WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ГРОМОВЫХ Петр Сергеевич

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ

С-КОНЦЕВЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЕРМОРФИНА

03.00.23 – Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН академик РАН, доктор химических наук, профессор

Научный руководитель:

Мясоедов Николай Федорович доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Безуглов Владимир Виленович кандидат химических наук Кириллова Юлия Геннадьевна Московский государственный университет им. М.В.

Ведущая организация:

Ломоносова

Защита состоится « » 2008 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. (119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан «_»«» 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

*

Актуальность работы. Боль является одной из наиболее частых причин обращения людей за медицинской помощью, поэтому проблема создания высокоэффективных и безопасных болеутоляющих средств сохраняет свою актуальность (Gureje et al., 2001; Павленко и др. 2002). В настоящее время терапия острой и хронической боли основывается на применении трех основных групп лекарственных средств: опиоидов, нестероидных противовоспалительных препаратов, и группы веществ из других фармакологических классов, обладающих в качестве побочного эффекта обезболивающим действием (антидепрессанты, антиконвульсанты, анестетики, агонисты 2-адренорецепторов и т.д.). Традиционные подходы в лечении болевых синдромов не всегда эффективны и сопряжены с риском возникновения побочных эффектов.





Наиболее эффективными анальгетиками при лечении большинства тяжелых болевых синдромов (онкологические, постоперационные боли и т.д.) по-прежнему остаются опиоиды, несмотря на то, что их применение ограничено риском развития лекарственной зависимости и эффектами, связанными с передозировкой. В регулировании различных систем организма, в том числе ноцицепции и антиноцицепции, участвуют эндогенные пептиды. Большинство природных пептидных соединений обладает большим количеством эффектов, что затрудняет создание на их основе лекарственных препаратов, поэтому целесообразен поиск эндогенных опиоидных веществ, отвечающих за появление избирательного анальгетического действия.

обладает самой высокой и продолжительной анальгетической активностью (Stevens et al., 1986, Basso et al., 1985). Однако, как и большинство эндогенных пептидов, дерморфин обладает широким спектром физиологической активности: оказывает влияние на функции сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной и выделительной систем и влияет на различные формы поведения животных (Melchiorri and Negri, 1996). Подобная полифункциональность затрудняет создание селективного анальгетика на основе дерморфина. С этой целью были проведены исследования, направленные на выявление минимального фрагмента дерморфина, сохраняющего анальгетическое действие.

_ В руководстве работой принимала участие к. б. н. Гузеватых Л.С.

Список используемых сокращений: ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография, ГЭБ – гематоэнцефалический барьер, ДМ – дерморфин, НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты, ОМР – относительная молярная радиоактивность, ОР – опиоидные рецепторы, ПКМС – подвздошная кишка морской свинки, РРА – радиорецепторный анализ, СПМ – семявыносящий проток мыши, ТСХ – тонкослойная хроматография. ТФУ – трифторуксусная кислота, ТЭА – триэтиламин, ЦНС – центральная нервная система, ЯМР – ядерный магнитный резонанс, BOC – трет-бутилоксикарбонильная группа, BSA – бычий сывороточный альбумин; DAGO – [D-Ala2, MePhe4, Gly-ol5]-энкефалин.

Путем укорачивания молекулы дерморфина с C-конца было установлено, что Nконцевой тетрапептид Tyr-D-Ala-Phe-Gly является самым коротким фрагментом, сохраняющим биологическую активность (Broccardo et al., 1981). Установлено, что при протеолизе дерморфина ферментами гомогената мозга основное место разрыва цепочки – связь Gly4-Tyr5, в результате чего образуются N-концевой тетра- и C-концевой трипептиды (Negri and Improta, 1984). Сведения о биологических свойствах C-концевого трипептида Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH2 отсутствуют.

Стереохимическая модификация Pro6 в молекуле дерморфина приводит к усилению анальгетической активности (Гузеватых и др. 2002), что указывает на значимость Сконцевого участка гептапептида для проявления обезболивающего действия. Поэтому в настоящее время C-концевые фрагменты представляют большой интерес и являются объектом пристального изучения. Они могут быть использованы в качестве основы для создания новых анальгетиков. Для изучения пептидов этой группы необходимо получить их меченые аналоги, позволяющие исследовать взаимодействие пептидов с эндогенной опиоидной системой, изучить кинетику распределения и метаболизма в организме.





Работа выполнена при частичной поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов «Ведущие научные школы» № НШ-2150.2003.4, № НШ-5638.2006.4 и Государственных контрактов «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, № 02.445.11.7150, № 02.245.11.7317; 2007-2012 годы, № 02.512.11.2124.

Цель работы:

Синтез и изучение биологических эффектов С-концевых фрагментов дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- синтез трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, их ненасыщенного аналога Tyr-DL-Pro-Ser-NH2 и тетрапептида Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2 в для введения трития количествах, необходимых для проведения биологических исследований;

и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 в количествах, необходимых для проведения биологических исследований;

- изучение анальгетической активности трипептидов Тyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-SerNH2 в сравнении с активностью дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина;

- изучение влияния антагонистов опиоидых рецепторов налоксона и налоксона метиодида на проявление анальгетического действия дерморфина и [D-Pro ]-дерморфина;

- изучение распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов Tyr-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 после однократного внутримышечного введения крысам;

- изучение взаимодействия Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 с плазматическими мембранами головного мозга крысы;

[3H]-дерморфина-(1-4) трипептидами Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2;

- изучение взаимодействия Tyr-D-Pro-Ser-NH2, с периферическими опиоидными рецепторами препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки (µ-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (-опиоидные рецепторы).

Методами пептидного синтеза в растворе были получены трипептиды Tyr-Pro-SerNH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, Tyr-DL-Pro-Ser-NH2 и тетрапептид Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2.

Впервые получены меченные тритием аналоги дерморфина Tyr-[3,4-3H]-Pro-SerNH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 и показано, что наилучшими условиями для их синтеза является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития.

