WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

на правах рукописи

Парфенов Игорь Александрович

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЯ

специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т. А. Валуева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская доктор биологических наук, профессор М. А. Белозерский

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра РАН

Защита состоится «22» марта 2012 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН по адресу: 119071,Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33.

строение 1.

Автореферат разослан «21» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А. Ф. Орловский

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) – это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [Rawlings et al., 2004].





Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул белковых ингибиторов протеиназ, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [Валуева, Мосолов, 1999; Otlewski et al., 2005]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес.

В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [Rawlings et al., 2004]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Белковые ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [Wei et al., 2009]. Так, в растениях они могут обладать контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [Lawrence, Koundal, 2002; Мосолов, Валуева, 2005].

В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов, изучение белков-ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства.

К настоящему времени проведено много исследований и накоплено достаточное количество данных о белках-ингибиторах, представленных в картофеле (Solanum tuberosum L.), который является одной из важнейших мировых сельскохозяйственных культур [Bauw et al., 2006]. Часть этих белков объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и C-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых – PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C – относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI, выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.





Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи.

ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI.

2. Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства PKPI и охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты:

-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин.

Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля.

3. Выделить и охарактеризовать кДНК, кодирующую новый белок, картофеля.

выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантный белок, кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать специфичность его действия на протеиназы.

картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor), который одинаково эффективно действовал на -химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы. Таким образом, выделенный белок PKCI, является «двуглавым» ингибитором трипсина и химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра.

позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физикохимические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и pH-стабильностью. Показано, что ингибитор угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Bary, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения.

Определена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Разработан метод экспрессии этой кДНК в E. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантный белок одинаково эффективно подавляет активность -химотрипсина и трипсина и так же, как и белок PKCI, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, белок PKPIJ-B идентичен белку PKCI, который кодируется в геноме картофеля кДНК PKPIJ-B. Сравнительный анализ восстановленных аминокислотных последовательностей белка PKCI с последовательностями белков группы PKPI-B, присутствующих в клубнях различных сортов картофеля и действующих как ингибиторы протеиназ, показал, что наиболее вариабельным является С-концевой участок их молекул, расположенный между остатками Cys147 и Cys164, в котором локализован реактивный центр, ответственный за связывание -химотрипсина.

Сделано заключение, что в состав реактивного центра, ответственного за связывание трипсина, входят остатки Arg68-Phe69, а в центре, ответственном за связывание химотрипсина, находятся остатки Met153Ser154. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов PKPI определяет специфичность их действия.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009);

XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (г. Екатеринбург, 2010); I Всероссийской виртуальной интернет – конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (г. Казань, 2010); V Российском симпозиуме «Белки и биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, 8 тезисов в материалах конференций.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 135 страницах;

содержит 22 рисунка и 6 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 232 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы рассматривается структура, механизм действия и функции сериновых протеиназ. Подробно рассматривается классификация, молекулярная структура и механизмы действия белковых ингибиторов протеиназ, а также их различные функции в растениях.

Делается акцент на ингибиторах семейства SKTI, а также, подсемействе PKPI из картофеля.

Глава 2. Основные результаты и их обсуждение Выделение и очистка белка-ингибитора -химотрипсина Для первичного скрининга белковых ингибиторов, белки, осажденные сульфатом аммония (75% насыщения) из сока картофеля (S. tuberosum, сорт Юбилей Жукова), разделяли методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75. В полученных фракциях измеряли ингибиторную активность по отношению к сериновым протеиназам.

В результате гель-хроматографии были получены три белковых компонента: I, II и III. В компоненте I присутствовали высокомолекулярные белки, большая часть которых является представителями семейства пататинов (Mr ~ 50000). Белки, содержащиеся в компоненте II (Mr ~ 20обладали способностью эффективно ингибировать -химотрипсин.

В состав компонента III входили белки (Mr ~ 10000), не действующие на химотрипсин.

хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B, уравновешенной 0,4 М Naацетатным буфером, pH 4,3. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0 до 0,5 M в стартовом буфере. Белки разделялись на три основных компонента, обозначенных как Iа, IIа и IIIа (рис. 1А, кривая 1). Все три белковых компонента эффективно подавляли активности -химотрипсина и трипсина, в то же время значительно слабее действовали на субтилизин Карлсберг (рис. 1А, кривые 2-4 соответственно).

Диск-электрофорез полученных компонентов в Ds-Na-ПААГ показал, что только компонент IIIа, элюировавшийся при концентрации NaCl, равной 0,38 M, содержал единственный белок с молекулярной массой 23 ± 1 кДа, молекула которого состоит из одной полипептидной цепи (рис. 1В). Это представителем подсемейства PKPI.

Рис. 1. А - Ионообменная хроматография белков с молекулярной массой 20-25 кДа из клубней картофеля на КМ-сефарозе CL-6B и Ds-NaПААГ-электрофорез (Б) компонентов, обладающих активностью ингибиторов протеиназ А - Ia,IIa,IIIa, – белковые компоненты, 1 – А280; 2-4 – активность ингибиторов трипсина, химотрипсина и субтилизина соответственно (в % от исходной активности фермента), в качестве субстратов использовали BAPA, Suc-GGF-pNa и Z-AAL-pNa; 5 - концентрация NaCl [M].

Б - М – белки-маркеры, I – компонент Iа; II – компонент IIа; III – компонент IIIа.

протеиназ (рис. 2). Ингибитор слабо подавлял активность субтилизина Карлсберг и не действовал на цистеиновую протеиназу, папаин (рис. 2, кривые 3 и 4 соответственно), но в равной степени эффективно подавлял ингибирования от количества внесенного ингибитора сохраняли линейный характер практически до полного угнетения (рис. 2, кривые 1 и 2). Расчеты показали, что с 1 молем ингибитора связывается 1 моль, как химотрипсина, так и трипсина.

Оказалось, что с -химотрипсином белок PKCI связывается несколько сильнее, чем с трипсином, поскольку для него линейный характер данной зависимости сохраняется на более протяженном участке вплоть до 85% ингибирования.

Расчет равновесных константы диссоциации (Кi) комплексов химотрипсин/трипсин-PKCI показал, что для -химотрипсина значение Кi, рассчитанное при гидролизе Suc-GGF-pNa (0,3 мМ), составило величину, равную 0,3 ± 0,1 нМ, а для трипсина - 1,2 ± 0,1 нМ при гидролизе BAPA мМ) (табл. 1). Это подтверждает сделанное выше заключение о том, что белок PKCI сильнее связывает -химотрипсин, чем трипсин.

Таблица 1. Константы диссоциации (Кi) комплексов PKCI с исследуемыми ферментами * - реальные концентрации активных ферментов, определенные титрованием активных центров [Shonbaum et al., 1961: Chase, Shaw, 1967].

количеств трипсина, -химотрипсина и PKCI. Белкимаркеры: I – БСА (67 кДа), II – яичный альбумин ( массы составляли величины 46 и 45 (± 1) кДа (рис. 3Б), что практически равно сумме молекулярных масс белка PKCI и -химотрипсина/трипсина, соответственно. Это указывает на то, что ингибитор взаимодействует с ферментами в соотношении 1:1, образуя с ними стехиометрические комплексы (моль/моль), устойчивые в условиях ВЭЖХ. При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI, -химотрипсин и трипсин, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 63 ± 1 кДа (рис.

3В), представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKCI связывались одновременно одна молекула -химотрипсина и одна молекула трипсина.

Это давало основания предположить, что ингибитор является «двуглавым»

и содержит два независимых реактивных центра, ответственных за связывание каждой из этих протеиназ.

