...»

«Кармазина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ЦЕНОТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИТИКА МОХООБРАЗНЫХ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА РУССКИЙ СЕВЕР (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре геоботаники Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова доктор...»

«ТЕРЕЩЕНКО ОЛЕСЯ ЮРЬЕВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ АНТОЦИАНОВОЙ ОКРАСКИ У ИЗОГЕННЫХ И ИНТРОГРЕССИВНОЙ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.) 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 1 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской...»

«ЗОЛФАГАРИ АМИР СТРАТЕГИИ РАЗМНОЖЕНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ PHYTOPHTHORA INFESTANS В ИРАНСКОМ ГОЛЕСТАНЕ И МОСКВЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ФУНГИЦИДОВ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 03.02.12 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева Научный Доктор биологических наук, профессор кафедры...»

«Антонов Алексей Иванович КУЛИКИ (CHARA DRII) П РИАМУ РЬЯ : ВИДОВОЙ СОСТАВ, МИГРАЦИИ, РЕСУ РСЫ И ОХРАНА 03.02.14 — биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток 2011 2 Работа выполнена в Тихоокеанском институте географии ДВО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Бочарников В. Н. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Мартыненко А. Б., кандидат биологических...»

«НИМБУЕВА АЮНА ЗОРИКТОЕВНА ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ В ОРГАНИЧЕСКОМ ВЕЩЕСТВЕ ЛУГОВО-ЧЕРНОЗЕМНЫХ МЕРЗЛОТНЫХ И СЕРЫХ ЛЕСНЫХ ПОЧВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.00.27 – Почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук г. Улан- Удэ 2007 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор...»

«ФЕДОСЕЕВА ЛАРИСА АБРАМОВНА ЭКСПРЕССИЯ КЛЮЧЕВЫХ ГЕНОВ РЕНИНАНГИОТЕНЗИНОВОЙ СИСТЕМЫ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС НИСАГ 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2014 Работа выполнена в лаборатории структуры генома и лаборатории эволюционной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск. Научные руководители: доктор биологических наук,...»

«Хутакова Светлана Владимировна ГИДРОМОРФНЫЕ ПОЧВЫ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА Специальность 03.00.27 - почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2007 Работа выполнена на кафедре почвоведения и агрохимии ФГОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Р. Филиппова Научный руководитель : доктор биологических наук Убугунова Вера Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Бадмаев...»

«Бедарева Ольга Михайловна ЭКОСИСТЕМЫ СРЕДНИХ ПУСТЫНЬ КАЗАХСТАНА И ИХ ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ МЕТОДАМИ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Калининград 2009 2 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научные консультанты: академик Национальной Академии Наук Республики...»

«Штумпф Дарья Сергеевна СПИРОХЕТОЗ КУР (МОРФОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ЛЕЧЕНИЕ) 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Ставрополь – 2010 Работа выполнена на кафедре паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, профессор Луцук Светлана Николаевна Официальные оппоненты : доктор ветеринарных наук Оробец...»

«КОЛЕСОВА Мария Анатольевна ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ ОБРАЗЦОВ D-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА AEGILOPS L. К ЛИСТОВЫМ БОЛЕЗНЯМ (ЛИСТОВАЯ РЖАВЧИНА, СЕПТОРИОЗ, ТЕМНО-БУРАЯ ЛИСТОВАЯ ПЯТНИСТОСТЬ) Специальности: 03.00.15 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург - 2007 Диссертационная работа выполнена в отделе иммунитета Государственного научного центра Российской Федерации...»

«СНАКИНА Татьяна Ивановна ИНТРОДУКЦИЯ ГОЛУБИКИ ТОПЯНОЙ VACCINIUM ULIGINOSUM L. В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2007 Работа выполнена в Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск Научный руководитель – кандидат биологических наук, профессор Горбунов Алексей Борисович. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, с.н.с. Высочина Галина...»

«ПРОВОРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты Специальность 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации, представленной в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт...»

«Ташлыкова Наталия Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ФИТОПЛАНКТОНА ДЕЛЬТОВЫХ ПРОТОК РЕКИ СЕЛЕНГИ И СОРА ЧЕРКАЛОВО (ОЗ. БАЙКАЛ) 03.00.16 – экология 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2009 Работа выполнена в Институте природных ресурсов, экологии и криологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Чита доктор биологических наук, Научные руководители: Г.И. Поповская кандидат...»

«Лузянин Сергей Леонидович ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ЭКОЛОГИЯ ПЧЁЛ ТРИБЫ BOMBINI (HYMENOPTERA, APIDAE) ЕСТЕСТВЕННЫХ И УРБАНИЗИРОВАННЫХ ЭКОСИСТЕМ КУЗНЕЦКО-САЛАИРСКОЙ ГОРНОЙ ОБЛАСТИ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Еремеева Наталья Ивановна...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.