Впервые исследовано распределение по органам и динамика выведения Сконцевого фрагмента дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH и установлено, что трипептиды способны проникать в мозг.

Впервые показано, что С-концевые фрагменты дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2, TyrD-Pro-Ser-NH2 обладают анальгетической активностью сопоставимой или превышающей активность дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина. Установлено, что анальгетический эффект дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и их С-концевых фрагментов Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2 уменьшается при совместном введении с налоксоном и налоксоном метиодидом, что может предполагать наличие одного из механизмов анальгетического опиоидергическую систему организма.

Впервые радиорецепторными исследованиями выявлены два центра связывания дерморфина с плазматическими мембранами головного мозга крыс и показано, что СTyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH преимущественно с «высокоаффинными» местами насыщения [ H]-дерморфина и не влияют на связывание [3H]-дерморфина с «низкоаффинными» местами связывания на плазматических мембранах головного мозга крыс.

Впервые показано, что трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2 не влияют на связывание N-концевого фрагмента дерморфина [3H]-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2 на плазматических мембранах головного мозга крыс.

Впервые показано, что С-концевые фрагменты дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 имеют низкое сродство к периферическим µ- и опиоидным рецепторам препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока мыши.

Практическая значимость Подобраны условия химического синтеза C-концевых фрагментов дерморфина и их меченых аналогов. Разработанный метод получения меченных тритием пептидов может быть рекомендован для синтеза меченных тритием препаратов, применяемых в медикобиологических исследованиях.

Получены и исследованы новые пептиды, перспективные для создания на их основе анальгетиков нового поколения. Полученные данные демонстрируют, что трипептиды могут рассматриваться в качестве потенциальных лекарственных веществ.

Апробация работы Материалы диссертации представлены на четвертом Всероссийском съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), на третьем Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), на семинарах сектора регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН.

Публикации По основным результатам диссертации опубликовано 7 научных работ. В изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликовано 4 статьи.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы, состоящего из источников.

Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время известно лишь два уникальных семейства природных пептидов, содержащих D-аминокислотный остаток – это дерморфины и дельторфины (Negri et al., 2000), при этом оба семейства пептидов обладают высокой биологической активностью и имеют общий предшественник – продерморфин (Amiche et al., 1990). Распределение дерморфинов в органах и тканях животных свидетельствует о вовлечении их в регуляцию ряда жизненно важных функций, обеспечивающих поддержание жизнедеятельности организма. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что, являясь мощнейшими анальгетиками, дерморфины эффективны при периферическом введении, действуют преимущественно на спинальном уровне и обладают менее выраженными негативными эффектами, которые характеры для опиоидов (толерантность, физическая зависимость, угнетение процессов дыхания и др.). Поэтому новые аналоги дерморфина, активные при периферическом введении и лишенные побочного действия, представляют большой теоретический и практический интерес в качестве основы для создания новых сильных анальгетиков с легким седативным эффектом. Подход, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН и ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, позволил создать принципиально новую группу соединений, общей формулы А-B-Tyr-Pro (D-Pro, Pro, D,Pro, Hyp)-В-X, обладающих анальгетической активностью (Гузеватых 2005, 2007, 2008). Этот класс пептидов включает в себя С-концевые фрагменты дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2.

В данной работе химическим синтезом были получены трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, Tyr-DL-3,4- Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2, их меченые аналоги Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2.

исследований анальгетической активности трипептидов, кинетики распределения и накопления в органах и крови крысы, взаимодействие с опиоидергической системой организма.

1. Химический синтез пептидов и их меченых аналогов Синтез трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, Tyr-DL-3,4- Pro-Ser-NH проводили в соответствии со схемой 1 (а), а тетрапептида Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2 – в соответствии со схемой 1 (б).

На первом этапе синтеза трипептидов получали дипептиды Boc-Tyr(Boc)-Pro-OH (Ia), Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-OH (Ib) и Boc-Tyr(Boc)-DL-3,4- Pro-OH (Ic) путем конденсации аминокислот с применением методов смешанных ангидридов и активированных эфиров.

Синтез трипептидов Boc-Tyr(Boc)-Pro-Ser-NH2 (IIIa), Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-Ser-NH2 (IIIb), Boc-Tyr(Boc)-DL-3,4- Pro-Ser-NH2 (IIIc) осуществляли конденсацией дипептидов (Ia), (Ib) и (Iс) c метиловым эфиром серина и последующим аммонолизом. Деблокированием соответствующих Boc-производных получали необходимые стандарты свободных пептидов в виде гидрохлоридов, HCl·H-Tyr-Pro (Va), HCl·H-Tyr-D-Pro (Vb), HCl·H-ProSer-NH2 (VI), HCl·H-Tyr-Pro-Ser-NH2 (IVa), HCl·H-Tyr-D-Pro-Ser-NH2 (IVb), HCl·H-Tyr- DL-3,4- Pro-Ser-NH2 (IVc).

Синтез дипептида (Ib) и его аналогов (Ia), (Ic) осуществляли в растворе ацетонитрила при температуре +4 оС. Выход Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-OH составил 81 %.

Методом тонкослойной хроматографии было установлено, что полученное соединение имеет фактор удерживания Rf, равный 0.52 в хроматографической системе хлороформметанол-концентрированный раствор аммиака, 8:1.75:0.25 (Б) и температуру плавления 75-77 °C. При аналогичных условиях синтеза выход дипептида (Ia) составлял 95 %.

Дипептид имеет температуру плавления 79-81 °C и фактор удерживания Rf равный 0,26 в хроматографической системе ацетон-бензол-уксусная кислота, 2:1:1 (А).

На второй стадии были синтезированы гидроксисукцинимидные эфиры дипептидов, из которых получали метиловые эфиры трипептидов Boc-Tyr(Boc)-Pro-SerOCH3 (IIa), Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-Ser-OCH3 (IIb) и Boc-Tyr(Boc)-DL-3,4-Pro-Ser-OCH (IIc) (Andreeva et al., 1992). Установлено, что наибольший выход при конденсации дипептидов с метиловым эфиром серина HCl·Ser-OCH3 был получен при синтезе трипептида (IIa) и составил 96 %. Температура плавления продукта 81-83 °C, фактор равен 0,27 в хроматографической системе ацетон-бензол-уксусная удерживания Rf кислота, 2:1:1 (A).