Определение N-концевой последовательности аминокислотных остатков белка PKCI. На рис. 4 приведено сравнение его N-концевой аминокислотной последовательности с последовательностями белков: PSPI-21-6.3, PKTI-22, PKSI, P1H5, KPI A-k1, KPi B-k2 и PI-2, выделенных из клубней картофеля сортов Истринский [Ревина и др., 2010;

Valueva et al., 2000], Provita [Heibges et al., 2003], Kuras [Bauw et al., 2006] и Elkana [Pouvreau et al., 2003] соответственно.

Белки PKPI принято разделять на три структурные группы: PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C [Ishikawa et al., 1994]. Белки PKPI, относящиеся к указанным трем структурным группам, имеют различное строение N- и Cконцевых участков, а также обладают различной специфичностью действия на протеиназы [Ishikawa et al., 1994].

Видно, что последовательности белков PKCI, PSPI-21-6.3, PKTI- P1H5, KPi B-k2 и PI-2 значительно отличались от последовательностей белков PKSI и KPI A-k1 (рис. 4), что указывает на их принадлежность к различным структурным группам ингибиторов PKPI. В работе [Ревина 2004] было показано, что белок PKSI входит в состав группы PKPI-C. Белок KPI Ak1 входит в группу PKPI-A [Bauw et al., 2006]. В тоже время первые аминокислотных остатков белков PKCI, PSPI-21-6.3, PKTI-22, P1H5, KPi B-k и PI-2 полностью совпадали (рис. 4). Эти остатки обнаружены в последовательностях всех белков структурной группы PKPI-B и являются консервативными [Ishikawa et al., 1994]. Таким образом, белок PKCI был отнесен именно к этой структурной группе.

Определение pH и термостабильности белка PKCI Были исследованы рН- и термостабильность белка PKCI (рис. 5) Видно, что при инкубации белка в течение 20 ч при различных значениях pH наблюдалось определенное снижение его активности по отношению к химотрипсину, наиболее выраженное при pH 2,0 и 12,0 (рис. 5а), где ее потеря составила 30 и 70%, соответственно.

Рис. 5. Зависимость активности белка PKCI по отношению к химотрипсину от рН (а) и температуры (б) 1 – инкубация при рН 6,0, 2 – инкубация при рН 2,0. В качестве субстрата использовали Suc-GGF-pNa. Измеряли степень ингибирования фермента (%) при соотношении ингибитор/фермент (моль/моль).

Нагревание белка PKCI в течение 10 мин при температурах от 50 до 90°С приводило к значительному снижению активности ингибитора по отношению к -химотрипсину, как при pH 6,0, так и при pH 2,0 (рис.5б). При активность. Таким образом, имеются все основания предполагать, что при температурах среды белок PKCI теряет конформацию нативной молекулы.

Изучение фунгицидной активности белка PKCI Ранее в нашей лаборатории было установлено, что некоторые белки PKPI накапливаются в тканях клубней картофеля сорта Истринский при инфицировании оомицетом P. Infestans [Валуева и др., 2003]. Было показано, что эти белки in vitro не только подавляют активность экзопротеиназ, секретируемых патогенными микроорганизмами [Гвоздева и др., 2004], но и угнетают их рост и развитие [Ревина и др., 2010]. В связи с этим было исследовано действие на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов белка PKCI, выделенного из картофеля сорта Юбилей Жукова, который обладает к ним повышенной устойчивостью. На рис. представлены результаты изучения влияния белка PKCI на рост гиф и развитие макроконидий гриба F. culmorum и зооспор оомицета P. infestans.

Гриб F. culmorum вызывает у растения картофеля фузариозное увядание, а оомицет P. infestans – фитофтороз.

Рис. 6. Влияние белка PKCI на рост гиф и повреждение макроконидий гриба F. culmorum (а) и зооспор оомицета P. infestans (б) 1 - длина гиф; 2 – количество лизированных макроконидий или зооспор. Приведены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%.

На рис 6а, видно, что при добавлении 400 мкг белка PKCI длина растущих гиф гриба уменьшалась на 60% по сравнению с контролем поврежденными (кривая 2). При той же концентрации белка PKCI длина гиф оомицета уменьшалась на 50% (рис. 6б, кривая 1) и разрушению свидетельствует о том, что белок PKCI слабее действовал на рост и предположить, что данный белок наряду с другими известными факторами включен в защитную систему картофеля.

Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI-B в геноме картофеля сорта Юбилей Жукова.

Методом обратной транскрипции, используя мРНК как матрицу, выделенную из 2-х недельных проростков картофеля сорта Юбилей Жукова, была получена полная кДНК картофеля. Затем с помощью ПЦР со специфическими праймерами, синтезированными нами, была получена кДНК, обозначенная как PKPIJ-B. Последовательность нуклеотидов в этой кДНК характеризовалась высокой степенью сходства (от 95,2 до 96,6% идентичных н.п.) с генами PKPI-B9 (AY693424), PKPI-B10 (AF536175.1) [Сперанская и др., 2005], PI-2 (AY166690) [Pouvreau et al., 2003], KPi B-k (DQ168333.1) [Bauw et al., 2006], P1H5 (AF492359), P4D11 (AF4955584) и S1C1 (AF492769) [Heibges et al., 2003], которые были обнаружены в последовательности gCDI-B1 (Q41484) из сорта Danshaku, содержащей только 90,7% идентичных н.п. [Ishikawa et al., 1994]. Оценка степени кодирующих белки PKPI-B в картофеле семи сортов, показала, что они содержат от 89 до 99% идентичных н.п. При этом, наиболее вариабельные участки последовательностей расположены в 5’-концевой части молекул.

Анализируя положения замен нуклеотидов в этих последовательностях можно сделать заключение, что они локализуются в одних и тех же рекомбинации.

На рис. 7 приведено филогенетическое дерево, из которого видно, что сорта японской и европейской (в том числе российской) селекции находятся на разных ветвях «дерева», что соответствует гипотезе, предложенной в вариабельности белков PKPI. Действительно, замены в нуклеотидных последовательностях могут приводить к полиморфизму аллелей одного и того же генного локуса в геноме тетраплоидного картофеля Рис. 7. Филогенетическое дерево генов, кодирующих белки PKPI-B в различных сортах картофеля Построено с использованием программы MEGA 4 по принципу максимального подобия.

Числа в узлах ветвей (bootstraps) – индексы поддержки каждого узла, полученные при расчете 100-кратной повторности.

Гетерологичная экспрессия белка PKPIJ-B Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPIJ-B в E. coli штамма BL-21(DE3), была создана на основе экспрессионного вектора pET23а.

Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPIJ-B, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве в растворимой фракции клеточных белков E. coli штамма BLDE3). Молекулярная масса полученного рекомбинантного белка PKPIJ-B, определенная методом DS-Na-ПААГ-электрофореза, имела значение около 25 кДа, что совпадало с расчетной величиной. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pET23a, не содержащим вставки, белковый продукт с такой молекулярной массой не был обнаружен.

Для получения рекомбинантного белка PKPIJ-B клетки E. coli разрушали ультразвуком. Нерастворимая фракция с тельцами включения E.

предварительные эксперименты показали, что присутствие небелковых и белковых примесей отрицательно сказывается на процессе его ренатурации и низкому выходу целевого белка. В связи с этим денатурированные тельца включения были подвергнуты очистке от примесей на колонке (2,5х30 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М Трис-HCl-буфером, pH 8,0, содержащим М мочевину. Связанный с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Данная процедура позволила практически полностью отделить целевой продукт от белковых и небелковых примесей, содержащихся в клеточном лизате E. сoli.

Рефолдинг солюбилизированных белков телец включения E. coli проводили путем диализа против 0,05 М Трис-HCl-буфера, pH 7,5 при 4°С в течение 24 ч. Ренатурированный белок PKPIJ-B дополнительно очищали до гомогенности методом анионообменной FPLC-хроматографии на ДЭАЭToyopearl, уравновешенном 0,05 М Трис-HCl-буфере, pH 7,5. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере.