На третьей стадии синтеза был проведен аммонолиз метиловых эфиров трипептидов и получены амиды трипептидов (IIIa), (IIIb) и (IIIс). Наибольший выход ( %) был получен при синтезе амида трипептида (IIIa). Амиды трипептидов имеют близкую температуру плавления, варьирующую в пределах 115-129 C. Завершающая стадия синтеза – деблокирование защитных групп амидов трипептидов. Наибольший выход 97 % составил при синтезе трипептида HCl·Tyr-D-Pro-Ser-NH2.

Cинтез тетрапептида Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2 (XII) проводили путем конденсации дипептидов Boc-Tyr(Boc)-D-Ala-OH (VII) и Boc-Phe-Gly-OCH3 (VIII), которые получали методами смешанных ангидридов и активированных эфиров (схема 1 (б)). Защитную конденсацию дипептидов последних стадиях синтеза проводили аммонолиз и деблокирование защитных групп тетрапептида.

На первой стадии методом смешанных ангидридов в растворе ацетонитрила был получен дипептид (VII), выход которого составил 81 %. Полученное соединение имеет фактор удерживания Rf равный 0,57 в хроматографической системе хлороформ-метанолконцентрированный раствор аммиака, 8:1.75:0.25 (Б) и температуру плавления 171-173 °C.

На второй стадии с использованием пентафторфенилового эфира Boc-Phe-OPfp и метилового эфира глицина HCl·Gly-OCH3 был синтезирован дипептид (VIII) в растворе диметилформамида. Выход продукта составил 92 %, температура плавления 56-58 °C и фактор удерживания Rf кислота, 2:1:1 (А).

На третьей стадии деблокировали защитную группу у дипептида (VIII), при этом выход дипептида (IX) составил 96 %. Путем конденсации дипептидов (VII) и (IX) методом смешанных ангидридов был получен тетрапептид Boc-Tyr(Boc)-D-Ala-Phe-GlyOCH3 (X), выход которого составил 82 %, температура плавления 150-153 °C и фактор удерживания распределения Rf 0,41 в хроматографической системе хлороформ-метанолконцентрированный раствор аммиака, 8:1.75:0.25 (Б). Аммонолизом метилового эфира завершающей стадии деблокировали защитные группы и был получен тетрапептид (XII).

Выход продукта составил 94 %.

Гомогенность полученных продуктов синтеза характеризовали с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия), температурами плавления на плавильном столике фирмы Boetius (Германия). Структуру конечных деблокированных пептидов подтверждали данными масс-спектрометрии, 1H- и 13С-ЯМР-спектроскопии.

Важной характеристикой при изучении динамики выведения пептидов является время удерживания пептида, оцениваемое с помощью ВЭЖХ. Установлено, что время удерживания D- и L-изомеров Pro-Ser-NH2 и пролина было одинаковым и составило 1.49 и 1.76 мин соответственно. Иные результаты получены для D- и L-изомеров Tyr-Pro-SerNH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2. Время удерживания для D-изомера больше, чем для L- и составило 14.21 мин и 13.56 соответственно.

Для количественного определения концентрации трипептидов и их фрагментов в органах и тканях крыс были использованы меченые аналоги. В качестве радионуклида в работе использовали 3Н (тритий), так как он относительно доступен и имеет хорошие характеристики (Шевченко и др. 2003). Учитывая, что в процессе протеолиза деградация трипептидов Tyr-D-Pro-Ser-NH2 и Tyr-Pro-Ser-NH2 может проходить с образованием дипептидов Tyr-D-Pro, D-Pro-Ser-NH2, Tyr-Pro и Pro-Ser-NH2 и аминокислот были синтезированы трипептиды, меченные тритием по Pro2.

Синтез меченных тритием типептидов Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-ProSer-NH2 проводили в соответствии со схемой 2.

N CH C NH CH C NH

H3C C O C NH CH C N H3C C O C NH CH C

Использование для введения тритиевой метки твердофазного и жидкофазного гидрирования дегидропролинового предшественника Boc-Tyr(Boc)-DL-3,4-Pro-Ser-NH газообразным тритием в присутствии катализатора показало, что с точки зрения оптимального сочетания выхода и молярной радиоактивности целевого пептида наилучшим синтетическим методом является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития (растворитель – диоксан, катализатор – PdO (5%)/BaSO4 (95 %), 3 ч при комнатной температуре). Смесь меченых диастереомеров деблокировали и разделяли методом ВЭЖХ, что позволило получить меченые пептиды Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 с молярной радиоактивностью – 35 Ки/ммоль, достаточной для проведения исследований распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов.

2. Изучение анальгетической активности пептидов нелинейных крыс массой 180-250 г и беспородных мышей массой 20-22 г. При оценке болевой чувствительности в тесте отдергивания хвоста учитывали латентный период отдергивания хвоста крысы после погружения его в горячую воду (t° = 56 °C) (D`Amor, 1941). При оценке болевой чувствительности в тесте уксусных корчей регистрировали число корчей у мышей за 30 мин после внутрибрюшинного введения 0.6 % раствора уксусной кислоты (Chernov et. al., 1967). Пептиды вводили внутрибрюшинно в диапазоне доз 0.1-10 мг/кг веса животного в виде водного раствора за 20 минут до тестирования.

Животным опытной группы вводили раствор пептида, а контрольной - эквивалентный объем физраствора.

Влияние трипептидов на соматическую болевую чувствительность оценивали с помощью теста отдергивания хвоста, который характеризует болевую реакцию на раздражение терморецепторов кожи. В результате этого действия возникает спинальный флексорный (или сгибательный) рефлекс, направленный на устранение хвоста из области повреждающего воздействия. Наличие анальгетического действия проявляется в увеличении времени реакции животного (латентный период) на болевой раздражитель (Bars et al., 2001).

С использованием теста отдергивания хвоста, установлено, что трипептиды Tyr-ProSer-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в дозах 0.1, 1.0 и 10.0 мг/кг обладают анальгетической активностью. Достоверные отличия латентного периода от контрольной группы наблюдаются через 20, 40, 60 и 90 мин после введения всех исследуемых доз трипептидов.

Дерморфин проявляет анальгетическое действие в дозах выше 1 мг/кг. [D-Pro6]дерморфин обладает дозо-зависимым анальгетическим эффектом при введении в дозах 0. - 10 мг/кг. Так, при введении 0.1 и 1.0 мг/кг доз пептида достоверные отличия регистрировались через 20, 40, 60 и 90 мин, а 10.0 мг/кг – через 20, 40, 60, 90 и 120 мин (таблица 1).

Таблица 1 – Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и их C-концевых трипептидов на болевую чувствительность в тесте уксусных корчей Примечание: * - достоверность отличий от контроля по U-критерию Вилкоксона-МаннаУитни при p0.05.

Болевая реакция в тесте уксусных корчей возникает вследствие комплексного воздействия на рецепторы висцеральных органов протонами (Н+) и медиаторами воспаления (Bars et al., 2001). Исследования показали, что число корчей за 30 мин в контрольной группе животных составило 38.5±10.1. Трипептид Tyr-Pro-Ser-NH2 дозозависимо достоверно снижал количество корчей. Введение 0.1, 1.0 и 10.0 мг/кг доз Аналогичный анальгетический эффект установлен и для Tyr-D-Pro-Ser-NH2, который достоверно уменьшал число уксусных корчей при введении 0.1, 1.0, 10.0 мг/кг на 71.9, 73.2 и 98.8 % соответственно.

Введение дерморфина дозо-зависимо уменьшало число корчей. Так, при введении дозы 0.1 мг/кг этого пептида количество корчей уменьшалось на 57.3 %, 1.0 мг/кг – на 81.1 %, а в дозе 10.0 мг/кг – полностью устранялись болевые реакции. При введении [DPro6]-дерморфина в дозах 0.1 и 1.0 мг/кг достоверно уменьшается число корчей на 77.7 % и 76.0 % соответственно, а в дозе 10.0 мг/кг – на 95 %.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в тесте отдергивания хвоста и уксусных корчей обладают анальгетическим действием, сравнимым с таковым для дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина. Стереохимическая модификация Pro2 трипептида Tyr-Pro-Ser-NH2 не приводит к значительному изменению анальгетической активности в отличие от модификации Pro6 дерморфина. Полученные в работе результаты позволяют предположить возможность применения Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в качестве пептидных анальгетиков.

Влияние антагонистов опиодных рецепторов на анальгетическую активность пептидов Неселективный антагонист µ-, -, -, и -опиоидных рецепторов налоксон (SantosArteaga et al., 2003) уменьшает анальгетическое действие Tyr-Pro-Ser-NH2 на 54.1 %, а периферический неселективный антагонист µ-, -, - и -опиоидных рецепторов налоксон метиодид (Ji et al., 2006) - на 48.5 %. Совместное введение Tyr-D-Pro-Ser-NH2 с налоксоном снижает анальгетическую активность на 55.7 %, а одновременное введение с налоксоном метиодидом – на 44.8 %. Таким образом, в тесте отдергивания хвоста налоксон и налоксон метиодид при одновременном введении с пептидами полностью не устраняют анальгетическую активность последних. Аналогичные результаты были анальгетического действия изучаемых пептидов в тесте соматической боли участвует не только опиоидергическая система организма.

В тесте уксусных корчей налоксон и налоксон метиодид полностью устраняли анальгетическое действие Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, дерморфина и [D-Pro6]дерморфина. Следовательно, в механизме анальгетического действия изучаемых пептидов в тесте висцеральной боли участвует только опиоидергическая система организма.

Не выявлено существенных различий в эффективности блокирования анальгетического действия пептидов налоксоном, проникающим через ГЭБ, и налоксон метиодидом, не проникающим через ГЭБ. Это свидетельствует о преимущественно периферическом анальгетическом механизме действия пептидов.

Таким образом, можно предположить, что при раздражении висцеральных рецепторов кислотой в обезболивающем действии пептидов принимают участие периферические налоксон-чувствительные механизмы. При термическом раздражении рецепторов хвоста, являющихся рецептивным полем спинального флексорного рефлекса, обезболивающее действие пептидов связано не только с периферическим налоксончувствительным, но и налоксон-нечувствительным механизмом.

3. Изучение распределения по органам и динамики выведения пептидов Изучение распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 проводили на самцах беспородных белых крыс весом 200±20 г. Животным однократно внутримышечно вводили водные растворы (200 мкл) смеси 200 мкКи (0.06 мкмоль) меченого ( Ки/ммоль) и 198 мкг (0.54 мкмоль) нерадиоактивного пептидов. Динамику выведения пептидов оценивали по результатам анализа образцов крови и органов крыс. Выделение пептидной фракции проводили твердофазной экстракцией, предварительную очистку и анализ - методом ВЭЖХ.

Показано, что после внутримышечного введения трипептиды Tyr-[3,4-3H]-Pro-SerNH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 присутствуют в крови только в течение пяти минут, причем их концентрация составляет 0.31 %. Это свидетельствует о быстром выведении трипептидов из крови в другие органы, а также их протеолизе под действием ферментов плазмы крови.

Основное накопление трипептида Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 наблюдается в почках:

через 5 минут после введения концентрация пептида составляет 0.84 %, а через 20 минут уже 3.58 %, затем через 80 минут содержание постепенно снижается до 0.23 %. В этот период трипептид уже отсутствует в крови. Аналогичная динамика накопления и выведения трипептида наблюдается в печени и легких. Незначительное количество трипептида проникает в мозг, при этом наибольшая концентрация отмечается через минут после введения (рисунок 1).