элюировавшейся при 0,15 М NaCl, содержал гомогенный белок PKPIJ-B с молекулярной массой 25 кДа (рис 8А). Можно заключить, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи. Следует отметить, что молекулярная масса рекомбинантного белка несколько выше, чем у PKCI, выделенного из клубней картофеля. Это связано с присутствием дополнительных аминокислотных остатков, которые был введены при создании экспрессионной плазмиды.

Была исследована активность рекомбинантного белка PKPIJ-B по отношению к протеолитическим ферментам. Показано, что он эффективно подавлял активность -химотрипсина и в меньшей степени трипсина (рис.

8Б).

Зависимость степени подавлении активности -химотрипсина от количества добавленного ингибитора сохраняла линейный характер до достижения 80%-ного ингибирования (рис. 8Б, кривая 1). Расчеты показали, что 1 моль ингибитора стехиометрически связывался с 1 молем химотрипсина, а также с 1 молем трипсина.

Исследования при помощи ВЭЖХ, смесей, содержащих избыток рекомбинантного белка PKPIJ-B, -химотрипсина и трипсина, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 65 ± 1 кДа, представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKPIJ-B связывались одновременно одна молекула -химотрипсина и одна молекула трипсина.

Таким образом, рекомбинантный белок PKPIJ-B и выделенный нами из клубней картофеля белок PKCI обладают одинаковым характером действия на протеиназы и способны образовывать тройные комплексы, в которых одна молекула ингибитора связывается одновременно две молекулы химотрипсина и трипсина. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что белок PKCI идентичен рекомбинантному белку PKPIJ-B.

Рис. 8. А - Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка PKPIJ-B (А) и его влияние (Б) на активность -химотрипсина (1) и трипсина (2) А: М – белки-маркеры, 1 – белок PKPIJ-B Б: Влияние рекомбинантного белка на активность -химотрипсина (1) и трипсина (2). Для определения активностей -химотрипсина и трипсина использовали в качестве субстратов Suc-GGF-pNa и BAPA, соответственно.

4.8. Аминокислотная последовательность белка PKCI На основании сравнения N-концевых участков белков PKCI и PKPIJ-B, их молекулярных масс, а также действия на протеиназы с возможностью образовывать тройные комплексы позволило утверждать, что белок PKCI кодируется в геноме картофеля выделенным фрагментом гена PKPIJ-B.

Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы PKPI-B, приведенных на рис. 9, показало, что они содержат от 86,5 до 98,6% идентичных остатков, часть из которых является консервативной. Прежде всего, это два консервативных остатка цистина, образующих дисульфидные связи, соединяющие остатки Cys49-Cys98 и Cys147Cys164, первая из которых формирует большую пептидную петлю в N-концевой части молекулы, а вторая – малую в ее С-концевой части. Несмотря на высокое сходство первичных структур, рассматриваемые белки различаются по специфичности действия на -химотрипсин и трипсин. Так, белок PSPI-21который кодируется геном PKPI-B9, эффективно подавлял активность эластазы из лейкоцитов человека и значительно слабее действовал на трипсин и -химотрипсин [Valueva et al., 2000]. Такой же специфичностью действия на протеиназы характеризуется белок PSPI-21-5.2, который кодируется гибридным геном, содержащем на 3’-участке фрагмент гена PKPI-B9, а на 5’-участке - PKPI-A6 [Сперанская и др., 2005]. Белок PKTI-22, кодируемый геном PKPI-B10, является специфическим ингибитором трипсина [Ревина и др., 2010], а белки PKCI и P1H5 с одинаковой эффективностью действуют на -химотрипсин и трипсин [Heibges et al., 2003].

Все белки, аминокислотные последовательности которых представлены на рис. 9, являются ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по «каноническому» субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на своей поверхности специфическую структуру - «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь Р1-Р1’, образующая реактивный центр ингибитора.