Полученные результаты согласуются с литературными данными, полученными для дерморфина. Показано, что при внутрибрюшинном введении дерморфина основное его количество аккумулируется в почках и печени, где он накапливается и подвергается действию пептидаз и лишь его незначительная часть (0.0005 %) проникает в мозг (Negri and Improta, 1984).

Трипептид Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 имеет сходную фармакокинетику с Tyr-[3,4H]-Pro-Ser-NH2 и также накапливается в крови только в течение первых 5 минут после введения, различается незначительно.

Иная тенденция отмечается в почках: максимальное количество обоих изомеров отмечается через 20 минут, однако концентрация D- превышает концентрацию Lстереоизомера. Это обстоятельство обусловлено присутствием D-аминокислотного остатка в молекуле трипептида и меньшей скоростью протеолиза Аналогичная динамика накопления и выведения трипептида отмечается и в легких.

Содержание, % Рисунок 1 - Изменение во времени содержания H-Tyr-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2 в Следует отметить, что во всех органах аккумулируется значительно больше D-, чем L-трипептида. Так, в сердце в течение первых 5 мин наблюдается почти одинаковое накопление как Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2, так и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2, но затем Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 остается практически неизменным (рисунки 1 и 2). Таким образом, можно сделать утверждение о том, что D- и L-стереоизомеры с одинаковой скоростью проникают в кровь, накапливаются в органах, способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и накапливаться в мозге. При исследовании метаболизма трипептидов в органах и крови крыс не удалось детектировать какие-либо радиоактивные метаболиты, кроме изомерных L- и D-пролинов. Это наблюдение, возможно, указывает на высокую скорость протеолитической деградации трипептидов по обеим пептидным связям, независимо от конфигурации пролина.

Содержание, % Рисунок 2 - Изменение во времени содержания H-Tyr- [3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 в Во всех тканях крысы образование меченого пролина из L- идет быстрее, чем D-Pro из D-стереоизомера, что, по-видимому, связано с меньшей скоростью метаболизма Dтрипептида. Поэтому меньшее содержание L-трипептида в мозге крысы обусловлено более быстрым его протеолизом. Суммарное количество радиоактивности в мозге крысы в системе L-трипептид плюс Pro и в системе D-трипептид плюс D-Pro практически одинаковое. Это может быть связано с тем, что оба изомера трипептида проникают в мозг крысы в одинаковом количестве после их внутримышечного введения, а через 5 минут после введения (первая временная точка) двукратное преобладание D-трипептида связано с более быстрым протеолизом L-трипетида.

Исследования показали, что стереохимическая модификация Pro2 влияет на скорость метаболизма, следовательно, этот аминокислотный остаток играет важную роль в устойчивости молекулы трипептидов к воздействию протеолитических ферментов.

Накопление во всех органах и крови крысы большего количества D-трипептида, чем Lтрипептида является важным доказательством большей устойчивости к протеолизу пептида, содержащего D-аминокислотный остаток пролина.

4. Изучение рецепторного механизма действия пептидов Оценку способности трипептидов взаимодействовать с рецепторами головного мозга крысы проводили радиорецепторным методом, используя P2 - мембранную фракцию, полученную по стандартной методике микроварианта радиорецепторного анализа применяли плоскодонные планшеты “Limbro” (Великобритания), которые практически не сорбируют меченые лиганды. В работе изучали конкурентное связывание меченных тритием пептидов Tyr-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2, Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2, [3H]-дерморфина и [3H]-дерморфина-(1-4). Определение концентрации белка в инкубационной смеси проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1958) с использованием реагентов фирмы «Sigma» (США) на спектрофотометре фирмы «Perkin-Elmer» (ФРГ). Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (BSA).

С помощью радиорецепторного анализа на плазматических мембранах головного мозга крыс было показано, что специфическое связывание (SB), определенное как разница между общим (TB) и неспецифическим (NB) связыванием на плазматических мембранах головного мозга крыс, в присутствии избытка (5 мкМ) немеченого лиганда составило в среднем 60 % от TB. Исследование кинетики связывания Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и TyrH]-D-Pro-Ser-NH2 с плазматическими мембранами при 25 С показало, что SB возрастает в течение первых 10 минут, но затем оно быстро уменьшается и через 20 минут в инкубационной смеси не обнаруживается связанного лиганда (рисунок 3).

присутствующим в инкубационной смеси, поэтому в дальнейшей работе в качестве известного лиганда опиоидных рецепторов был выбран [3H]-дерморфин и проводилось исследование конкурентного вытеснения [3H]-дерморфина* трипептидами Tyr-Pro-SerNH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 на плазматических мембранах головного мозга крысы. Изучение кинетики связывания [3H]-дерморфина P2 мембранной фракцией головного мозга крысы показало, что равновесное насыщение наступает через 20 мин (рисунок 4, б). Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными (Amiche et al., 1988).

различных концентрациях с плазматическими мембранами головного мозга крысы показали, что дерморфин имеет две участка насыщения, соответствующие областям 1.5- нМ и 5 нМ. (рисунок 4, а).

Специфическое связывание, пМ двух участков связывания [3Н]-дерморфина. Первому соответствует константа связывания Kd = 0.26 ± 0.07 нМ и концентрация рецепторов Bmax = 24.12 ± 0.66 фмоль/мг белка, второму - Kd=1.70 ± 0.01 нМ и концентрация рецепторов Bmax = 52.94 ± 4.4 фмоль/мг белка. Таким образом, полученные результаты противоречат данным, приведенным в _ *[3H]-дерморфин (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2) был любезно предоставлен В.П. Шевченко (Институт молекулярной генетики РАН) Рисунок 5 – Зависимость специфического связывания [3H]-дерморфина в (Amiche et al.,1987; 1988; 1990), где было показано наличие только одного участка специфического связывания дерморфина с рецепторами головного мозга крысы и определена константа связывания, варьирующая от Kd=0.86 нМ до Kd=0.46 нМ (рисунок 5).

Полученные отличия можно объяснить тем, что дерморфин под действием ферментов гомогената мозга гидролизуется с преимущественным образованием Nконцевого тетра- и С-концевго трипептидов (Negri and Improta, 1984). Использование меченного тритием дерморфина с меткой по Tyr1 и Tyr5 (Amiche et al., 1987; 1988; 1990), содержащейся как в N-концевом тетра-, так и в С-концевом трипептиде будет показывать наличие одного участка связывания. Использование широкого набора ингибиторов полностью не исключает возможность образования фрагментов [3Н]-дерморфина в инкубационной среде. Можно предположить, что образующийся при гидролизе [3Н]дерморфина меченый тритием трипептидный фрагмент также взаимодействует с рецепторами. Имеются сведения о том, что некоторые гептапептидные аналоги дерморфина, такие как [Lys(Z)7]-дерморфин, [des-Gly3, Tyr4, Pro5, Asn6]дерморфин, а также пентапептиды [Tyr5-NH2]-дерморфин-(1-5) и [Trp4, Asn5-OH]дерморфин-(1-5) также имеют два участка связывания (Attila et al., 1993).

Для изучения способности С-концевых трипептидов взаимодействовать с местами связывания дерморфина исследовали возможные изменения специфического связывания «низкоаффинным» (5 нМ) местам связывания в присутствии Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-ProSer-NH2. Кривые вытеснения 0.5 нМ [3H]-дерморфина немеченым дерморфином, Tyr-ProSer-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 представлены на рисунке 6. Как видно из рисунка, трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 начинают вытеснять [3H]-дерморфин уже в наномолярной области концентраций и достигают максимального эффекта в микромолярной. Кривые вытеснения [3H]-дерморфина обоими трипептидами выходят на плато, соответствующее 50 % специфического связывания.

Рисунок 6 – Вытеснение 0.5 нМ [3H]-дерморфина немеченым дерморфином Как показал анализ кривой насыщения [3H]-дерморфина в координатах Скэтчарда, плотность его «высокоаффинных» мест связывания с мембранной фракцией в 2 раза ниже, чем «низкоаффинных». По-видимому, трипептиды вытесняют [3H]-дерморфин только из «высокоаффинных» мест связывания, в первую очередь оккупируемых [3H]-дерморфином при использовании его в концентрации 0.5 нМ. По данным, представленным на рисунке 6, IC50 немеченого дерморфина составила 0.5 нМ, а IC50 для Tyr-D-Pro-Ser-NH2 составила 5±1 мкМ, для Tyr-Pro-Ser-NH2 - 8±2 мкМ.

Кривые вытеснения 5 нМ [3H]-дерморфина немеченым дерморфином, Tyr-Pro-SerNH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2 и DAGO представлены на рисунке 7. Можно предположить, что «низкоаффинными» участками насыщения. Немеченый дерморфин и DAGO дозоСпецифическое связывание, % Рисунок 7 – Вытеснение 5 нМ [3H]-дерморфина, немеченым дерморфином (контроль), Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser- NH2 и DAGO зависимо ингибируют связывание [3H]-дерморфина с рецепторами (IC50 составляет 5.0 и 4.8 нМ, соответственно). В то же время Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 практически не влияют на связывание [3H]-дерморфина с «низкоаффинными» участками насыщения.

Только при концентрациях трипептидов, намного превышающих концентрацию меченого дерморфина, наблюдается некоторое его вытеснение. Это предположение подтвердилось при построении кривых насыщения [3H]-дерморфина в присутствии трипептидов в высоких концентрациях.

Для изучения способности С-концевых трипептидов взаимодействовать с местами связывания N-концевого фрагмента дерморфина проводили радиорецепторный анализ кинетики связывания [3H]-дерморфина-(1-4) показало, что при 25 С равновесное насыщение наступает через 15 мин (рисунок 8, б).

Кривые вытеснения 5 нМ [3H]-дерморфина-(1-4) дерморфином, Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2 представлены на рисунке 8, а. Как видно из результатов, дерморфин трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 никак не влияют на связывание [3H]дерморфина-(1-4), что может свидетельствовать о взаимодействии с разные местами связывания, при этом трипептиды не имеют сродства к местам связывания N-концевого тетрапептида Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2.

Специфическое связывание, % Рисунок 8 – Вытеснение 1 нМ (контроль), дерморфином, Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 (а) и кинетика связывания [3H]-дерморфина-(1-4) при 25 С (б) _ *[3H]-дерморфин-(1-4) был любезно предоставлен Ю.А. Золотаревым (Институт молекулярной генетики РАН) Таким образом, можно предположить, что из обнаруженных двух мест специфического связывания дерморфина «низкоаффинные» являются местами Nконцевого, а «высокоаффинные» - отражают рецепторное связывание его С-концевого фрагмента. Поскольку фармакологические эффекты дерморфина и С-концевых опиоидных рецепторов, а дерморфин имеет наибольшее сродство и избирательность к µопиоидным рецепторам (Melchiorri and Negri, 1996), можно предположить, что исследуемые трипептиды взаимодействуют с опиоидными рецепторами.

Итак, при исследовании влияния С-концевого фрагмента дерморфина Tyr-Pro-SerNH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH2 на рецепторное связывание [3H]-дерморфина установлена способность трипептидов взаимодействовать с высокоаффинными местами насыщения дерморфина. Можно предположить, что один из механизмов анальгетического действия С-концевых трипептидов связан с взаимодействием с опиоидергической системой организма.

5. Изучение взаимодействия с периферическими опиоидными рецепторами Взаимодействие с периферическими опиоидными рецепторами исследуемых соединений оценивали по их способности ингибировать стимулируемое электрическими импульсами сокращение препаратов, полученных из гладкой мышечной мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (µ-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (-опиоидные рецепторы) (Hughes et al., 1975; Lemaire et al., 1978).

Сравнительную оценку опиоидной активности дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и их Сконцевых трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 Tyr-D-Pro-Ser-NH2 проводили по показателю концентрации ингибирования IC50.

Специфическое связывание пептидов с периферическим опиоидными рецепторами определяли по изменению амплитуды сокращения препаратов, полученных из гладкой мышечной мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (µ-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (-опиоидные рецепторы) после добавления исследуемого вещества. Для построения кривых ингибирования использовали пептиды дерморфин, [DPro6]-дерморфин, Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в концентрациях от 1 нМ до мкМ.