последовательностях всех ингибиторов PKPI-B присутствует консервативный участок, окружающий остатки Arg68-Phe69, расположенные в большой пептидной петле. Показано, что они входят в состав реактивного трипсин-связывающего центра ингибиторов [Valueva et al., 2000]. Таким образом, в пространственной организации их молекул создаются условия для образования «канонической петли» связывания трипсина.

Как было установлено, белок PKCI способен одновременно связать молекулы трипсина и -химотрипсина. Кроме того, белки P1H5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1, обладают способностью действовать как на трипсин, так и достаточно эффективно на -химотрипсина [Bauw et al., 2006; Heibges et al., 2003; Pouvreau et al., 2003]. Следовательно, второй реактивный центр, связывающий -химотрипсин, должен присутствовать в их молекулах.

Рис. 9. Сравнение аминокислотных последовательностей белков PKPIB из различных сортов картофеля 1 – PKPIJ-B (PKCI), 2 – PSPI-6.3 [Valueva et al., 2000], 3 - PKTI-22 [Ревина и др., 2010], 4 PSPI-21-5.2 [Valueva et al., 2000], 5 - P1H5 [Heibges et al., 2003;], 6 - gCDI-B1 [Ishikawa et al., 1994], 7 - KPi B-k2 [Bauw et al., 2006], 8 - P4D11 [Heibges et al., 2003], 9 - PI-2 [Pouvreau et al., 2003], 10 - S1C1 [Heibges et al., 2003]. Аминокислотные остатки, идентичные во всех последовательностях, не окрашены, а различающиеся обозначены серым цветом.

Вариабельные участки окрашены в бирюзовый цвет. Реакционные центры указаны стрелками, дисульфидные связи (Cys49-Cys98 и Cys147-Cys164)- * и **, соответственно В работе [Heibges et al., 2003] была продемонстрирована важность проявления ингибиторами PKPI-B, действующими на трипсин, также активности по отношению к -химотрипсину. Так оказалось, что удаление значительному снижению активности белка по отношению к -химотрипсину, при этом активность по отношению к трипсину оставалась неизменной. Это указывало на то, что остаток Met153 может входить в состав реактивного центра, связывающего -химотрипсин и локализованного в «канонической петле», образующейся между остатками Cys147-Cys164.

В аминокислотной последовательности белка gCDI-B1 в результате делеции в нуклеотидной последовательности кодирующей его ДНК также отсутствует остаток Met153. В молекуле белка PKTI-22 этот остаток присутствует, но существуют препятствия для образования «канонической»

петли связывания -химотрипсина, поскольку между остатками Cys147Cys164 расположена еще одна дисульфидная связь Cys155-Cys158. И, действительно, белок gCDI-B1 не действует на -химотрипсин [Ishikawa et al., 1994], а белок PKTI-22 очень слабо подавляет активность этого фермента [Ревина и др., 2010]. Только в молекулах белков PKCI, P1H5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1 возможно образование «канонической» петли между остатками Cys147-Cys164, в которой локализован мотив Thr152Met153-XX-Pro156, входящий в состав химотрипсинсвязывающего реактивного центра.

Таким образом, ингибитор -химотрипсина и трипсина PKCI содержит два независимых реактивных центра связывания ферментов. В одном из них локализованы остатки Arg68-Phe69, ответственные за связывание трипсина, в другом - Met153-Ser154, по которым связывается химотрипсин.

1. Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный как PKCI, эффективно подавляющий активность -химотрипсина и трипсина. Белок PKCI содержал два независимо действующих реактивных центра и был способен одновременно связать оба фермента. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность белка PKCI, позволившая отнести его к группе белковингибиторов PKPI-B.

обозначенной как PKPIJ-B. Полученный рекомбинантный белок PKPIJ-B действует на протеиназы аналогично белку PKCI. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что при развитии клубней картофеля белок PKCI кодируется кДНК PKPIJ-B.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки семейства PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5’-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

4. Восстановлена полная аминокислотная последовательность белка PKCI. Показано, что остаток Met153 входит в состав реактивного центра связывания химотрипсина, который локализован в С-концевом участке между остатками Cys147 и Cys164.

5. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Bary, поражающих растение картофеля, что свидетельствует об его участии в защитной системе растения при поражении этими патогенами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ревина Т.A., Парфенов И.A., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева Т.A. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 265-272.

Парфенов И.А., Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле // Прикладная биохимия и микробиология. 2011.

Valueva T.A., Parfenov I.A., Revina T.A., Morozkina E.V., Benevolensky S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. V. 52. P. 83-90.

Ревина Т.A., Кладницкая Г.В., Гвоздева Е.Л., Парфенов И.A., Валуева Т.A. Специфические ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и кодирующие их гены / Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова.

Парфенов И.А., Ревина Т.А. Белок-ингибитор трипсина и химотрипсина из клубней картофеля / Тез. XXII зимней молодежной научной школы биотехнологии". Москва. 2010. С. 48.

Парфенов И.А. Новый белок-ингибитор сериновых протеиназ из клубней картофеля / Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010". Москва. 2010. С. 60.

Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующий белок ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле / Всероссийская "Биология будущего: традиции и инновации". Екатеринбург. 2010. С. 97.

Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина из клубней картофеля и кодирующий его ген / I Всероссийская виртуальная интернет – конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий". Казань. 2010. С. 124.

Парфенов И.А. Молекулярное клонирование генов, кодирующих белкиингибиторы сериновых протеиназ в картофеле / Тез. XXIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии". Москва. 2011. С. 52.

Парфенов И.А., Валуева Т.А. Новый ингибитор химотрипсина из клубней картофеля. Выделение, очистка и характеристика природного и рекомбинантного белков / V Российский симпозиум "Белки и пептиды".

Петрозаводск. 2011. С. 289.

Парфенов И.А., Валуева Т.А. Исследование свойств нового ингибитора химотрипсина из клубней картофеля Solanum tuberosum / Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва. 2011. Т. 2.



 
Похожие работы:

«Тимошкина Ольга Александровна ВЛИЯНИЕ ВЫРУБОК И КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫЖИГАНИЯ ПОРУБОЧНЫХ ОСТАТКОВ НА СООБЩЕСТВА ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ПТИЦ ВОСТОЧНОГО САЯНА) 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2004 Работа выполнена на кафедре охотничьего ресурсоведения и заповедного дела Красноярского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Соколов...»

«Туйгунова Вера Георгиевна ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации...»

«ЗАБОТИН Ярослав Игоревич ТКАНЕВАЯ И КЛЕТОЧНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕСКИШЕЧНЫХ ТУРБЕЛЛЯРИЙ (ACOELA) В СВЕТЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОСТРОЕНИЙ (УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АСПЕКТ) 03.02.04 – Зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2010 г. Работа выполнена на кафедре зоологии беспозвоночных биологопочвенного факультета Казанского федерального (Приволжского) университета. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Голубев...»

«ГАВРИЛОВА Вера Львовна ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.00.06 Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир-2007 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных Научный руководитель : доктор ветеринарных наук, профессор Байбиков Тауфик Закарьевич Официальные...»

«МОЛОДЦОВ Максим Игоревич ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРОТРУБОЧЕК И РАЗВИВАЕМЫХ ИМИ СИЛ 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2007 Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук. Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор И.А....»

«Остроумова Ольга Сергеевна МНОГОУРОВНЕВАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ИОННЫХ КАНАЛОВ, ОБРАЗОВАННЫХ ЦИКЛИЧЕСКИМИ ЛИПОДЕПСИПЕПТИДАМИ PSEUDOMONAS SYRINGAE В ЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научные руководители: доктор биологических наук Людмила Владимировна Щагина, Институт цитологии РАН,...»

«Пиотровский Михаил Сергеевич Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 1 Работа выполнена в лаборатории мембран растительных клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва Научный руководитель :...»

«ПОДОЙНИЦЫН ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПОПУЛЯЦИИ СУДАКА ОБЫКНОВЕННОГО (SANDER LUCIOPERCA L.) В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОГО ПРЕОБРАЗОВАНИЯ АЗОВО-ДОНСКОГО БАССЕЙНА 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2010 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент...»