Данные расчета концентраций ингибирования (IC50) количественно показали, что дерморфин и [D-Pro6]-дерморфин уменьшают амплитуду сокращения препаратов ПКМС в два раза в наномолярной области: их IC50 составляют 26 ± 5 и 30 ± 6 нМ соответственно.

Концентрация ингибирования IC50 препарата СПМ составляет для дерморфина 90 ± 19 и [D-Pro6]-дерморфина - 87 ± 11 нМ (таблица 2).

Таблица 2 – Взаимодействие дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и их С-концевых фрагментов с периферическими опиоидными Трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 снижают амплитуду сокращений препаратов СПМ и ПКМС только в микромолярной концентрации, при этом их ингибирующий эффект гораздо менее выражен, чем у дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина.

Трипептиды взаимодействуют преимущественно с µ-, чем с - рецепторами: при добавлении Tyr-Pro-Ser-NH2 эффект больше в 14 раз, Tyr-D-Pro-Ser-NH2 – в 25 раз.

Установлено, что физиологический эффект всех пептидов обратим и снимается при добавлении в камеру раствора налоксона. Таким образом, можно предполагать, что механизм анальгетического действия трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH возможно связан с их влиянием на опиоидергическую систему организма.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о высокой биологической активности трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2, а, следовательно, и важности C-концевого участка молекулы дерморфина на проявление его физиологической активности. Химическим синтезом были получены два стереоизомера трипептидов, их ненасыщенный аналог и меченные тритием по пролину трипептиды.

Было установлено, что трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 проявляют анальгетическую активность, доказанную тестами отдергивания хвоста и уксусных корчей. Анальгетический эффект трипептидов сравним с таковым для дерморфина и его рецепторов. Это свидетельствует о возможном участии опиоидергической системы в механизме анальгетического действия трипептидов.

внутримышечного введения попадают в кровяное русло, способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в мозг и другие органы. Радиорецепторными исследованиями выявлены два центра связывания дерморфина на плазматических мембранах головного мозга крыс, при этом С-концевые фрагменты Tyr-Pro-Ser-NH2 и TyrD-Pro-Ser-NH2 взаимодействуют преимущественно с «высокоаффинными» местами насыщения [3H]-дерморфина и не влияют на связывание N-концевого фрагмента дерморфина [3H]-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2. Изученные трипептиды с низким сродством взаимодействуют с периферическим µ-опиоидными рецепторами и не взаимодействуют с -опиоидными рецепторами. В заключение можно сказать, что трипептиды Tyr-Pro-SerNH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 могут быть предложены в качестве основы для создания новых анальгетиков.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, Tyr-DLтрипептиды Pro-Ser-NH2 и тетрапептид Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2, методами смешанных ангидридов и активированных эфиров в количествах, необходимых для проведения биологических исследований.

2. Получены меченные тритием Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 и установлено, что наилучшими условиями синтеза с точки зрения оптимального сочетания выхода и молярной радиоактивности является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития.

3. Показано, что в тестах соматической и висцеральной боли анальгетическое действие дерморфина. Анальгетический [D-Pro6]-дерморфина блокируется неселективными антагонистами дерморфина и опиоидных рецепторов налоксоном и налоксоном метиодидом. Результаты свидетельствует о том, что анальгетическое действие трипептидов реализуется через опиоидергическую систему организма.

Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 в организме крысы. Максимальное накопление меченых трипептидов наблюдается в печени и почках. Единственными детектируемыми радиоактивными метаболитами является [3,4-3H]Pro и [3,4-3H]-D-Pro.

5. Показано, что трипептиды Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH способны проникать в мозг крысы.

6. Установлено, что дерморфин имеет два места связывания на плазматических мембранах головного мозга крысы.

7. Трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 Tyr-D-Pro-Ser-NH2 имеют места специфического связывания на плазматических мембранах головного мозга крысы. Оба изомера связываются с высокоаффинными местами связывания дерморфина и не взаимодействуют с низкоаффинными. Трипептиды не взаимодействуют с местами связывания дерморфинаТрипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 обладают меньшим сродством (IC около 10-5 M) к периферическим µ-опиоидным рецепторам препарата ПКМС по сравнению с дерморфином и [D-Pro6]-дерморфином (IC50 около 10-9 M) и, в отличии от дерморфина и [D-Pro6]-дерморфина, не взаимодействуют с -опиоидными рецепторами препарата СПМ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Громовых П.С., Л.С. Гузеватых, К.В. Шевченко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, В.П.

Шевченко, И.Ю. Нагаев, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов. Синтез, фармакокинетика и метаболизм C-концевого трипептида дерморфина и его диастереомера //Биоорганическая химия. 2007. Т.33. № 6. С. 581-587.

2. Громовых П.С., Гузеватых Л.С., Шевченко К.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Воронина Т.А., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием фрагментов дерморфина и исследование кинетики распределения радиоактивности в органах крысы при их внутримышечной инъекции. //Радиохимия. 2007. T. 49. № 1. С. 93-95.

3. Гузеватых Л.С., Воронина Т.А., Емельянова Т.Г., Андреева Л.А., Громовых П.С., Мясоедов Н.Ф., Середенин С.Б. Сравнительный анализ анальгетической активности дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и их С-концевых трипептидов //Известия РАН. Серия биологическая. 2007. Т 5. С. 1-6.

4. Громовых П.С., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля А.А., Гузеватых Л.С., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф.

Использование меченного тритием дерморфина для исследования взаимодействия Cконцевого фрагмента дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH с опиоидными рецепторами. //Доклады Академии наук. 2008. Т. 419. № 2. С. 276–278.

5. Громовых П.С., Шевченко К.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Синтез С-концевых аналогов дерморфина и исследование фармакокинетики и метаболизма при внутримышечном введении этих пептидов.

//Материалы Четвертого съезда Общества биотехнологов России. Пущино. 2006. С. 58.

6. Громовых П.С., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля А.А., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко К.В., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. Использование меченного тритием дерморфина для исследования взаимодействия С-концевого аналога дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH2 с опиоидными рецепторами.

//Тезисы III Российского симпозиума «Белки и пептиды». Пущино. 2007. С. 66.

7. Громовых П.С., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля А. А., Гузеватых Л.С., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко К.В., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П. Использование меченного тритием Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 для изучения его рецепторного связывания с мембранной фракцией головного мозга крыс. //Тезисы III Российского симпозиума «Белки и пептиды». Пущино. 2007. С. 67.



 
Похожие работы:

«Спангенберг Виктор Евгеньевич Динамика структурной организации хромосом в профазе I мейоза у мыши и человека 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории цитогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Коломиец...»

«Бысыина Мария Федотовна ФЛОРА АЛАСНОЙ ЧАСТИ ЛЕНО-АМГИНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ (ЦЕНТРАЛЬНАЯ ЯКУТИЯ) 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2009 1 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Пяк Андрей Ильич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Олонова Марина Владимировна ГОУ ВПО Томский государственный...»

«УДК 577.32 Тен Дмитрий Ильич Процессы агрегации макромолекул белков в водных растворах, содержащих ионы тяжелых металлов 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2003 Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель :...»

«Бушуев Андрей Владимирович ФАКТОРЫ ВАРИАЦИИ УРОВНЯ МЕТАБОЛИЗМА ПОКОЯ ПТЕНЦОВ МУХОЛОВКИ-ПЕСТРУШКИ (FICEDULA HYPOLEUCA) 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель кандидат биологических наук Керимов Анвар Бурханович Официальные оппоненты доктор...»

«Бускунова Гульсина Гильмановна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ACHILLEA NOBILIS L. В УСЛОВИЯХ СТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮЖНОГО УРАЛА Специальность 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2009 Работа выполнена на кафедре экологии Сибайского института (филиал) ГОУ ВПО Башкирский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Аминева Аниса Ахметсафеевна Официальные оппоненты :...»

«КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна ИНДУКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PODOSPORA ANSERINA (RABENH.) NIESSL В ПРОЦЕССЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОГО ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Специальность 03.02.12 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного...»

«ДЖУМАЕВА Гулшермо Рамихудоевна АЛЬГОФЛОРА ОСНОВНЫХ ТЕРМАЛЬНЫХ И МИНЕРАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ ПАМИРА 03.00.05 — “Ботаника” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск — 2008 1 Работа выполнена в Отделе флоры и систематики растений Института ботаники АН Республики Таджикистан. Научный руководитель — доктор биологических наук, чл.-корр. АН РТ Хисориев Хикмат. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, с.н.с. Науменко Юрий...»

«Поляков Николай Александрович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЦИОНАЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАГУЛЬНИКА БОЛОТНОГО 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2008 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Красноярский государственный аграрный университет на кафедре машины и аппараты пищевых производств. Научные руководители: доктор химических наук, профессор Ефремов Александр Алексеевич доктор биологических наук Кириенко Наталья...»

«ЧУЛКИН АНДРЕЙ МИХАЙЛОВИЧ CREA – ЗАВИСИМАЯ УГЛЕРОДНАЯ КАТАБОЛИТНАЯ РЕПРЕССИЯ В PENICILLIUM CANESCENS 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2011 Работа выполнена в лаборатории оптимизации экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (ИНБИ РАН). Научный руководитель : кандидат биологических наук, ИНБИ РАН, г. Москва Беневоленский Сергей Владимирович...»

«МАЛЫШЕВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДРЫШКОВЫХ БЕЛКОВ В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ 03.01.04. – биохимия 14.01.21. – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН и Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и...»

«АБУЗАРОВА Эльмира Ренардовна ОСОБЕННОСТИ ГЕНОТИПОВ HELICOBACTER PYLORI И ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ (IL-1 И IL-10) У БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань-2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук Научный руководитель...»

«Андрющенко Сергей Валерьевич ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИНГИБИТОРОВ ЛИЗОЦИМА В АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург – 2012 2 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждени науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук. Научный руководитель : кандидат...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«Потапенко Наталья Христофоровна АДАПТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШЕЛКОВИЦЫ В УСЛОВИЯХ КЛИМАТИЧЕСКОГО СТРЕССА (НА ПРИМЕРЕ НИЖЕГОРОДСКОГО ПОВОЛЖЬЯ) Специальность: 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена на базе Ботанического сада Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Научный...»

«ЕНУЩЕНКО Илья Валерьевич Триба Овсовых злаков (Poaceae: Aveneae) в Байкальской Сибири 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2010 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики в ГОУ ВПО Иркутский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Чепинога Виктор Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологическах наук, профессор Олонова Марина Владимировна...»

«Соболева Юлия Викторовна Структурно-функциональная характеристика микросимбиоценозов верхних дыхательных путей человека 03.02.03 - Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук. Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Усвяцов...»

«Сираева Зульфира Юнысовна БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ НА ОСНОВЕ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS ВКПМ В-11008 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2012 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент – Захарова Наталия Георгиевна...»

«Чимитдоржиева Эржена Очировна ЗАПАСЫ УГЛЕРОДА В ЧЕРНОЗЕМАХ И КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ И ЭМИССИЯ СО2 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2011 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«СТЕПАНОВА Ирина Сергеевна ОРГАНИЗАЦИЯ И ДИНАМИКА ТЕЛЕЦ КАХАЛА И КЛАСТЕРОВ ИНТЕРХРОМАТИНОВЫХ ГРАНУЛ В ООЦИТАХ ДОМОВОГО СВЕРЧКА ACHETA DOMESTICUS 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2006 2 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : кандидат биологических наук Боголюбов Дмитрий Сергеевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург...»

«Ягудин Тимур Анверович Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства Специальность 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 г Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГосНИИГенетика и в лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научный руководитель : кандидат биологических наук С.В. Беневоленский Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.