«Никонов Алексей Александрович ИНТРАЦЕРЕБРАЛЬНЫЕ ГЕМАТОМЫ МАЛОГО ОБЪЕМА (клинико-биохимическое исследование) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.01.11 – нервные болезни 03.01.04 – биохимия Москва - 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Научном центре неврологии РАМН Научные руководители: Доктор медицинских наук Максимова Марина Юрьевна Доктор медицинских наук, профессор Ионова Виктория Григорьевна...»

«ЛАТЫПОВ Олег Рустамович ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ БЕТА-ПРОПЕЛЛЕРНЫХ БЕЛКОВЫХ ДОМЕНОВ, ГОМОЛОГИЧНЫХ ФОЛДОНУ ФИБРИТИНА БАКТЕРИОФАГА Т4 Специальность 03.00.04. – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2008 Работа выполнена в лаборатории вирусов микроорганизмов Института...»

«КОМАРОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА АЛЛЕЛОПАТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАСТИТЕЛЬНЫХ ДОМИНАНТ В ОПТИМИЗИРОВАННЫХ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ ЛУГОВЫХ АГРОЦЕНОЗАХ НИЖНЕГО ДОНА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2006 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и в Ботаническом саду Ростовского государственного университета Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Сидоренко Владимир Гаврилович кандидат...»

«Нямжав Мунхжаргал ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИЕ РАСТЕНИЯ ЗАПАДНОЙ МОНГОЛИИ (СКРИНИНГ, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ, ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.00.05 – ботаника 03.00.12 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2009 Работа выполнена в лаборатории фитохимии Сибирского ботанического сада ГОУ ВПО Томский государственный университет доктор химических наук, старший Научный руководитель : научный сотрудник Зибарева...»

«НЕСТЕРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАТИВНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФОРМ IgG НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ПСОВЫХ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2009 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Удмуртский государственный университет Научный руководитель : кандидат...»

«Биломар Елена Евгеньевна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ ГЕРПЕТОБИОНТНЫХ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ ЛУГОВЫХ СООБЩЕСТВ ПРИХОПЕРЬЯ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж – 2009 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет (ГОУ ВПО ВГУ) Научный руководитель доктор биологических наук, проф. О.П. Негробов Официальные оппоненты Доктор...»

«Ямбуров Михаил Сергеевич ВЕДЬМИНЫ МЁТЛЫ МУТАЦИОННОГО ТИПА У НЕКОТОРЫХ ВИДОВ СЕМЕЙСТВА PINACEAE 03. 02. 01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2010 Работа выполнена в Институте мониторинга климатических и экологических систем Сибирского отделения РАН и Сибирском ботаническом саду ГОУ ВПО Томский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Горошкевич Сергей Николаевич...»

«ФЕДОРОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ СТРОБИЛУРИНОВЫХ ФУНГИЦИДОВ ДЛЯ ГИДРОБИОНТОВ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону-2012 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Южного федерального университета, в Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (ФГУП АзНИИРХ) Научный руководитель : кандидат биологических наук, Левина Ирина...»

«Хоменков Василий Григорьевич Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков Специальность 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2005 1 Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Попов Владимир...»

«ГАЛУШКО МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ТРОМБИНУ ПО КОАГУЛОАКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ И УРОВНЮ МАРКЕРОВ НЕПРЕРЫВНОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и...»

«ЗЕЛЕНКИНА Татьяна Савельевна Разнообразие и функциональная активность метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал 03.00.16 – экология 03.00.07– микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 2 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Дагурова Ольга Павловна Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«Скобанев Алексей Васильевич Ксилотрофные базидиомицеты (Basidiomycota) Пензенской области и накопление тяжелых металлов и мышьяка их базидиомами Специальность 03.02.12. – Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии и экологии ФГОУ ВПО Пензенская ГСХА и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.